Evaluación del nivel de daño en el material genético de niños de la

Artículo original
Arch Argent Pediatr 2015;113(2):126-132 / 126
Evaluación del nivel de daño en el material
genético de niños de la provincia de Córdoba
expuestos a plaguicidas
Assessment of the level of damage to the genetic material of
children exposed to pesticides in the province of Córdoba
Lic. Natalí Bernardia, Lic. Natalia Gentilea, Dr. Fernando Mañasa,
Méd. Álvaro Méndeza, Dra. Nora Gorlaa y Dra. Delia Aiassaa
a. Grupo de
investigación
GeMA - Genética
y Mutagénesis
Ambiental.
Departamento de
Ciencias Naturales.
Universidad
Nacional de Río
Cuarto.
Correspondencia:
Dra. Delia Aiassa:
daiassa@exa.unrc.edu.ar;
delia.aiassa@gmail.com
Financiamiento:
Este trabajo se realizó
con el subsidio de la
Secretaría de Ciencia
y Técnica de la
Universidad Nacional
de Río Cuarto. Resol.
Rec. 852/11. Proyecto:
“Evaluación del nivel
de daño en el material
genético en grupos
humanos expuestos
a agroquímicos y
sus implicancias
en educación y
legislación”.
Conflicto de intereses:
Ninguno que declarar.
Recibido: 19-5-2014
Aceptado: 10-11-2014
RESUMEN
Introducción. En las últimas décadas, numerosos
autores han investigado acerca de los daños
genotóxicos producidos por la exposición a
sustancias químicas, aunque no existen para
Argentina reportes de estudios que analicen
dichos efectos en los niños. El objetivo de
este trabajo fue determinar la frecuencia de
micronúcleos en células exfoliadas de la mucosa
bucal en niños de plantas urbanas con exposición
ambiental (por inhalación) y compararla con la
frecuencia de micronúcleos en niños que habitan
en plantas urbanas alejadas de zonas donde se
pulveriza.
Población y métodos. Se estudiaron cincuenta
niños que habitan la localidad de Marcos Juárez
(Córdoba), ubicados a diferentes distancias
de exposición a la aplicación de productos
plaguicidas, y veinticinco niños de la ciudad de
Río Cuarto (Córdoba), considerados no expuestos
a dichos productos, y se aplicó el ensayo de
micronúcleos en células de la mucosa bucal.
Resultados. Se encontró diferencia significativa
entre los expuestos a menos de quinientos metros
con respecto al grupo de niños no expuestos. El
40% de los individuos expuestos sufren algún
tipo de afección persistente, que se podría asociar
a la exposición crónica a plaguicidas.
Conclusiones. Los resultados obtenidos permiten
indicar que existe una exposición a sustancias
genotóxicas en un grupo de niños con relación
al otro y poner de manifiesto la relevancia del
ensayo de micronúcleos en la mucosa bucal para
el biomonitoreo genético y la vigilancia en salud
pública. El ensayo utilizado detecta un nivel de
daño que todavía es reversible.
Palabras clave: micronúcleos, inducción genotóxica,
mucosa oral, exposición a plaguicida, monitoreo.
http://dx.doi.org/10.5546/aap.2015.126
INTRODUCCIÓN
El monitoreo genotoxicológico
en humanos es una herramienta
útil para estimar el riesgo genético
de una exposición a un compuesto
o mezclas complejas de productos
químicos 1 y se constituye en un
sistema de advertencia temprana para
enfermedades genéticas y/o cáncer.2
Identifica factores de riesgo, a la vez
que las medidas de control pueden ser
puestas en práctica.3
Las investigaciones científicas
sobre monitoreo genotoxicológico
humano comienzan a publicarse
alrededor de 1985 con una escalada
exponencial hasta la fecha. Desde
1980 a 2000, los ensayos de
monitoreo en poblaciones humanas
expuestas a productos químicos se
han focalizado principalmente en
estudios citogenéticos –ensayos de
aberraciones cromosómicas (AC), de
micronúcleos (MN) y de intercambio
de cromátidas hermanas (ICH); todos
estos realizados en sangre–.4
En este aspecto, la frecuencia de
micronúcleos en células exfoliadas
de la mucosa bucal es un método
mínimamente invasor y útil para
el monitoreo del daño genético en
humanos. 5 El Human Micronucleus
Project ha iniciado un proceso
internacional de validación para el
ensayo de micronúcleos en células de
la mucosa bucal, similar al realizado
previamente utilizando linfocitos
humanos.6
Desde 2000 a 2008, el ensayo de
micronúcleos en células de la mucosa
bucal comienza a emplearse en
poblaciones expuestas a plaguicidas
de Brasil, Polonia, México, España,
Hungría, Costa Rica y otras
poblaciones europeas, 7,8 usuarios
de teléfonos celulares, 9 estudiantes
fumadores de Bolivia 10 y personas
expuestas a diferentes agentes
mutagénicos.11
Asimismo, este ensayo fue
Evaluación del nivel de daño en el material genético de niños de la provincia de Córdoba expuestos a plaguicidas / 127
utilizando por Peñaloza y Jaraba12 en niños con
deficiencias alimenticias, por Benítez-Leite et
al.,13 Unal et al.,14 Minicucci et al.,15 Holland et al.6
y Gómez-Arroyo et al.16 en poblaciones de niños
expuestos a mezclas de plaguicidas.
En nuestro país, informan resultados sobre
monitoreo genotoxicológico en poblaciones
de adultos expuestos por inhalación y/o
absorción dérmica Larripa et al. 17 y Dulout et
al.,18 efectuados en la provincia de Buenos Aires,
y Simoniello et al.,19 en la provincia de Santa Fe.
Aiassa et al.,8,23 Mañas et al.,20-22 Peralta et al.,24
Gentile et al.,25 entre otros, reportan resultados
en personas expuestas. Los trabajos utilizan
los ensayos de AC, MN y cometa, en sangre
periférica.
La proximidad de las viviendas a los
campos agrícolas tratados con agroquímicos
se ha sugerido como un factor estrechamente
relacionado con la exposición ambiental a
plaguicidas. 26 No se encuentran reportes de la
frecuencia de MN en la mucosa bucal de niños
con exposición ambiental (por inhalación) a
plaguicidas.
Por lo tanto, se planteó determinar la
frecuencia de micronúcleos en células exfoliadas
de la mucosa bucal en niños de plantas urbanas
con exposición ambiental (por inhalación) y
compararla con la frecuencia de micronúcleos
en niños que habitan en plantas urbanas alejadas
de zonas donde se pulveriza, por lo tanto,
sin exposición ambiental (por inhalación) a
plaguicidas.
POBLACIÓN Y MÉTODOS
Diseño: observacional, transversal y analítico.
Población
Grupo 1: niños sanos con edad comprendida
entre 4 y 14 años, con tiempo de residencia ≥ 4
años en la localidad de Marcos Juárez. A su vez,
este grupo fue dividido teniendo en cuenta los
límites indicados en el art. 59 de la Ley 9164 de
la provincia de Córdoba: residentes a menos
de 500 metros de los lugares de aplicación de
plaguicidas y residentes a más de 500 metros
hasta la distancia máxima que las características
geográficas de la localidad permitieran.
Marcos Juárez está situada al este de la
provincia de Córdoba. Tiene 27 004 habitantes
(INDEC, 2010). La ciudad está rodeada por zonas
cultivadas.
Grupo 2: niños sanos con edad comprendida
entre 4 y 14 años, con tiempo de residencia ≥ 4
años en la localidad de Río Cuarto, que residen
en áreas alejadas a zonas donde se realizan
pulverizaciones con plaguicidas (≥ 3000 m) y con
estilos de vida semejantes a los niños del grupo 1.
Río Cuarto está situada en el sur de la
provincia de Córdoba. Tiene 155 911 habitantes
(INDEC, 2010).
El tamaño de la muestra se eligió de acuerdo
con Preston y Hoffmann, 27 que sugieren que
“grupos de estudio de 20 o más individuos
pueden ser un razonable sustituto de la
concordancia exacta porque los factores de
confusión tendrán menor influencia sobre la
alteración cromosómica o la mutación”.
Se realizaron dos muestreos: uno en marzo/
abril de 2012, época final de pulverizaciones
continuas (entre 4 y 6 meses); y otro muestreo
en agosto/septiembre del mismo año, época
previa al ciclo de pulverizaciones continuas (sin
pulverizaciones, al menos, 5 meses). La repetición
del ensayo se realizó en 19 niños residentes
en Marcos Juárez elegidos al azar del primer
muestreo.
El protocolo de trabajo está aprobado por
el CIEIS, UNRC - Ministerio de Salud de la
Provincia de Córdoba. Incluye un escrito con
la información básica sobre el estudio, actas de
consentimiento y asentimiento informado.
La investigación fue socializada por el grupo
de investigación a través de charlas informativas
abiertas a la comunidad. Se incluyeron en el
estudio aquellos niños que, junto con sus padres,
decidieron participar voluntariamente.
Quedaron excluidos los niños con padres o
familiares fumadores, que consumían café, té
en exceso, con medicamentos de uso crónico,
expuestos a rayos X en los últimos 6 meses,
a contaminantes en agua de bebida y a otros
contaminantes ambientales cercanos a los lugares
de residencia28 por ser considerados factores que
podían crear confusión sobre los resultados que
se obtuvieran.
Se consideraron ambas poblaciones expuestas
a residuos de plaguicidas de degradación en los
alimentos.
Antes de la toma de células de la mucosa bucal,
se implementó una historia clínica-ambiental
que interrogó sobre datos demográficos, tipo de
exposición a plaguicidas, patologías y síntomas
persistentes y estilo de vida.
El ensayo de micronúcleos se realizó en células
de la mucosa bucal, que se extrajeron utilizando
hisopos estériles, frotando el interior de la mejilla
durante 30 segundos, con enjuague bucal previo
128 / Arch Argent Pediatr 2015;113(2):126-132 / Artículo original
con agua corriente a los fines de eliminar restos
de alimentos. Los extendidos se realizaron según
Tolbert y col.29 con modificaciones.
Se observaron 1000 células por individuo. Los
criterios de inclusión para la consideración de
micronúcleos son los indicados por Budak, Diler
y Ergene.11
Análisis estadístico: los datos de la historia
clínica-ambiental se analizaron usando
estadísticas descriptivas (frecuencias y
porcentajes).
El test de Kolmogorov-Smirnov se realizó para
determinar la distribución normal de los datos de
micronúcleos y, posteriormente, la prueba t-test
de Student (p < 0,05), utilizando el programa
GraphPad Prism versión 5.02.
RESULTADOS
La media de las edades de los niños
participantes fue de 9,06 ± 0,39 años para el grupo
1 y de 9,92 ± 0,54 para el grupo 2.
El tamaño total de la muestra fue de 75 niños
(n= 75), 31 varones y 44 mujeres. El grupo 1 se
constituyó con 27 niños residentes a menos de 500
metros de los lugares de aplicación de plaguicidas
(166,7 ± 11,62 m) y 23 residentes a más de 500
metros (1095 ± 146,4 m); y el grupo 2, 25 niños
residentes a más de 1500 metros (3320 ± 192,7 m).
Ninguno de los niños convocados se rehusó a
participar del estudio.
La historia clínica-ambiental arrojó los
siguientes datos:
• Los plaguicidas más utilizados en la zona
son glifosato, aplicado en sus diferentes
formulaciones líquidas o granuladas, y los
insecticidas cipermetrina y clorpirifós en
formulaciones líquidas.
• Del total de niños expuestos, 20 (40%)
presentaron síntomas persistentes de diversa
índole: 9 niños con síntomas respiratorios
(estornudos a repetición, dificultad
respiratoria, tos y/o broncoespasmos); 9 niños
con síntomas respiratorios asociados a picazón
o manchas en la piel y picazón o sangrado de
nariz; y 2 niños con síntomas respiratorios
asociados a lagrimeo, ardor o picazón de
ojos y oídos. Ninguno de los participantes no
expuestos relatan síntomas persistentes.
• La frecuencia de persistencia de dichos
síntomas varía entre seis meses y todo el año.
• Los últimos tres informes del análisis
microbiológico y físico-químico de agua de
consumo, solicitados por el municipio al
ente oficial (18 meses anteriores a la toma
de la muestra), indican que los recuentos
bacterianos y el análisis de amoníaco, arsénico,
cloruros, carbonato de calcio, fluoruros,
nitratos, nitritos, sulfatos y bicarbonatos
cumplen con las especificaciones del Código
Alimentario Argentino y la Resolución de la
Dirección Provincial de Agua y Saneamiento
(DiPAS) 608/93.
Los valores de la media y error estándar de
micronúcleos en la población estudiada se indican
en la Tabla 1. En la Figura 1, se muestran imágenes
de células de la mucosa bucal con micronúcleos.
La frecuencia de micronúcleos en niños con
síntomas de exposición crónica a plaguicidas es de
5,35 ± 0,97 (n= 20) y la frecuencia de aquellos que
no presentan síntomas es de 5,13 ± 0,73 (n= 30),
por lo que no existen diferencias estadísticamente
significativas entre ambos grupos.
La frecuencia media de micronúcleos por
cada 1000 células de la mucosa bucal fue superior
en los niños residentes de Marcos Juárez,
comparados con los de Río Cuarto. Se encontró
una media de 5,20 ± 0,58 micronúcleos cada 1000
células en las muestras de Marcos Juárez y de
3,36 ± 0,63 micronúcleos cada 1000 células en las
de Río Cuarto.
El análisis que relaciona la frecuencia media
de micronúcleos entre los participantes del primer
muestreo (marzo/abril de 2012) con los del
segundo muestreo (agosto/septiembre de 2012)
arrojan una media de 5,78 ± 1,27 micronúcleos
cada 1000 células para los niños que habitan a
menos de 500 metros de las zonas pulverizadas,
muestreados en el primer período, y una media de
Tabla 1. Valores medios de la frecuencia de micronúcleos por cada 1000 células de la mucosa bucal de los grupos estudiados
Grupo y procedencia
Distancia a n
lugares pulverizados
Distancia de residencia
(media + DE)
MN/1000
células
Grupo 1 Marcos Juárez
Hasta 500 m
Más de 500 m
27
23
166,7 ± 11,62
1095 ± 146,4
5,59 ± 0,75*
4,74 ± 0,91
Grupo 2 Río Cuarto
Más de 3000 m
25
3320 ± 192,7
3,36 ± 0,63
* Estadísticamente significativo con respecto al grupo 2.
MN: micronúcleos.
Evaluación del nivel de daño en el material genético de niños de la provincia de Córdoba expuestos a plaguicidas / 129
16,67 ± 2,37 micronúcleos cada 1000 células para
los niños del segundo muestreo. La diferencia
es altamente significativa (p= 0,0009), con una
frecuencia superior en el segundo muestreo con
respecto al primero.
Comparando los niños expuestos a más de 500
metros de las áreas de aplicación de plaguicidas
en el primer y el segundo muestreo, se obtuvieron
diferencias también altamente significativas
(p= 0,0006), con frecuencias superiores en el
segundo período. La media para los niños del
primer muestreo fue de 3,60 ± 0,99 micronúcleos
cada 1000 células y, en el segundo muestreo, fue
de 19,70 ± 3,75 micronúcleos cada 1000 células.
DISCUSIÓN
En cuanto a las diversas sintomatologías
presentes en niños expuestos, estas afectan
principalmente al sistema respiratorio
(estornudos a repetición, dificultad respiratoria,
tos y/o broncoespasmos), asociadas a picazón o
manchas en la piel y picazón o sangrado de nariz,
lagrimeo, ardor o picazón de ojos y oídos. El 40%
de los individuos expuestos sufren algún tipo
Figura 1. Micronúcleos en células de la mucosa bucal
MN
MN
MN
MN
MN: micronúcleo/s.
130 / Arch Argent Pediatr 2015;113(2):126-132 / Artículo original
de afección persistente que se podría asociar a la
exposición crónica a plaguicidas.30-33 Al respecto,
la Organización Internacional del Trabajo (OIT),
en el año 1993, ya postulaba que los síntomas
de exposición a plaguicidas podían adoptar
la forma de sensación general de enfermedad,
debilidad, irritación de la piel, lagrimeo, ardor
o picazón de ojos, náuseas, vómitos, dolor
abdominal, alergia, diarrea, cefalea y alteraciones
del comportamiento, entre otros.
Conjuntamente, la frecuencia de micronúcleos
encontrada en la localidad de Marcos Juárez
(grupo 1), relacionada con la distancia de la
vivienda a las zonas pulverizadas (menos de
500 m y entre 500 m y 1500 m), no muestra
diferencias significativas entre ambos. Tratándose
de una ciudad relativamente pequeña, este
resultado pone de manifiesto que las
pulverizaciones podrían alcanzar (por vía aérea)
toda la localidad y que la población vulnerable
de niños se encuentra sometida a una exposición
extremadamente alta y continua, dado que vive
rodeada por los cultivos. Teniendo en cuenta que
no existen diferencias entre los grupos de niños
en estudio en cuanto a distancias de pulverización
hasta un máximo de 1095 m, debería tomarse
en cuenta este dato al momento de establecer
resguardos ambientales en localidades que
se encuentren rodeadas de cultivos donde se
pulveriza.
La frecuencia de micronúcleos en el grupo
de niños expuestos (menos de 500 m de
pulverizaciones) es significativamente superior
(p < 0,05) a la encontrada en el grupo que reside
a más de 1500 m. Estos datos concuerdan con la
bibliografía disponible.
Gómez-Arroyo et al. 16 hicieron la misma
asociación que en este trabajo para estudiar el
daño genético en niños de una población de
El Porvenir, Ahome, Sinaloa. Sus resultados
sugieren que la exposición a mezclas de
plaguicidas es posiblemente la causa de las
diferencias significativas en las frecuencias de
micronúcleos encontradas en esa población.
Además, Benítez-Leite et al. 13 analizando dos
poblaciones de Paraguay (San Lorenzo y Ñemby),
encontraron una frecuencia significativamente
mayor de micronúcleos en el grupo de niños
potencialmente expuestos que en el grupo no
expuesto. Estudios similares fueron realizados
por Unal et al.14 Minicucci et al.15 y Holland et
al. 6 y mostraron resultados incrementados de
daño genético en niños expuestos a mezclas de
plaguicidas.
En relación con los valores encontrados en
el grupo que habita entre 500 m y 1500 m de los
lugares de aplicación de plaguicidas y el grupo
que reside a más de 1500 m, si bien no existen
diferencias estadísticamente significativas, existe
un considerable aumento de la frecuencia media
de micronúcleos en los niños expuestos (4,74 para
Marcos Juárez y 3,36 para Río Cuarto), que estaría
indicando un mayor daño en el material genético
de los niños de Marcos Juárez, 44% más, en
relación con los niños de Río Cuarto. Del mismo
modo, cuando se compara la frecuencia media de
micronúcleos de los niños residentes en Marcos
Juárez respecto de los de Río Cuarto, se observa
un aumento del 58% (5,2 para Marcos Juárez y
3,36 para Río Cuarto), que indica que existe un
daño en el material genético mayor en los niños
de Marcos Juárez.
Existen pocos estudios que han evaluado la
asociación entre el uso de plaguicidas agrícolas
cerca de las viviendas y patologías en niños.
Reynods y col. 34-36 y Rull y col. 37 evidencian
una relación entre leucemia infantil y uso de
plaguicidas en las cercanías de las viviendas.
En lo que respecta al análisis de los resultados
obtenidos en el primer y el segundo muestreo
(marzo/abril de 2012 vs. agosto/septiembre
de 2012), tanto en el grupo que habita a menos
de 500 m como en el que habita entre 500 m y
1500 m, la diferencia es altamente significativa
(p= 0,0009 y p= 0,0006, respectivamente), con
una frecuencia superior en el segundo muestreo
con respecto al primero. En marzo/abril, finaliza
la época de pulverizaciones; por lo tanto, la
segunda toma de muestras (agosto/septiembre)
se realizó tras un período de menor exposición
de alrededor de 5 meses, lo que significa que
hubo un menor contacto con el contaminante,
que debería traducirse en una disminución de
la frecuencia de micronúcleos. Sin embargo, los
resultados muestran un aumento en la frecuencia
de micronúcleos en el segundo muestreo. Este
aumento podría explicarse sobre el registro
de la quema de basurales a cielo abierto en
abril, junio y julio de ese año, cuyos residuos
abarcaron todas las dimensiones de Marcos
Juárez. Esta quema fue más intensa los días 10,
19, 21 y 29 de julio. Sumado a este suceso, se
debe considerar una lluvia posterior a la quema,
el día 6 de agosto (comunicación personal Méd.
Méndez, Centro de Atención Primaria Ambiental,
Marcos Juárez). Por lo tanto, todos los habitantes
de la ciudad estuvieron expuestos a diversos
gases contaminantes, como dioxinas, dióxido
Evaluación del nivel de daño en el material genético de niños de la provincia de Córdoba expuestos a plaguicidas / 131
de carbono, monóxido de carbono, dióxido de
azufre, entre otros, no menos de 4-5 días antes de
la toma de las muestras. Dado que las células de la
mucosa bucal se regeneran cada 7-21 días, es, en
teoría, posible observar los efectos genotóxicos de
una exposición aguda aproximadamente 7-21 días
después, lo que explica el elevado incremento de
la frecuencia media de micronúcleos encontrado
en el segundo muestreo. Estas observaciones
ponen de manifiesto la relevancia de la técnica
de micronúcleos en la mucosa bucal para el
biomonitoreo genético y la vigilancia en salud
pública.
Los resultados obtenidos permiten indicar
que existe una exposición a genotóxicos en un
grupo de niños con relación a otro. Este marcador
utilizado detecta un nivel de daño que todavía
es reversible. Por lo tanto, se debería establecer
un seguimiento a través de marcadores de efecto
para determinar la persistencia, o no, de los
indicadores biológicos de daño celular.
La importancia de la detección precoz
del daño genético a través del ensayo de
micronúcleos radica en que permite tomar las
medidas necesarias para disminuir o suprimir
la exposición al agente deletéreo cuando aún
este es reversible y, de ese modo, prevenir y
disminuir el riesgo de desarrollar neoplasias y
otras alteraciones patológicas.
La salud de una sociedad puede ser juzgada
por la salud de sus niños. Esto supone la
identificación precoz de riesgos prevenibles y
la traducción inmediata de estos conocimientos
en intervenciones eficaces con políticas de
protección. n
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