Fitorremediación

Agrobiotecnología
Curso 2011
Fitorremediación
Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones
de metales pesados
Fitorremediación
- Ventajas
- Limitaciones
- Tipos de plantas más utilizadas
Tipos de fitorremediación
- Fitoextracción
- Rizofiltración
- Fitotransformación
- Fitodegradación de compuestos orgánicos
- Fitoestimulación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Fitoestabilización
Plantas transgénicas para detectar compuestos
inorgánicos tóxicos en el medio ambiente
Referencias
Alternativas actuales para eliminar
contaminaciones de metales pesados
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Rangos de
concentración
comúnmente
hallados y límites
permitidos para
los contaminantes
metálicos y los
radionucleótidos
más importantes
Agrobiotecnología
Fitorremediación
a
Elemento
Rango de concentración
Límite regulatorio
Metales
(µ
µg/Kg)a
(mg/Kg) b
Plomo
1.000-6.900.000
600
Cadmio
100-345.000
100
Arsénico
100-102.000
20
Cromo
5,1-3.950.000
100
Mercurio
0,1-1.800.000
270
Cobre
30-550.000
600
Zinc
150-5.000.000
1.500
Radionucleótidos
Unidades
pCi . g-1
Uranio
0,2-16.000 c
0,06-18.700 d
------250 f
Estronio
0,03-540.000 e
-------
Cesio
0,02-46.900 e
-------
Plutonio
0,00011-3.500.000 e
-------
Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1998.
Riley et al.
b Clean up Standards for contaminated sites. New Jersey, Department of Environmental Protection
(1996)
c Microgramos por gramo
d Picocuries por gramo
e Picocuries por kilogramo
f Stern et al.
Alternativas
actuales para
eliminar
contaminaciones
de metales
pesados
•
- Rellenado de terrenos
- Fijación química e impermeabilización
superficial
- Lixiviación y reposición del suelo
•
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Suelos
Aguas
- Precipitación o floculación
- Intercambio iónico
- Osmosis inversa
- Microfiltración
Mercado potencial
para la
descontaminación
ambiental
en Estados Unidos
mediante las
tecnologías
actuales
• En los últimos 10 años se ha desarrollado un mercado
. importante para la biorremediación, principalmente en
. Estados Unidos.
Productos tóxicos:
Metales pesados:
Metales pesados y tóxicos:
~ U$S 400.000 M
~ U$S 7.100 M
~ U$S 35.400 M
• El costo estimado para remediar los sitios utilizados
. por el Departamento de Energía Atómica por métodos
. convencionales se calculó en U$S 142.000 M
• En 2005, el mercado norteamericano de remediación
. ambiental era de U$S 6.000 a 8.000 M por año.
• El mercado norteamericano de fitorremediación era de
. U$S 100-150 M anuales (0.5% del total de remediación).
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• El mercado comercial de fitorremediación comprende
. 80% de contaminantes orgánicos y 20% de inorgánicos.
• El mercado de fitorremediación creció de 3 y 5 veces
. entre 1999 y 2005.
La fitorremediación es económicamente competitiva
respecto de otras alternativas de remediación
Adaptado de Chappell, US Environmental Protection Agency,1998.
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Fitorremediación
“Conjunto de métodos para degradar,
asimilar, metabolizar o detoxificar metales
pesados y compuestos orgánicos por
medio de la utilización de plantas.”
“Es el empleo de vegetación para
el tratamiento in situ de suelos,
sedimentos y aguas contaminadas.”
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Se basa en los procesos que ocurren
naturalmente por los cuales las plantas
y los microorganismos rizosféricos
degradan y secuestran contaminantes
orgánicos e inorgánicos
La fitorremediación permite detoxificar distintos sustratos
• Sustratos sólidos (suelos y sedimentos):
- sitios militares (TNT, metales, orgánicos)
- campos agrícolas (herbicidas, pesticidas, metales, selenio)
- sitios industriales (orgánicos, metales, arsénico)
- minas (metales)
- sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos aromáticos policíclicos; PAHs)
• Sustratos líquidos
- aguas residuales (nutrientes, metales)
- drenajes de agricultura (nutrientes, fertilizantes, metales,
arsénico, selenio, boro, pesticidas orgánicos y herbicidas)
- efluentes industriales (metales, selenio)
- efluentes de minería (metales)
- plumas subterráneas (metales, compuestos orgánicos)
• Sustratos gaseosos
- aire libre e interior (óxidos de nitrógeno, SO2, ozono, CO2, gases
neurotóxicos, partículas de hollín, e hidrocarburos halogenados volátiles)
Contaminantes orgánicos
• Son consecuencia de las actividades humanas:
- industria petroquímica (derrames de combustibles y solventes)
- actividades militares (explosivos y armas químicas)
- agricultura (pesticidas, herbicidas)
- industria química (efluentes)
- industria forestal y maderera (efluentes)
• Dependiendo de sus propiedades, pueden ser:
- degradados en la zona radicular
- incorporados a la planta
degradación
secuestro
volatilización
• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación:
Solventes orgánicos, herbicidas, explosivos, hidrocarburos
derivados del petróleo, bifenilos policlorinados (PCBs),
tricloroetileno (TCE), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs).
Contaminantes inorgánicos
• Pueden ser consecuencia de elementos naturales presentes en la corteza
. terrestre y/o en la atmósfera, o resultado de actividades humanas:
- minería
- industria
- transporte
- agricultura
- actividades militares
• No pueden ser degradados, pero pueden fitorremediarse mediante
. estabilización o secuestro en la parte cosechable de la planta.
• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación:
Macronutrientes vegetales (nitrato y fosfato), elementos traza (Cr, Cu, Fe,
. Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, V y W), e
. isótopos radioactivos (238U, 137Cs y 90Sr), entre otros.
Fitorremediación
Ventajas
• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas
extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas
contaminadas (costo 7-10 veces menor respecto de los
. métodos tradicionales).
- Las plantas emplean energía solar.
- El tratamiento es in situ.
• Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida
con plantas que con microorganismos.
• Es un método apropiado para descontaminar superficies
grandes o para finalizar la descontaminación de áreas
restringidas en plazos largos.
Agrobiotecnología
• Es una metodología con buena aceptación pública.
Fitorremediación
• Se generan menos residuos secundarios.
Fitorremediación
Limitaciones
• El proceso se limita a la profundidad de penetración
de las raíces o a aguas poco profundas.
• La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente
contaminadas.
• Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.
• La biodisponibilidad de los compuestos o metales
es un factor limitante de la captación.
• Deben considerarse contaminaciones potenciales
de la cadena alimentaria y napas de agua.
Agrobiotecnología
• Se requiere comprender mejor la naturaleza
de los productos de degradación (fitodegradación).
Fitorremediación
• Falta elaborar el marco regulatorio detallado.
Biología de la
acumulación
de metales
en plantas
• Captación por las raíces:
- Movilización de los metales
• Quelación mediante fitosideróforos
• Unión a proteínas quelantes (fitoquelatinas)
• Acidificación por exudado de H+
- Captación por la raíz
• Via apoplástica
• Vía simplástica
• Transporte:
- Almacenamiento en raíz o exportación al tallo por xilema
- Transporte por xilema o redistribución por floema
- Almacenamiento en vacuolas
• Mecanismos de evasión o tolerancia:
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Captación celular limitada (evasión)
- Metabolismo tolerante a metales pesados
- Detoxificación por quelación, compartimentalización
o precipitación
• Mecanismos más probables:
- Compartimentalización en vacuolas y quelación con
fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ )
- Precipitación como fitatos (Zn2+)
Mecanismos
involucrados en
la quelación y
compartimentalización
pared celular
citoplasma
Contaminante
inorgánico
secuestro
conjugación
adsorción
vacuola
degradación
enzimática
Contaminante
orgánico
modificación
enzimática
Agrobiotecnología
Fitorremediación
secuestro
Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Biollogy, 2005.
Mecanismos de tolerancia para contaminantes orgánicos e inorgánicos en plantas.
La detoxificación generalmente involucra la conjugación seguida del secuestro activo en la
vacuola y el apoplasto, donde el contaminante hace el menor daño. Los quelantes son:
glutatión (GSH), glucosa (Glu), metalotioneínas (MT), nicotinamina (NA), ácidos orgánicos (OA,
fitoquelatinas (PC). Los transportadores se representan por cajas con flechas.
Estrategias de
fitorremediación
utilizadas para
remediar agua,
suelo o aire
contaminados.
hidroponia
(rizofiltración)
humedal artificial
Plantas usadas como filtros
Plantas usadas como
barrera hidráulica
para prevenir la
contaminación de
napas y la dispersión
horizontal de plumas.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
barrera hidráulica
fitoextracción y
fitoestabilizacion
filtración
de aire
Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Biology, 2005.
Diseño de
sistemas de
fitorremediación
• Selección de la especie vegetal
• Datos de toxicidad y de degradación de contaminantes
• Tasa de captación del contaminante y tiempo
de limpieza requerido
• Esquema y densidad de las plantaciones
• Costos de Irrigación, insumos agronómicos,
. mantenimiento y gastos de cosecha.
Agrobiotecnología
• Zona de captura de agua y tasa de transpiración
Fitorremediación
• Análisis de riesgos contingentes (plagas, sequías, etc.)
Tipos de plantas
más utilizadas
• Freatófitas
- Plantas de raíces profundas
(álamo, sauce, algodonero).
• Pasturas
- Por su tipo de raíz retienen el suelo.
• Legumimosas
- Permiten enriquecer el suelo en N2.
• Acuáticas
- Permiten la degradación de contaminantes
en humedales artificiales.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Algunas especies propuestas para fitorremediación
Brassica juncea
Thlapsi caerulescens
Lotus corniculatus
Silene vulgaris
Alyssum lesbiacum
Hibiscus cannabinus
Festuca arundinacea
Ejemplos
de pruebas
de campo para
fitorremediación
de metales
Metal
Planta
Ubicación
Métodoa
Comentarios
Pb
Brassica juncea
Trenton, N.J.
FE-FEAQ
La incorporación de
Pb2+ aplicando EDTA
resultó en la reducción del
28% en la contaminación
en el área en una
temporada de cosecha.
Cd
Zn
Thlapsi caerulescens
Silene vulgaris
Beltsville, Md.
FE-FEC
Fitoextracción de suelos
enmendados con barros
sedimentarios.
La acumulación de Zn2+
en T. caerulescensfue
10 veces mayor que
en otras plantas.
Zn
Cd
Ni
Cu
Pb
Cr
Se
B
Brassica oleracea
Raphanus sativus
Thlapsi caerulescens
Alyssum lesbiacum
Alyssum murale
Arabidopsis thaliana
Brassica juncea
Festuca arundinacea
Hibiscus cannabinus
Lotus corniculatus
Rothamstead,
U.K.
FE-FEC
Suelos enmendados con
sedimentos.
FE-FEC
FV
El contenido de B extraible
por agua se redujo entre
24% y 52%, y el de Se se
redujo entre 13% y 48%
por todas las especies.
U
Helianthus annus
Asthabula, Ohio
RF
Remoción de U de aguas
subterráneas
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Los Baños,
California
Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.
a:
Métodos de fitorremediación. FE: fitoextracción; FV: fitovolatilización; RF: rizofiltración;
FEAQ: fitoextracción asistida por quelantes; FEC: fitoextracción continua
Características
del contaminante
que afectan
la captación por
la planta
• Contaminantes orgánicos:
No existen generalmente transportadores específicos en la planta. Se
mueven por difusión en los tejidos vegetales, según sus propiedades
químicas. La hidrofobicidad les permite atravesar fácilmente la bicapa
lipídica pero se mueven con dificultad por los fluidos celulares.
• Contaminantes inorgánicos:
Incorporados por procesos biológicos mediante transportadores de
membrana, preexistentes porque son nutrientes o similares a ellos
(arsenato y selenato son incorporados por transportadores de fosfato).
Por ello, su captación es saturable.
• Los contaminantes inorgánicos causan en general toxicidad
. por daños en la estructura celular (estrés oxidativo por su
. actividad redox) y reemplazan a otros nutrientes esenciales.
• Los contaminantes orgánicos suelen ser menos tóxicos: no
. tienden a acumularse a altos niveles y son menos reactivos.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• En los suelos con mezcla de ambos contaminantes, el
. crecimiento vegetal y la posibilidad de fitorremediación son
. más limitados
Factores físicos
y químicos que
afectan la
biodisponibilidad
del contaminante
La biodisponibilidad depende de:
• Las propiedades químicas del contaminante (hidrofobicidad
. y volatilidad):
Las moléculas con extrema hidrofobicidad (PCBs, PAHs, hidrocarburos) se
unen fuertemente a la materia orgánica y no se disuelven en el agua
(contaminantes “recalcitrantes”).
Los contaminantes no volátiles son fitodegradados o secuestrados, mientras
que los volátiles pueden liberarse a la atmósfera sin transformaciones.
• Las propiedades del suelo:
Los arcillosos (partículas pequeñas) retienen más agua que los arenosos y
tienen más sitios de unión para iones (cationes), al igual que los de mayor
concentración de materia orgánica (humus). Éstos pueden unir mayor
cantidad de contaminantes hidrofóbicos. La biodisponibilidad de los
contaminantes iónicos está afectada por el pH del suelo (pH ácido, aumenta
la biodisponibilidad de cationes)
Agrobiotecnología
• Las condiciones medioambientales:
Fitorremediación
La temperatura y la humedad afectan la biodisponibilidad (por ejemplo,
aumentando la migración de contaminantes disueltos en agua)
Factores
biológicos que
afectan la
biodisponibilidad
del contaminante
Interacciones planta-microorganismo:
- La liberación de fotosintatos por la planta aumenta la población
. microbiana capaz de remediar.
- La liberación de metabolitos secundarios de la planta puede activar
. la expresión de genes relacionados a la degradación de
. contaminantes en los microorganismos o actuar como co-metabolitos
. para la degradación por los microorganismos.
La biodisponibilidad es modificada por liberación de:
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Biosurfactantes (ramnolípidos) liberados por bacterias que aumentan
. disponibilidad de compuestos hidrofóbicos
• Exhudados vegetales con compuestos que pueden promover la síntesis
. de biosurfactantes por las bacterias
• Enzimas (vegetales y bacterianas) que modifican las cadenas laterales de
. algunos compuestos orgánicos aumentando su biodisponibilidad.
• Quelantes por plantas y bacterias (sideróforos, ácidos orgánicos y
. fenólicos) que aumentan disponibilidad de metales.
• Secreción de H+ por las plantas que acidifican el suelo.
• Enzimas que convierten los metales a formas menos tóxicas o más
. biodisponibles (por ejemplo, Cr VI a Cr III)
.
Aspectos que
requieren
de mayor
investigación
Procesos que requieren aumentar los conocimientos
para aumentar la eficiencia de la fitorremediación:
• Interacciones planta-microorganismo y otros procesos
. rizosféricos
• Captación por la planta
• Mecanismos de traslocación
• Mecanismos de tolerancia (compartimentalización,
. degradación)
• Quelantes vegetales involucrados en transporte y
. almacenamiento
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Movimiento de los contaminantes en los ecosistemas
. vía el sistema suelo-agua-planta hacia niveles tróficos
. superiores
Tipos de fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Las bases
conceptuales de
la fitorremediación
se apoyan en
los mecanismos
presentes en
plantas que
hiperacumulan
metales
Acumulación o degradación
en el tejido cosechable
Fitorremediación
Fitovolatilización
Fitoestimulación
Fitodegradación
Microorganismo
que degrada
toxinas
Toxina
Fitoextracción
Fitoestabilización
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Adaptado de: Buchanan et al., Biochemisty and Molecular Biology of Plants, 2000.
Tipos de
fitorremediación
• Fitoextracción
Las plantas se usan para concentrar metales en las partes
cosechables (principalmente, la parte aérea).
• Rizofiltración
Las raíces de las plantas se usan para adsorber, precipitar
y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos
contaminados.
• Fitoestimulación
Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo
de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).
• Fitoestabilización
Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la
movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas
o al aire.
• Fitotransformación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan,
almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar
subproductos no tóxicos o menos tóxicos.
- Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales
pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósfera
mediante la transpiración.
Las diferentes estrategias de fitorremediación
son adecuadas para distintos contaminantes
• Fitoextracción:
Usada principalmente para remediar metales y otros tóxicos inorgánicos
. (Se, As, radionucleótidos).
.
• Rizofiltración:
Técnica relativamente cara de implementar, siendo útil para cantidades
. pequeñas de aguas residuales conteniendo compuestos inorgánicos
. peligrosos (radionucleótidos). Los humedales artificiales se utilizan para
. una amplia gama de contaminantes inorgánicos (metales, percloratos, cianuro,
. nitratos y fosfatos) y contaminantes orgánicos (explosivos y herbicidas).
• Fitoestimulación:
Es usado para remediar contaminantes orgánicos hidrofóbicos que no pueden
. ser incorporados por la planta pero que pueden ser degradados por los
. microorganismos (PCBs, PAHs e hidrocarburos derivados del petróleo).
Las diferentes estrategias de fitorremediación
son adecuadas para distintos contaminantes
• Fitoestabilización:
Este técnica es usada cuando se plantan coberturas vegetales en sitios
. conteniendo contaminantes orgánicos o inorgánicos; o cuando se usan
. árboles como barreras hidráulicas para permitir el filtrado de contaminantes
. orgánicos e inorgánicos.
• Fitodegradación:
Es útil para compuestos orgánicos que se movilizan dentro de la planta,
. (herbicidas, TNT, MTBE y TCE).
• Fitovolatilización:
Puede utilizarse para compuestos orgánicos con formas volátiles (TCE y
. MTBE) y para algunos compuestos inorgánicos que pueden existir en forma
. volátil (Se y Hg).
Fitoextracción
• Se utiliza para el tratamiento de contaminaciones con
metales (Cd2+, Co2+, Cr2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Se2+, Zn2+).
• Características deseables en la planta:
- Debe tolerar y acumular altas concentraciones de metales
en las partes cosechables
- Debe tener una alta tasa de crecimiento
- Debe producir un gran volumen de biomasa
Coeficiente de bioacumulación ± DE
Tallos
Agrobiotecnología
Fitorremediación
1
Raíces
Metal
Brassica
Thlapsi
Brassica
Thlapsi
Cd2+ (5)1
175 ± 16
59 ± 12
20.574 ± 4295
4258 ± 168
Cu2+ (1)
159 ± 32
623 ± 265
55.809 ± 9221
60.716 ± 21510
Cr2+ (0,4)
80 ± 8
89 ± 15
5.486 ± 393
8.545 ± 4220
Ni2+ (1)
587 ± 115
2.739 ± 383
11.475 ± 125
8.425 ± 4220
Pb2+ (5)
3±1
29 ± 23
1.432 ± 1409
7.011 ± 3616
Zn2+ (3)
49 ± 31
770 ± 320
1.816 ± 1739
2.990 ± 1424
Concentración inicial del metal en solución (mg/L)
Tomado de: Salt et al., Biotechnology 1995.
Coeficiente de bioacumulación: relación entre la acumulación en el
tejido (µg/g de peso seco) y concentración en solución (mg/L) o en suelo.
Fitoextracción
• Plantas típicas empleadas en fitoextracción:
- Girasol (Helianthus annuus)
- Mostaza de la India (Brassica juncea)
- Nabos (Brassica napus; B. rapa)
- Cebada (Hordeum vulgare)
- Lúpulo (Humulus lupulus)
- Ortigas (Urtica dioica; U. urens),
- Diente de León (Taraxacum officinale)
• Hiperacumuladores:
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Thlapsi caerulescens
- Brassica juncea
- Pelargonium spp.
- Allysum lesbiacum
Fitoextracción
Los metales en el suelo pueden estar
en distintas formas:
• Como iones o complejos insolubles
• Adsorbidos a constituyentes inorgánicos del suelo o unidos
a sitios de intercambio
• Unidos a moléculas orgánicas
• Como compuestos o precipitados insolubles
(óxidos, carbonatos, hidróxidos)
• Integrados a la estructura de los silicatos
Formas de incrementar la biodisponibilidad:
• Agregado de quelantes de metales
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Establecimiento de un pH moderadamente ácido
• Disolución de surfactantes para contaminantes hidrofóbicos
• Agregado de microorganismos
Esquema de
fitoextracción
continua y
asistida por
quelantes
La línea sólida naranja (
) representa la concentración de metal en
la biomasa, la línea discontinua (
) representa la biomasa de tallo.
Fitoextracción
asistida por
quelantes
Fitoextracción
continua
Aplicación
del quelante
Fase de captación
de metal
Fase de
captación
de metal
Fase de crecimiento
Cosecha
Fase de crecimiento
Cosecha
Adaptado de: D. E. Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Concentración de Pb2+ en tallos (µg/g)
Concentración de Pb2+ en tallos de Brassica juncea en un suelo
contaminado con plomo (600 mg/kg de suelo) tratado con EDTA.
EDTA aplicado (mmol/kg suelo)
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.
Acumulación
de metales
y tolerancia
a manganeso
en plantas
de tabaco
que expresan
el gen cax2
de Arabidopsis
• El transporte de metales desde el citosol a la vacuola es un componente
importante para la tolerancia a metales en las plantas.
• El intercambiador de Ca2+ CAX2 (Calcium Exchanger 2) de Arabidopsis
es un regulador clave de este proceso.
• La expresión del gen cax2 en células de Saccharomyces cereviciae
suprime defectos en el crecimiento debidos a excesos de Ca2+ y Mn2+.
• Se transformaron plantas de tabaco con el gen cax2 dirigido por el
promotor de 35S de CaMV. La secuencia se introdujo también en
antisentido para usar esta construcción como un control interno.
Vector Control
CAX2 Control
Vector cnb
CAX2 cnb
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol. 2000.
Control: cepa salvaje de S. cereviciae
cnb: cepa de S. cereviciae mutada en el gen de calcineurina (suceptibilidad a Mn2+)
Vector: cepas transformadas con el vector vacío
CAX2: cepas transformadas con el gen cax2
Ensayo de
tolerancia a Mn2+
en cepas de
Saccharomyces
cereviciae que
expresan el
intercambiador
CAX2.
Las plantas de tabaco que expresan CAX2 acumularon más Ca2+,
Cd2+ y Mn2+ y fueron más tolerantes a niveles elevados de Mn2+.
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Control
C-21
C-14
Tiempo (min)
B
Transporte de iones
(nmoles/mg de proteína)
A
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Tiempo (min)
C
Transporte de iones
(nmoles/mg de proteína)
Fitorremediación
µ g/g peso seco
µ g/g peso seco
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Concentración de iones en las raíces (izquierda) y en los tallos (derecha) de plantas transgénicas.
Vector: controles transformados con el vector vacío. C-14: línea transformada con el gen cax2. Los
ensayos se realizaron complementando el medio con 10 mM Cl2Ca, 0,1 µM Cl2Cd ó 0,1 mM Cl2Mn.
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Agrobiotecnología
µ g/g peso seco
CAX2
µg/g peso seco
Vector
Transporte de iones
(nmoles/mg de proteína)
Acumulación
de metales
y tolerancia
a manganeso
en plantas
de tabaco
que expresan
el gen cax2
de Arabidopsis
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Tiempo (min)
Captación de iones en vacuola de células de
raíces de plantas que expresan el gen cax2.
A: transporte de Cd2+; 10 µM total Cd2+.
B: transporte de Mn2+; 100 µM total Mn2+.
C: transporte de Ca2+; 10 µM total Ca2+.
Remoción
de metales
utilizando
algas y plantas
acuáticas
Las plantas acuáticas emplean dos mecanismos para
separar metales y otros contaminantes (incluyendo
radioisótopos) de aguas polucionadas:
- Reacción superficial rápida independiente del metabolismo:
proceso de difusión que finaliza cuando los iones metálicos
solubles se unen o adsorben a la pared celular. Puede remover
cantidades significativas en minutos.
- Reacción de incorporación intracelular lenta dependiente
del metabolismo: proceso de transferencia desde la pared
celular al interior de la célula. Demanda horas o días.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Lemna minor
Microspora
Modelo
Concentración de Ni 2+ (mg/L)
Remoción
de metales
utilizando
Lemna minor
0,0 mg/L Pb 2+
Concentración inicial
de Ni2+ : 5 mg/L
5,0 mg/L Pb 2+
10,0 mg/L Pb 2+
Tiempo (h)
Agrobiotecnología
Concentración Pb2+ (mg/L)
Modelo
Concentración inicial
de Pb2+ : 10 mg/L
Fitorremediación
Tiempo (h)
Tomado de: Axtell et al., Bioresource Technology, 2003.
0,0 mg/L Ni2+
2,5 mg/L Ni2+
5,0 mg/L Ni2+
Rizofiltración
• Se emplea en el tratamiento de contaminaciones por:
- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+)
- Radioisótopos (137Cd, 90Sr, U)
- Compuestos orgánicos hidrofílicos
• Características deseables en la planta:
- Debe tener raíces de crecimiento rápido y ramificación abundante.
- Debe poder remover metales tóxicos por períodos prolongados.
- No debe ser un translocador eficiente al tallo.
• La remoción tiene distintos componentes:
- Componente rápido: combinación de procesos físicos y químicos
(quelación, intercambio iónico, adsorción); puede ocurrir en raíces
muertas.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Componentes intermedios: Incluyen captura intracelular,
deposición en la vacuola y translocación a los tallos.
- Componente lento: precipitación mediada por la raíz; involucra
exudados de la raíz.
Rizofiltración
Las plantas -acuáticas son buenos candidatos
para encarar procesos de rizofiltración
• Plantas acuáticas sumergentes:
• Plantas acuáticas emergentes:
- Scirpus validus
- Typha latifolia
- Ceratophyllum demersum
- Potamogeton pectinatus
- Maranta arundinaceae
- Lemna spp
- Algas
- Chara vulgaris
- Myriophyllum aquaticum
- Myriophyllum spicatum
- Hydrilla verticillata
Flujo
vertical
Scirpus
validus
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Capas
de
arena
y
grava
Eflujo
Esquema de
rizofiltración
basado en
Scirpus validus
Rizofiltración
de uranio
usando cultivos
de raíces de
Brassica juncea
y Chenopodium
amaranticolor
Agrobacterium rhizogenes es capaz de transformar raíces
y provocar el sobrecrecimiento de las mismas.
Tejido radicular de
Brassica juncea y
de Chenopodium
amaranticolor.
C. amaranticolor
B. juncea
Se utilizaron raíces transformadas de ambas especies
para remover U de soluciones con baja concentración.
C. amaranticolor
Tasa de
acumulación de
U en raíces de
Brassica juncea y
de Chenopodium
amaranticolor. Los
valores se expresan
como µg U/g tejido
seco.
µg U/g tejido seco
Agrobiotecnología
µg U/g tejido seco
B. juncea
Fitorremediación
Concentración de U (µM)
Concentración de U (µM)
Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.
• Se utilizaron raíces transformadas de ambas especies
para remover U de soluciones con alta concentración.
• Para todas las concentraciones utilizadas, el 90%
del U fue absorbido por las raíces dentro de las 10 h
de tratamiento.
B. juncea
C. amaranticolor
µg U/g D.w.t. ( X10 3)
Rizofiltración
de uranio
usando cultivos
de raíces de
Brassica juncea
y Chenopodium
amaranticolor
Agrobiotecnología
Tasa de acumulación
de U en raíces de
Brassica juncea y de
Chenopodium amaranticolor.
Los valores se expresan
como µg U/g tejido seco.
Concentración de U (µM)
Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.
Fitorremediación
Las raíces transformadas de ambas especies podrían
usarse como bioabsorbentes de uranio, para lo cual
podrían producirse a gran escala en biorreactores.
Fitotransformación
La fitotransformación comprende los procesos
de fitodegradación y fitovolatilización
Empleada en tratamientos de contaminación por:
• Herbicidas (atrazina, alaclor)
• Aromáticos (BTEX: benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos)
• Alifáticos clorinados (TCE: tricloroetileno; tetracloroetileno)
• Deshechos de nutrientes (NO3-, NH4+, PO43-)
• Deshechos explosivos (TNT; RDX: hexahidrotrinitrotriazina)
Depende de:
• Concentración del compuesto disuelto en el suelo
• Eficiencia de captura, que depende de:
- las propiedades físico-químicas del compuesto
- especie química
- propiedades de la especie vegetal
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Tasa de transpiración, que depende de:
- el tipo de planta
- área foliar
- nutrientes
- humedad del suelo
- temperatura
- viento
- humedad relativa
Fitotransformación
• Una vez translocado, el compuesto puede tener
los siguientes destinos:
- Almacenamiento del producto (o de sus productos de
.degradación) vía conjugación o lignificación
- Metabolización a distintos productos de degradación
- Volatilización por la transpiración
- Mineralización (CO2 + H2O)
• Plantas típicas empleadas en fitotransformación:
- Arboles freatófitos (álamo, sauce, álamo americano)
- Pasturas (centeno, sorgo, festuca)
- Leguminosas (trébol, alfalfa, caupí)
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Fitodegradación de compuestos orgánicos
Las plantas pueden desarrollar una serie de reacciones
para metabolizar o mineralizar compuestos orgánicos
Enzimas
Rol natural
Aplicaciones en fitorremediación
Nitroreductasas
Su función es la reducción de nitrato para
obtener nitrógeno destinado al crecimiento
celular
Reducen grupos nitrato en explosivos
y otros compuestos nitroaromáticos y
remueven el nitrógeno del anillo
aromático
Deshalogenasas
Están vinculadas a la degradación de
subproductos de etileno durante la
senescencia
Deshalogenan solventes clorinados
Nitrilasas
Detoxifican compuestos aromáticos
cianamidados naturales
Procesan grupos cianidados de los
anillos aromáticos en herbicidas y
otros compuestos cianidados
Fosfatasas
Su rol es el procesamiento de fosfato
durante el desarrollo
Procesan grupos fosfato de pesticidas
organofosfatados y de compuestos
que afectan el sistema nervioso
Lacasas
Intervienen en la lignificación y
delignificación por adición de oxígeno
Completan la degradación del TNT.
Aparentemente involucradas en la
incorporación de fragmentos de anillos
aromáticos en la biomasa vegetal
Peroxidasas
Degradan en forma no específica
compuestos fenólicos, lignina, y otros
Empleadas en el tratamiento de aguas
residuales para degradar fenoles
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin, 1998.
Contaminación
con explosivos
• Las técnicas tradicionales se basan en la
. incineración o en utilización de microorganismos
. e implican remoción del suelo
• La alternativa frente a las técnicas tradicionales fue
. usar sistemas de fitorremediación:
.
- Cultivos celulares de remolacha que degradan
nitroglicerina (GNT)
- Plantas acuáticas y cultivos de raíces que biotransforman
trinitroglicerina (TNT)
• El éxito fue limitado, ya que la GNT sólo pudo ser
. denitrificado a di- y mononitroglicerol; la remoción
. completa de grupos nitratos no se logró nunca.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Además, la degradación de TNT produjo la
. acumulación de otra toxina: aminodinitrotolueno.
• Otra desventaja es que las plantas captan y
. metabolizan los compuestos nitrogenados 10 veces
. más lentamente que los microorganismos.
Rutas de
degradación
del TNT
mediante
nitroreductasas
y lacasas
vegetales
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
ADNT: aminodinitrotolueno;
DANT: diaminonitrotolueno;
TAT: triaminotolueno;
TNT: trinitrotolueno
Detoxificación
de TNT por
plantas de
tabaco
transformadas
con el gen de
nitroreductasa
de Enterobacter
cloacae
Crecimiento brotes de tabaco no transformado y transgénico
(NR 3-2) en medio líquido.
Sin TNT
NT
TNT 0,25 mM
NR 3-2
NT
NR 3-2
Crecimiento de plantas de tabaco no transformado y transgénicas (NR 3-2)
luego de la germinación en medio conteniendo explosivos.
TNT 0,05 mM
Sin TNT
TNT 0,1 mM
Agrobiotecnología
Fitorremediación
NT
NT
NR
NR 3-2
3-2
NT
NT
NR
NR 3-2
3-2
NT
NT
NR
NR 3-2
3-2
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan
el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
Crecimiento de raíces para brotes de plantas no transformadas (NT)
y transgénicas (NR 3-2) luego de 21 días de exposición a TNT
NT
TNT
(mM)
Longitud de las
raíces (cm ± e.s.)
NR 3-2
Indice de tolerancia
de las raíces (%)
Longitud de las
raíces (cm ± e.s.)
Indice de tolerancia
de las raíces (%)
0
8,1 ± 0,1
100
8,1 ± 0,1
100
0,05
5,5 ± 0,6
68
6,2 ± 0,9
77
3
5,5 ± 0,9
68
0,1
0,2
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
e.s.= Error estándar
Indice de tolerancia = longitud de las raíces de brotes tratados con TNT/longitud de las raíces de brotes control x 100
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan
el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
Estudios de toxicidad de TNT en plantas
no transformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2)
NT
TNT
(mM)
Peso
antes del
TNT (g)
NR 3-2
Peso
después del
TNT (g)
Ganancia /
pérdida de
peso (g)
Peso
antes del
TNT (g)
Peso
después del
TNT (g)
Ganancia /
pérdida de
peso (g)
0
11,37 ± 0,17
16,9 ± 0,28
+5,52 ± 0,45
11,08 ± 0,05
16,88 ± 0,18
+5,79 ± 0,23
0,1
11,2 ± 0,14
11,3 ± 0,02
+0,13 ± 0,15
11,4 ± 0,95
14,65 ± 0,07
+3,24 ± 0,88
0,25
11,59 ± 0,01
7,59 ± 0,19
-4,00 ± 0,21
11,93 ± 0,18
13,95 ± 1,20
-2,02 ± 1,01
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que
expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
• El explosivo hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) es tóxico para todo tipo
. de organismos y un posible carcinógeno. Su degradación ambiental es muy lenta
. y su presencia en suelos y napas de agua constituye un problema grave.
• El RDX es tóxico para las plantas. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las
. bacterias del género Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no
. desarrollan suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradación.
• La molécula responsable de la degradación es un citocromo P450. Como prueba
. de concepto, se aisló el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus
. rhodocochrous y se lo expresó en plantas de Arabidopsis thaliana. Las plantas .
. fueron utilizadas en ensayos de detoxificación de suelos contaminados con RDX.
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
4-nitro-2,4-diazabutanal
Ruta de degradación de RDX por el citocromo P450 codificado por el gen XplA de R.
rhodocochrous y ensayos de actividad realizados con proteína expresada en E. coli.
Los controles fueron realizados con proteína sometida a 100oC.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que
expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
Caracterización de plantas transgénicas que expresan el gen XplA
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
a) Análisis de Northern y Western blot de líneas de A. thaliana que expresan
el gen XplA en forma constitutiva.
b) Captación de RDX de medio acuoso por plántulas de A. thaliana. Los
resultados son el promedio de repeticiones de cinco experimentos.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que
expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
Estudios en suelos contaminados con RDX empleando plantas wild type y transformadas
con 35S::XPLA. Se cultivaron plantas de A. thaliana de 8 semanas de edad en suelo conteniendo
50, 250, 500 y 2000 mg de RDX/Kg de suelo. Se muestran las mediciones de biomasa (tallos y
raíces) obtenidos en las diferentes condiciones experimentales (promedio de cinco ensayos).
El ciclo
biogeoquímico
del mercurio
y de la
biomagnificación
de metilmercurio
Principales interconversiones del mercurio en el medio ambiente
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Hg(0): mercurio elemental
Hg(II): mercurio iónico libre
RSHg: mercurio unido a azufre
MeHg: metilmercurio
Expresión
de los genes
merA y mer B
de Desulfovibrio
desulfuricans
en plantas
transgénicas
de Arabidopsis
thaliana
• No se conocen plantas capaces de detoxificar Hg.
• En cambio, existen microorganismos presentes en los sitios
contaminados que poseen dos enzimas (organomercúrico
liasa, gen merB, y mercúrico reductasa, gen merA) que
permiten convertir metilmercurio en Hg elemental,
detoxificado este metal.
• Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con los dos
genes mencionados aislados de Desulfovibrio desulfuricans.
R-CH2-Hg+ + H+
Hg(II) + NADPH
MerB
MerA
R-CH3 + Hg(II)
Hg(0) + NAD+ + H+
Agrobiotecnología
Fitorremediación
MerB: organomercúrico liasa
MerA: mercúrico reductasa
Expresión
de los genes
merA y mer B
de Desulfovibrio
desulfuricans
en plantas
transgénicas
de Arabidopsis
thaliana
merB merA/B-1 merA NT
merB merA/B-1 merA NT
0 µM
1 µM
NT
A/B-1
A/B-2 A/B-3
NT A/B-1 A/B-2
5 µM
10 µM
A/B-3
Fenotipos de resistencia a mercurio
orgánico de plantas control y de 3 líneas
transgénicas para merA/merB
0 µM PMA
5 µM PMA
A/B-4 A/B-5 A/B-6
pg Hg(0).min-1/mg de
tejido
Fitorremediación
merB merA/B-1 merA NT
Plantas NT y transgénicas creciendo en medios con mercurio orgánico.
A/B-4 A/B-5 A/B-6
Agrobiotecnología
merB merA/B-1 merA NT
Tasas de volatilización de Hg(0)
en plantas control y en 6 líneas
transgénicas de A. thaliana
Líneas de plantas
Tomado de: Bizily et al., Nature Biotechnology, 2000.
Fitorremediación de
organomercuriales
vía transformación
de cloroplastos
(genes merA
y mer B de
Desulfovibrio
desulfuricans)
Se transformaron cloroplastos de tabaco con dos versiones de esta construcción
con y sin región 3´ no traductible (3´ UTR) portando el operón MerAB
16S→
→
aadA
merB
trnA→
→
merA
P
3´UTR
Efecto de la concentración de acetato de fenilmercurio en el crecimiento
de plantas de tabaco controles (NT) y transgénicas (5A y 9)
NT
5A
9
Concentración de PMA
Agrobiotecnología
trnI→
→
Fitorremediación
Tomado de: Ruiz et al., Plant Physiol., 2003.
Aumento de la
acumulación
y tolerancia a selenio
en plantas
transgénicas
de Arabidopsis
que expresan
la enzima
selenocisteína liasa I
de ratón
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• La toxicidad del selenio (Se) se debe a la
. incorporación inespecífica de selenocisteína
. (Se-Cys) a las proteínas.
• Estrategia:
Expresar el gen de la selonocisteína liasa de ratón
en citoplasma y cloroplastos de Arabidopsis thaliana
Se-Cys
Se-Cys liasa
Se elemental + alanina
Agrobiotecnología
Incorporación de Se a proteínas
en brotes de Arabidopsis thaliana
no transgénicas (NT) y transgénicas
(citosólicas y plastídicas)
Control
1
µg Se g protein -
NT
cit SL
cp SL
Control
50 µM Se-Cys
Tolerancia
a Se-Cys
selenato y
selenito de
brotes de
Arabidopsis
no transgénicos
y transgénicos.
50 µM Se-Cys
Largo de raíces (mm)
Aumento de la
acumulación
y tolerancia
a selenio en
plantas
transgénicas
de Arabidopsis
thaliana
25 µM SeO2-3
25 µM SeO2-3
50 µM SeO2-4
Fitorremediación
50 µM SeO2-4
Tomado de: Pilon et al., Plant Physiol., 2003.
NT
cyt SL cp SL
Fitoestimulación
• Las plantas proveen el hábitat para el incremento
en el tamaño y actividad de poblaciones
microbianas.
• Los exudados vegetales estimulan las
transformaciones efectuadas por las bacterias
(inducción enzimática).
• La síntesis de carbón orgánico aumenta la tasa
de mineralización microbiana (enriquecimiento
de sustrato).
• El oxígeno que difunde con las raíces asegura
un medio adecuado para las transformaciones
. aeróbicas.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Los hongos micorríticos asociados a las raíces
vegetales metabolizan contaminantes orgánicos.
Fitoestimulación
• Empleado en el tratamiento de contaminación orgánica
causada por pesticidas (atrazina), compuestos
. aromáticos, e hidrocarburos aromáticos policíclicos
. (PAHs)
• Se basa en la liberación por la planta de exudados entre
los que se incluyen:
- ácidos orgánicos de cadena corta
- compuestos fenólicos
- bajas concentraciones de enzimas y péptidos
• Plantas típicas empleadas en fitoestimulación:
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Liberadoras de compuestos fenólicos (mora,
manzano, Maclura pomífera)
- Pastos con raíces fibrosas (centeno, festuca)
para contaminantes hasta 1 metro de profundidad
- Arboles freatófitos para contaminantes hasta 3
metros de profundidad
- Plantas acuáticas para sedimentos
Fitoestabilización
• Empleada en el tratamiento de contaminación por:
- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, As2+, Cu2+, Se2+, U)
- Compuestos orgánicos hidrofóbicos: hidrocarbonos
aromáticos policiclícos (PAHs), bifenilos
policlorados (PCBs), dioxinas, furanos,
pentaclorofenol, DDT, dieldrina
• Características deseables en la planta:
- Debe tolerar altos niveles de metales tóxicos
- Debe inmovilizar los metales vía captura
y posterior precipitación y reducción
- Debe acumular bajas concentraciones en las
raíces
• Plantas típicas empleadas en fitoestabilización:
Agrobiotecnología
Fitorremediación
- Arboles freatrófitos que transpiren grandes
volúmenes de H2O
- Pastos con raíces fibrosas que estabilicen
la erosión del suelo
- Plantas con sistemas radiculares robustos
capaces de absorber/unir contaminantes
Referencias
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Pilon-Smits. Phytorremediation. Annual Review of Plant
Biology, 56:15-39. 2005.
2.
Eapen and D’Souza. Prospects of genetic engineering of
plants for phytoremediation of toxic metals. Advances in
Biotechnology, 23:97-114, 2005.
3.
Mejáre, M. and Bulow, L. Metal binding proteins and
peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy
metals. Trends in Biotechnology, 19:67-73, 2001.
4.
Kovalchuk, O., Titov, V. Hohn, B. and Kovalchuk, I. A
sensitive trangenic plant system to detect toxic inorganic
compounds in the environment. Nature Biotechnology,
19:568-572, 2001.
5.
Salt, D. E., Smith, R.D., and Raskin I. Phytoremediation.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology, 49:643-668, 1998.
6.
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7.
http://www.envirotools.org/factsheets/phytoremediation.shtml
Agrobiotecnología
Fitorremediación