m/z - INTI

SEGUNDAS JORNADAS DE ACTUALIZACIÓN ANALÍTICA
INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL
CENTRO DE INVESTIGACIONES TECNOLÓGICAS DE LA INDUSTRIA LÁCTEA
INTI Lácteos - Sede Rafaela
Análisis de trazas de Somatropina en leche por
LC-MS/MS y en modo MRM3
Dr. Fernando A. Iñón
Gte. investigación y Desarrollo – Gte. Capacitación y Aplicaciones
JENCK S.A.
11 de junio de 2015
Temario
• Importancia de la determinación de somatropina en leche
• Qué es y cómo funciona un LC-MS/MS y que tipo de
espectrómetros existen
• Ventajas y aplicaciones de equipos MS/MS híbridos
• Determinación de somatropina en leche mediante MRM y MS3
JENCK S.A.
• RECURSOS
HUMANOS
o INFRAESTRUCTURA
o
JENCK S.A.
• Asesoramiento y provisión
de Instrumental analítico
• Calificación, certificación y
mantenimiento de
instrumental
• Capacitación
• Cursos
• Seminarios
• Desarrollo de aplicaciones
Capacitación Jenck S.A. 2015
Cursos teórico-prácticos dictados en JENCK
Seminarios de Innovación y Divulgación Tecnológica
Seminarios del Departamento de Servicios de Posventa
Cursos a medida (dictados en planta o laboratorio del cliente o
en JENCK)
• Cursos fuera de nuestra sede, en vinculación con universidades
y centros de investigación de todo el país
•
•
•
•
NOTIJENCK.COM.AR
GERENCIA DE
CAPACITACIÓN Y APLICACIONES
cursos@jenck.com .:. www.jenck.com
TEL: (54) 11-4014-5300 .:. FAX: (54) 11-4014-5353
Somatropina en leche
• Tratamiento de vacas con Somatotropina Bobina recombinante(rBST)
• aumentar su producción en leche (de 10-15%)
• promover su crecimiento,
• Favorecer, según ciertos estudios, la fertilidad.
Somatropina bovina recombinante en leche
• Tratamiento prohibido en muchos países
• Comunidad Europea, Japón, Australia, Nueva Zelandia, Canadá,
• …Argentina (¿?!)
• se utiliza comúnmente en los Estados Unidos, ya que está autorizada por la
FDA desde 1994.
• La mayoría de los métodos analíticos utilizados para detectar esta
hormona implican inmunoensayos,
• Incapacidad de diferenciar la hormona natural y la versión recombinante
• La rbST en leche se la encuentra presente en baja concentraciones (~
ng/ml, ppb),
• La metodología implementada debe poser buena sensibilidad con elevada
confianza en su confirmación definitiva.
Somatropina bovina recombinante en leche
• De todas las matrices, la leche es la matriz más complicada para
detectar rBST, ya que:
• es una matriz compleja, con alto contenido de proteínas, lípidos y azúcares;
• contiene un gran número de proteínas que presentan propiedades
fisicoquímicas similares a la rBST
• la concentración de rBST muy baja
• la caseína puede actuar como secuestrador de rBST
• Secuestro de proteína: donde la proteína activa (en este caso la rBST) se un une a
un complejo proteico inactivo (en este caso la caseína)
• Remoción anticipada de caseínas podría afectar la recuperación de rBST
• La cuantificación de proteínas, especialmente en matrices ricas en proteínas,
siempre ha sido un desafío
• Para resolver estos problemas, se debe utilizar técnicas especializadas
• Que pueda validarse y defenderse legalmente
Somatropina y somatropina recombinate
• La formas natural y recombinante difieren por un aminoácido N-terminal,
• rBST, 190 aminoácidos, Peso molecular: 22kDa
Alanina
Metionina
2 ptes disulfuro
53-164,181- 189
• Ligera diferencia, pero significativa para que un método basado en espectrometría de
masas sea una alternativa viable
• varias ventajas, incluyendo la especificidad y sensibilidad.
Somatropina bovina recombinante en leche
• Es necesario contar con una tecnología analítica diferencial
capaz de discriminar entre el efecto matriz y el analito en
cuestión (rbST);
• al intentar eliminar los interferentes de la matriz solamente por
métodos físico-químicos (extracción líquido/líquido, evaporaciones,
extracción y/o dispersión en fase sólida, cambio de fases, ect.), al fin
de obtener un extracto de inyección aceptable, involucra que en cada
paso adicional de limpieza disminuye el porcentaje de recuperación
del analito.
Comparación de metodologías
Inmunoensayos
Espectrometría de masas
Se basa en la detección de la proteína entera
a través su unión a anticuerpos específicos
+
-
+
-
Alta sensibilidad
No discrimina entre
BST y rBST
Discrimina entre BST
y rBST
Dificulta en la
purificación de la
matriz
Altísima sensibilidad
No es fácil detectar
la proteína entera,
Digestión enzimática
previa para enfocarse
en el péptido Nterminal
Facil de realizar
Cuantitativo
Principio del espectrómetro de masas (MS)
Inyección de muestra
Eluido de la
columna
Separación en la
columna
< ESI >
Introducción al MS
fase móvil
Protón
Eliminación de
un protón
Adición protónica
Ión positivo
(molécula protonada )
•
•
•
•
イオン化したい化合物の分子
Fuente de iones Unidad de
Analizador
enfoque
Región a presión
Región de vacío
atmosférica
Ión Negativo
(molécula desprotonada)
Se aplica alto voltaje al eluido de la columna, formando una niebla por adición de nitrógeno
(nebulización)
Las gotas cargadas disminuyen su tamaño gradualmente hasta provocar la evaporación de iones.
Los iones son separados por tamaños dentro del analizador.
Al alcanzar el detector, los iones son contados.
Detector
¿Cuál es el mayor beneficio de un MS como detector en
LC?
• El mayor beneficio es:
• Adicionalmente al tiempo de retención, puede obtenerse
información sobre la masa relacionada con cada compuesto,
de forma sencilla y simultánea.
• La información de la masa permite reducir el riesgo de；
• Identificación errónea del compuesto
• Error en la Cuantificación debido a la elución
inesperada de interferencias, etc.
La posibilidad de
separar en función
de la masa
m/z
↓
Reduce el riesgo de 267
cometer errores de
identificación y
cuantificación
m/z
281
m/z
264
m/z
278
LC-MS: datos analíticos
 MS
(3)
(1)
(2)
cromatograma
int.
Espectro de masas
(4)
(1) TIC
m/z
(2) m/z 582
(3) m/z 193
(4)
(5)
int.
(5)
m/z
tiempo
 PDA (dispositivo de fotodiodos)
(2)
(4)
cromatograma
(2)  580 nm
(3)  210 nm
(3)
(5)
tiempo
Espectro UV
AU
(4)
nm
AU
(5)
nm
Espectrometría MS/MS
• Información estructural
• Identificación de compuestos desconocidos
• Selectividad adicional a la cromatografía
• Análisis de mezclas complejas
• No siempre se necesita de un cromatógrafo
• Mejor relación señal/ruidos (S/N)
• Análisis de trazas
• Bajo tiempo de desarrollo de métodos
Alta Sensibilidad y Selectividad en Modo MRM
Triple Cuadrupolos
Ideal para “Targered Analysis” (Análisis de Compuestos Conocidos) que requiere
precisión en la cuantificación.
Generación de Iones
Transporte de Iones
Filtro de Iones
Fragmentación
Filtro de Iones
Circuito Iónico Electrónico “Esquiando en Pendiente”
Funcioes de la Fuente de Iones API
• Nexo de unión entre el HPLC y la primer región de vacío del
MS, todo a presión atmosférica.
• Generar iones en fase gaseosa
• Ionizar el analito (APCI, APPI o AP-MALDI).
• Nebulización de los iones en disolución (ESI o NSI).
• Desolvatar los cluster (analito(s) más solvente) antes de
ingresar al MS.
• Eliminar moléculas neutras e iones de carga opuesta a la
polaridad de trabajo antes de ingresar al MS.
Fuente de Iones API
Los “turbo heater” son
calentadores cerámicos del
aire que promueven la
desolvatación de los iones.
Se puede programar su
temperatura desde Analyst®,
permitiendo tener para cada
tiempo cromatográfico (δΤ≥1
min.) diferentes temperaturas
que optimizan la señal. A su
vez reduce el “efecto
memoria” y aumenta el rango
de flujos de trabajo.
API 3200TM, API 4000TM, API 4500TM, API 5000TM, API 5500TM, 3200 Q TRAP®, 4000 QTRAP®,
4500 QTRAP® 5500 QTRAP® poseen la Fuente de Iones API: Turbo VTM
ESI - macromoléculas
proteinase K
thermolysin
29 kDa
34 kDa
ESI MS
disolución en CH3CN:H2O:ác.acético 50:46:4
temp fuente: 100 oC.
Gas Cortina
• Interfase ideal para
prevenir contaminación
• Permite una operación
robusta ideal para
secuencias largas.
Interfase de vacío para el sistema API 5000, 5500, 4500 y
5500 QTrap
Orifice plate,
Curtain plate
Declustering
Potential (DP)
QJet
Orificio de
Entrada al MS
Presión
atmosférica
4-7 mTorr
Gas Cortina
Región Q1
10 µTorr
Q0,
Potencial
De entrada (EP)
Diferencia de presiones debido al vacío aplicado por la bomba mecánica externa
Skimmer vs Guías
• Guías:
• Cuadrupolo solo RF
• Enfoca iones en Q0
• Introduce más iones y menos gas en Q0
• Más eficiente que un skimmer
QTRAP® 4500
4000 Q TRAP®
Incrementa la sensibilidad
en todos los modos
Nueva guía iónica IonDrive QJet
• Permite la entrada de más iones
• Guía RF de dos etapas
API 6500, 6500 QTRAP
• 1ra Etapa: Mejor captura iones entrantes por orificios grandes
• 2da Etapa : Mejor transferencia de iones a la región Q0
• Mayor robustez
• Mejor barrara contra especies neutras y micro gotas
• La eficiencia de transmisión es 2x veces mejor que la guía iónica QJet®
original
Sciex QTRAP 4500
AcQuRate™ pulse counting detector
Highest reproducibility and accuracy
Turbo V™ source and
Curtain Gas™ interface
Unmatched robustness
and ruggedness
Qurved LINAC® collision cell
Shortest MRM cycles and highest scan speed
and reduced instrument footprint
Linear Accelerator™
Ion trap
More efficient and faster Q
TRAP® scanning
940 kHz ion path
Extended mass range with best low mass
ion confinement
High pressure Q0 and
QJet®2 ion guide
Most efficient ion focusing
Modos de Barrido
Modo de Barrido
Q1
Q2
Q3
Propósito
Full-Scan
Scanning
Transmisión Total
Trans. Total
Info. PM
SIM
m/z Fijo
Transmisión Total
Trans. Total
Cuantificación
Producto
m/z Fijo
CE + Transmisión Total
Scanning
Info Estructural
MRM
m/z Fijo
CE + Transmisión Total
m/z Fijo
Cuantif. Específ.
Pérdida neutra
Scanning
CE + Transmisión Total
Scanning
Screening Tipo de
Compuestos
Precursor
Scanning
CE + Transmisión Total
m/z Fijo
Screening Tipo de
Compuestos
MRM Alta Resolución
Scaning Alta
Resolución
CE + Transmisión Total
Scaning Alta
Resolución
Cuantif. Específ. +
Cualif. Definitiva.
Multi Target
Screening
m/z Fijo
CE + Transmisión Total
m/z Fijo +
Scanning
Cuantif. Específ. +
Cualif. Definitiva.
Rojo: MS simple, Triple Cuad., QqTOF y Q TRAP® - Verde: Triple Cuad.,
QqTOF y Q TRAP® - Marrón: solamente QqTOF - Azul: solamente Q TRAP®
Selected/Multiple Reaction Monitoring (SRM/MRM)
m/z Fijo
Q1
•
Transmisión
Total
m/z Fijo
Q2
Q3
Ventajas
• Monitoreo específico del analito
en cuestión.
• Altos ciclos de Barrido.
• “Simultáneos” Monitoreo de
Múltiples Transiciones.
•
Desventajas
• Nula provisión de información
estructural.
• Las moléculas desconocidas
son ignoradas por el MS/MS
(Unknowns Screening).
Identificación de Compuestos utilizando Relación de
Áreas o Alturas en modo MRM
Alternativa de Identificación a la Relación de Áreas o
Alturas en modo MRM, el modo FullScan MS/MS
Q3 en un Sistema Q TRAP® puede funcionar como Cuadrupolo o Trampa Lineal.
Atrapamiento de
Iones
Generación de Iones
Transporte de Iones
Filtro de Iones
Filtro de Iones
Fragmentación
Ideal para “Targered Analysis” y para GUS (General Unknow Screening) que
requiere precisión en la Cuantificación y Confirmación Definitiva.
Atrapamiento y Barrido Full-Scan dentro de la Trampa
Lineal de Iones Q3
Tecnologías MS/MS
Trampa 3D
Sensibilidad Full
Scan
MS3 (o más)
QqQ
Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de
Precursores
Q TRAP
Sensibilidad Full Scan MS y MS/MS
MS3
Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de Precursores
Ventajas de las trampas lineales de iones
• El analizador de masas (corazón del espectrómetro) es mucho más rápido que
un triple cuadrupolo convencional.
• La tecnología Q TRAP posibilita la utilización de Bibliotecas Espectrales de
Compuestos MS/MS
• Permite realizar MS3 y así aumentar la especificidad y sensibilidad
significativamente.
• Q3 puede funcionar como Trampa Lineal y posibilita estudios de elucidación de
estructuras (Ej.: Estudios de Impurezas de Plaguicidas y Metabolitos), dado que
permite alcanzar una alta resolución en masa (~12 ppm)
• Es factible trabajar en modo GUS (General Unknows Screening), para investigar
compuestos desconocidos
• La tecnología Q TRAP puede funcionar también como un Triple Cuadupolo,
manteniendo las ventajas de éste, por ejemplo el amplio rango dinámico (en
modo MRM), gran exactitud de cuantificación, etc.
Barrido realzado de ion producto (EPI)
Q1
Q2
Q3
1) Q1 Selecciona el Ión Precursor.
2) Q2 Genera los Iones Producto.
3) Q3 Atrapa y barre en modo Full-Scan los Iones Producto.
s
,
c
p
Confirmación con QqLIT o QqQ
i t y
XIC of +MRM (10 pairs): Exp 1, 216.1/174.0 amu from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray)
s
1.4e4
(10ng/mL Atrazine)
7.20
n
1.2e4
MRM
Max. 1.4e4 cps.
t e
1.0e4
8000.0
Is n
6000.0
p
4000.0
c
2000.0
0.0
2
3
4
5
6
7
8
9
Time, min
+EPI (216.10) CE (35): Exp 2, 7.028 to 7.344 min from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray)
10
11
12
13
14
s
i t y
,
1
n
4.0e5
x 100
t e
3.0e5
Barrido EPI (Q TRAP)
Pureza 95.6%
Max. 4.5e5 cps.
174.0
sI n
2.0e5
104.0
132.0
96.0
p
1.0e5
146.0
216.0
79.0
125.9 128.0 138.0
c
110.0
0.0
70
180
190
200
210
220
230
i t y
,
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
m/z, amu
+MS2 (216.10) CE (35): Exp 2, 7.074 to 7.382 min from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - MS2 216.wiff (Turbo Spray)
s
3000
n
2500
Barrido PI (QqQ)
Pureza 69.5%
96.2
t e
2000
1500
Max. 3136.9 cps.
174.2
104.2
79.2
I n
216.0
1000
132.2
500
0
70
126.8
80
90
100
110
120
130
146.0
138.2
140
150
m/z, amu
160
170
180
190
200
210
220
230
s
,
c
p
Confirmación con QqLIT o QqQ
i t y
XIC of +MRM (10 pairs): Exp 1, 216.1/174.0 amu from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray)
MRM
Max. 660.0 cps.
(0.5 ng/mL Atrazine)
n
s
660
600
7.21
t e
500
400
Is n
300
p
200
c
100
0
2
3
4
5
6
7
8
9
Time, min
+EPI (216.10) CE (35): Exp 2, 7.121 to 7.301 min from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray)
10
11
12
13
14
i t y
,
1
s
3.5e4
n
3.0e4
t e
2.5e4
Barrido EPI (Q TRAP)
Pureza 76.5%
Max. 3.5e4 cps.
174.0
sI n
2.0e4
1.5e4
79.0
96.1
216.0
1.0e4
p
104.0
145.9
c
5000.0
180
190
200
210
220
230
i t y
,
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
m/z, amu
+MS2 (216.10) CE (35): Exp 2, 6.628 to 7.861 min from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - MS2 216.wiff (Turbo Spray)
s
89
n
80
t e
60
Barrido PI (QqQ)
No hay match
Max. 89.2 cps.
174.0
I n
40
20
0
70
80
90
100
110
120
130
140
150
m/z, amu
160
170
180
190
200
210
220
230
Influencia de la concentración en la búscada en
bibliotecas
1ng/mL
Linear calibration
Fit (%) EPI
Fit (%) MS2
99.7 100
98.8
4.5E+05
92.3
4.0E+05
Peak Area (counts) MRM
QTRAP®
87.1
3.5E+05
95.6
90
QqQ
80
76.5
2
R = 0.9992
69.5
3.0E+05
70
60
2.5E+05
54.6
50
48.2
2.0E+05
40
1.5E+05
30
1.0E+05
20
5.0E+04
10
2.0
0.0
0
0.0
0.0E+00
0
0
5
10
15
20
25
30
Concentration (ng/mL)
35
40
45
50
Cuantificación vía MS3
MS/MS/MS
Q1
Q2
1)
Q3
3)
2)
1)
2)
3)
4)
5)
Selección del Ión Precursor.
Fragmentación.
Atrapamiento de Ión Producto.
Fragmentación del Ión Producto.
Escaneo y envío al detector de los
Iones Productos Secundarios.
4)
5)
MRM & MS/MS/MS
MS/MS/MS Aumento de la Selectividad y Sensibilidad
Malatión 10 ng/g en Manzana - % CV<5, recuperación entre 90-110 %
Interferencias en modo MRM
Muestras blanco de orina de 33 sujetos diferentes. Intensidad normalizada a 0.50 pg/uL
para MRM 277-168 (transición con mejor LOQ).
10 de 33 sujetos presentan interferencias!!!
(flechas indican sujeto con interferencia al TR del clenbuterol
Muestras #1, 10 y 11
fortificadas con 0.25 pg/µL
Selectividad en modo MS3
Muestras blanco de orina de 33 sujetos diferentes. Intensidad normalizada a 0.05 pg/µL
para MS3 277168132
Ninguno presenta interferencias, aún con un umbral 10 veces menor !!!
Muestras #1, 10 y 11
fortificadas con 0.25 pg/µL
Determinación de rBST
• Pasos críticos en la preparación de muestras
• Recordar que la rBST está en niveles muy bajos (1-5 ng/mL)
• Extracción de grasas de muestras
• Precipitación de proteínas
• Desnaturalización y optimización de la digestión
• Introducción de un estándar interno antes de la preparación de
la muestra es esencial para evaluar y compensar perdidas de
analito o variabilidad del procedimiento analítico
Metodología
• Se agrega estándar interno (hormona equina (rEST) ) a 10 mL de muestra
• Extracción en fase sólida en cartucho C4
• Se lava cartucho con solución acuosa al 0.1% en ácido trifluoroacetico (TFA), y luego con
solución 30:70 (acetonitrilo : sol. aq 0.1% TFA)
• Se eluye con 7 mL de solución 80:20 (acetonitrilo : sol. aq 0.1% TFA)
• Se evapora hasta 1 mL
• Precipitación de proteínas
• Se induce con metanol frío, se centrifuga y se seca el sobrenadante
• Digestión
• El residuo se reconstituye con 120 µL de buffer carbonato de amonio y se digiere a 37°C,
con tripsina durante 16 hs
• Reconstitución
• El digerido se evapora hasta sequedad y se reconstituye con 500 µL de solución 30:70
(acetonitrilo: sol aq. 0.2% ác. fórmico) agregando además antes de la inyección el péptido
N-terminal C13 de la de la rBST
Metodología
LC-MS/MS de BST y rBST
Multiple Reaction Monitoring
MS/MS/MS
Condiciones intrumentales
• Shimadzu Nexera XR
• Fase móvil A: 90:10 (agua:acetonitrilo), Fase móvil B: 10:90 (agua:acetonitrilo) siempre
conteniendo 0.1% ác. fórmico.
• Columna150 mm x 2.1 mm x 3 µm C18 Interchrom QS Uptisphere HDO.
• Temperatura ambiente, Gradiente 25 min a 300 µL/min.
• MS/MS: SCIEX 5500 QTRAP
• Equipado con fuente Turbo V™. Ionización electrospay aplicando 3500 V
MRM3
MRM
Hormona
Secuencia péptido
N-Terminal
Transiciones
DP
(V)
CE
(V)
Transiciones
DP
(V)
CE
(V)
AF2
(mv)
rBST
MFPAMSLSGLFANAVLR
913.2/774.0
913.2/1047.6
35
37
913.2/774.0/791.0
35
37
0.2
rEST
MFPAMPLSSLFANAVLR
933.2/794.2
35
38
rBST 13C6
MFP(A13C)MS(L13C)SG(L13C)F
(A13C)N(A13C)V(L13C)R
916.2/777.0
35
37
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 790.309 to 790....
7.0e5
913.2 / 774.0 / 791.0
I n t e n s it y , c p s
rBST MRM3
S/N = 74.3
6.0e5
5.0e5
S/N = 74.3
4.0e5
4.0e5
rBST MRM3
3.5e5
913.2 / 774.0 / 961.0
3.0e5
S/N = 60.8
2.5e5
S/N = 60.8
2.0e5
3.0e5
1.5e5
2.0e5
1.0e5
4.71
4.5
5.0
6.69
5.5
6.0
Time, min
XIC of +MRM (8 pairs): 913.200/774.000 Da from Sa...
6.5
7.0
0.0
4.0
7.5
rBST MRM
4000
913.2 / 774.0
4.5
4.90
5.75 6.05
6.0
Time, min
XIC of +MRM (8 pairs): 913.200/1047.600 Da from S...
Max. 4610.0 cps.
5.0
5.5
1000
900
S/N = 68.7
2500
2000
6.5
7.0
7.5
Max. 1085.0 cps.
S/N = 32.6
800
3000
6.39
rBST MRM
913.2 / 1047.6
5.60
1085
S/N = 68.7
3500
4.56
7.84
4500
5.58
4.72
5.0e4
6.09
I n t e n s it y , c p s
0.0
4.0
4.62
Max. 4.6e5 cps.
5.67
4.5e5
8.0e5
1.0e5
I n t e n s it y , c p s
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 960.349 to 960....
5.66
9.0e5
I n t e n s it y , c p s
Max. 9.1e5 cps.
700
S/N = 32.6
600
500
4.17
4.58
4.83
400
1500
300
5.94
1000
500
0
4.0
4.25 4.34 4.62
4.5
5.00
5.0
200
6.01
5.18
5.5
6.0
Time, min
6.33
6.5
5.74
100
6.60 6.83
7.0
7.397.60 7.68
7.5
0
4.0
6.17
5.13
4.5
5.0
5.5
6.0
Time, min
6.38 6.83 7.09 7.17
6.5
7.0
7.79
7.58
7.5
Cromatograma iónico total
rBST 10 ppb
rEST MRM
933.2 / 794.2
rBST 13C6
916.2 / 777.0
rBST MRM3
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 960.9
913.2 / 774.0 / 791.0
. .
i t y
TIC: from Sample 12 (milk, 2 ppb) of rbST 20110512.wiff (Turbo Spray)
Max. 3.4e7 cps.
s
4.66
3.4e7
4.88
3.0e7
n
Cromatograma iónico total
t e
2.5e7
4.51
2.0e7
rBST 2 ppb
5.63
I n
1.5e7
5.97
1.0e7
6.67
5.0e6
0.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.28
8.0
8.89
9.66 9.95
9.0
1.00e5
8.00e4
6.00e4
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
Time, min
XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 916.200/777.000 Da fro...
5.71
rEST MRM
21.0
22.0
23.0
Max. 1.1e5 cps.
In te n s ity , c p s
In te n s ity , c p s
XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 933.600/794.300 Da fro...
13.85
10.90
933.2 / 794.2
4.00e4
5.63
1.8e5
1.5e5
1.0e5
24.0
Max. 1.8e5 cps.
rBST 13C6
916.2 / 777.0
5.0e4
2.00e4
0.00
4.0
4.5
5.0
6.5
7.0
7.5
Max. 1.4e5 cps.
5.64
1.4e5
1.2e5
1.0e5
8.0e4
rBST MRM3
913.2 / 774.0 / 791.0
6.0e4
4.0e4
0.0
3.5
4.0
4.5
5.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
Time, min
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 960.469 to 960....
5.5
Time, min
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0e4
rBST MRM3
6.0e4
913.2 / 774.0 / 961.0
7.0
7.5
Max. 9.8e4 cps.
5.60
4.84
4.0e4
0.0
6.5
5.66
9.8e4
4.51
2.0e4
4.68 4.83
2.0e4
0.0
In te n s ity , c p s
5.5
6.0
Time, min
XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 790.190 to 790....
In te n s ity , c p s
3.5
3.5
4.0
4.5
6.01
5.0
5.5
Time, min
6.0
6.45
6.5
7.0
7.5
Curva de calibración
Conclusiones
• La espectrometría de masas permite un nuevo enfoque para la detección
selectiva de rBST en leche,
• A diferencia de los métodos clásicos, permite diferenciar la forma nativa BST
de la recombinante rBST
• Esto es un paso importantísimo para el control del uso (indebido) de esta
hormona en la producción de leche
• El método presentado podría mejorarse, especialmente en la preparación de
muestra para mejorar el porcentaje de recuperación de la rBST y mejorar
aun más los límites de detección. Esto incluye el proceso de digestión con
tripsina.
• La detección utilizando tecnología MS3 permite reducir significativamente
interferencias de matriz, mejorando la relación S/N obtenida.
GERENCIA DE
CAPACITACIÓN Y APLICACIONES
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