BIOLOGIA Acta Científica Venezolana, 51: 207–210, 2000 UNA INFECCION VIRAL EN LA GLANDULA CERVICAL DE LARVAS DE Dione junio (LEPIDOPTERA: NYMPHALIDAE) Frances Rowland Osborn y Fredi Sánchez Instituto de Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas – UDO, Aptdo. 245, Cumaná, Venezuela. FAX: 093 521629, e-mail: frances_osborn@hotmail.com Centro de Microbiología y Biología Celular, Servicio de Microscopía Electrónica IVIC, Aptdo. Postal 21827, Caracas 1020A, Venezuela. Recibido: 13/08/98 ; Revisado: 17/03/00 ; Aceptado: 13/05/00 RESUMEN: Las larvas de Lepidoptera son atacadas por diferentes tipos de virus, muchos de los cuales pertenecen a la familia Baculoviridae. En un estudio de la ultraestructura de la glándula cervical de Dione junio se observó que en los estadíos avanzados, las larvas mostraron a veces síntomas indicando la presencia de dos tipos de virus. Las glándulas cervicales se prepararon para microscopía óptica y electrónica de transmisión, utilizando el procedimiento estándar, y como tampón cacodilato de sodio (0,1M, pH 7,2). La glándula está compuesta por dos sacos ovalados internos, que se comunican con el exterior mediante un canal extracelular. Cada saco contiene, en su parte externa, células con núcleos grandes e irregulares y un citoplasma muy electrón denso con numerosas mitocondrias de pequeño diámetro. En larvas infectadas los tejidos se encuentran muy dañados y se observa el virus de la poliedrosis nuclear en varios de los núcleos. En el citoplasma se observa otro virus tipo “rickettsia”. Los virus patógenos presentes en las larvas de D. junio podrían ser estudiados como potenciales controladores biológicos en los programas de manejo de esta plaga. Palabras clave: Virus, glándula cervical, larvas, Dione junio A VIRAL INFECTION IN THE NECK GLAND OF LARVAE OF Dione junio (LEPIDOPTERA: NYMPHALIDAE)) ABSTRACT: Lepidopteran larvae may be attacked by different viruses, many of which belong to the Baculoviridae family. Whilst studying the ultrastructure of the neck gland in Dione junio larvae we found that in later instars the larvae showed symptoms of attack by two types of virus. The glands were prepared for optical and electron microscopy using sodium cacodylate buffer and standard procedures (0.1M, pH 7.2). The neck gland is composed of two oval internal sacks which communicate with the exterior via an extracellular channel. Each sack contains, in its external region, cells with large, irregular nuclei and a dense cytoplasm containing numerous small mitochondria. In infected larvae, the tissues are damaged and the nuclear polyhedrosis virus can be observed in several of the nuclei. In the cytoplasm another “rickettsia type” virus, may be observed. The pathogenic viruses present in D. junio larvae could be studied as potential biological controls of this pest. Key Words: virus, cervical glands, larvae, Dione junio . INTRODUCCION Las larvas de un número grande de especies de Lepidoptera son atacadas por diferentes tipos de virus, muchos de los cuales pertenecen a la familia Baculoviridae (Adams 1996). Se ha desarrollado el uso comercial de algunos de estos virus, especialmente el virus de la poliedrosis nuclear en programas de control biológico de plagas de cultivos, por ejemplo, Heliothis spp. (Noctuidae) y Lymantria dispar (Liparidae)1 . Dione junio (Heliconiinae: Nymphalidae) es una plaga de Parchita, Passiflora edulis (Passifloraceae) en el estado larval. Durante un estudio de las defensas químicas de esta especie se observó que en los estadios avanzados, las larvas a veces muestran síntomas que evidencian la presencia de un virus de la poliedrosis nuclear (Baculoviridae). Las larvas infectadas toman una apariencia flácida, la epidermis se vuelve débil y frágil y los tejidos internos pierden su estructura completamente (lisis) (resultados no publicados). Como parte del estudio mencionado arriba se realizó una investigación de la ultraestructura de la glándula cervical de D. junio . Esta glándula está ubicada ventralmente en el tórax, justamente anterior al primer par de patas y tiene una función defensiva6 . Aquí se presenta una descripción de las glándulas sanas de D. junio, y glándulas infectadas con el vi- rus. Se espera que estas observaciones preliminares representan un primer paso en el posible desarrollo de este virus como un control biológico de esta plaga. MATERIALES Y METODOS Se colectaron larvas del quinto estadío de Dione junio en una plantación de parchita, ubicada en Las Maravillas, Dtto. Brión, Estado Miranda. Las larvas se trasladaron al Laboratorio de Comportamiento de la Universidad Simón Bolívar. Se disecaron las glándulas cervicales de las larvas vivas bajo agua destilada, con la ayuda de un microscopio estereoscopio, Zeiss Stemi SV 11. Las glándulas disecadas se sumergieron inmediatamente en pre-fijador fresco (glutaraldehido al 2,5% y paraformaldehido 1% en solución tampón cacodilato de sodio (CBS), pH 7,2 y 260 mOsm/l; luego los tejidos fueron postfijados en una solución de Tetróxido de Osmio (OsO4 ) al 1% en solución tampón CBS, pH 7,2. Los tejidos, después de varios lavados en tampón CBS fueron deshidratados en una serie creciente de etanol3;5;8 . Las muestras fueron incluidas en una mezcla de resina, Polybed 812. Se realizaron cortes ultrafinos, de 60-70 nm, teñidos con Acetato de Uranilo al 6% durante 5 min y Citrato de Plomo durante 3 min. Las observaciones y tomas fotográficas se realizaron en un mi- 208 Osborn y Sánchez Figura 1. Ultraestructura de la glándula cervical en larvas sanas. Detalle del área perimetral de un saco. Mb: membrana basal, P: pliegue de la superficie basal de una célula. 31.000X. Figura 3. Ultraestructura de la glándula cervical en larvas sanas. Detalle del área próxima al canal. Ca: canal, Pc: epicutícula, Nc: endocutícula, Mv: microvellosidades. 13.000X. Larvas sanas Células de los sacos Figura 2. Ultraestructura de la glándula cervical en larvas sanas. Detalle del área de síntesis de un saco. N: núcleo, Cr: cromatina, Rr: retículo endoplasmático rugoso, M: mitocondria. 2.800X. Los sacos de la glándula cervical están delimitados por una membrana basal de 0.5m de grosor, y contenido homogéneo (Figura 1). Próxima a esta membrana la superficie basal de las células está muy plegada y aparecen prolongaciones en forma de dedos apuntando hacia la membrana (Figura 1). El citoplasma de las células es denso y contiene mitocondrias además de retículo endoplasmático rugoso (Figura 2). Los núcleos son grandes y de forma irregular (Figura 2). La cromatina se observa en conglomerados definidos uniformemente distribuidos, y entre los mismos se encuentra un material heterogéneo y granular. Células del canal central croscopio electrónico de transmisión Philips (EM-400T). RESULTADOS Este canal está rodeado por células similares a las encontradas en el saco. El tejido cercano a la membrana basal se encuentra muy plegado y próximo a la cutícula las células presentan numerosos microvellosidades (Figura 3). Estructura de la glándula cervical de Dione junio Larvas infectadas La glándula cervical es una glándula eversible, compuesta por un par de sacos ovalados internos. Cada saco contiene, en su parte externa, células dispuestas alrededor del reservorio que contiene una sustancia amorfa (Figura 4). Se puede observar que estas células presentan una estructura muy abierta. En la parte anterior de cada saco se presenta un canal extracelular que descarga independientemente en un canal central ensanchado que comunica directamente con el exterior (Figura 4). Este canal está formado por una invaginación de la cutícula de la larva. La ultraestructura de la glándula se observa muy alterada (Figura 5). En varias de las células de la glándula, particularmente hacia la región externa donde se evidencia la presencia de partículas virales de la poliedrosis nuclear, algunas de ellas en proceso de replicación. (Figuras 5 y 6). En algunos cortes se observa que la envoltura nuclear está desintegrada, liberando los poliedros virales (Figura 7). Además del virus de la poliedrosis nuclear se presenta otra estructura viral tipo “rickettsia”, en el citoplasma1 (Figura 5). Infección viral en larvas de Dione junio Figura 4. Sección transversal de la glándula cervical de D. junio. S: saco, R: reservorio, C: cutícula, Ca: canal central. 70X, microscopía óptica. Figura 5. Detalle de una célula periférica infectada con los virus. N: núcleo, Ci: citoplasma, Bv: virus de la polihedrosis nuclear (Baculoviridae), Vr: virus tipo “rickettsia”. 9.000X, microscopía electrónica de transmisión. 209 Figura 6. Detalle del virus de la polihedrosis nuclear. Bv: Baculoviridae. 36.000X, microscopía electrónica de transmisión. Figura 7. Se observa la desintegración de la envoltura nuclear, liberando los poliedros virales. N: núcleo, Bv: Baculoviridae, Po: poliedros. 17.000X, microscopía electrónica de transmisión. DISCUSION guir las estructuras, probablemente debido a las alteraciones morfológicas producidas por la presencia de dos tipos de virus, el virus de la poliedrosis nuclear y el virus tipo “rickettsia”. La ultraestructura de la glándula cervical contiene núcleos grandes y de forma irregular, característicos de células defensivas en larvas de Lepidoptera4;7 . En los sacos, los numerosos pliegues próximos a la membrana basal probablemente tienen la función de absorción. Las células que rodean el canal central de la glándula son similares a las células del saco. La presencia de microvellosidades próximas a la cutícula del canal sugiere una secreción de sustancias al canal. No se observa ninguna perforación de la cutícula del canal, lo que sugiere que la secreción pasa a través de éste por difusión2 . En larvas infectadas de Dione junio no se pudo distin- El virus de la poliedrosis nuclear ataca con frecuencia larvas de diferentes familias dentro del orden Lepidoptera. Las larvas ingieren los poliedros, que están presentes en el follaje. Luego, el virus se multiplica en los núcleos de la larva y eventualmente causa la ruptura y desintegración celular. Ha sido reportado recientemente la presencia de un Baculovirus en larvas de Spodoptera frugiperda en un cultivo de maíz ubicado en el estado Lara, Venezuela 9 . Estudios de laboratorio y campo confirmaron que el virus es altamente patógeno para esta plaga, reduciendo significativamente la infestación de la misma10;11 . Los virus tipo “rickettsia” han sido reportados en larvas de Trichoplusia 210 Osborn y Sánchez (Noctuidae)1 . ni Este virus retarda el desarrollo de la larva y en los estados avanzados de la enfermedad, el citoplasma de los órganos infectados es destruido por completo1 . Este es el primer reporte de la presencia de este virus en larvas de Nymphalidae para Venezuela. En conclusión, la existencia de los virus patógenos en las larvas de D. junio aporta una información interesante para la formulación de una nueva línea de investigación. En este caso, demostrar la potencialidad de ser utilizados como agentes de control biológico en los programas de manejo de esta plaga. AGRADECIMIENTOS Se agradece la Dra. Gloria Villegas para facilitarnos el uso del microscopio electrónico de transmisión en el Laboratorio de Ultraestructura, Centro de Biociencias del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Caracas, Venezuela. Este trabajo fue parcialmente financiado por CONICIT bajo el proyecto QF-36. REFERENCIAS 1. Adams, J.R. The use of electron microscopy in insect pathology. Phillips Electron Optics Bull . 123:11-21, 1996. 7. Snodgrass, R.E. Principles of Insect Morphology. Cornel University Press. Ithaca and London, 1993, pp. 59. 2. Billen, J. Morphology and ultrastructure of the exocrine glands in social Hymenoptera. En: Chemistry and Biology of Social Insects. J. Reder and H. Rembold (eds.). J. Peperny Verlag, München, 1987, pp. 81-84. 8. Stobbart, R.H.J. and Shaw, J. Salt and water balence: excretion. In: The Physiology of Insecta. Vol III. Rockstein (ed.). Academic Press. New York, London, 1964, pp. 189235. 3. Crossley, A.C. and Waterhouse, D.F.. 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