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ESTUDIO DEL MICROBIODETERIORO DEL
FONDO DOCUMENTAL ANSELMO PINEDA DE LA
BIBLIOTECA NACIONAL DE COLOMBIA
El biodeterioro, proceso conocido como el cambio indeseado en las propiedades de un material debido a la actividad
biológica de organismos vivos, es considerado una de las principales causas de pérdida de información de valor histórico
en archivos, museos y bibliotecas. Por ello, el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el biodeterioro causado
por hongos filamentosos en las unidades documentales pertenecientes al Fondo Anselmo Pineda custodiado por la
Biblioteca Nacional de Colombia. El total de unidades del Fondo (1145) fue clasificado en cuatro niveles de biodeterioro
según la intensidad y cobertura de los indicadores de crecimiento de microorganismos, a partir de los cuales se realizó el
aislamiento de hongos filamentosos y levaduras, siguiendo las técnicas de muestreo directo e indirecto en medios sólidos
PDA y DG18 para hongos xerófilos. Se obtuvo un total de 57 aislamientos incluyendo hongos filamentosos y levaduras que
fueron identificados mediante la observación de las características macroscópicas y microscópicas de las colonias. Los
géneros más frecuentes, aislados a partir de las unidades documentales, fueron Penicillium sp. y Aspergillus sp., seguidos
por Cladosporium sp., Paecilomyces sp., Trichoderma sp. y Rhodotorula sp, así como el aislamiento denominado NN
cuya identificación se hace necesaria. La mayoría de los géneros aislados son considerados agentes causales de foxing
y su capacidad de colonización de los soportes documentales fue confirmada mediante la evaluación en placa de las
actividades celulolítica, amilolítica y proteolítica, donde la mayoría de los aislamientos presentó actividad celulolítica, lo
que permitió hacer un acercamiento a la estrategia de colonización del papel de los hongos deteriorantes.
Los resultados del presente estudio contribuyeron al desarrollo de la base de datos de biodeterioro documental (indicadores
y agentes biológicos), así como a la construcción del cepario del laboratorio del Grupo de Conservación de la Biblioteca
Nacional de Colombia.
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INTRODUCCIÓN
Las bibliotecas y archivos de Colombia tienen como misión recuperar, custodiar y preservar el patrimonio
bibliográfico y hemerográfico en los diferentes soportes, así como el acceso de los colombianos a la
información insignia de la historia y de la cultura del país. De acuerdo con esta misión, las instituciones velan
porque las distintas unidades de carácter histórico estén conservadas de manera que no se pierdan sus
características originales y la información a pesar del paso del tiempo. Para tal fin, se han consolidado grupos
de conservación y restauración con tareas especificas enfocadas en la prevención y control del deterioro del
patrimonio documental.
El estudio del deterioro durante varios años fue abordado únicamente desde el punto de vista físico y químico,
pero el interés en el biodeterioro, proceso originado por la actividad de organismos vivos que tienen la
capacidad de crecer y colonizar los soportes documentales, ha adquirido un notable auge en los últimos años.
La Biblioteca Nacional de Colombia se ha interesado, en estudiar el biodeterioro de las unidades pertenecientes
a los distintos Fondos Documentales, centrando su interés actualmente en los Fondos Especiales (Fondo
Antiguo), en este caso, el Fondo Pineda, compuesto por unidades bibliográficas y hemerográficas que hacían
parte de la colección del coronel Anselmo Pineda, y esta bajo custodia de la Biblioteca Nacional desde 1852,
con nuevas donaciones en los años 1873 y 1874, y una final en 1978 por Leonor Pineda de Uribe. La mayor
parte del Fondo presenta biodeterioro, caracterizado por patrones de crecimiento de microorganismos en los
documentos, conocidos como indicadores de biodeterioro.
En este contexto el laboratorio del Grupo de Conservación ha desarrollado e implementado lineas de
investigación en torno al conocimiento de los agentes biológicos deteriorantes, su control y aplicaciones
biotecnologías de los microorganismos, como un nuevo campo de proyección para futuros trabajos de
investigación.
De acuerdo con lo anterior, el presente trabajo bajo la linea de investigación de biodeterioro evaluó el proceso
de deterioro causado por hongos en las unidades documentales del Fondo Anselmo Pineda, como una
aproximación al conocimiento de los agentes deteriorantes propios de la Biblioteca Nacional que permita
la implementación de programas de conservación preventiva para proteger el patrimonio bibliográfico
custodiado por la biblioteca, así como la posibilidad de ampliar las investigaciones que abordan el fenómeno
del biodeterioro y la exploración del potencial biotecnológico de los microorganismos aislados de nuestros
archivos y bibliotecas.
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2.JUSTIFICACIÓN Y
PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA
3. MARCO TEÓRICO
Y REFERENTES
CONCEPTUALES
El Fondo Anselmo Pineda custodiado por la
Biblioteca Nacional de Colombia, desde el año 1852,
está conformado por documentos especiales de alta
consulta y de gran diversidad en cuanto a la tipología,
soportes e información. Gran parte del material
que conforma el Fondo es de naturaleza orgánica,
que lo hace más sensible a sufrir alteraciones
de tipo físico, químico y biológico, siendo éstas
últimas las de mayor relevancia debido a la acción
de los microorganismos sobre el papel, que
ocasiona cambios indeseados en las propiedades
de los documentos. Este proceso conocido como
biodeterioro, originado en gran parte por hongos
filamentosos, es una de las principales causas de
pérdida parcial o total de información contenida en
documentos antiguos.
La Biblioteca Nacional de Colombia, ubicada en la
calle 24 N° 5 - 60 de la ciudad de Bogotá, cuenta
con una variedad de unidades bibliográficas de
importancia histórica y cultural para el país, y tiene
como misión recuperar, preservar y permitir el
acceso a la memoria que para el país representa
el patrimonio bibliográfico y hemerográfico. Así
mismo, tiene como objetivo la conservación del
material, estudiando y controlando agentes que
puedan causar su deterioro.
Debido a que un porcentaje considerable de las
unidades documentales del Fondo Anselmo Pineda
presenta indicadores de biodeterioro, y dados los
procesos técnicos de digitalización y conservación
de la documentación, se hace pertinente identificar
los agentes biológicos causales de dicho deterioro
con el fin de ofrecer alternativas de control,
garantizar procesos seguros al ambiente y al
funcionario y prevenir la pérdida de información de
valor histórico para nuestro país.
Los factores de deterioro pueden ser intrínsecos,
aquellos relacionados directamente con el material
del cual está hecho el documento, foto, libro, etc., o
extrínsecos, de origen ambiental, físicos, mecánicos,
químicos, humanos y biológicos. El deterioro
causado por agentes, biológicos, se denomina
biodeterioro, y puede ser causado por insectos y
otro tipo de invertebrados, o por microorganismos.
Dentro de estos microorganismos, se destacan los
hongos filamentosos (micromicetos), los cuales por
su alto grado de colonización (capacidad de utilizar
la matriz de la unidad como fuente nutricional)
y de producción de compuestos deteriorantes,
representan agentes notables de deterioro en
documentos y unidades custodiadas en bibliotecas,
archivos y museos (Zotti et al., 2008). El proceso de
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biodeterioro fúngico conlleva a la pérdida de las
propiedades estéticas de las unidades custodiadas,
definiéndose como unidad al elemento documental
que puede ser de tipo bibliográfico, hemerográfico,
fonográfico o audiovisual, hasta procesos de
degradación irreversibles.
Los hongos al establecerse en el papel generan
patrones de crecimiento ó manifestaciones visuales
propias en el soporte documental, conocidas como
indicadores de biodeterioro. Se caracterizan por su
forma, ubicación y color entre otros, siendo frecuente
manchas de bordes irregulares de color marrón,
marrón - rojizo o amarillento; y se denominan
“foxing” biótico (Montemartini et al., 2003). Este tipo
de deterioro se diferencia de procesos abióticos
como la oxidación de naturaleza química ó la
humedad, presentándose como patrones de formas
regulares. La capacidad deteriorante de hongos
como Penicillium sp., Aspergillus sp., Cladosporium
sp. y otros hongos mitospóricos, e incluso especies
de hongos xerófilos (sobreviven en baja actividad de
agua) en unidades documentales bajo condiciones
controladas de humedad relativa en los depósitos
donde son almacenadas, ha sido descrita por
autores como Florian y Manning (2000).
Entre los mecanismos utilizados por los hongos
para colonizar soportes como el papel se destacan
la producción de enzimas tales como celulasas,
amilasas y proteasas, y la producción de ácidos
orgánicos producto del metabolismo secundario,
que al ser excretados sobre el soporte generaran
manchas de diferentes tonalidades y modifican sus
propiedades químicas trayendo como consecuencia
el deterioro del soporte (Giraldo et al., 2009).
Es importante mencionar que la actividad de
diferentes especies de hongos y bacterias se ve
favorecida por factores como la humedad relativa,
las fluctuaciones de la temperatura, la luz, el
contenido de humedad del soporte, las propiedades
físicas de la superficie del objeto, el mecanismo de
adsorción-emisión de la humedad del material, el
pH, la presencia de polvo, el movimiento del aire
ambiental y su grado de penetración en el objeto,
así como también las concentraciones de oxígeno
en el lugar donde son almacenados los documentos
(Giraldo et al., 2009). Además, dicha actividad está
influenciada por la naturaleza de los nutrientes del
soporte por lo cual la capacidad de colonización de
los microorganismos dependerá en gran medida de
la composición de los soportes documentales (Zotti
et al., 2008).
Aunque existen diversos reportes en literatura sobre
los principales géneros de hongos filamentosos
causantes del deterioro de diversos soportes de
carácter histórico, es necesario evaluar e identificar
las poblaciones de hongos filamentosos implicadas
en la degradación y deterioro del material propio
de nuestras colecciones en el ámbito nacional,
como es el Fondo Documental Anselmo Pineda,
salvaguardado en la Biblioteca Nacional de
Colombia. El apoyo académico conjuntamente con
los funcionarios de la entidad, así como el estudio
presentado en este trabajo permitirá plantear
medidas de control eficientes que se ajusten a las
condiciones de la Biblioteca y a la materialidad de
las unidades documentales.
4.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar el microbiodeterioro causado por hongos
en las unidades bibliográficas del Fondo Documental
Anselmo Pineda, custodiado por la Biblioteca
Nacional de Colombia.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Clasificar las unidades documentales según el
nivel de microbiodeterioro, considerando el
diagnóstico preliminar presentado por el Grupo
de Conservación de la Biblioteca Nacional.
•
Aislar e identificar hongos a partir de los indicadores de deterioro biológico.
•
Construir la base de datos “indicadores de deterioro documental” de acuerdo con los patrones
más frecuentes de alteración.
•
Establecer el banco de cepas del Laboratorio de
Conservación de la Biblioteca Nacional, a partir
del material biológico aislado, considerando
metodologías normalizadas de conservación.
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•
Evaluar cualitativamente la capacidad degradadora de los microorganismos, valorando las
actividades enzimáticas celulolítica, amilolítica
y proteolítica de los hongos aislados e identificados, con el fin de relacionar esto con su capacidad colonizadora del papel.
5. METODOLOGÍA
5.1 Clasificación de las unidades documentales
del Fondo Anselmo Pineda por niveles de
biodeterioro.
5.1.1 Criterios de clasificación.
Se establecieron cuatro niveles de biodeterioro para
clasificar las unidades del Fondo, teniendo en cuenta
la intensidad y cobertura del deterioro por unidad
(libros, periódicos o manuscritos) (Tabla 1). Las 1145
unidades del Fondo fueron clasificadas, observando
folio a folio, encuadernación, hojas de guarda, lomo
y canto, entre otros.
Tabla 1. Niveles de biodeterioro según porcentaje
de la unidad afectada.
Nivel de biodeterioro
Porcentaje de unidad afectada (%)
Avanzado
51 al 100
Medio
26 al 50
Bajo
1 al 25
Incipiente
<1, hojas de guarda, encuadernación
o canto
5.1.2 Selección de la muestra.
Se seleccionó el tamaño de muestra con una
confianza del 95% y una precisión alrededor
del 5% arrojando un total de 123 unidades para
el muestreo con respecto al total de unidades
evaluadas. Se recurrió a un muestreo aleatorio
estratificado considerando los cuatro niveles de
biodeterioro establecidos. El número de unidades
muestreadas por nivel se calculó con base en una
fijación proporcional teniendo en cuenta el número
de unidades clasificadas por cada nivel.
El número de unidades estadísticamente representativas para el muestreo por nivel se calculó en dos
unidades para el nivel avanzado, ocho unidades
para el nivel medio, sesenta y dos unidades para el
nivel bajo y cincuenta y uno para el nivel incipiente. Sin embargo, teniendo en cuenta la posibilidad
de encontrar mayor cantidad y diversidad de aislamientos a partir del nivel avanzado de biodeterioro,
las unidades clasificadas en este nivel fueron muestreadas en su totalidad y el número de muestras del
nivel incipiente se redujo a veinticinco unidades,
considerando la escasa variedad de indicadores de
biodeterioro observados en este nivel, para un total
de 105 unidades muestreadas.
5.2 Caracterización de los
indicadores de biodeterioro.
Para cada una de las unidades documentales
seleccionadas como muestra se realizaron
observaciones y registro fotográfico de los
indicadores de biodeterioro bajo luz blanca y luz
ultravioleta 365 nm (Montemartini et al., 2003)
considerando la forma, color y ubicación en la
unidad documental (Florian y Manning, 2000) según
la nomenclatura que se muestra a continuación en
la figura 1.
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Fig. 1. Nomenclatura según forma, color y ubicación de los indicadores de biodeterioro en la unidad
documental.
5.3 Aislamiento de hongos filamentosos y levaduras
a partir de los indicadores de deterioro biológico.
•
Se seleccionaron los puntos de toma de muestra
según las observaciones de los indicadores de
biodeterioro. Se realizaron raspados asépticos del
indicador (Michaelsen et al., 2009), usando bisturí
con cuchilla No.3 e hisopos estériles y preservando
en todo momento la integridad de la unidad y la
técnica de registro.
Muestreo indirecto: raspado del indicador
e inoculación en 3mL de Caldo Sabouraud
(Anexo 1). Incubación a 28°C durante tres días.
Posterior a este tiempo, se sembró por superficie
0.1mL de cada réplica en agar PD y agar DG18,
suplementados con cloranfenicol (50mg/L)
(Anexo 1). Los medios sólidos fueron incubados
a 28°C durante 15 días.
•
Muestreo directo: raspado del indicador e
inoculación en tres puntos de la superficie del
agar PD y DG18 suplementados con cloranfenicol
(50mg/L). Los medios fueron incubados a 28°C
durante 15 días.
A partir de los raspados se siguieron dos técnicas de
muestreo:
•
Las dos técnicas de muestreo se realizaron por
triplicado para cada unidad.
5.3.1 Técnica de muestreo.
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5.3.2 Cultivo e identificación de
los microorganismos.
Luego del tiempo de incubación se purificaron
las colonias de hongos filamentosos y levaduras
obtenidas en los medios de cultivo PDA y DG18. Los
nuevos cultivos se llevaron a incubación a 28ºC por
7 días.
Para la identificación de los microorganismos
aislados, se tuvieron en cuenta las características
macroscópicas de las colonias como color del
anverso y reverso, textura y producción de pigmentos
difusibles al medio, así como las observaciones
microscópicas del micelio vegetativo y estructuras
reproductivas mediante de láminas realizadas
con tinción en azul de lactofenol para hongos
filamentosos y coloración de Gram para levaduras.
La identificación de los hongos filamentosos se
realizó hasta género usando las claves taxonómicas
de Barnett y Hunter (1998) y Samson (2000) y para
levaduras se utilizó el test bioquímico API 20C AUX
para su identificación hasta especie.
5.4 Conservación de los
microorganismos aislados.
5.4.1 Técnica de aislamiento
por dilución.
Con el fin de garantizar la pureza de las colonias
aisladas, se realizó la técnica de aislamiento por
dilución antes de efectuar las metodologías de
conservación. A partir de cultivos jóvenes (no
mayores a 8 días de incubación) de cada hongo
filamentoso aislado, se tomó una porción de agarmicelio de 5x5 mm del borde de la colonia y se
suspendió en 4,5 mL de solución salina al 0.85% (p/v)
estéril. Se realizó recuento en cámara de Neubauer
con el fin de establecer la concentración inicial de
conidios y a partir de ésta, se realizaron diluciones
en base 10, hasta obtener una concentración final
aproximada de 101 conidios/mL. A partir de las dos
últimas diluciones realizadas, se sembraron 0,1 mL
en superficie en agar PD o DG18 (según el medio de
crecimiento óptimo para cada hongo) por duplicado.
Se llevó a incubación a 28 ºC durante 3 a 5 días hasta
observar crecimiento de colonias aisladas. Se tomó
una de las colonias aisladas características del hongo
a conservar y se sembró por punción central en agar
PD ó DG18. Los cultivos fueron incubados a 28 ºC
por 5 a 7 días (Lim et al, 2002)
5.4.2 Conservación en papel
filtro.
A partir de las colonias puras obtenidas a través de
la técnica de aislamiento por dilución, se efectuó la
conservación en papel filtro Whatman Nº3.
Se realizó una suspensión de cada hongo filamentoso
aislado, colocando de 2 a 3 mL de solución salina al 0,85
% (p/v) en la caja de petri y realizando una remoción
de conidios. Se transfirió 2 mL, aproximadamente,
de la suspensión fúngica a la superficie de una
caja con agar PD ó DG18, a la cual previamente se
le colocaron discos de papel de filtro de 5 mm de
diámetro estériles ubicados equidistantemente en
la superficie del agar. La suspensión se homogenizó
uniformemente por toda la superficie de la caja
de petri y se llevó a incubar a 28 ºC hasta observar
crecimiento del hongo sobre los discos de papel
filtro. Los discos que presentaron crecimiento
fúngico fueron transferidos a una caja de Petri estéril
vacía para permitir que se secaran. Esto se mantuvo
debidamente sellado a temperatura ambiente
durante 7 días aproximadamente. Posteriormente,
los discos secados fueron depositados en un sobre
de papel mantequilla estéril, contenido a su vez, en
un sobre de papel estéril. Este último fue rotulado y
almacenado en una bolsa Ziploc® en refrigeración a
4 °C (Camacho y Gil, 2008)
5.4.3 Crioconservación en leche
descremada.
La conservación en leche se realizó para las cepas
de hongos que no tuvieron crecimiento en el
papel filtro, hongos considerados micelio estéril y
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levaduras. A partir de cultivos jóvenes se realizaron
cortes de discos de agar de 5 mm de diámetro que
fueron depositados en crioviales que contenían
1mL de solución de Skim Milk Difco® (Anexo 2) al 20
% p/v. Se conservaron dos copias por cada cepa y se
almacenaron a -20 °C (Ángel, 2006).
5.5 Evaluación de actividades
hidrolíticas en placa.
5.5.1 Inoculación
Se evaluaron las actividades celulolítica, amilolítica
y proteolítica para los microorganismos aislados
basados en la selección de morfotipos diferentes por
cada género de la siguiente manera: ocho morfotipos
de Penicillium sp., seis morfotipos de Aspergillus sp.,
tres morfotipos de hongos considerados Mycelia
sterilia, dos morfotipos de levaduras y un morfotipo
por género de Cladosporium, Paecilomyces,
Trichoderma y el hongo filamentoso denominado
NN. La clasificación por morfotipos se llevó a cabo,
basados en las características macroscópicas de las
colonias.
Se preparó un inóculo de 105 conidios/mL en
solución salina 0,85% /v de cada microorganismo. Los
medios utilizados fueron agar carboximetilcelulosa
1% p/v para la actividad celulolítica, agar almidón
1% p/v para la actividad amilolítica y agar Skim Milk
1% en el caso de la actividad proteolítica. Se siguió
la técnica de siembra en pozo en medios sólidos
inoculando 50μL de la suspensión de conidios por
triplicado (Cruz et al, 2010) (Anexo 1). Los medios
fueron incubados a 28 ºC durante 5 días.
Para el caso de los hongos considerados micelio
estéril, la inoculación se realizó por discos de agar de
5 mm de diámetro en el centro de los medios sólidos
y para los aislamientos de levaduras, se sumergió un
disco de papel filtro en una solución de 105 células/
mL y se colocó en el centro de los medios sólidos.
5.5.2 Lectura y medición de los
halos de hidrólisis
La lectura de los halos de hidrólisis se realizó para el
caso del agar carboximetilcelulosa 1% p/v mediante
revelado con el colorante rojo congo al 0.1% p/v
y para el agar almidón 1% p/v con lugol de Gram
(Anexo 3). La lectura del agar Skim Milk 1 % p/v se
hizo observando los halos a contraluz.
Las mediciones de los halos de hidrólisis se
realizaron en forma de asterisco, calculando el
tamaño de los halos mediante la fórmula A-B= C;
donde A hace referencia al diámetro de la colonia
más el halo de hidrólisis, B es el diámetro de la
colonia y C es el resultado de la diferencia de las
dos medidas y equivalente al halo de degradación
o de hidrólisis generado por actividad enzimática
del microorganismo. Los datos obtenidos fueron
promediados y se calcularon la desviación estándar
y el coeficiente de variación entre las medidas (Rojas
et al., 2009; Pedroza et al., 2001).
5.6 Evaluación de actividades
hidrolíticas en cultivo líquido.
Se realizó un ensayo para evaluar la capacidad
enzimática de una cepa de Trichoderma sp. aislada,
ya que que este hongo por su alta tasa de crecimiento
cubre en poco tiempo la superficie del medio sólido,
lo que no permite visualizar los halos de hidrólisis
generados. Para esto, se realizó la inducción de las
enzimas en medios de cultivo líquidos para las tres
actividades: caldo carboximetilcelulosa 1% p/v,
caldo almidón 1% p/v y caldo leche descremada
1% p/v (Anexo 1). Esto se realizó por triplicado para
cada caldo, teniendo en cuenta un volumen de 20
mL de caldo por réplica. Cada réplica fue inoculada
con 2 discos de un cultivo de 3 días de la cepa de
Trichoderma sp. crecida en PDA. Los caldos fueron
mantenidos en agitación a 120 rpm a temperatura
ambiente durante 5 días. Pasado el periodo de
incubación 10 mL de cultivo de cada réplica fueron
centrifugados dos veces a 4000 rpm durante 20 min
y se sembró un volumen de 50 μL del sobrenadante
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obtenido en pozos en los medios sólidos para
evaluación de halos de hidrólisis de cada actividad
y se llevó a incubación a 28 ºC. La lectura se realizó
a las 24 horas de la misma forma indicada en el
numeral 5.4.2.
F
5.7 Análisis estadístico
Los datos obtenidos se analizaron mediante
estadística descriptiva utilizando el cálculo de
porcentajes y gráficos de frecuencia.
Para el análisis de la actividad enzimática, se
calcularon promedios de los diámetros de halo
obtenidos en las mediciones realizadas para
cada actividad, así como desviación estándar y
coeficiente de variación para las réplicas realizadas
por morfotipo.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Clasificación del Fondo
Anselmo Pineda por niveles de
biodeterioro
Del total de 1145 unidades documentales que
componen el Fondo Anselmo Pineda de la
Biblioteca Nacional de Colombia, se encontraron
1065 unidades que presentaban indicadores de
biodeterioro, las cuales fueron clasificadas en los
cuatro niveles propuestos de la siguiente manera:
NIVEL DE BIODETERIORO
TOTAL DE UNIDADES
INCIPIENTE
445
BAJO
539
MEDIO
71
AVANZADO
10
La figura 2 muestra la clasificación del Fondo por
niveles de biodeterioro representada en porcentajes
con respecto al total de unidades evaluadas.
Figura 2. Clasificación del Fondo Anselmo Pineda
por niveles de biodeterioro.
Como se observa en la gráfica, la mayor parte de
las unidades documentales se encontró en el nivel
bajo de biodeterioro con un 48%, mientras que el
39% de las unidades clasificó en el nivel incipiente,
el 6% en nivel medio y sólo un 1% del Fondo fue
diagnosticado en nivel avanzado; por otra parte,
el 6% de las unidades documentales evaluadas no
presentó indicadores de biodeterioro.
Al observar el comportamiento de la temperatura
y la humedad relativa en el depósito del Fondo
Antiguo, lugar donde se encuentra el Fondo Pineda,
durante los años 2008 a 2011 se obtuvieron valores
promedio de HR del 51% y temperatura de 19.27
ºC. Teniendo en cuenta el rango sugerido para las
condiciones climáticas de archivos (Tº 16-20ºC y % HR
40-60%) (Montemartini et al., 2003) podría afirmarse
que las condiciones ambientales registradas en el
depósito del Fondo Antiguo, que se encuentran
dentro del rango sugerido, han permitido que la
mayor parte del Fondo se encuentre aún en los
niveles incipiente y bajo de biodeterioro debido
a que la actividad de diversas especies de hongos
y bacterias se encuentra condicionada por estos
factores, siendo importantes para la germinación
de los propágulos y colonización de los soportes
(Valentín, s.f ). Sin embargo, considerando que el
94% de las unidades del Fondo Anselmo Pineda
presentaban algún grado de biodeterioro y tan sólo
el 6% de las unidades no presentaron indicadores,
se debe contemplar el control y monitoreo estricto
de las condiciones ambientales del depósito, que
incluyan la humedad relativa, temperatura, luz
y material particulado, entre otros, ya que se ha
conservamos 12
observado que las oscilaciones de los parámetros
microclimáticos pueden favorecer el desarrollo de
las esporas fúngicas (Valentín, s.f ).
Otro de los factores que influye en el proceso
de deterioro causado por microorganismos es
la naturaleza de los nutrientes y las propiedades
físicas de los soportes documentales entre las que
se destaca la resistencia de la hoja (Valentín, s.f ),
existiendo una correlación entre la composición del
papel y la capacidad de acción de microorganismos
deteriorantes (Zotti et al., 2008). La figura 3 muestra
la materialidad de los soportes documentales que
componen el Fondo Anselmo Pineda, representado
en porcentajes con respecto al total de unidades
seleccionadas para el muestreo (105 unidades
documentales).
como aditivos, es posible observar diferencias en
los microorganismos implicados en el proceso de
biodeterioro, específicamente en la capacidad de
éstos para colonizar el papel y causar la degradación
del soporte.
La figura 4 expone los porcentajes de aislamientos
obtenidos con relación al tipo de papel de las
unidades documentales tomadas como muestra.
F
Figura 4. Porcentaje de aislamiento según tipo
de papel de las unidades muestreadas del Fondo
Anselmo Pineda.
Figura 3. Materialidad de los soportes documentales
que componen el Fondo Pineda.
El Fondo del coronel Pineda se caracteriza por la gran
variedad de documentos, que incluyen misceláneas
de cuadernos, libros, cuadernillos y periódicos con
fechas desde 1734 hasta 1939, por lo que se observa
también una variedad de soportes que incluyen
papel manual e industrial. Como se observa en la
figura 3, el 85% de las unidades del Fondo presentan
soportes en papel industrial, mientras que el 15%
están constituidas por papel manual.
Debido a las diferencias en la composición del
papel manual y el papel industrial, relacionadas con
la naturaleza y resistencia de las fibras, así como
con la presencia de otros compuestos utilizados
Se obtuvo el mayor porcentaje de aislamientos
de hongos filamentosos y levaduras a partir de
las unidades documentales con soporte en papel
industrial representado en un 73,68% de los
aislamientos totales, mientras que a partir de las
unidades en papel manual sólo se recuperó el 26,32%
de los aislamientos. Esto está relacionado con la
naturaleza de las fibras, es decir, los papeles hechos
antes de la Revolución Industrial (papel manual)
fueron elaborados a partir de fibras derivadas de
trapos de lino o algodón (Bringas, s.f ), que contienen
aproximadamente un 96% de celulosa, lo que los
hace de cierta forma de difícil degradación para los
microorganismos; además, su método tradicional de
elaboración que hacía que los papeles no tuvieran
dirección de fibra, le confería mayor resistencia con
relación al papel industrial (Asunción, 2004).
El papel industrial empieza a elaborarse a mediados
del siglo XIX en máquinas a partir de nuevas fuentes
de fibras como la madera (contenido de celulosa de
conservamos 13
40-50%, fibras cortas) (Asunción, 2004). Este tipo
de papel se caracteriza por ser ácido, decolorarse
y volverse quebradizo porque tiene ingredientes
ácidos como la lignina, elemento constitutivo de
la madera, y el alumbre, sal de aluminio añadida
durante la formación de la pulpa, que causan el
debilitamiento de estos papeles (Bringas, s.f ). Estas
diferencias en la materialidad de los soportes,
explican de cierta forma el mayor porcentaje de
hongos filamentosos recuperados a partir de papel
industrial, debido a que representa un sustrato de
fácil degradación comparado con el papel manual
y la cantidad de aditivos como abrillantadores
y encolantes que contiene, lo que lo hace más
bioreceptivo al ofrecer mayor cantidad de sustratos
para el crecimiento de los microorganismos.
6.2 Indicadores de deterioro
documental
Varios de los géneros aislados en el presente estudio,
han sido reportados como “agentes causales de
foxing” (Arai, 2000), principalmente Penicillium sp.
y Aspergillus sp. (Florian y Manning, 2000), este
es un fenómeno descrito como “modificaciones
en el papel que son visibles en forma de manchas
amarillas a marrón causadas por la actividad de los
microorganismos” (Montemartini et al, 2003). Dichas
manifestaciones conocidas como indicadores de
biodeterioro fueron caracterizadas en todas las
unidades del Fondo Anselmo Pineda que fueron
seleccionadas como muestra. La figura 5 expone
algunas fotografías de las unidades del Fondo que
presentaron indicadores de biodeterioro.
Como se observa en la figura 5, las manifestaciones
en los soportes producto de la actividad de los
microorganismos deteriorantes, se visualizan como
manchas irregulares con tonalidades de amarillo
a café que se distribuyen en diferentes lugares
del documento. Esto concuerda con los reportes
que explican el fenómeno de foxing causado por
hongos como la reacción entre la glucosa y los
oligosacáridos, producto de la degradación de
la celulosa, con los aminoácidos que sintetiza el
hongo para su crecimiento y el ácido aminobutírico
producto del metabolismo, en una reacción
de Maillard que genera sustancias melanoides
causantes de la pigmentación café en el papel (Arai,
2000).
Debido a que algunos autores afirman que el
foxing puede deberse a procesos abióticos como
la oxidación de metales o las tintas (Mesquita et
al., 2009), en la caracterización de los indicadores
de biodeterioro del Fondo Anselmo Pineda, se
incluyeron observaciones bajo luz ultravioleta (λ
365nm) como método para diferenciar el foxing o
manchas en el papel causado por factores bióticos
y el foxing causado por microorganismos. Los
resultados obtenidos se muestran a continuación
en la figura 6.
A.
B.
Figura 5. Indicadores de biodeterioro documental.
Figura 6. Observaciones de los indicadores
de deterioro. A) Observaciones bajo luz
blanca. B) Observaciones bajo luz UV 365
nm. – Fluorescencia verde: Foxing abióticoFluorescencia naranja: foxing biótico.
conservamos 14
Como se observa en las fotografías (figura 6) de los
indicadores expuestos a luz ultravioleta, existen
diferencias en la emisión de fluorescencia entre las
manchas en el papel producto de procesos abióticos
y las generadas por la acción de los microorganismos,
proceso conocido como foxing biótico. En general,
las manchas con formas circulares definidas
correspondieron a foxing abiótico y presentaron
fluorescencia verde azulado o no emitieron
fluorescencia al ser expuestas a la luz ultravioleta,
mientras que los indicadores con formas irregulares
presentaron fluorescencia de color naranja y
correspondían a foxing biótico. Estas observaciones
concuerdan con los reportes que indican que las
manchas coloreadas causadas por hongos en el
papel usualmente presentan fluorescencia amarilla
a naranja bajo luz ultravioleta, debido a la presencia
de aminoácidos aromáticos como tirosina, triptófano
y fenilalanina en las proteínas estructurales de los
hongos que responden a la excitación electrónica
y emiten fluorescencia (Florian y Manning, 2000;
Montemartini et al., 2003). Este método permite
discriminar las áreas del papel en las que es posible
encontrar material viable y por lo tanto aislar los
hongos filamentosos implicados en el proceso
de biodeterioro documental (Montemartini et al.,
2003.)
6.3 Aislamiento de hongos
filamentosos y levaduras a
partir de los indicadores de
deterioro biológico.
6.3.1 Microorganismos
recuperados según descripción
del indicador.
Se realizó una caracterización de los indicadores
de biodeterioro a partir de los cuales se obtuvo
crecimiento de hongos filamentosos y levaduras
deteriorantes con el fin de efectuar correlaciones
entre las manifestaciones visuales en los soportes y
los microorganismos implicados. La tabla 3 presenta
la caracterización de los indicadores de biodeterioro
más frecuentes, teniendo en cuenta la forma, color
y ubicación en la unidad documental, así como las
observaciones bajo luz ultravioleta y los géneros
aislados (Véase Anexo 4).
Unidad
documental
Descripción
indicador
Descripción
indicador Bajo
luz UV
Géneros aislados.
139
Mancha irregular
de color amarillo
ubicada hacia el
borde de la hoja.
Mancha
irregular, emite
fluorescencia
amarillo-naranja
Aspergillus sp.
273
Manchas irregulares
de aspecto punteado, color café.
Sobresalen en toda
la página.
Manchas
irregulares
de aspecto
punteado,
emiten
fluorescencia
naranja.
Cladosporium sp.
95
Manchas irregulares
pequeñas color
marrón, distribuidas
en el borde de la
página
Manchas
irregulares
pequeñas,
emiten
fluorescencia
naranja.
Penicillium sp.
1109
Mancha irregular
pequeña de
tonalidad rosa-café
ubicada en el centro
de la página. Se
observan indicios
de humedad.
Mancha irregular
pequeña, emite
fluorescencia
naranja.
Rhodotorula sp.
191
Manchas irregulares
color amarillo,
localizadas en el
centro y borde de
las páginas.
Manchas
irregulares
que emiten
fluorescencia
amarillo-naranja.
Mycelia sterilia
433
Manchas irregulares
de aspecto
homogéneo
punteado, color
marrón. Ubicadas
hacia el borde de la
página.
Manchas
irregulares
que emiten
fluorescencia
naranja
Paecilomyces sp.
996
Manchas cafés de
aspecto irregular
situadas en el borde
de la página. Se
observan indicios
de humedad.
Manchas
irregulares
que emiten
fluorescencia
naranja.
NN
855
Manchas irregulares
pequeñas color
marrón, ubicadas
hacia el interior de
las páginas.
Manchas irregulares pequeñas
que emiten
fluorescencia
naranja
Trichoderma sp.
Tabla 3. Caracterización de los indicadores de
biodeterioro.
conservamos 15
Como se observa en la tabla 3, cada género aislado
generaba manifestaciones características en el
papel, que variaban en cuanto a forma, color y
tamaño de las manchas producidas, lo que puede
estar relacionado con la capacidad de esporulación
y colonización del papel de cada hongo. Ejemplo
de ello, es el género Penicillium sp., caracterizado
en este estudio por la producción de manchas
irregulares pequeñas de gran distribución en bordes
de una misma página e incluso en páginas contiguas,
lo que puede ser indicativo de la capacidad de los
hongos pertenecientes a este género para crecer y
colonizar efectivamente el papel.
En cuanto a las ubicaciones de los indicadores
de biodeterioro registradas, se obtuvo un mayor
porcentaje de aislamiento de microorganismos a
partir de los indicadores localizados en el borde de
las páginas de las unidades documentales. La figura
7 expone los porcentajes de aislamientos obtenidos
con relación a la ubicación de los indicadores
de biodeterioro en las unidades documentales
tomadas como muestra.
de contaminación de las unidades documentales
ya que se considera que las colonias localizadas
en el borde corresponden a esporas o conidios de
hongos considerados contaminantes ambientales,
mientras que los encontrados en otras ubicaciones
pueden estar relacionados con la manipulación de
los documentos ó a una contaminación en el mismo
proceso de elaboración del papel (Florian y Manning,
2000).
Considerando el bajo porcentaje de recuperación
de microorganismos al interior de las unidades
documentales, podría pensarse en la posibilidad de
implementar metodologías para el aislamiento de
microorganismos anaerobios facultativos, capaces
de crecer en estos lugares con baja disponibilidad
de oxígeno.
6.3.2 Microorganismos
recuperados según técnica
de aislamiento y medios de
cultivo seleccionados.
En el aislamiento de los microorganismos, específicamente hongos filamentosos y levaduras, a partir
de las unidades seleccionadas de cada nivel, se evaluaron dos técnicas de muestreo (directo e indirecto)
y dos medios de cultivo (PDA y DG18 para hongos
xerófilos). Las figuras 8 y 9 muestran los resultados
obtenidos en cuanto a porcentaje de recuperación
de microorganismos para ambos casos.
Figura 7. Porcentaje de aislamientos según
ubicación de los indicadores de biodeterioro en las
unidades muestreadas del Fondo Anselmo Pineda.
El 74% de los aislamientos fueron obtenidos a
partir de indicadores de biodeterioro localizados
en el borde de las páginas, lo que puede estar
relacionado con las condiciones aerobias
de crecimiento de los hongos filamentosos
encontrados en el papel. Comparando con algunos
reportes, estos resultados pueden sugerir la forma
Figura 8. Porcentaje de recuperación Vs medio de
cultivo.
conservamos 16
Figura 9. Porcentaje de recuperación vs técnica de
muestreo.
En cuanto a los medios de cultivo evaluados para
el aislamiento de hongos filamentosos y levaduras
a partir de documentos con indicadores de
biodeterioro, el 67% de los hongos fue aislado en
PDA mientras que en agar DG18 se obtuvo el 33%
de los aislamientos totales. Aunque el porcentaje
de recuperación fue mayor en PDA, el agar DG18
reportado para el aislamiento de hongos xerófilos
(Hocking y Pitt, 1980; Piñar et al., 2009) definidos
como microorganismos capaces de sobrevivir en
condiciones de baja disponibilidad de agua (Zotti
et al., 2008) permitió la recuperación de especies de
Aspergillus sp. que exhibieron crecimiento óptimo
en este medio, incluyendo al aislamiento SDB170
que sólo presentó crecimiento en agar DG18 (Figura
10).
A
B
Figura 10. Aislamiento SDB170 A) Crecimiento en
agar DG18. B) Microscopía 40x.
Los hallazgos coinciden con los reportes sobre el
género Aspergillus y su telemorfo Eurotium como
hongos xerofílicos, cuya presencia ha sido estudiada
en el fenómeno del biodeterioro por su capacidad
de sobrevivir en sustratos con baja disponibilidad
de agua (Aw), lo que los convierte en frecuentes
contaminantes del papel (Florian y Manning,
2000). Por otro lado, como se observa en la figura
9, el porcentaje de recuperación siguiendo la
técnica de muestreo directo fue similar al obtenido
con la técnica de siembra en caldo y posterior
pase a medios sólidos ó muestreo indirecto, sin
embargo, el muestreo indirecto permitió la mayor
recuperación de levaduras implicadas en el proceso
de biodeterioro, por lo cual es recomendable
implementar los dos tipos de muestreo, así como los
dos medios de cultivo propuestos (PDA y DG18) en
el aislamiento de hongos filamentosos y levaduras
causantes de deterioro en soportes documentales.
6.3.3 Microorganismos aislados
Siguiendo la metodología planteada, se obtuvieron
57 aislamientos incluyendo hongos filamentosos y
levaduras pertenecientes a diversos géneros, cuya
frecuencia de aparición se muestra a continuación
en la tabla 4 y la figura 11.
Género
Aislamientos Frecuencia
(%)
Penicillium sp. 33
57,89
Aspergillus sp. 8
14,04
Cladosporium 3
5,26
sp.
Paecilomyces 2
3,51
sp.
Mycelia sterilia 5
8,77
Trichoderma
1
1,75
sp.
NN*
1
1,75
Rhodotorula
4
7,02
sp.
*NN: Aislamiento de hongo filamentoso que no ha sido identificado.
Tabla 4. Número de aislamientos obtenidos por
género.
conservamos 17
Fig 11. Frecuencia de aparición de los géneros con respecto al total de aislamientos obtenidos.
El 57,89% de los aislamientos pertenecen al
género Penicillium sp., seguidos por el 14,04%
del género Aspergillus sp., mientras que el 8,77%
fueron identificados como Mycelia sterilia al no
observar formación de propágulos luego de 30
días de incubación; el 7,02% de los aislamientos
correspondió a levaduras clasificadas en el género
Rhodotorula sp, el 5,26% pertenece al género
Cladosporium sp., el 3,51% de los aislamientos
totales fue identificado como Paecilomyces sp., y
el 1,75% correspondió al género Trichoderma sp.
Uno de los aislamientos que corresponde al 1,75%
del total de aislamientos obtenidos, no ha sido
identificado y para el presente estudio ha sido
denominado NN.
Los géneros aislados han sido ampliamente
reportados como hongos deteriorantes, capaces
de colonizar el papel y han sido encontrados
frecuentemente como parte de la Género
Aislamientos Frecuencia (%) Penicillium sp. 33
57,89 Aspergillus sp. 8 14,04 Cladosporium sp. 3
5,26 Paecilomyces sp. 2 3,51 Mycelia sterilia 5 8,77
Trichoderma sp. 1 1,75 NN* 1 1,75 Rhodotorula
sp. 4 7,02 micobiota presente en el suelo y el aire
(Zotti et al., 2008; Bueno et al., 2003; Sterflinger,
2010). La figura 12 muestra algunas fotografías de la
caracterización microscópica realizada a los géneros
aislados.
A
B
C
D
Figura 12. Observaciones microscópicas de algunos
de los géneros aislados 40x A) Penicillium sp. B)
Aspergillus sp. C) NN. D) Rhodotorula sp.
conservamos 18
A continuación se muestran los resultados obtenidos en cuanto a la frecuencia de aparición de los géneros
aislados a partir de las unidades documentales clasificadas en cada nivel de biodeterioro (Figuras 13 - 16).
Figura 13. Frecuencia de géneros aislados a partir
de las unidades clasificadas en el nivel incipiente de
biodeterioro.
Figura 16. Frecuencia de géneros aislados a partir
de las unidades clasificadas en el nivel avanzado de
biodeterioro.
Como se muestra en las figuras 13 a 16, el género
Penicillium sp. presenta la mayor frecuencia de
aparición y se encuentra en todos los niveles de
biodeterioro evaluados, lo que coincide con los
reportes que describen a Penicillium sp. como uno
de los géneros más prolíficos y ubicuos de hongos
(Villalba et al, 2004), siendo capaz de sobrevivir y
desarrollarse en diferentes ambientes (Montemartini
et al., 2003).
Figura 14. Frecuencia de géneros aislados a
partir de las unidades clasificadas en el nivel bajo
biodeterioro.
Figura 15. Frecuencia de géneros aislados a partir
de las unidades clasificadas en el nivel medio de
biodeterioro.
El género Aspergillus sp. también fue aislado a partir
de unidades documentales clasificadas en todos los
niveles de biodeterioro, lo que está relacionado con
los reportes que señalan la tendencia de este género
a la xerofilia, lo que lo hace capaz de crecer y causar
deterioro en diferentes soportes documentales
(Zotti et al., 2008). Al parecer, estos dos géneros
son los responsables de iniciar el proceso de
biodeterioro, lo que se confirma con su presencia
en las unidades del Fondo Pineda que fueron
diagnosticadas con deterioro incipiente, esto gracias
al gran potencial de sus enzimas que participan en
la descomposición de materiales orgánicos como el
papel, la madera y textiles, entre otros (Villalba et al.
2004). Los demás géneros aislados aparecen a partir
de unidades documentales clasificadas en niveles
de biodeterioro superiores, lo que puede estar
indicando que el daño del material documental
es el resultado de una sucesión ecológica de
microorganismos que en conjunto potencializan el
deterioro de la documentación (Villalba et al., 2004).
conservamos 19
Es importante destacar la presencia de los hongos
identificados como Mycelia sterilia en tres de
los cuatro niveles de biodeterioro evaluados, ya
que a pesar de estar reportados como hongos
contaminantes ambientales en depósitos, archivos
y bibliotecas (Bueno et al, 2003), están involucrados
además en el deterioro de los documentos,
por acción de sus enzimas que participan en la
degradación de los componentes del soporte y
en algunos casos por la producción de pigmentos
(Gorbushina y Petersen, 2000), como los observados
en los aislamientos codificados como SPM 273
y SDM 273 cuya caracterización macroscópica y
microscópica se muestra en la figura 17.
A
B
Figura 17. A). Características macroscópicas del
aislamiento SPM 273 en PDA. B). Observación
microscópica 40x. Mycelia sterilia.
Así mismo, cabe resaltar la presencia de levaduras
como agentes activos en el proceso de biodeterioro,
específicamente levaduras del género Rhodotorula
sp. que fueron aisladas con mayor frecuencia a partir
de las unidades documentales del Fondo Pineda
clasificadas en el nivel avanzado de biodeterioro, lo
que coincide con los reportes sobre la participación
de este género en el deterioro de diferentes soportes
causando manchas de diversas tonalidades (Borrego
et al., 2010). Adicionalmente, el género Rhodotorula
ha sido estudiado por estar asociado principalmente
a la piel (Miceli et al., 2011), por lo que su aislamiento
puede estar indicando inadecuada manipulación de
los documentos del Fondo.
Los aislamientos SPA 1109 y PB RM168 fueron
identificados bioquímicamente (API 20C AUX) como
Rhodotorula mucilaginosa caracterizada por la
coloración rojo salmón de sus colonias y su textura
rugosa, tal como se observa en la figura 18.
A
B
Figura 18. A) Características macroscópicas del
aislamiento SPA 1109 en PDA. B) Observaciones
microscópicas. Coloración de Gram.
R. mucilaginosa ha sido aislada de muestras clínicas
y en algunos casos se ha considerado un patógeno
emergente dado que puede causar infecciones en
huéspedes inmunocomprometidos (Libkind, 2007),
por lo que su hallazgo en las unidades documentales
del Fondo Pineda cobra mayor importancia, al
ser éste el primer reporte de aislamiento de R.
mucilaginosa en documentos de las bibliotecas, que
son altamente consultados.
6.4 Evaluación de la
capacidad enzimática de los
microorganismos aislados
Se evaluó la acción hidrolítica de los
microorganismos aislados a partir de las unidades
del Fondo Anselmo Pineda, teniendo en cuenta que
ésta capacidad constituye un factor determinante
en el proceso de biodeterioro de la documentación
(Villalba et al. 2004). Dado que el papel está
compuesto principalmente por fibras celulósicas
y aditivos funcionales como encolantes, cargas,
abrillantadores ópticos y agentes consolidantes
(Alarcón, s.f ), la degradación de los soportes
documentales involucra no sólo la degradación de
la celulosa, sino también de otros compuestos como
pastas de almidón o colas animales (alto contenido
de proteínas) utilizadas para dar impermeabilidad al
papel, dar solidez a la hoja y prevenir el corrimiento
de las tintas utilizadas en la escritura (Asunción,
2004); es así como en el proceso de biodeterioro,
intervienen gran variedad de exoenzimas producidas
por los hongos filamentosos (celulasas, amilasas,
proteasas) que les confieren capacidad de degradar
los diferentes componentes de los soportes y de
conservamos 20
esta manera obtener fuentes nutricionales para su
crecimiento (Villalba et al., 2004).
Los resultados obtenidos en la determinación
cualitativa de actividades hidrolíticas en placa para
23 morfotipos y las tres actividades evaluadas se
muestra a continuación en la figura 19.
7 (M7P) presentó la mayor actividad amilolítica,
generando halos de hidrólisis de 9,08 mm. En cuanto
a la actividad proteolítica, se destacaron el género
Cladosporium sp. generando halos de degradación
de 9,42 mm y el morfotipo 1 de los hongos
considerados Mycelia sterilia (M1E) al presentar
halos de hidrólisis de 9,17 mm en promedio.
La figura 20 muestra los resultados de la evaluación
en placa para los morfotipos destacados.
A
Figura 19. Halos de hidrólisis (mm) generados
en los medios de evaluación para cada actividad
enzimática. MP: Morfotipos Penicillium sp; MA:
Morfotipos Aspergillus sp; ME: Morfotipos Mycelia
sterilia; C: Cladosporium sp; T: Trichoderma sp; P:
Paecilomyces sp; ML: Morfotipos levaduras; NN:
Hongo sin identificar. * No morfotipos 2 y 3 de
Aspergillus sp.
La figura 19 expone los resultados de las mediciones
de los halos de hidrólisis obtenidos en la evaluación
en placa de las tres actividades hidrolíticas en
los medios agar carboximetilcelulosa (CMC) 1%
(actividad celulolítica), agar almidón 1% (actividad
amilolítica) y agar skim milk 1% (actividad
proteolítica) para 21 de los 23 morfotipos
clasificados, debido a que dos de ellos (M2A y
M3A), pertenecientes al género Aspergillus sp., no
presentaron crecimiento en dichos medios, lo que
concuerda con la naturaleza xerofílica descrita para
estos aislamientos y considerando que los medios
utilizados para la evaluación no presentaban
actividad de agua reducida como en el caso del agar
DG18 (Aw 0,95) (Hocking y Pitt, 1980).
En general, el morfotipo 5 de Penicillium sp. (M5P)
presentó los mayores halos de hidrólisis en agar
celulosa (17,08 mm), mientras que el morfotipo
B
C
Figura 20. Evaluación de actividades hidrolíticas
en placa. Lectura día 5. A. M5P en agar
carboximetilcelulosa. B. M7P en agar almidón. C.
Cladosporium sp en agar skim milk.
conservamos 21
Los resultados obtenidos confirman la capacidad
de los hongos filamentosos aislados a partir de las
unidades del Fondo Anselmo Pineda para colonizar
los soportes documentales aprovechando su
potencial enzimático para degradar los diferentes
sustratos presentes en el papel y obtener
monómeros que pueden ser utilizados en la
obtención de energía y crecimiento en los soportes,
lo que finalmente lleva al deterioro del material
documental, por varios mecanismos que incluyen
el debilitamiento del soporte al ser hidrolizada la
celulosa, componente fundamental del papel, y
la formación de manchas o foxing producto del
crecimiento de los hongos filamentosos en el papel,
así como por la generación de ácidos producto de
su metabolismo (Bringas, s.f; Valentin, s.f ).
Por otra parte, los morfotipos de levaduras aisladas
(M1L y M2L), pertenecientes al género Rhodotorula
sp., no presentaron ninguna de las tres actividades
hidrolíticas evaluadas. Debido a que no existen
reportes donde se presente al género Rhodotorula
y en general a las levaduras como destacadas
degradadoras de polímeros, podría considerarse
que su mecanismo de obtención de fuentes
nutricionales y crecimiento en el papel incluye la
utilización de monómeros liberados por la acción
enzimática de otros microorganismos como los
hongos filamentosos, como parte de una serie de
relaciones ecológicas. Las figuras 21 a 24 muestran
el comportamiento de las actividades hidrolíticas de
los morfotipos aislados por género.
Figura 21. Halos de hidrólisis (mm) generados en
los medios de evaluación para cada actividad.
Morfotipos Penicillium sp.
Figura 22. Halos de hidrólisis (mm) generados en
los medios de evaluación para cada actividad.
Morfotipos Aspergillus sp.
Los resultados obtenidos para Penicillium sp. y
Aspergillus sp. muestran el potencial enzimático
de estos géneros, al presentar actividad celulolítica,
amilolítica y proteolítica, lo que les permite empezar
el proceso de colonización del papel, degradando
todos los sustratos presentes en él. Dicha capacidad
puede relacionarse con los resultados expuestos
anteriormente en la figura 13, donde se encontró
la presencia de estos dos géneros en las unidades
documentales clasificadas en el nivel incipiente de
biodeterioro como indicio de su participación en las
primeras etapas del proceso.
Los resultados obtenidos para los demás géneros
aislados se muestran a continuación.
Figura 23. Halos de hidrólisis (mm) generados en
los medios de evaluación para cada actividad.
Morfotipos de Mycelia sterilia.
conservamos 22
Los resultados muestran que el 85,7% de
los morfotipos evaluados presentó actividad
celulolítica, mientras que el 42,86% de los morfotipos
fueron amilolíticos y el 47,62% proteolíticos. La
alta incidencia de morfotipos celulolíticos está
justificada con el tipo de sustrato de donde fueron
aislados (Montemartini et al, 2003) considerando
que el componente principal del papel son las fibras
celulósicas. Las actividades amilolíticas y proteolíticas
aparecen como actividades complementarias que
permiten la degradación de otros componentes
minoritarios de los soportes documentales.
Figura 24. Halos de hidrólisis (mm) generados en
los medios de evaluación para cada actividad. C:
Cladosporium sp; T: Trichoderma sp; P: Paecilomyces
sp; NN: Hongo sin identificar.
Como se observa en las figuras 23 y 24, los morfotipos
de los hongos considerados Mycelia sterilia y los
pertenecientes a los géneros Cladosporium sp.,
Trichoderma sp., Paecilomyces sp. y el denominado
NN, solamente presentaron actividad celulolítica y
proteolítica. Notablemente la actividad proteolítica
de estos géneros es mayor que la presentada por
los géneros Penicillium sp. y Aspergillus sp, lo que
les permite la degradación de polímeros complejos
como las proteínas presentes en las colas animales
empleadas en el proceso de impermeabilización del
papel (Asunción, 2004) y de sustancias utilizadas
como aglutinantes, entre ellas, la gelatina (Alarcón,
s.f ). Este hecho podría relacionarse con su presencia
en las unidades documentales clasificadas en los
niveles superiores de biodeterioro (figuras 14 - 16)
Finalmente, la figura 25 muestra el consolidado
de las actividades hidrolíticas representado en
porcentaje de morfotipos para cada actividad con
respecto al total de morfotipos evaluados.
Figura 25. Porcentaje de morfotipos para cada
actividad hidrolítica.
Los hallazgos realizados en el presente estudio,
permiten conocer la variedad de géneros de hongos
filamentosos y levaduras implicados en el proceso
de biodeterioro del patrimonio bibliográfico de la
Biblioteca Nacional de Colombia, como primer paso
para la generación de propuestas y búsqueda de
nuevas alternativas útiles en el control del deterioro
causado por microorganismos. La gran capacidad
enzimática exhibida por los microorganismos
aislados a partir de las unidades del Fondo Pineda,
abre el panorama en investigación sobre deterioro
de otros soportes, ya que si bien, el papel ha sido
el soporte documental utilizado por excelencia, es
necesario el estudio del biodeterioro de nuevos
soportes utilizados por las tecnologías digitales
del siglo XXI , así como el estudio del potencial
enzimático de especies microbianas de ambientes
poco estudiados como lo son las bibliotecas y
archivos de la nación (Mikan y Castellanos., 2004),
aplicable en diversas tecnologías y procesos
biotecnológicos.
7. CONCLUSIONES
Las técnicas de muestreo directo e indirecto,
utilizando los medios de cultivo PDA y DG18
permitieron el aislamiento de gran diversidad de
microorganismos implicados en el deterioro de los
soportes documentales, resaltando el aislamiento
de hongos xerófilos en agar DG18. Así mismo, la
previa exposición de los indicadores de biodeterioro
bajo luz ultravioleta, permitió maximizar los
recursos utilizados en el muestreo, al revelar las
zonas en el papel a partir de las cuales es posible
aislar microorganismos.
conservamos 23
Se obtuvieron 57 aislamientos de hongos
filamentosos y levaduras a partir de las unidades
del Fondo documental Anselmo Pineda, siendo
los géneros de mayor frecuencia Penicillium sp
y Aspergillus sp., seguidos por Cladosporium sp,
Paecilomyces sp., Trichoderma sp. y Rhodotorula
sp., así como el aislamiento denominado NN cuya
identificación se hace necesaria.
control del crecimiento de estos microorganismos,
siendo
necesario
implementar
programas
complementarios de limpieza locativa, limpieza
documental y saneamiento ambiental preventivo,
entre otros.
El 85,7% de los aislamientos mostró actividad
celulolítica, el 42,86% actividad amilolítica y el
47,62% proteolítica, lo que confirma la capacidad
de los hongos filamentosos encontrados en las
unidades del Fondo Pineda para colonizar y degradar
los soportes causando el deterioro del material
bibliográfico. Específicamente, llama la atención la
actividad proteolítica exhibida por algunos de los
aislamientos como Cladosporium sp. y Mycelia sterilia
ya que muchas de las unidades documentales de
otros Fondos encontrados en el depósito del Fondo
Antiguo presentan encuadernaciones en pergamino,
y al ser estos hongos considerados contaminantes
ambientales, podrían estar implicados en el deterioro
de dichos Fondos que no han sido estudiados.
•
Constituido el cepario del laboratorio, es
necesario establecer protocolos de evaluación de
viabilidad de los microorganismos conservados
en el laboratorio de la Biblioteca Nacional de
Colombia.
•
Desarrollo de proyectos conjuntos con otras
instituciones a nivel académico con el fin de realizar
la identificación mediante de herramientas
moleculares de los microorganismos aislados y
conservados para fines investigativos.
•
Incluir el aislamiento de otros microorganismos
como bacterias, teniendo en cuenta que el
proceso de biodeterioro obedece a un conjunto
de sucesiones ecológicas de las que las bacterias
forman parte.
•
Evaluar las actividades hidrolíticas para los
microorganismos aislados en el presente estudio
cuantitativamente.
•
Teniendo en cuenta los microorganismos aislados, en especial las levaduras pertenecientes al
género Rhodotorula sp., se recomienda implementar la manipulación de los documentos con
guantes por parte de los usuarios y trabajadores
de la Biblioteca, con el fin de evitar la contaminación.
•
Teniendo conocimiento de los agentes deteriorantes propios de la Biblioteca, se recomienda
implementar estudios de efectividad de los productos de control utilizados, así como la rotación
de los mismos para los programas de limpieza y
saneamiento de las unidades documentales.
Se encontraron coincidencias entre el indicador de
biodeterioro en cuanto a forma, color y ubicación
en el papel y el microorganismo aislado, teniendo
cada uno de los géneros aislados su manifestación
propia en los soportes documentales. La aparición
de estos “patrones”, permite tener una aproximación
al microorganismo implicado en el deterioro antes
de realizar procesos de saneamiento.
La mayor recuperación de microorganismos se
obtuvo a partir de indicadores de biodeterioro
localizados en el borde de las páginas, lo que sugiere
que la forma de contaminación de las unidades
del Fondo Anselmo Pineda, está relacionada con
el material particulado generado constantemente
en el depósito, que contiene esporas o conidios de
microorganismos capaces de llegar a las unidades
documentales expuestas en las estanterías.
Por último, se resalta la presencia de hongos
xerófilos por su capacidad de crecer incluso en
condiciones de humedad relativa que se encuentran
dentro del rango sugerido para ambientes en
archivos y bibliotecas, como indicativo de que el
control de éste parámetro no constituye garantía de
8. RECOMENDACIONES
Ada Luz Manrique Hernández1
María Camila Patiño Ramírez1 Sandra Angulo2 Luz Stella Villalba Corredor2
María Ximena Rodríguez Bocanegra1 /
1
Facultad de Ciencias
Microbiología Industrial/
Pontificia Universidad Javeriana
2
Laboratorio Grupo de Conservación/Biblioteca Nacional de Colombia
conservamos 24
BIBLIOGRAFIA
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conservamos 26
ANEXOS
ANEXO 1: MEDIOS DE CULTIVO.
1. Caldo Sabouraud:
Componentes:
•
•
Peptona: 10 g/L.
Glucosa: 5 g/L.
Preparación:
Disolver tanto la peptona como la glucosa en la cantidad de agua destilada medida. Calentar hasta que se
observe una solución homogénea. Ajustar el pH a 5.7 con HCl 1 N. Servir 3 mL del caldo en cada tubo 16 x 100
mm a usar y esterilizar estos tubos en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
2. Agar PDA suplementado con cloranfenicol:
Componentes:
•
•
Agar comercial PDA (papa – dextrosa agar) Merck®: 39 g/L.
Cloranfenicol: 50 mg/L.
Preparación:
Disolver los gramos de agar PDA en un litro de agua destilada. Añadir también los miligramos de cloranfenicol.
Agitar constantemente y calentar hasta alcanzar el punto de ebullición. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15
minutos. Servir en las cajas de Petri y dejar en reposo hasta que se gelifique.
3. Agar DG18 para xerófilos modificado suplementado con cloranfenicol:
Componentes:
•
•
•
•
•
•
•
•
Peptona: 5 g/L.
Glucosa: 10 g/L.
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4): 1 g/L.
MgSO4: 0.5 g/L.
Agar – agar: 15 g/L.
Cloranfenicol: 50 mg/L.
Solución al 0,2 % p/v de diclorán en etanol al 96%: 1 mL/L.
Glicerol: 175 mL/L.
Preparación:
Preparar una solución stock de diclorán al 0.2 % p/v suspendiendo 0.2 g en 100 mL de etanol al 96 % v/v grado
analítico. Agitar bien hasta disolver completamente. Realizar este procedimiento en cabina de extracción de
gases. Cubrir con papel aluminio para evitar daño por entrada de luz. Aparte, disolver todos los componentes
descritos anteriormente, excepto la solución de diclorán preparada, el cloranfenicol y el glicerol, en 800 mL de
conservamos 27
agua destilada. Agitar bien y calentar suavemente hasta disolver completamente. Adicionar el mililitro de la
solución de diclorán, los miligramos de cloranfenicol y el volumen de glicerol indicados en los componentes
y llenar con agua destilada hasta alcanzar el litro. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos, servir en las
cajas de Petri y dejar gelificar.
4. Agar carboximetilcelulosa 1% p/v:
Componentes:
•
•
•
•
•
•
Carboximetilcelulosa sódica de baja densidad Sigma®: 10 g/L.
Cloruro de amonio (NH4Cl): 1 g/L.
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4): 1 g/L.
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2*2H2O): 0.4 g/L.
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4*7H2O): 0.1 g/L.
Agar-agar: 15 g/L.
Preparación:
Pesar la cantidad de todas las sales y suspender en el litro de agua destilada. Calentar suavemente para lograr
la disolución completa. Aparte, pesar los gramos de agar- agar y de carboximetilcelulosa. En una licuadora,
añadir la solución de sales preparada y adicionar los gramos de agar - agar y carboximetilcelulosa pesados
simultáneamente. Licuar durante 5 a 10 minutos hasta lograr una mezcla homogénea. Ajustar el pH de la
solución obtenida a 6.5 - 7.0 con HCl 1 N. esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Servir en las
cajas de Petri y esperar la gelificación.
5. Agar almidón 1% p/v:
Componentes:
•
•
•
•
Almidón hidrosoluble: 10 g/L.
Extracto de levadura: 3 g/L.
Cloranfenicol: 50 mg/L.
Agar – agar: 12 g/L.
Preparación:
Disolver todos los componentes en agua destilada, calentar suavemente hasta observar la disolución completa.
Ajustar el pH a 6.5 – 7.0 con HCl 1 N o NaOH 1 N según sea el caso. Esterilizar en autoclave por medio ciclo (7
P.S.I x 7 min), servir en las cajas de Petri y dejar gelificar.
6. Agar leche (Skim Milk) 1 % p/v:
Componentes:
•
•
•
•
•
•
•
Skim Milk: 10 g/L.
Sulfato de amonio (NH4SO4): 0.5 g/L.
Cloruro de calico dihidratado (CaCl2 * H2O): 0.5 g/L.
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4): 0.1 g/L.
Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4): 0.1 g/L.
Cloranfenicol: 50 mg/L.
Agar – agar: 15 g/L.
conservamos 28
Preparación:
Disolver todos los componentes excepto el agar - agar en un litro de agua destilada, agitando bien. Ajustar el
pH a 7.0 con NaOH 1 N. agregar el agar – agar y calentar suavemente hasta observar disolución. Esterilizar en
autoclave a medio ciclo (7 P.S.I x 7 min), servir en las cajas de Petri y dejar solidificar.
7. Caldos para inducción de actividad enzimática: los caldos mencionados en el numeral 5.7, caldo
carboximetilcelulosa 1 %p/v, caldo almidón 1 % p/v y caldo leche descremada 1 % p/v, tienen la misma
preparación indicada para los agares respectivos; sin embargo no se agraga agar.
ANEXO 2: SOLUCIONES:
1. Solución salina 0.85 % p/v:
Componentes:
•
Cloruro de sodio (NaCl): 8.5 g/L.
Preparación:
Disolver el cloruro de sodio en un litro de agua destilada, agitando bien. En el caso de usar la solución salina
en tubos, añadir la cantidad deseada en cada tubo y esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min.
2. Skim Milk, protector para conservación:
Componentes:
•
Skim milk Difco®: 20 g/L.
Preparación:
Disolver los gramos de Skim Milk en un litro de agua destilada. Agitar vigorosamente hasta observar una
mezcla homogénea. Calentar suavemente si es necesario para observar la disolución completa. Esterilizar en
autoclave a medio ciclo ( P.S.I x 7 min).
ANEXO 3: REACTIVOS
1. Rojo congo 0.1 % p/v:
Componentes:
•
Rojo congo en polvo: 1 g/L.
Preparación:
Disolver el gramo de rojo congo en 1 L de agua destilada, en un frasco ambar para proteger al colorante de la
luz. Agitar y rotular bien.
conservamos 29
ANEXO 4: Base de datos indicadores de deterioro biológico
Unidad
Descripción macroscópica
Descripción
microscópica
Identificación
SDB19 (1) Colonia verde,
reverso crema. Textura
aterciopelada. Pigmento
difusible amarillo.
Hifas hialinas
septadas,
conidióforos,
fialides, conidios
catenulados.
Penicillium sp
RM 168
SPB RM 168 (2) Colonia rosado
pálido. Reverso crema. Textura
aterciopelada. No pigmento
difusible al medio.
Hifas hialinas
septadas.
Conidióforos,
fialides largas,
conidios en
sucesión
basipétala.
Paecilomyces
sp.
802
SPB 802 (2) Colonias color
salmón pequeñas borde
regular, no pigmento difusible
Células
levaduriformes
Rhodotorula sp.
44
DB44(2) Colonia verde oliva.
Reverso crema. Textura
aterciopelada No pigmento
difusible.
Hifas dematiáceas,
septadas, célula
conidiógena en
escudete, conidios
en forma de barril.
Cladosporium
sp
191
PB 191(2) Colonia blanca.
Reverso crema. Textura
algodonosa. No pigmento
difusible.
Hifas hialinas
septadas.
19
Indicador y ubicación
Registro fotográfico indicador
Mycelia sterilia
conservamos 30
996
NN
SPB 996 (1) Colonia café
verdosa. Reverso café. Textura
correosa. No pigmento
difusible
1109
SPA1109 (3) colonias color
salmón, tipo cerebroide, no
pigmento.
Células levaduriformes
273
SPM 273(1) Colonia café claro,
textura correosa, no pigmento
difusible
Hifas hialinas,
septada
Mycelia sterilia
SDM 170 Colonia amarillonaranja, verde con el tiempo.
Textura aldogonosa. Pigmento
difusible al medio café con el
tiempo.
Hifas hialinas
septadas,
conidióforos
en vesícula,
fiálides y conidios
catenulados.
Aspergillus sp
170
Rhodotorula
mucilaginosa
conservamos 31
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Niveles de biodeterioro según porcentaje de unidad documental afectada.
Tabla 2. Clasificación de las unidades del Fondo Anselmo Pineda por niveles de biodeterioro.
Tabla 3. Caracterización de los indicadores de biodeterioro.
Tabla 4. Frecuencia de géneros aislados.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Nomenclatura según forma, color y ubicación de los indicadores de biodeterioro en la unidad
documental.
Figura 2. Clasificación del Fondo Pineda por niveles de biodeterioro.
Figura 3. Materialidad de los soportes documentales que componen el Fondo Pineda.
Figura 4. Porcentaje de aislamiento según tipo de papel de las unidades muestreadas.
Figura 5. Indicadores de deterioro documental.
Figura 6. Observaciones de los indicadores de deterioro bajo luz blanca y luz ultravioleta.
Figura 7. Porcentaje de aislamientos según ubicación de los indicadores de biodeterioro
Figura 8. Porcentaje de recuperación de microorganismos según medio de cultivo.
Figura 9. Porcentaje de recuperación de microorganismos según técnica de muestreo.
Figura 10. Características macroscópicas y microscópicas del aislamiento SDB170.
Figura 11. Frecuencia de aparición de los géneros aislados.
Figura 12. Observaciones microscópicas de los géneros aislados.
Figura 13. Frecuencia de géneros aislados a partir de las unidades clasificadas en el nivel incipiente de
biodeterioro.
Figura 14. Frecuencia de géneros aislados a partir de las unidades clasificadas en el nivel bajo de biodeterioro.
Figura 15. Frecuencia de géneros aislados a partir de las unidades clasificadas en el nivel medio de biodeterioro.
Figura 16. Frecuencia de géneros aislados a partir de las unidades clasificadas en el nivel avanzado de
biodeterioro.
Figura 17. Características macroscópicas y microscópicas del aislamiento SPM 273.
Figura 18. Características macroscópicas y microscópicas del aislamiento SPA 1109.
Figura 19. Evaluación de actividades hidrolíticas en placa para los 23 morfotipos clasificados.
Figura 20. Actividades hidrolíticas en placa de los morfotipos destacados.
Figura 21. Actividades hidrolíticas para Penicillium sp.
Figura 22. Actividades hidrolíticas para Aspergillus sp.
Figura 23. Actividades hidrolíticas para hongos considerados Mycelia sterilia.
Figura 24. Actividades hidrolíticas para otros géneros.
Figura 25. Porcentaje de morfotipos para cada actividad hidrolítica evaluada.
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Medios de cultivo.
Anexo 2. Soluciones.
Anexo 3. Reactivos.