universidad autónoma de coahuila facultad de ciencias químicas

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE COAHUILA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
APUNTES DE APOYO PARA EL CURSO DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL.
PROGRAMA EDUCATIVO: QUÍMICO
FARMACOBIÓLOGO
IV SEMESTRE
AUTOR. DR. GERARDO DE JESÚS SOSA
SANTILLÁN
ELABORADO: ENERO DE 2006.
MODIFICADO: ENERO 2007.
SALTILLO, COAHUILA, MÉXICO
ÍNDICE
I. Introducción a la Microbiología……………………………….…………………….
1.1 El Descubrimiento de los Microorganismos………………..……………………
1.2 El Conflicto de la Generación Espontánea…………………...…………………
1.3 El Reconocimiento del Papel de los Microorganismos en el Desarrollo de
Enfermedades…………………………………………………………………………..
1.4 El Descubrimiento del Efecto Microbiano Sobre la Materia Orgánica e
Inorgánica………………………………………………………………………………..
1.5 Composición del Mundo Microbiano……………………………………………..
1.6 Relevancia de la Microbiología en la Vida Diaria……………………………….
II. Estudio de la Estructura Microbiana……………………………………………….
2.1 Microscopio Óptico (de Campo Claro, de Campo Oscuro, de Contraste de
Fases, de Fluorescencia)………………………………………………………………
2.2 Preparación y Tinción de Muestras (Fijación, Colorantes y Tinción Simple,
Tinción Diferencial)……………………………………………………………………..
2.3 Microscopia Electrónica……………………………………………………………
Pág
1
1
1
3
5
6
8
9
9
12
14
III. Estructura y Función de la Célula Procariota……………………………………
3.1 Tamaño, Forma y Organización Procariota……………………………………..
3.2 Membranas de Células Procariotas (Membrana Plasmática y Sistemas de
Membranas Internas)............................................................................................
3.3 Matriz Citoplasmática......................................................................................
3.4 Nucleoide........................................................................................................
3.5 Pared Celular Procariota.................................................................................
3.6 Componentes Externos a la Pared Celular.....................................................
3.7 Quimiotaxis.....................................................................................................
3.8 Endospora Bacteriana.....................................................................................
16
16
17
20
22
23
27
31
32
IV. Nutrición Microbiana………………………………………………………………..
4.1 Requerimientos Comunes de Nutrientes………………………………………..
4.2 Tipos Nutricionales de Microorganismos………………………………………..
4.3 Factores de Crecimiento…………………………………………………………..
4.4 Toma de Nutrientes por la Célula………………………………………………...
4.5 Medios de Cultivo…………………………………………………………………..
4.6 Aislamiento de Cultivos Puros……………………………………………………
35
35
38
40
40
45
47
V. Crecimiento Microbiano…………………………………………………………….
5.1 Curva de Crecimiento……………………………………………………………...
5.2 Medición del Crecimiento Microbiano……………………………………………
5.3 Productividad del Crecimiento y Efecto del Nutriente Limitante………………
5.4 Cultivo Continuo de Microorganismos…………………………………………...
5.5 Crecimiento Balanceado y No Balanceado……………………………………..
5.6 Influencia de Factores Ambientales Sobre el Crecimiento Microbiano………
50
50
54
56
57
59
59
i
VI. Control de Microorganismos por Agentes Físicos y Químicos........................
6.1 Patrón de Muerte Microbiana..........................................................................
6.2 Condiciones que Influyen Sobre la Efectividad de la Actividad de Agentes
Microbianos……………………………………………………………………………...
6.3 Uso de Métodos Físicos en Control……………………………………………...
6.4 Uso de Agentes Químicos en Control……………………………………………
6.5 Evaluación de la Efectividad de Agentes Antimicrobianos…………………….
66
67
67
VII. Microorganismos Como Componentes del Medio Ambiente…………………
7.1 Microorganismos y la Estructura de los Ambientes Naturales………………
7.2 Estado Fisiológico de los Microorganismos en el Medio Ambiente…………..
7.3 Procesos de Reciclamiento de Nutrientes………………………………………
7.4 Interacciones en la Utilización de Recursos…………………………………….
7.5 Sustratos Orgánicos Utilizados por los Microorganismos……………………..
78
78
80
81
85
86
VIII. Hongos. Generalidades…………………………………………………………..
8.1 Hongos Filamentosos. Mohos…………………………………………………….
8.2 Hongos Unicelulares. Las Levaduras……………………………………………
8.3 Hongos Mucosos…………………………………………………………………...
87
88
89
90
IX. Protozoarios. Generalidades………………………………………………………
9.1 Mastigophora. Los Flagelados……………………………………………………
9.2 Sarcodina. Las Amebas…………………………………………………………...
9.3 Ciliophora. Los Ciliados……………………………………………………………
9.4 Sporozoa (Apicomplejos)………………………………………………………….
92
93
93
94
95
X. Virus. Introducción y Características Generales…………………………………
10.1 Propiedades Generales de los Virus…………………………………………...
10.2 Genomas Víricos………………………………………………………………….
10.3 Hospederos de Virus y Taxonomía……………………………………………..
96
96
97
97
Referencias Bibliográficas……………………………………………………………..
99
68
72
76
ii
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA.
1.1 El descubrimiento de los microorganismos.
Incluso antes de que los microorganismos fueran vistos, algunos investigadores
sospecharon de su existencia y los responsabilizaron de las enfermedades. Entre
otros, el filósofo Romano Lucrecius (98-55 A.C.) y el físico Girolamo Fracastoro
(1478-1553) sugirieron que las enfermedades eran causadas por criaturas vivas
invisibles. Las primeras observaciones microscópicas fueron hechas al parecer entre
1625 y 1630 por el Italiano Francesco Stelluti, utilizando un microscopio facilitado
muy probablemente por Galileo. Sin embargo, la primera persona en observar y
describir microorganismos de manera sistemática fue el microscopista Holandés
Antonio van Leeuwenhoek (1632-1723). Leeuwenhoek se ganaba la vida como
comerciante de telas, pero gasto gran parte de su tiempo construyendo microscopios
simples compuestos de lentes dobles convexos montados entre dos placas de plata.
Sus microscopios podían amplificar de 50 a 300 veces y se podían mantener
iluminadas sus muestras líquidas colocándolas entre dos piezas de vidrio e
incidiendo la luz sobre ellas en un ángulo de 450 con respecto al plano de la muestra.
Esto pudo haber proporcionado una forma de iluminación parecida a la de campo
oscuro e hizo a las bacterias claramente visibles. A principios de 1673 Leeuwenhoek
envió cartas detalladas describiendo sus observaciones a la Real Sociedad de
Londres; de acuerdo con dichas descripciones, es claro que él observó tanto
bacterias como protozoarios.
1.2 El conflicto de la generación espontánea.
Desde tiempos muy remotos, la gente había creído en la generación
espontánea, esto es, que los organismos vivos podrían desarrollarse a partir de
materia no viva. Incluso el gran Aristóteles (384-322 A.C.) pensaba que algunos
invertebrados simples se originaban por generación espontánea. Esta visión fue
finalmente cambiada por Francesco Redi (1626-1697) quien llevó a cabo una serie
de experimentos sobre la descomposición de la carne y su habilidad para producir
larvas espontáneamente. Redi colocó carne en tres contenedores: uno no estaba
cubierto, el segundo fue cubierto con papel y el tercero fue cubierto con una gasa
fina que podía excluir las moscas. Las moscas dejaron sus huevecillos en la carne al
descubierto y se generaron larvas; las otras dos piezas de carne no produjeron
larvas de manera espontánea. Sin embargo, las moscas fueron atraídas hacia el
contenedor cubierto con gasa y dejaron sus huevecillos sobre ésta; estos huevecillos
produjeron larvas. Así, la generación de larvas como resultado de la descomposición
de la carne es debida a la presencia de huevecillos de moscas, y por lo tanto la carne
no genera larvas de manera espontánea como se creía. Experimentos similares
realizados por otros científicos ayudaron a desacreditar la teoría al menos en lo que
se refiere a organismos grandes.
1
El descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek renovó la
controversia. Algunos propusieron que los microorganismos se generaban por
generación espontánea, incluso aunque los organismos de gran tamaño no lo
hicieran. Ellos pensaban que los extractos hervidos de carne podían dar origen a
microorganismos si se dejaban en reposo por un rato. En 1748 el sacerdote Inglés
John Needham (1713-1781) reportó el resultado de sus experimentos sobre
generación espontánea. Needham calentó caldo de carnero y luego tapó
herméticamente los frascos. Eventualmente muchos de los frascos de volvieron
turbios y contenían microorganismos. Él pensó que la materia orgánica contenía una
fuerza vital que podía conferir las propiedades de vida a materia no viva. Unos
cuantos años más tarde el sacerdote y naturalista Italiano Lázaro Spallanzani (17291799) mejoró el diseño experimental de Needham sellando primero los frascos de
vidrio que contenían agua y semillas. Si los frascos sellados eran colocados en agua
hirviendo por 45 minutos, no había crecimiento mientras permanecieran sellados. Él
propuso que el aire acarreaba gérmenes al medio de cultivo. Sin embargo, quienes
apoyaban la teoría de la generación espontánea sostenían que calentar el aire en los
frascos sellados destruía su habilidad para soportar la vida.
Diversos investigadores intentaron rebatir tales argumentos, aunque con poco
éxito. En 1859 el naturalista francés Félix Pouchet afirmó haber realizado
experimentos que determinaban de manera concluyente que el crecimiento
microbiano podía ocurrir sin contaminación debida al aire. Está afirmación provocó
que Luis Pasteur (1822-1895) se decidiera a intentar resolver esta situación de una
vez por toda. Pasteur primero filtró aire a través de algodón y encontró que algunos
objetos que asemejaban esporas de plantas habían sido atrapados. Si un pedazo de
este algodón se colocaba en medio estéril, aparecía crecimiento microbiano.
Enseguida él colocó solución nutritiva en frascos, calentó sus cuellos en una flama y
los dobló en una variedad de curvas mientras mantenía el extremo del cuello abiertos
a la atmósfera. Pasteur calentó luego las soluciones por unos cuantos minutos y
permitió que se enfriaran. No hubo crecimiento aún y cuando los contenidos de los
frascos estaban expuestos al aire. Pasteur señaló que el crecimiento no se
presentaba porque el polvo y gérmenes habían sido atrapados en las paredes del
cuello curvo de los frascos. Si los cuellos eran rotos, el crecimiento comenzaba
inmediatamente. Pasteur no sólo resolvió la controversia en 1861, sino que también
mostró cómo mantener estériles las soluciones.
El científico Inglés John Tyndall (1820-1893) puso punto final al asunto de la
generación espontánea en 1877 al demostrar que el polvo acarreaba gérmenes y
que, si el polvo estaba ausente, los cultivos permanecían estériles incluso si eran
expuestos al aire. Durante el curso de sus estudios, Tyndall proporcionó evidencia de
formas bacterianas excepcionalmente resistentes al calor. Trabajando
independientemente, el botánico Alemán Ferdinand Cohn (1828-1898) demostró la
existencia de endosporas bacterianas resistentes al calor.
2
1.3 El reconocimiento del papel de los microorganismos en el desarrollo de
enfermedades.
Aunque Fracastoro y algunos otros habían sugerido que organismos invisibles
producían las enfermedades, la mayoría creía que las enfermedades eran causadas
por fuerzas sobrenaturales, vapores venenosos llamados miasmas y el desbalance
entre los cuatro humores presentes en el cuerpo (sangre, flema, bilis amarilla o
cólera y bilis negra o melancolía). Los apoyos a la teoría de los gérmenes como
productores de enfermedades comenzaron a acumularse a principios del siglo XIX.
Agostino Bassi (1773-1856) fue el primero en mostrar que un microorganismo podría
ser el causante de una enfermedad cuando demostró que una enfermedad en el
gusano de seda era debida a una infección por hongos. Él también sugirió que
muchas enfermedades eran causadas por hongos. Después de su éxito con el
estudio de las fermentaciones, Pasteur fue llamado por el gobierno francés para
investigar una enfermedad en el gusano de seda que estaba acabando con la
industria de la seda. Después de varios años de trabajo, demostró que la
enfermedad era debida a un protozoario parásito. La enfermedad fue controlada
desarrollando gusanos a partir de huevecillos de palomillas sanas.
Evidencia indirecta de que los microorganismos eran agentes causantes de
enfermedades humanas derivó de los estudios del cirujano Inglés Joseph Lister
(1827-1912) sobre la prevención de infecciones en heridas. Lister, impresionado con
los trabajos de Pasteur sobre fermentaciones y putrefacción, desarrolló un sistema
de cirugía antiséptica diseñado para prevenir la entrada de microorganismos en las
heridas. Los instrumentos eran esterilizados por calor y el fenol era utilizado sobre
las ropas quirúrgicas y asperjado a intervalos de tiempo sobre el área de cirugía.
Este sistema fue notablemente exitoso y transformó a la cirugía después de que
Lister publicó sus trabajos en 1867. Esto también proporcionó fuerte evidencia
indirecta del papel de los microorganismos en las enfermedades debido a que el
fenol, el cual mataba bacterias, también prevenía la infección de las heridas.
La primera demostración directa del papel de las bacterias como causantes de
enfermedades llegó con los estudios del ántrax por el científico Alemán Robert Koch
(1843-1910). Koch utilizó los criterios propuestos por su maestro y formador Jacob
Henle (1809-1885) para establecer la relación entre Bacillus anthracis y el ántrax y
publicó sus hallazgos en 1876. Koch inyectó ratones sanos con material proveniente
de animales enfermos, y los ratones se enfermaron. Después de transferir ántrax por
inoculación a través de una serie de 20 ratones, incubó un fragmento de bazo que
contenía el bacilo del ántrax en suero de carne de res. Los bacilos crecieron, se
reprodujeron y produjeron esporas. Cuando bacilos aislados o esporas fueron
inyectados en los ratones, el ántrax se desarrolló. Sus criterios para probar la
relación causal entre un microorganismo
y una enfermedad específica son
conocidos como Postulados de Koch y pueden resumirse como sigue:
3
1.
2.
3.
4.
El microorganismo debe estar presente en cada caso de enfermedad,
pero ausente en organismos sanos.
El microorganismo sospechoso debe ser aislado y crecido en cultivo
puro.
La misma enfermedad debe resultar cuando el microorganismo aislado
es inoculado en un hospedero sano.
El mismo microorganismo debe ser aislado otra vez a partir del
hospedero enfermo.
Aunque Koch utilizó lo descrito en sus postulados durante sus estudios sobre el
ántrax, él no los estableció completamente hasta 1884 en su publicación sobre la
tuberculosis.
Durante los estudios de Koch sobre las enfermedades bacterianas se volvió
necesario aislar bacterias patógenas en suspensión. Al principio él cultivo las
bacterias en la superficie estéril de papas cortadas y hervidas. Esto no era
satisfactorio debido a que las bacterias no siempre crecían bie sobre las papas.
Luego intentó solidificar medio líquido regular añadiendo gelatina. Colonias
separadas de bacterias se desarrollaban después de que la superficie era estriada
con una muestra de bacterias. La muestra podía también ser mezclada con el medio
de gelatina líquida; cuando la gelatina solidificaba bacterias individuales
desarrollaban colonias separadas. A pesar de sus ventajas, la gelatina no era el
agente solidificante ideal debido a que era digerida por muchas bacterias y se
derretía a temperaturas superiores a 280C. Una mejor alternativa fue proporcionada
por Fannie Eilshemius Hesse, esposa de Walter Hesse, uno de los asistentes de
Koch. Ella sugirió el uso de agar como agente solidificante ya que ella lo había
utilizado de manera exitosa durante algún tiempo para hacer jaleas. El agar no era
atacado por la mayoría de las bacterias y no se derretía sino hasta alcanzar una
temperatura de 1000C. Uno de los asistentes de Koch, Richard Petri, desarrolló la
caja petri, un contenedor para medio de cultivo sólido. Estos desarrollos hicieron
posible el aislamiento de cultivos puros que contenían sólo un tipo de bacteria, y
estimularon de manera directa el progreso en todas las áreas de la bacteriología.
Koch también desarrolló medios adecuados para crecer bacterias aisladas del
cuerpo. Debido a su similitud con los fluidos corporales, los extractos de carne y
digeridos de proteínas fueron usados como fuentes de nutrientes. El resultado fue el
desarrollo de caldos nutritivos y del agar nutritivo, medios que son utilizados
ampliamente aún en la actualidad.
Para 1882 Koch había utilizado estas técnicas para aislar el bacilo que cusa la
tuberculosis. A esto le siguió una edad de oro de cerca de 30 a 40 años en los
cuales la mayor parte de los principales patógenos bacterianos fueron aislados.
El descubrimiento de los virus y su papel en las enfermedades fue hecho
posible cuando Charles Chamberland (1851-1908), uno de los asociados de Pasteur,
construyó un filtro bacteriano de porcelana en 1884. El primer patógeno viral en ser
estudiado fue el virus de la enfermedad del mosaico del tabaco.
4
En este período también se hicieron progresos en la determinación de cómo los
animales resisten a las enfermedades y en el desarrollo de técnicas para proteger a
los humanos y al ganado contra patógenos. Durante sus estudios sobre el cólera en
pollos, Pasteur y Roux descubrieron que incubando sus cultivos por intervalos largos
entre transferencias, podían atenuar las bacterias, lo cual significa que éstas habían
perdido su capacidad para causar la enfermedad. Si los pollos eran inyectados con
estos cultivos atenuados, permanecían saludables y desarrollaban la habilidad de
resistir a la enfermedad. Ellos llamaron vacuna a los atenuados (del latín vacca,
vaca) en honor de Edward Jenner quien, muchos años antes, había usado la
vacunación con materia proveniente de lesiones de viruela de ganado para proteger
a la gente contra la viruela. Poco después de esto, Pasteur y Chamberland
desarrollaron una vacuna atenuada de ántrax por dos caminos distintos: tratando los
cultivos con dicromato de potasio, y por incubación de las bacterias a 42-430C.
Poco después Pasteur preparó vacunas contra la rabia por una vía distinta. El
patógeno fue atenuado haciéndolo crecer en un hospedero no común, el conejo.
Después de que los conejos infectados murieron, sus cerebros y médula espinal
fueron removidas y deshidratadas. Durante el curso de estos estudios, Joseph
Meister, un niño de nueve años de edad que había sido mordido por un perro
rabioso, fue llevado a Pasteur. Puesto que la muerte del niño era irremediable en
ausencia de un tratamiento, Pasteur estuvo de acuerdo en aplicar su vacuna. Joseph
fue inyectado 13 veces en los siguientes 10 días con preparaciones con virulencia
creciente del virus atenuado. El niño sobrevivió.
La lucha contra las enfermedades infecciosas estaba en marcha, y la ciencia
disponía ya de armas para hacerles frente.
1.4 El descubrimiento del efecto microbiano sobre la materia orgánica e
inorgánica.
Aunque Theodore Schwann (1810-1882) y otros habían propuesto en 1837 que
las células de levadura eran responsables de la conversión de azúcar a alcohol, un
proceso llamado fermentación alcohólica, los químicos más relevantes de la época
creían que los microorganismos no tenían nada que ver en el asunto. Ellos estaban
convencidos de que la fermentación era debida a una inestabilidad química que
degradaba los azúcares a alcohol. Pasteur no estaba de acuerdo. Al parecer Pasteur
se interesó en las fermentaciones muy temprano en su carrera debido a sus
investigaciones sobre la actividad óptica de las moléculas. Él creía que las
fermentaciones eran realizadas por organismos vivos y producían productos
asimétricos tales como el alcohol amílico que tenían actividad óptica. Había una
íntima conexión entre la asimetría molecular, la actividad óptica y la vida. Entonces,
en 1885 M. Bigo, un industrial francés requirió la ayuda de Pasteur. Su negocio era la
producción de etanol por fermentación a partir de remolacha y el alcohol producido
había declinado recientemente y el producto se había acidificado. Pasteur descubrió
que la fermentación fallaba porque la levadura normalmente responsable de la
formación de alcohol había sido reemplazada por microorganismos productores de
5
ácido láctico más que de etanol. Al resolver este problema práctico, Pasteur
demostró que todas la fermentaciones eran debidas a actividades de levaduras y
bacterias específicas, reportando sus trabajos en diversos artículos sobre
fermentaciones entre 1857 y 1860. Su éxito lo llevo al estudio de las enfermedades
del vino y al desarrollo de la pasteurización para preservar el vino durante su
almacenamiento. Los estudios de Pasteur sobre fermentación continuaron durante
casi 20 años. Uno de sus más importantes descubrimientos fue que algunos
microorganismos fermentativos eran anaerobios y podían vivir sólo en ausencia de
oxígeno, mientras que otros eran capaces de vivir tanto aerobia como
anaeróbicamente.
Unos pocos de los primeros microbiólogos escogieron investigar el papel
ecológico de los microorganismos. En particular estudiaron los microorganismos
involucrados en los ciclos del carbono, nitrógeno y azufre que tiene lugar en el suelo
y en ambientes acuáticos. Dos de los pioneros en este tema fueron Sergei N.
Winogradsky (1856-1953) y Martinus W. Beijerinck (1851-1931).
El microbiólogo ruso Sergei N. Winogradsky hizo muchas contribuciones a la
microbiología del suelo. Descubrió que las bacterias del suelo podían oxidar hierro,
azufre y amonio para obtener energía, y que muchas bacterias podían incorporar
CO2 como materia orgánica tal y como lo hacían muchos organismos fotosintéticos.
Winogradsky también aisló bacterias del suelo anaerobias fijadoras de nitrógeno y
estudió la descomposición de la celulosa.
Martines W. Beijerinck fue uno de los grandes microbiólogos generales que hizo
aportaciones fundamentales a la ecología microbiana y muchos otros campos. Él
aisló la bacteria anaerobia fijadora de nitrógeno Azotobacter; una bacteria de nódulos
de raíz capaz de fijar nitrógeno (llamada posteriormente Rhizobium); y bacterias
sulfato reductoras. Beijerinck y Winogradsky desarrollaron la técnica de cultivo
enriquecido y el uso de medios selectivos, los cuales han sido de gran importancia
en el desarrollo de la microbiología.
1.5 Composición del mundo microbiano.
Existen dos tipos fundamentales de células. Las células procariotas (organismos
con un núcleo primordial) tienen una morfología mucho más simple que los
organismos eucariotas y carecen de una verdadera membrana que delimite el
núcleo. Todas las bacterias son procariotas. En contraste, las células eucariotas
tienen una membrana que rodea al núcleo y son morfológicamente más complejas y
usualmente más grandes que las procariotas. Algas, hongos, protozoarios, plantas
superiores y animales son eucariotas.
La antigua descripción de los organismos como plantas o animales es
claramente demasiado simple, y por muchos años los biólogos han dividido a los
organismos en cinco reinos:
6
1. Los organismos procariotas se encuentran en el reino Monera o
Procaryotae.
2. El reino Protista contiene organismos eucariotas unicelulares o coloniales
que carecen de tejidos verdaderos. Los protozoarios, los hongos inferiores, y
la mayoría de las algas microscópicas están colocados en este reino.
3. Los miembros del reino Fungi son organismos eucariotas que se nutren por
absorción y a menudo son multinucleados. Los hongos superiores
pertenecen a este reino.
4. El reino Animalia contiene animales multicelulares con nutrición por
ingestión.
5. Las plantas multicelulares con células eucariotas poseedoras de pared
celular y fotosíntesis se localizan en el reino Plantae.
En las últimas décadas se han hecho grandes progresos en tres áreas que
afectan profundamente la clasificación de los microorganismos. Primero, Se ha
aprendido mucho sobre la estructura a detalle de las células microbianas con el uso
de la microscopia electrónica. Segundo, los microbiólogos han determinado las
características bioquímicas y fisiológicas de muchos microorganismos diferentes.
Tercero, se han comparado las secuencias de proteínas y RNA ribosomal de una
amplia variedad de organismos. Está claro ahora que hay dos grupos de organismos
procariotas con diferencias importantes: eubacterias y archaeobacterias. Más aún, el
reino Protista es tan diverso que puede ser necesario dividirlo en tres o más reinos.
Así, muchos taxónomos han concluido que el sistema de cinco reinos es demasiado
simple. Un sistema de clasificación más reciente divide a los organismos en dos
imperios y ocho reinos.
Imperio Bacteria
1. Reino Eubacteria. Bacterias verdaderas.
2. Reino Archaeobacteria. Bacterias ancestrales, por lo general extremófilas.
Imperio Eucaryota
3. Reino Archezoa. Organismos primitivos eucariotas unicelulares, tales como
Giardia, que tienes ribosomas 70S y carecen de aparato de Golgi,
mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas.
4. Reino Protozoa. Protozoarios complejos.
5. Reino Chromista. Organismos fotosintéticos que tiene sus cloroplastos
dentro del lumen del retículo endoplasmático rugoso y no en la matriz
citoplasmática.
6. Reino Fungi. Organismos eucariotas que se nutren por absorción y a
menudo son multinucleados. Los hongos superiores pertenecen a este reino.
7. Reino Plantae. Plantas multicelulares con células eucariotas poseedoras de
pared celular y fotosíntesis.
8. Reino Animalia. Animales multicelulares con nutrición por ingestión.
7
1.6 Relevancia de la microbiología en la vida diaria.
Los microorganismos son excepcionalmente diversos, se encuentran casi donde
sea y afectan a las sociedades humanas de incontables maneras. Así, la
microbiología moderna es una disciplina compleja con muchas diferentes
especialidades; tiene gran impacto en medicina, agricultura y ciencias alimentarias,
ecología, genética, bioquímica y muchos otros campos.
La microbiología tiene aspectos tanto básicos como aplicados. Muchos
microbiólogos tienen un interés primario en la biología de los microorganismos en si
mismos. Ellos pueden centrarse en un grupo específico de microorganismos y
convertirse en virólogos (virus), bacteriólogos (bacterias), ficólogos o algólogos
(algas), micólogos (hongos) o protozoologos (protozoarios). Otros están interesados
en la morfología microbiana o en procesos funcionales particulares y trabajan en
campos tales como citología microbiana, fisiología microbiana, ecología microbiana,
genética y biología molecular
microbiana, y taxonomia microbiana. Muchos
microbiólogos tienen una orientación más aplicada y trabajan sobre problemas
prácticos en campos tales como la microbiología médica, microbiología de alimentos
o de la leche, microbiología de salud pública, biotecnología, microbiología industrial e
ingeniería genética, entre otros.
El futuro de la microbiología es brillante. Con el advenimiento de la tecnología
del DNA recombinante la microbiología se expandirá y cambiará mucho más rápido
en el futuro. La necesidad de microbiólogos para trabajar en problemas de medicina,
protección ambiental, producción y conservación de alimentos y en el desarrollo
industrial, crecerá indudablemente. El microbiólogo René Dubos ha resumido bien lo
prometedor de la microbiología:
“Cuan extraordinario es que, en todo el mundo, los microbiólogos están
ahora involucrados en actividades tan diferentes como el estudio de la
estructura genética, el control de enfermedades, y los procesos
industriales basados en las fenomenales habilidades de los
microorganismos para descomponer y sintetizar moléculas orgánicas
complejas. La microbiología es una de las profesiones más reconfortantes
debido a que da a quienes la practican a oportunidad de estar en contacto
con todas las demás ciencias naturales y contribuir así de muchas
maneras diferentes al mejoramiento de la calidad de vida humana.”
8
CAPÍTULO II. ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA MICROBIANA
Usualmente la microbiología se relaciona con organismos tan pequeños que
no pueden ser distinguidos con el ojo desnudo. Debido a la naturaleza de esta
disciplina, el microscopio es de importancia crucial: mucho de lo que se conoce de
los microorganismos ha sido descubierto gracias a los microscopios. Así, es
importante entender cómo trabajan los microscopios y la manera en la cual los
especimenes son preparados para su observación.
2.1 Microscopio óptico (de campo claro, de campo oscuro, de contraste de
fases, de fluorescencia).
Los microbiólogos emplean una variedad de microscopios ópticos (de luz) en
su trabajo; los de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases y de
fluorescencia son los utilizados más comúnmente. Los microscopios modernos son
todos compuestos, esto es, la imagen amplificada formada por los lentes del objetivo
es posteriormente agrandada por uno o más lentes adicionales.
Microscopio de campo claro.
El microscopio ordinario es llamado de campo claro debido a que se genera
una imagen oscura sobre un fondo brillante. El microscopio consiste en un cuerpo
robusto de metal compuesto de una base y un brazo en el cual se fijan el resto de las
partes. Una fuente de luz, que puede ser un espejo o un iluminador electrónico, se
localiza en la base. Dos botones, el de ajuste grueso y el de ajuste fino (llamados
tornillos macro y micrométrico, respectivamente) están localizados sobre el brazo y
pueden moverse para enfocar la imagen.
La platina está localizada en la parte media del brazo y en ella se colocan las
laminillas de observación, sujetas por un clip simple o por un clip mecánico. El clip
mecánico permite al operador mover una laminilla en cuatro direcciones (atrás,
adelante, derecha e izquierda) durante la observación. El condensador de la platina
está montado dentro o por debajo de la platina y su función es transmitir un cono de
luz sobre la muestra. A menudo su posición es fija en los microscopios simples, pero
puede ajustarse verticalmente en los modelos más avanzados.
La curvada parte superior del brazo sostiene el revólver y uno o más oculares.
Los microscopios más avanzados tienen oculares para ambos ojos y son llamados
microscopios binoculares. El cuerpo del ocular contiene en sí mismo una serie de
espejos y prismas y el tubo que los sostiene puede estar inclinado para facilitar la
observación. El revólver sostiene de tres a cinco objetivos con lentes de diferente
poder de amplificación y pueden ser rotados para posicionar cualquiera de ello
debajo del cuerpo del ocular. Idealmente un microscopio deber ser parfocal, esto es,
que la imagen debe permanecer enfocada cuando los objetivos son cambiados.
Las lentes de los objetivos forman una imagen real amplificada dentro del
microscopio, y las lentes del ocular amplifican aún más esta imagen primaria. El
9
aumento total es calculado multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del
ocular. Por ejemplo, si se utiliza el objetivo 45x con un ocular 10x, el aumento total de
la muestra será de 450x.
La parte más importante del microscopio es el objetivo, el cual debe producir
una imagen clara y no sólo amplificarla. Por ello, la resolución es extremadamente
importante. La resolución es la capacidad de una lente para separar o distinguir entre
dos objetos pequeños que están demasiado cerca uno del otro. Mucho de la teoría
óptica respecto al diseño de microscopios fue desarrollada por el físico Alemán Ernst
Abbé en los 1870’s. La distancia mínima (d) entre dos objeto que los revela como
entidades separadas está dada por la ecuación de Abbé en la cual lambda (λ) es la
longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra y (nsenθ) es la apertura
numérica (AN).
d=
0.5λ
nsenθ
Conforme d se vuelve más pequeña, la resolución se incrementa y pueden
discernirse detalles más finos de la muestra. La ecuación anterior indica que el
principal factor en la resoluciones la longitud de onda de la luz empleada. La longitud
de onda debe ser más corta que la distancia entre dos objetos o éstos no serán
vistos claramente. Así, la mayor resolución se obtiene con luz de longitud de onda
más corta, la del extremo azul del espectro visible (en el rango de 450 a 500 nm).
Normalmente, un microscopio está equipado con tres o cuatro objetivos en el
rango de 4x a 100x. La distancia de trabajo de un objetivo es la distancia entre la
superficie frontal de la lente y la superficie del cubreobjetos (si es utilizado) o de la
muestra cuando está enfocada. Los objetivos con apertura numérica grande y gran
poder de resolución tienen distancias de trabajo pequeñas.
La mayoría de los microscopios estándar vienen con ocular de 10x y tiene un
límite superior de amplificación de 1000x con aceite de inmersión. Un ocular de 15x
puede usarse con objetivos adecuados y obtener una amplificación de 1500x.
Cualquier aumento superior no capacita a la persona para observar más detalles.
Puede construirse un microscopio de luz capaz de amplificar hasta 10,000x, pero se
estaría amplificando simplemente una imagen borrosa. Sólo el microscopio
electrónico proporciona suficiente resolución para hacer útil tan alta capacidad de
amplificación.
La siguiente tabla muestra las propiedades de los objetivos más comunes del
microscopio de luz.
10
Propiedades
Amplificación
De escaneo
4x
Apertura numérica
Longitud focal aproximada (f)
Distancia de trabajo
Poder de resolución aproximado
con luz de 450 nm (azul)
Objetivo
Seco débil
Seco fuerte
10x
40-45x
De inmersión
90-100x
0.10
0.25
0.55-0.65
1.25-1.4
40 mm
16 mm
4 mm
1.8-2.0 mm
17-20 mm
4-8 mm
0.5-0.7 mm
0.1 mm
2.3 µ
0.9 µ
0.35 µ
0.18 µ
Microscopio de campo oscuro.
Células y organismos vivos no teñidos pueden ser observados simplemente
cambiando la manera en la cual son iluminados. Un cono hueco de luz es enfocado
sobre la muestra de manera tal que la luz no reflejada y no refractada no entra al
objetivo. Sólo la luz que ha sido reflejada o refractada por la muestra forma una
imagen. El campo alrededor de la muestra aparece negro, mientras que el objeto a
observar está brillantemente iluminado; debido a que el fondo es negro, este tipo de
microscopia es llamada microscopia de campo oscuro. Considerables estructuras
internas son visibles en microorganismos eucariotas. El microscopio de campo
oscuro es utilizado para identificar bacterias tales como Treponema palidium, el
agente causante de la sífilis.
Microscopio de contraste de fases.
Las células vivas no pigmentadas no son claramente visibles en el
microscopio de campo claro debido a que hay poca diferencia en contraste entre las
células y el agua. Así, los microorganismos a menudo deben ser fijados y teñidos
antes de ser observados para incrementar el contraste y crear variaciones en color
entre las estructuras celulares. Un microscopio de contraste de fases convierte
pequeñas diferencias en el índice de refracción y de densidad celular en variaciones
de intensidad de luz fácilmente detectables y es una excelente manera de observar
células vivas.
El condensador de un microscopio de contraste de fases tiene un alto anular,
un disco opaco con un delgado anillo transparente el cual produce un cono hueco de
luz. Conforme este cono pasa a través de la célula, algunos rayos de luz son
curvados debido a variaciones en densidad e índice de refracción dentro de la
muestra y son retardados cerca de ¼ de longitud de onda. La luz desviada es
enfocada para formar una imagen del objeto. El fondo de la imagen, formado por la
luz no desviada, es brillante, mientras que los objetos no teñidos aparecen oscuros y
bien definidos. A menudo se utilizan filtros de color para mejorar la imagen.
El microscopio de contraste de fase es especialmente útil para la detección de
componentes bacterianos tales como endosporas o inclusiones que contienen poli-β-
11
hidroxibutirato, polimetafosfato, azufre y otras sustancias. Éstas son claramente
visibles debido a que tiene índices de refracción marcadamente diferentes al del
agua. El microscopio de contraste de fases es también ampliamente utilizado para el
estudio de células eucariotas.
Microscopio de fluorescencia.
Los microscopios hasta ahora considerados producen una imagen a partir de
la luz que pasa a través de la muestra. Un objeto también puede ser observado
debido a que emite luz, y esto es la base del microscopio de fluorescencia. Cuando
algunas moléculas absorben energía radiante se excitan y después liberan la energía
capturada como luz. Cualquier luz emitida por una molécula excitada tendrá una
menor longitud de onda (o será de menor energía) que la radiación absorbida
originalmente.
El microscopio de fluorescencia expone una muestra a luz ultravioleta, violeta,
o azul y forma una imagen de los objetos con la luz fluorescente resultante. Una
lámpara de vapor mercurial u otra fuente produce un rayo intenso y el calor
transferido es limitado por un filtro infrarrojo especial. La luz pasa a través de un filtro
excitador que transmite sólo la longitud de onda deseada. Un condensador de campo
oscuro proporciona un campo oscuro contra el cual brillan los objetos fluorescentes.
Usualmente la muestra ha sido teñida con moléculas colorantes llamadas
fluorocromos que fluorescen brillantemente al ser expuestas a luz de una longitud de
onda específica, pero algunos microorganismos son autofluorescentes. El microcopio
forma una imagen a partir de la luz emitida cuando el objeto fluoresce. Un filtro de
barrera posicionado después de las lentes del objetivo remueve cualquier luz
ultravioleta remanente, la cual podría dañar los ojos del observador, o la de color azul
o violeta, la cual podría reducir el contraste de la imagen.
La microscopia de fluorescencia se ha vuelto una herramienta esencial en
microbiología médica y en ecología microbiana.
2.2 Preparación y tinción de muestras (fijación, colorantes y tinción simple,
tinción diferencial).
Aunque los microorganismos vivos pueden ser examinados directamente con
el microscopio de luz, a menudo deben ser fijados y teñidos para incrementar su
visibilidad, acentuando características morfológicas específicas y preservándolas
para su estudio posterior.
Fijación.
Las células teñidas vistas al microscopio deben recordar a la célula viva tanto
como sea posible. La fijación es el proceso mediante el cual las estructuras externas
e internas de las células y microorganismos son preservados y fijados en una
posición definida. Esto inactiva las enzimas que podrían alterar la morfología celular
12
y endurece las estructuras celulares de manera que no cambien durante el teñido y
la observación. El microorganismo es usualmente muerto y adherido firmemente a la
laminilla durante la fijación.
Hay dos tipos fundamentales diferentes de fijación. (1) Los bacteriólogos fijan
las muestras de bacterias al calor, pasando la laminilla, previamente secada al aire,
cuidadosamente por la flama del mechero. Esto preserva adecuadamente la
morfología de las estructuras externas, pero no las estructuras celulares internas. (2)
La fijación química debe ser usada para proteger las finas estructuras subcelulares y
la morfología de microorganismos más grandes y delicados. Los químicos para
fijación penetran las células y reaccionan con los componentes celulares, usualmente
proteínas y lípidos, para volverlos inactivos, insolubles e inmóviles. Las mezclas
comunes para fijación contienen componentes tales como etanol, ácido acético,
cloruro mercúrico, formaldehído y glutaraldehído.
Uso de colorantes.
Los muchos tipos de colorantes usados para teñir microorganismos tiene dos
características en común. (1) Tienen grupos cromóforos, es decir, grupos con dobles
enlaces que dan al colorante su color. (2) Pueden unirse con las células por enlaces
iónicos, covalentes o hidrofóbicos. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente
se une a una estructura celular cargada negativamente.
Los colorantes ionizables pueden dividirse en dos clases generales en base a
la naturaleza de sus grupos cargados.
1. Colorantes básicos. Son catiónicos o tienen grupos cargados positivamente
(usualmente algunos en forma de nitrógeno pentavalente) y se venden
generalmente como sales de cloruro. Los colorantes básicos se unen a
moléculas cargadas negativamente, tales como los ácidos nucleicos y muchas
proteínas. Debido a que la superficie de las células bacterianas está también
cargada negativamente, los colorantes básicos son de los más comúnmente
usados en bacteriología. Dentro de este grupo se encuentran el azul de
metileno, la fucsina básica, el cristal violeta, la safranina y el verde malaquita.
2. Colorantes ácidos. Son aniónicos o poseen grupos cargados negativamente
tales como el carboxilo (-COOH) e hidroxilos fenólicos (-OH). Los colorantes
ácidos, debido a su carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas
positivamente. Dentro de este grupo se encuentran la eosina, el rosa de
bengala y la fucsina ácida.
El pH puede afectar la efectividad del colorante puesto que la naturaleza y el
grado de carga de los componentes celulares cambia con el pH. De esta manera, los
colorantes aniónicos tiñen mejor bajo condiciones de acidez cuando las proteínas y
muchas otras moléculas llevan una carga positiva; los colorantes básicos son más
efectivos a pH altos.
13
Aunque las interacciones iónicas son probablemente el medio más común de
unión de los colorantes, también pueden hacerlo mediante enlaces covalentes o
debido a sus características de solubilidad. El Sudan III (negro sudan), por ejemplo,
tiñe selectivamente los lípidos debido a que es lípido soluble, pero no se disuelve en
las porciones acuosas de la célula.
A menudo los microorganismos pueden ser teñidos de manera satisfactoria
por tinción simple, en la cual se usa sólo un agente de tinción. El valor de la tinción
simple radica en su simplicidad y facilidad de uso. Se cubre la muestra fijada con
colorante durante un tiempo apropiado, se lava el exceso de colorante con agua y se
deja la laminilla a secar. Colorantes básicos como el cristal violeta, el azul de
metileno y la carbolfucsina son frecuentemente usados para determinar el tamaño,
forma y arreglo de las bacterias.
Los procedimientos de tinción diferencial dividen a las bacterias en grupos
separados en base a sus propiedades de tinción. La tinción de Gram, desarrollada en
1884 por el Danés Christian Gram, es el método de tinción más ampliamente usado
en bacteriología. Éste es un procedimiento de tinción diferencial debido a que divide
a las bacterias en dos clases, gram negativos y gram positivos. Otra técnica muy
usada de tinción diferencial es la tinción ácido-resistentes.
2.3 Microscopia electrónica.
Microscopio electrónico de transmisión.
El mejor microscopio de luz tiene un límite de resolución de cerca de 0.2 µ.
Debido a que las bacterias usualmente tienen un diámetro de 1 µ, con este tipo de
microscopio sólo se puede apreciar su forma general y sus principales características
morfológicas. La estructura interna a detalle de los microorganismos más grandes
tampoco puede ser estudiada de manera efectiva con el microscopio de luz. Estas
limitaciones surgen de la naturaleza de la longitud de onda de la luz visible y no de
una inadecuación del microscopio de luz en si mismo.
Hay que recordar que la resolución de un microscopio de luz se incrementa
con una disminución de la longitud de onda de la luz empleada para la iluminación.
Un rayo de electrones se comporta como radiación y puede ser enfocado mucho
mejor que la luz en un microscopio de luz. Si los electrones iluminan la muestra la
resolución del microscopio se incrementa enormemente debido a que la longitud de
onda de la radiación es cercana a 0.005 nm, aproximadamente 100,000 veces más
corta que la de la luz visible. El microscopio electrónico de transmisión tiene una
resolución práctica de aproximadamente 1,000 veces mejor que la del microscopio
de luz; en muchos microscopios electrónicos pueden distinguirse puntos 5 Å ó 0.5
nm cercanos entre sí y la amplificación útil es de casi 100,000x.
Un microscopio electrónico de transmisión moderno (TEM) es complejo y
sofisticado, pero el principio básico detrás de su operación puede ser entendido
14
fácilmente. Un filamento caliente de tungsteno en el emisor de electrones genera un
rayo de electrones que es luego enfocado sobre la muestra por el condensador.
Puesto que los electrones no pueden pasar a través de lentes de vidrio, para enfocar
el rayo se utilizan electromagnetos con forma de dona llamados lentes magnéticos.
La columna que contiene las lentes y la muestra debe estar al alto vacío para lograr
una imagen clara debido a que los electrones son deflectados al colisionar con
moléculas en el aire. La muestra dispersa los electrones cuando pasan a través de
ella y el rayo es enfocado por las lentes magnéticas para formar una imagen
amplificada y visible de la muestra sobre una pantalla fluorescente. Regiones más
densas de la muestra dispersa más electrones y por lo tanto aparece más oscura en
la imagen puesto que pocos electrones golpean esa área de la pantalla. En
contraste, regiones electro-transparentes son más brillantes. La pantalla puede
también ser movida hacia un lado y la imagen capturada en película fotográfica para
su registro.
Microscopio electrónico de barrido.
El microscopio descrito previamente forma una imagen a partir de la radiación
que ha pasado a través de la muestra. El microscopio electrónico de barrido (SEM),
en cambio, ha sido utilizado para examinar la superficie de los microorganismos en
gran detalle; muchos instrumentos tienen una resolución de 7 nm o menos. El SEM
difiere de otros microscopios electrónicos en que produce la imagen a partir de
electrones emitidos por la superficie del objeto, más que de los electrones
transmitidos.
El SEM escanea un rayo de electrones que incide sucesivamente sobre la
muestra. Cuando el rayo golpea un área en particular, los átomos de la superficie
descargan un delgado baño de electrones llamado electrones secundarios los cuales
son atrapados por un detector especial. Los electrones secundarios entran al
detector golpeando un cintilador causando que éste emita flashes de luz que un
fotomultiplicador convierte en una corriente eléctrica y la amplifica. La señal es
enviada a un tubo de rayos catódicos y produce una imagen como de televisión la
cual puede ser vista o fotografiada.
El número de electrones secundarios que alcanzan el detector depende de la
naturaleza de la superficie de la muestra. Cuando el rayo de electrones golpea un
área elevada, un gran número de electrones secundarios entran al detector; en
contraste, pocos electrones escapan a una depresión en la superficie y alcanzan el
detector. Así, las áreas elevadas aparecen más brillantes sobre la pantalla y las
depresiones más oscuras. El resultado es una imagen tridimensional muy realista de
la superficie del microorganismo con gran enfoque y profundidad.
15
CAPÍTULO III. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA CÉLULA PROCARIOTA.
3.1 Tamaño, forma y organización procariota.
Podría esperarse que los organismos pequeños y relativamente simples como
las bacterias fueran uniformes en forma y tamaño. Aunque es verdad que muchas
bacterias son similares en morfología, hay una remarcable cantidad de variaciones.
Se describen aquí los principales patrones morfológicos y algunas variantes
interesantes para la supervivencia bacteriana.
Forma.
Las bacterias más comúnmente encontradas tienen una o dos formas. Los cocos
son células aproximadamente esféricas. Pueden existir como células individuales,
pero también están asociados en arreglos característicos que con frecuencia son
útiles en la identificación de bacterias. Los diplococos se presentan cuando los cocos
se dividen y permanecen juntos formando pares (por ejemplo Neisseria). Cadenas
largas de cocos (estreptococos) resultan cuando las células se adhieren después de
repetidas divisiones en un plano; este patrón se observa en los géneros
Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus. Staphylococcus se divide en planos
aleatorios para formar grupos irregulares como racimos de uvas. La división en dos o
tres planos puede producir grupos simétricos de cocos. Los miembros del género
Micrococcus a menudo se dividen en dos planos para formar grupos cuadrados de
cuatro células llamados tétradas. En el género Sarcina los cocos se dividen en tres
planos produciendo paquetes cúbicos de ocho células.
La otra forma bacterial común es la de bastón, a menudo llamada bacilo. Bacillus
megaterium es un típico ejemplo de una bacteria con forma de bastón. Los bacilos
difieren considerablemente en su ancho y longitud; los cocobacilos son tan cortos y
anchos que parecen cocos. La forma del bastón varía entre especies y puede ser
plana, redondeada, en forma de cigarro, o bifurcada. Aunque muchos bacilos se
presentan solos, pueden permanecer juntos para formar pares o cadenas. Unas
cuantas bacterias con forma de bastón, los vibrios, están curvados para formar
comas distintivas o espirales incompletos.
Las bacterias pueden asumir una gran variedad de formas, aunque a menudo
son simples esferas o bastones. Los Actinomycetes forman de manera característica
largos filamentos multinucleados o hifas que pueden ramificarse para producir una
red llamada micelio. Muchas bacterias tienen forma de largos bastones rotados en
espirales o hélices; éstos son llamados espirilos si son rígidos y espiroquetas si son
flexibles. La bacteria con forma de oval a pera Hyphomicrobium produce un brote en
el extremo de una larga hifa. Unas pocas bacterias son de hecho planas. Por
ejemplo, E. Walsby descubrió una bacteria cuadrada viviendo en pozas saladas. Esta
bacteria tiene forma de caja aplanada, de cuadrada a rectangular, de cerca de 2 µ
por 2 a 4 µ, y sólo 0.25 µ de espesor. Finalmente, algunas bacterias son variables en
forma y carecen de una forma simple y característica. Éstas son llamadas
16
pleomórficas incluso aunque pueden, como Corynebacterium, tener una forma
general semejante a un bastón.
Tamaño.
Las bacterias varían en tamaño mucho más que en forma. Las más pequeñas
(por ejemplo algunos miembros del género Mycoplasma) tienen de 100 a 200 nm de
diámetro, aproximadamente el tamaño de los virus más grandes (los poxvirus).
Escherichia coli, un bacilo de tamaño promedio, es de 1.1 a 1.5 µ de ancho por 2.0 a
6.0 µ de largo. Unas pocas se han vuelto bastante largas; algunas espiroquetas
alcanzan ocasionalmente 500 µ de longitud y la cianobacteria Oscillatoria tiene cerca
de 7 µ de diámetro (el mismo diámetro que un eritrocito). Recientemente, se ha
descubierto una bacteria enorme en el intestino de un pez Acanthurus nigrofuscus
(pez cirujano café). Epulopiscium fishelsoni crece tan grande como 600 µ por 80 µ,
un poco más pequeña que un guión de imprenta. Ahora es claro que unas cuantas
bacterias son mucho más grandes que la célula eucariota promedio.
Organización de la célula procariota.
En las células procariotas se encuentran una variedad de estructuras. No
todas las estructuras se encuentran en cada género. Más aún, las células gram
negativas y las gram positivas difieren, particularmente con respecto a su pared
celular. A pesar de estas variaciones, las células procariotas son consistentes en su
estructura fundamental y en sus componentes más importantes.
Casi siempre las células procariotas están limitadas por una pared celular
químicamente compleja. Dentro de esta pared, y separada por un espacio
periplásmico, se encuentra la membrana plasmática. Esta membrana puede estar
invaginada para formar estructuras membranales internas simples. Puesto que las
células procariotas no contienen organelos membranales internos, su interior parece
morfológicamente simple. El material genético está localizado en una región discreta,
el nucleoide, y no está separado del citoplasma circundante por membranas. Los
ribosomas y las inclusiones citoplasmáticas están dispersos en la matriz
citoplasmática. Tanto las gram positivas como las gram negativas pueden utilizar
flagelos para la locomoción. Además, muchas células están rodeadas por una
cápsula o delgada capa externa a la pared celular.
Las células procariotas son morfológicamente más simples que las eucariotas.
3.2 Membranas de células procariotas (membrana plasmática y sistemas de
membranas internas).
Las membranas son un requerimiento absoluto para todos los organismos vivos.
La célula debe interactuar de una manera selectiva con su ambiente, ya sea el
ambiente interno de un organismo multicelular o un menos protegido y más variable
17
ambiente externo. Las células deben no solo ser capaces de adquirir nutrientes y
eliminar desechos, sino que también deben mantener su interior en un estado
constante altamente organizado a pesar de los cambios externos. La membrana
plasmática rodea al citoplasma tanto de células procariotas como eucariotas. Esta
membrana es el principal punto de contacto con el ambiente de la célula y es por lo
tanto responsable de muchas de sus relaciones con el mundo exterior. Para entender
la función de las membranas es necesario familiarizarse con su estructura,
particularmente con la de la membrana plasmática.
La membrana plasmática.
Las membranas contienen tanto proteínas como lípidos, aunque la proporción
exacta entre ambos varía ampliamente. La mayoría de los lípidos asociados a
membranas son estructuralmente asimétricos con extremos polares y no polares y
son llamados amfipáticos. El extremo polar interactúa con el agua y es hidrofílico; el
extremo no polar es insoluble en agua y tiende a asociarse con otro igual. Esta
propiedad de los lípidos los capacita para formar una bicapa en las membranas. Las
superficies externas son hidrofílicas, mientras que los extremos hidrofóbicos están
enterrados en el interior, lejos del agua circundante. Muchos de estos lípidos
amfipáticos son fosfolípidos. Las membranas bacterianas usualmente difieren de las
membranas eucariotas en que carecen de esteroles tales como el colesterol. Sin
embargo, muchas membranas bacterianas contienen moléculas pentacíclicas
parecidas al esterol llamadas hopanoides. Los hopanoides son sintetizados a partir
de los mismos precursores que los esteroides. Como los esteroides en las
eucariotas, los hopanoides probablemente estabilizan la membrana bacteriana. Los
lípidos de membrana están organizados en dos capas, u hojas, de moléculas
arregladas extremo con extremo.
Muchas membranas archeobacterianas difieren de otras membranas
bacterianas en que tienen una monocapa con moléculas de lípidos abarcando la
membrana entera.
Las membranas celulares son estructuras muy delgadas, de 5 a 10 nm de
espesor, y sólo pueden ser vistas con el microscopio electrónico. La técnica de
criofractura ha sido usada para romper membranas por el centro de la bicapa lipídica,
partiéndola en dos y exponiendo el interior. De esta manera se ha descubierto que
muchas membranas, incluyendo la plasmática, tienen una compleja estructura
interna. Las pequeñas partículas globulares vistas en estas membranas son
proteínas de membrana que se encuentran dentro de la bicapa lipídica.
El modelo de estructura de membrana más ampliamente aceptado en la
actualidad es el modelo de mosaico fluido de S. Jonathan Singer y Garth Nicholson.
Ellos distinguen entre dos tipos de proteínas de membrana. Las proteínas periféricas
están escasamente conectadas a la membrana y pueden ser fácilmente removidas.
Son solubles en solución acuosa y constituyen del 20 al 30 % de las proteínas totales
de la membrana. Cerca del 70 al 80 % de las proteínas de membrana son proteínas
18
integrales, las cuales no se extraen tan fácilmente de la membrana y son insolubles
en solución acuosa cuando están libres de lípidos.
Las proteínas integrales, como los lípidos de membrana, son amfipáticas; sus
regiones hidrofóbicas están enterradas en la fase lipídica mientras que las porciones
hidrofílicas se proyectan hacia la superficie de la membrana. Algunas de estas
proteínas se extienden incluso a través de toda la capa de lípidos. Las proteínas
integrales pueden difundirse lateralmente a lo largo de la superficie para tomar
nuevas posiciones, pero no pueden moverse o rotar hacia la otra capa lipídica. A
menudo hay carbohidratos unidos a la superficie externa de las proteínas de la
membrana plasmática, en donde desempeñan funciones importantes.
La membrana celular es uno de los sistemas más altamente organizados y
asimétricos, y además flexible y dinámico. Aunque las membranas tienen
aparentemente un diseño básico común, hay amplias variaciones tanto en estructura
como en capacidades funcionales.
La membrana plasmática de las células bacterianas debe desempeñar una
increíble variedad de funciones de manera exitosa. La membrana plasmática retiene
al citoplasma, particularmente en células sin pared celular, y lo separa del medio
circundante. La membrana plasmática también sirve como una barrera permeable
selectiva: permite el paso de algunos iones y moléculas particulares, ya sea hacia
adentro o hacia afuera de la célula, mientras que impide el paso de otros. De esta
manera la membrana previene la pérdida de componentes esenciales a través de
fugas al mismo que tiempo que permite el movimiento de otras moléculas. Debido a
que muchas sustancias no pueden cruzar la membrana plasmática sin ayuda, ésta
debe auxiliar estos movimientos cuando sea necesario. Usualmente se emplean
sistemas de transporte para realizar tareas tales como la toma de nutrientes, la
excreción de desechos y la secreción de proteínas. La membrana plasmática
bacteriana es también el sitio de localización de una variedad de procesos
metabólicos cruciales: respiración, fotosíntesis, y síntesis de lípidos y constituyentes
de la pared celular. Finalmente, la membrana contiene moléculas receptoras
especiales que ayudan a la bacteria a detectar y responder a químicos en el
ambiente. Claramente se ve que la membrana plasmática es esencial para la
supervivencia de los microorganismos.
Sistemas de membranas internas.
Aunque el citoplasma bacteriano no contiene organelos membranales
complejos como las mitocondrias o los cloroplastos, pueden observarse estructuras
membranales de diversos tipos. Una estructura común es el mesosoma. Los
mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática en forma de vesículas,
túbulos o lamelas. Estas estructuras se encuentran tanto en bacterias gram positivas
como gram negativas, aunque generalmente son más prominentes en las primeras.
A pesar de los años de investigación sobre mesosomas, su función exacta es
aún desconocida. Algunas veces se observan cerca de los septos o de la pared
19
celular en bacterias en división, y algunas veces se les observa unidos al cromosoma
bacteriano. Así, pueden estar involucrados en la formación de la pared celular
durante la división o jugar un papel en la replicación del cromosoma y su distribución
hacia las células hijas. Los mesosomas también pueden estar involucrados en
procesos secretorios.
Actualmente muchos bacteriólogos creen que los mesosomas son estructuras
generadas durante la fijación química de la bacteria para microscopia electrónica.
Posiblemente representan partes de la membrana plasmática que son químicamente
diferentes y más desorganizadas debido a la fijación. Sin embargo los mesosomas
han sido vistos ocasionalmente en bacterias criofracturadas y por lo tanto algunas
veces pueden estar presentes en células vivas. Resolver esta controversia requiere
por supuesto de investigación adicional.
Muchas bacterias tienen sistemas de membranas internas muy diferentes a
los mesosomas. Plegamientos de la membrana plasmática pueden volverse
extensos y complejos en bacterias fotosintéticas tales como las cianobacterias y las
bacterias púrpura, o en bacterias con actividad respiratoria muy alta como las
bacterias nitrificantes. Estos sistemas pueden ser agregados de vesículas esféricas,
vesículas aplanadas, o membranas tubulares. Su función parece ser proporcionar
una gran superficie de membrana para mayores actividades metabólicas.
3.3 Matriz citoplasmática (inclusiones celulares, ribosomas).
El citoplasma procariota, a diferencia del eucariota, carece de organelos de
unidad membranal. La matriz citoplásmica es la sustancia localizada entre la
membrana plasmática y el nucleoide. Esta matriz es en gran medida agua (cerca del
70% de la masa bacteriana es agua). La membrana plasmática y cada cosa hacia su
interior es llamada protoplasto, así, la matriz citoplasmática es la mayor parte del
protoplasto.
Inclusiones celulares.
Una gran variedad de inclusiones celulares (cuerpos de inclusión), gránulos de
materiales orgánicos e inorgánicos, son vistos a menudo dentro de la matriz
citoplasmática de las bacterias con ayuda del microscopio electrónico. Algunas de
estas inclusiones no están rodeadas por una membrana y se encuentran libres en el
citoplasma (los gránulos de polifosfato y los de cianoficina, por ejemplo); otras, en
cambio, están encerradas por una membrana monocapa no unitaria de 2.0 a 4.0 nm
de espesor. Ejemplos de estas inclusiones rodeadas por membranas son los
gránulos de poli-β-hidroxibutirato (PHB), algunos gránulos de glucógeno y azufre,
carboxisomas y vacuolas de gas. Las membranas de las inclusiones celulares varían
mucho en composición; algunas son de naturaleza proteínica, mientras que otras
contienen lípidos. No todas las bacterias poseen todos los tipos de inclusiones, e
incluso existen bacterias que no poseen ninguna de ellas. Se trata, por tanto, de
estructuras opcionales producidas solamente por algunas clases de procariotas. Una
20
breve descripción de algunas de las inclusiones de mayor importancia se da a
continuación.
Las inclusiones orgánicas usualmente contienen glucógeno o poli-βhidroxibutirato. El glucógeno es un polímero de unidades de glucosa compuesto de
largas cadenas unidas por enlaces α(1,4) glicosídicos y cadenas ramificadas
conectadas por enlaces α(1,6) glicosídicos. El poli-β-hidroxibutirato contiene
moléculas de β-hidroxibutirato unidas por enlaces éster entre grupos carboxilo e
hidroxilos de moléculas adyacentes. Usualmente sólo uno de estos polímeros se
encuentra en una especie, pero las bacterias púrpura fotosintéticas tienen ambos. El
PHB se acumula en inclusiones distintivas, de cerca de 0.2 a 0.7 µ de diámetro, que
son fácilmente teñibles con negro Sudan para microscopia de luz y que son
fácilmente visibles con microscopio electrónico. El glucógeno está disperso más
homogéneamente como pequeños gránulos (cerca de 20 a 100 nm de diámetro) a lo
largo de la matriz y a menudo sólo pueden ser vistos con microscopio electrónico. Si
las células contienen una gran cantidad de glucógeno, su tinción con una solución de
yodo las volverá café rojizas. Las inclusiones de glucógeno y de PHB son almacén
de reserva de materiales para proporcionar energía y para biosíntesis. Muchas
bacterias también almacenan carbono en forma de gotas de lípidos.
Las cianobacterias tienen dos inclusiones orgánicas distintivas. Los gránulos
de cianoficina están compuestos de polipéptidos que contienen cantidades
aproximadamente iguales de los aminoácidos arginina y ácido aspártico. Estos
gránulos son a menudo lo suficientemente grandes para ser visibles en el
microscopio de luz y almacenan nitrógeno extra para la bacteria. Los carboxisomas
están presentes en muchas cianobacterias, bacterias nitrificantes y tiobacilos. Éstos
gránulos son poliédricos, de cerca de 100 nm de diámetro y contiene la enzima
ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa en un arreglo paracristalino. Su función es servir
como reserva de esta enzima y pueden ser un sitio de fijación de CO2.
Unas inclusiones orgánicas más remarcables, las vacuolas de gas, están
presentes en muchas cianobacterias, en bacterias fotosintéticas púrpuras y verdes y
en algunas otras formas acuáticas como Halobacterium y Thiothrix. Estas bacterias
flotan en o cerca de la superficie debido a que las vacuolas de gas les dan flotación.
Las vacuolas de gas son agregados de un enorme número de estructuras cilíndricas,
pequeñas y huecas, llamadas vesículas de gas. La pared de las vesículas de gas no
contiene lípidos y está compuesta de una simple y pequeñas proteína. Estas
subunidades de proteína se ensamblan para formas un cilindro rígidamente cerrado
que es hueco e impermeable al agua, pero permeable a gases atmosféricos. Las
bacterias con vacuolas de gas pueden regular su flotación para moverse a la
profundidad necesaria para obtener niveles adecuados de intensidad de luz,
concentración de oxígeno y de nutrientes. Estas bacterias descienden simplemente
colapsando sus vesículas, y flotan hacia la superficie cuando son formadas nuevas
vesículas.
Se han observado dos tipos principales de inclusiones inorgánicas. Muchas
bacterias almacenan fosfato como gránulos de polifosfato o gránulos de volutina. El
21
polifosfato es un polímero lineal de ortofosfatos unidos por enlaces éster. Así, los
gránulos de volutina funcionan como almacén de reserva de fosfatos, un componente
importante de constituyentes celulares tales como los ácidos nucleicos. En algunas
células actúan como reserva de energía y el polifosfato puede servir como una fuente
de energía en algunas reacciones. En ocasiones estos gránulos son llamados
gránulos metacromáticos debido precisamente a que muestran un efecto
metacromático, esto es, aparecen rojos o con diferente sombreado en azul cuando
son teñidos con los colorantes azul de metileno o azul de toluidina. Algunas bacterias
también almacenan azufre temporalmente como gránulos de azufre, un segundo tipo
de inclusiones inorgánicas. Por ejemplo, las bacterias púrpuras fotosintéticas pueden
usar sulfuro de hidrógeno como donador de electrones en la fotosíntesis y acumulan
el azufre resultante ya sea en el espacio periplásmico o en glóbulos especiales en el
citoplasma.
Ribosomas.
La matriz citoplasmática procariota está a menudo empacada con ribosomas,
los cuales también se encuentra estrechamente adheridos a la membrana celular.
Con baja amplificación de micrografías electrónicas, los ribosomas se observan
como pequeñas partículas sin rasgos distintivos, pero son de hecho objetos muy
complejos formados tanto de proteínas como de ácido ribonucleico (RNA). Ellos son
el sitio de síntesis de proteínas: los ribosomas de la matriz sintetizan proteínas
destinadas a permanecer dentro de la célula, mientras que los ribosomas de la
membrana plasmática fabrican proteínas para transporte al exterior. Los ribosomas
procariotas son más pequeños que los eucariotas. Son comúnmente llamados
ribosomas 70S y tienen dimensiones de cerca de 14 a 15 nm por 20 nm, un peso
molecular de aproximadamente 2.7 millones, y están construidos por dos
subunidades llamadas 50S y 30S. La S de 70S y valores similares se adopta por las
unidades Svedberg, las cuales son las unidades del coeficiente de sedimentación,
una medida de la velocidad de sedimentación en una centrifuga. El coeficiente de
sedimentación está en función del peso molecular de la partícula, su volumen y su
forma. Normalmente las partículas más pesadas y compactas tienen número de
Svedberg más grandes o sedimentan más rápidamente. Debe enfatizarse que los
valores de Svedberg no son directamente proporcionales al peso molecular: el peso
de los ribosomas 70S es igual a la suma de los pesos moleculares de sus
subunidades 50S y 30S, aunque la suma de 50 y 30 es 80 y no 70. Los ribosomas de
la matriz citoplasmática eucariota son 80S y de cerca de 22 nm de diámetro. A pesar
de sus diferencias en tamaño, ambos tipos de ribosomas están compuestos de
manera similar por una subunidad grande y una pequeña.
3.4 Nucleoide.
Probablemente la diferencia más marcada entre las células procariotas y las
eucariotas es la manera en la cual está empacado su material genético. Las células
eucariotas tienen dos o más cromosomas contenidos dentro de un organelo
delimitado por membranas, el núcleo. En contraste, las procariotas carecen de un
22
núcleo delimitado por membranas. El cromosoma procariota, casi siempre uno sólo,
circular y formado por DNA de doble cadena, se localiza en una región de forma
irregular llamada nucleoide (otros nombres que recibe son cuerpo nuclear, cuerpo de
cromatina, y región nuclear). Aunque el nucleoide parece variar con el método de
fijación y tinción, en las micrografías electrónicas a menudo se observan fibras las
cuales muy probablemente son DNA. El nucleoide también es visible con el
microscopio de luz si se utiliza colorante de Feulgen el cual reacciona
específicamente con el DNA. Una célula puede tener más de un nucleoide cuando
ocurre la división celular después de que el material genético se ha duplicado. En
bacterias creciendo activamente el nucleoide tiene proyecciones que se extienden
dentro de la matriz citoplasmática; presumiblemente estas proyecciones contienen
DNA que está siendo trascrito activamente para producir RNAm.
Cuidadosos estudios de microscopia electrónica han mostrado a menudo que
el nucleoide está en contacto con los mesosomas o con la membrana plasmática. En
nucleoides aislados también se han encontrado membranas. Hay por lo tanto
evidencia de que el DNA bacteriano está unido a membranas celulares, y las
membranas pueden estar involucradas en la separación del DNA hacia las células
hijas durante la división celular.
Se han aislado nucleoides intactos y libres de membranas. Su análisis químico
revela que están compuestos de cerca del 60 % de DNA, algo de RNA y una
pequeña cantidad de proteínas. En Escherichia coli, un bacilo de 2 a 6 µ de longitud,
el DNA circular mide cerca de 1400 µ; obviamente debe haber un empaquetamiento
muy eficiente para colocarlo dentro del nucleoide. El DNA está extensamente
enrollado, probablemente con ayuda de proteínas nucleoides, las cuales difieren de
las proteínas histonas presentes en el núcleo eucariota.
Muchas bacterias poseen plásmidos además de su cromosoma. Los
plásmidos son moléculas de DNA circular de doble cadena que pueden existir y
replicarse independientemente del cromosoma o pueden estar integrados con él; en
cualquier caso los plásmidos son heredados a la descendencia. Los plásmidos no se
requieren para el crecimiento y la reproducción, aunque pueden llevar genes que dan
a las bacterias ventajas selectivas. Los genes de los plásmidos pueden volver a las
bacterias resistentes a drogas, darles nuevas habilidades metabólicas, hacerlas
patógenas, o dotarlas con otras propiedades.
3.5 Pared celular procariota.
La pared celular es una de las partes más importantes de la célula procariota
por diversas razones. Excepto para los micoplasmas y algunas arqueobacterias, la
mayoría de las bacterias tiene paredes sólidas que les dan forma y las protegen de la
lisis osmótica. La pared celular de muchos patógenos tiene componentes que
contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la célula de sustancias
tóxicas y es el sitio de acción de diversos antibióticos.
23
Después de que Christian Gram desarrolló la tinción de Gram en 1884, se
hizo evidente que las bacterias podían ser divididas en dos grupos principales en
base a su respuesta a la tinción de Gram. Las bacterias Gram-positivas se tiñen de
púrpura, mientras que las Gram-negativas se tiñen de rosa o rojo. La verdadera
diferencia estructural entre estos dos grupos se volvió clara con el advenimiento de la
microscopia electrónica. La pared de las células Gram-positivas consiste en una sola
capa de peptidoglicano o mureína homogénea y de 20 a 80 nm de espesor la cual se
encuentra hacia el exterior de la membrana plasmática. En contraste, la pared celular
de las Gram-negativas es muy compleja. Tiene una capa de peptidoglicano de 1 a 3
nm de espesor rodeada por una membrana externa de 7 a 8 nm de espesor. Los
microbiólogos llaman comúnmente a todas estas estructuras exteriores a la
membrana plasmática la envoltura celular. Este término incluye a la pared celular y a
otras estructuras como las cápsulas, cuando están presentes.
En las micrografías electrónicas de las bacterias Gram-negativas se observa
frecuentemente un espacio entre la membrana plasmática y la membrana externa, y
en algunas ocasiones se observa un espacio similar, aunque más pequeño entre la
membrana plasmática y la pared celular de bacterias Gram-positivas. Este espacio
es llamado espacio periplásmico. Evidencia reciente indica que el espacio
periplásmico puede estar ocupado por una red laxa de peptidoglicano. Posiblemente
es más un gel que un espacio ocupado por fluido. La sustancia que ocupa el espacio
periplásmico es el periplasma. El tamaño estimado del espacio periplásmico en las
bacterias Gram-negativas está en el rango de 1 nm hasta tanto como 71 nm. Algunos
estudios recientes indican que puede constituir del 20 al 40 % del volumen celular
total (cerca de 30 a 70 nm), pero se requieren más estudios para establecer un valor
más exacto. El espacio periplásmico de las bacterias Gram-negativas contiene
muchas proteínas que participan en la adquisición de nutrientes (por ejemplo,
enzimas hidrolíticas que atacan ácidos nucleicos y moléculas fosforiladas), y
proteínas involucradas en el transporte de materiales hacia el interior celular. Las
bacterias desnitrificantes y las quimiolitoautotróficas a menudo tienen proteínas
transportadoras de electrones en su periplasma. El espacio periplásmico también
contiene enzimas involucradas en la síntesis de peptidoglicano y en la modificación
de compuestos tóxicos que pudieran dañar a la célula. Las bacterias Gram-positivas
pueden no tener un espacio periplásmico visible y no parecen tener muchas
proteínas periplásmicas; más aún, secretan diversas enzimas que ordinariamente
serían periplásmicas en las bacterias Gram-negativas. Tales enzimas secretadas son
comúnmente llamadas exoenzimas.
Las arqueobacterias difieren de otras bacterias en muchos aspectos. Aunque
pueden ser positivas o negativas, sus paredes celulares son distintivas tanto en
estructura como en composición química. La pared carece de peptidoglicano y está
compuesta de proteínas, glicoproteínas y polisacáridos.
Estructura del peptidoglicano.
El peptidoglicano o mureína es un enorme polímero compuesto de muchas
subunidades idénticas. El polímero contiene dos derivados de azúcares, N24
acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico (el éter lactil de la N-acetilglucosamina),
y varios aminoácidos diferentes, tres de los cuales (ácido D-glutámico, D-alanina y
ácido meso-diaminopimélico) no se encuentran en las proteínas. El esqueleto de este
polímero está compuesto de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico
alternados. Una cadena polipeptídica de cuatro D- y L-aminoácidos alternados está
conectada al grupo carboxil del ácido N-acetilmurámico. Muchas bacterias
substituyen otro diaminoácido, usualmente L-lisina, en la tercera posición por el ácido
meso-diaminopimélico.
Cadenas de subunidades de peptidoglicano se forman mediante enlaces
entrecruzados entre los péptidos. A menudo el grupo carboxil de la D-alanina
terminal está conectada directamente al grupo amino del ácido diaminopimélico, pero
en su lugar puede ser utilizado un puente peptídico. La mayoría de las paredes
celulares Gram-negativas carecen de este puente peptídico. Estos
entrecruzamientos resultan al final en un enorme saco de peptidoglicano, que en
realidad es una densa red interconectada. Estos sacos han sido aislados de
bacterias Gram-positivas y son lo suficientemente fuertes para retener su forma e
integridad, aún cuando son elásticos y algo flexibles, a diferencia de la celulosa
(constituyente de la pared celular vegetal). La pared celular procariota es además
porosa, de manera que algunas moléculas pueden penetrarla.
Pared celular Gram-positiva.
Normalmente la gruesa y homogénea pared celular de las Gram-positivas está
compuesta primariamente de peptidoglicano, el cual a menudo contiene puentes
peptídicos. Sin embargo la pared celular Gram-positiva usualmente también contiene
grandes cantidades de ácidos teicoicos, polímeros de glicerol o ribitol unidos por
grupos fosfato. Aminoácidos tales como la D-alanina y azúcares como la glucosa
están unidos a los grupos glicerol y ribitol. Los ácidos teicoicos están conectados
tanto al peptidoglicano mismo mediante enlaces covalentes con el hidroxilo seis del
ácido aceilmurámico, o a los lípidos de la membrana plasmática; en este último caso
son llamados ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos parecen extenderse por toda
la capa de peptidoglicano y, debido a que están cargados negativamente, ayudan a
dar a la pared de las Gram-positivas su carga negativa. La función de estas
moléculas no es aún clara, pero pueden ser importantes para mantener la estructura
de la pared. Los ácidos teicoicos no están presentes en las bacterias Gramnegativas.
Pared celular Gram-negativa.
La pared celular Gram-negativa es mucho más compleja que la de las Grampositivas. La delgada capa de peptidoglicano enseguida de la membrana plasmática
puede constituir no más de 5 a 10% del peso de la pared. En E. coli es de cerca de 1
nm de espesor y contiene sólo una o dos capas de hojas de peptidoglicano. Como se
mencionó antes, el peptidoglicano puede estar en forma de gel más que como capa
compacta.
25
La membrana externa se encuentra hacia afuera de la delgada capa de
peptidoglicano. La proteína más abundante en esta membrana es la lipoproteína de
Braun, una pequeña lipoproteína unida covalentemente a la región superior del
peptidoglicano y embebida en la membrana externa por su extremo hidrofóbico. La
membrana externa y el peptidoglicano están tan firmemente unidos por esta
lipoproteína que pueden ser aislados como una unidad.
Posiblemente los constituyentes más inusuales de la membrana externa son
sus lipopolisacáridos (LPSs). Estas moléculas grandes y complejas contienen tanto
lípidos como carbohidratos y constan de tres partes: (1) lípido A, (2) núcleo
polisacárido, y (3) el poliscárido O ó cadena lateral O. El LPS de Salmonella
typhimurium ha sido el más estudiado y su estructura general se describe aquí. La
región del lípido A contiene dos glucosalinas, cada una con tres ácidos grasos y
fosfato o pirofosfato unido. Éste está sepultado en la membrana externa y el resto del
LPS se proyecta desde su superficie. El núcleo polisacárido está unido al lípido A. En
salmonela está construido de 10 azúcares, muchos de ellos de estructura inusual. La
cadena lateral O ó antígeno O es un polisacárido de cadena corta que se extiende
hacia el exterior desde el núcleo polisacárido. Tiene varios azúcares peculiares y
varía en composición entre cepas bacterianas. Aunque el polisacárido O es
reconocida por los anticuerpos de los hospederos, las bacterias Gram-negativas
pueden frustrar las defensas del hospedero cambiando rápidamente la naturaleza de
su cadena lateral O para evitar la detección. La interacción de los anticuerpos con el
LPS antes de alcanzar la membrana externa puede proteger a la pared celular de un
ataque directo.
El LPS es importante por diversas razones además de burlar las defensas del
hospedero. Puesto que el núcleo polisacárido normalmente contiene azúcares
cargados y fosfato, el LPS contribuye a la carga negativa de la superficie de la
bacteria. El lípido A es el principal constituyente de la membrana externa y el LPS
ayuda a estabilizar la estructura de la membrana. Más aún, el lípido A a menudo es
tóxico por lo cual el LPS puede actuar como endotoxina y causar algunos de los
síntomas que se presentan en infecciones por bacterias Gram-negativas.
Una función más importante de la membrana externa es servir como barrera
protectora. Previene o disminuye la entrada de sales biliares, antibióticos y otras
sustancias tóxicas que pueden matar o dañar a la bacteria. Incluso así, la membrana
externa es más permeable que la membrana plasmática y permite el paso de
pequeñas moléculas como la glucosa y otros monosacáridos. Esto es debido a la
presencia de proteínas porinas especiales. Tres moléculas de porina se agrupan y
atraviesan la membrana externa para formar un canal hueco a través del cual
pueden pasar moléculas pequeñas de 600 a 700 daltons. Moléculas más grandes,
tales como la vitamina B12, deben ser transportadas a través de la membrana externa
por acarreadores específicos. La membrana externa también previene de la pérdida
de constituyentes como las enzimas periplásmicas.
26
La pared celular y la protección osmótica.
Usualmente la pared celular es requerida para proteger a la bacteria contra la
destrucción por la presión osmótica. Los solutos están mucho más concentrados
dentro de la célula que en la mayoría de los hábitats microbianos, los cuales son
hipotónicos. Durante la ósmosis, el agua se mueve a través de membranas
selectivamente permeables, tales como la membrana plasmática, de soluciones
diluidas (alta concentración de agua) a soluciones más concentradas (baja
concentración de agua). Así, el agua normalmente entra a la célula bacteriana y la
presión osmótica puede alcanzar 20 atmósferas o 300 libras por pulgada cuadrada.
Sin una pared celular que la proteja, la membrana plasmática no puede resistir tales
presiones y la célula se hinchará y será destruida físicamente, un proceso llamado
lisis. En hábitats hipertónicos, donde los solutos están más concentrados que dentro
de la célula, el agua fluye hacia el exterior y el citoplasma se seca, fenómeno
llamado plasmólisis.
Aunque la mayoría de la bacterias requieren de la pared celular para
sobrevivir, algunas no la poseen. Por ejemplo, los micoplasmas carecen de pared
celular y sin embargo a menudo crecen en medios diluidos o en ambientes terrestres
porque su membrana plasmática es más fuerte de lo normal. La razón precisa de
esto no es bien conocida, aunque la presencia de esteroles en la membrana de
muchas especies puede proporcionar fuerza adicional. Sin una pared celular rígida,
los micoplasmas tienden a ser pleomórficos o variables en forma.
Las formas L (llamadas así en honor al Instituto Lister de Londres, donde
fueron descubiertas) también carecen de pared celular. La falta puede ser completa o
parcial (algunas tienen una pared defectuosa) y pueden ser Gram-positivas o Gramnegativas.
3.6 Componentes externos a la pared celular.
Las bacterias tienen una variedad de estructuras externas a la pared celular
cuyas funciones son protección, adhesión a objetos, o movimiento celular.
Cápsulas, capa mucosa, y capas S.
Algunas bacterias tienen una capa de material al exterior de la pared celular.
Cuando la capa está bien organizada y no se lava con facilidad se le llama cápsula.
Una capa mucosa es una zona difusa de material no organizado que se remueve con
facilidad. Un glicocáliz es una red de polisacáridos que se extiende desde la
superficie de las bacterias y otras células (en este sentido, podría rodear tanto a la
cápsula como a la capa mucosa). Las cápsulas y las capas mucosas usualmente
están compuestas de polisacáridos, pero pueden estar construidas de otros
materiales. Bacillus anthracis, por ejemplo, tiene una cápsula de ácido poli-Dglutámico. Las cápsulas son claramente visibles en el microscopio de luz cuando se
27
emplean tinciones negativas o tinciones especiales para cápsulas; pueden ser
estudiadas también con el microscopio electrónico.
Aunque las cápsulas no se requieren para el crecimiento bacteriano en
condiciones de laboratorio, éstas confieren varias ventajas cuando las bacterias
crecen en hábitats normales. Ayudan a las bacterias a resistir fagocitosis por células
fagocíticas de los organismos hospederos. Streptococcus pneumoniae proporciona
un ejemplo clásico. Cuando carece de cápsula es destruido fácilmente y no causa
enfermedad, mientras que la variante capsulada mata rápidamente a los ratones. Las
cápsulas contienen una gran cantidad de agua y pueden proteger a la bacteria contra
la desecación; además excluyen a los virus bacterianos y a la mayoría de los
materiales tóxicos hidrofóbicos como los detergentes. El glicocáliz también ayuda a
la fijación bacteriana a superficies de objetos sólidos en ambientes acuáticos o a
superficies de tejidos en hospederos vegetales y animales.
Muchas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tienen una capa
regularmente estructurada llamada capa S en su superficie. La capa S es común
entre las arqueobacterias, donde puede de hecho ser la única estructura de pared
externa a la membrana plasmática. La capa S tiene un patrón parecido a un mosaico
y está compuesta de proteína o glicoproteína. En las bacterias Gram-negativas la
capa S se adhiere directamente a la membrana externa; en las Gram-positivas está
asociada con la superficie del peptidoglicano. La capa S puede proteger a la célula
contra iones y fluctuaciones del pH, estrés osmótico, enzimas, o contra el depredador
bacteriano Bdellovibrio. La capa S también ayuda a mantener la rigidez de la
envoltura y la forma de al menos algunas bacterias. Finalmente, la capa parece
proteger a algunos patógenos contra el ataque del complemento y la fagocitosis,
contribuyendo así a su virulencia.
Pili y fimbrias.
Muchas bacterias Gram-negativas tienen apéndices parecidos a pelos, cortos
y finos, que son más delgados que los flagelos y no están involucrados en la
motilidad. Usualmente estas estructuras son llamadas fimbrias (en ocasiones son
referidas también como pili). Aunque una célula puede estar cubierta con más de
1,000 fimbrias, debido a su pequeño tamaño son visibles sólo con microscopio
electrónico. Las fimbrias parecen ser estructuras tubulares compuestas de
subunidades proteínicas en arreglo helicoidal, de cerca de 3 a 10 nm de diámetro y
varias micras de longitud. Al menos algunos tipos de fimbrias adhieren a la bacteria a
superficies sólidas tales como tejidos de hospederos o rocas en corrientes de agua.
Los pili sexuales son apéndices similares, de 1 a 10 por célula, que difieren de
la fimbrias en los siguientes aspectos. Los pili a menudo son más largos que las
fimbrias (alrededor de 9 a 10 nm de diámetro) y están genéticamente determinados
por factores sexuales o plásmidos conjugativos y son requeridos para el
apareamiento bacteriano. Algunos virus bacterianos atacan específicamente a
receptores en los pili sexuales al comienzo de su ciclo reproductivo.
28
Flagelos y motilidad.
La mayoría de las bacterias mótiles se mueven usando flagelos, apéndices
locomotores filamentosos que se extienden hacia afuera de la membrana plasmática
y la pared celular. Son estructuras esbeltas y rígidas de cerca de 20 nm de diámetro
y de más de 15 a 20 µ de longitud. Los flagelos son delgados y no pueden
observarse directamente con el microscopio de campo brillante, sino que deben
teñirse con técnicas especiales diseñadas para incrementar su grosor. La estructura
detallada del flagelo sólo puede observarse con el microscopio electrónico.
A menudo las especies bacterianas difieren distintivamente en sus patrones
de distribución de flagelos. Las bacterias monótricas tienen sólo un flagelo; si está
localizado en un extremo se dice que el flagelo es polar. Las bacterias amfítricas
tienen un flagelo solitario en cada polo. En contraste, las bacterias lofótricas tienen
un grupo de flagelos en uno o en ambos polos. En las bacterias perítricas los flagelos
están distribuidos a lo largo de la superficie completa de la célula. Los patrones de
flagelación son muy útiles en la identificación de bacterias.
-
Ultraestructura flagelar.
Estudios con microscopia electrónica de transmisión han demostrado que el
flagelo bacteriano está compuesto de tres partes. (1) La porción más larga y obvia es
el filamento, el cual se extiende desde la superficie celular hasta la punta. (2) Un
cuerpo basal que está embebido en la célula; y (3) un segmento corto y curvo, el
gancho, que une al filamento con el cuerpo basal y actúa como unión flexible. El
filamento es un cilindro rígido y hueco construido de una sola proteína llamada
flagelina, la cual tiene un peso molecular en el rango de 30,000 a 60,000.
El gancho y el cuerpo basal son bastante diferentes del filamento.
Ligeramente más ancho que el filamento, el gancho está hecho de diferentes
subunidades de proteína. El cuerpo basal es la parte más compleja del flagelo. En
E.coli y la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el cuerpo tiene cuatro anillos
conectados a un eje central. Los anillos más externos, L y P, se asocian con la capa
de lipopolisacáridos y de peptidoglicano, respectivamente. El anillo interno M está en
contacto con la membrana plasmática. Las bacterias Gram-positivas tienen sólo dos
anillos en el cuerpo basal, un anillo interno conectado a la membrana plasmática y un
anillo externo probablemente unido al peptidoglicano.
-
Síntesis flagelar.
La síntesis del flagelo es un proceso complejo que involucra al menos de 20 a
30 genes. Además del gen para la flagelina, 10 ó más genes codifican para las
proteínas del gancho y del cuerpo basal; otros genes conciernen al control de la
construcción flagelar o a su funcionamiento. No es bien conocido cómo la célula
regula o determina la localización exacta del flagelo.
29
Las bacterias pueden desflagelarse y de esta manera estudiar la regeneración
del filamento flagelar. Se cree que las subunidades de flagelina son transportadas a
través del hueco del filamento. Cuando alcanzan la punta las subunidades de
agregan espontáneamente de manera que el filamento crece desde su extremo más
que desde la base. La síntesis del filamento es un excelente ejemplo de ensamble a
sí mismo. Muchas estructuras se forman espontáneamente por la asociación de sus
partes componentes sin la ayuda de alguna enzima en especial u otros factores. La
información requerida para la construcción del filamento está presente en la
estructura de la subunidad de flagelina por sí misma.
-
Mecanismo de movimiento flagelar.
Los flagelos procariotas operan de manera diferente a como lo hacen los
eucariotas. El filamento está en la forma de una hélice rígida y las bacterias se
mueven cuando la hélice rota. Existe considerable evidencia que demuestra que los
flagelos actúan como las propelas de un bote. Las bacterias mutantes con flagelos
rectos o regiones del gancho anormalmente largas (mutantes poligancho) no pueden
nadar. Cuando las bacterias son fijadas a una laminilla de vidrio usando anticuerpos
para proteínas del filamento o del gancho, el cuerpo de la célula rota rápidamente
sobre el flagelo estacionario. El motor flagelar puede rotar muy rápidamente; en E.
coli, por ejemplo, rota a 270 revoluciones por segundo (r.p.s.) y Vibrio alginolyticus
promedia 1,100 r.p.s.
La dirección de la rotación flagelar determina la naturaleza del movimiento
bacteriano. Las bacterias monótricas con un flagelo polar rotan en dirección contraria
a las manecillas del reloj (vistas desde fuera de la célula) durante el movimiento
normal hacia adelante mientras que la célula en sí rota lentamente en dirección de
las manecillas del reloj. El movimiento flagelar rotando helicoidalmente empuja a la
célula hacia adelante con el flagelo siguiéndola atrás. Las bacterias monótricas se
detienen y cambian de dirección de manera aleatoria revirtiendo la dirección de la
rotación del flagelo. Las bacterias flageladas perítricas operan de una manera algo
similar. Para moverse hacia delante, los flagelos rotan en dirección contraria a las
manecillas del reloj; conforme los hacen, ellas doblan sus ganchos para formar un
haz rotatorio que las impulsa hacia adelante. La rotación del flagelo en dirección de
las manecillas del reloj rompe al haz y la célula se detiene o cambia de dirección.
Debido a que las bacterias nadan gracias a la rotación de sus flagelos rígidos,
debe haber algún tipo de motor en su base. De acuerdo con una hipótesis, un flagelo
rota debido a interacciones entre los anillos S y M. Un eje se extiende desde el
gancho y termina en el anillo M, el cual puede rotar libremente en la membrana
plasmática. Se cree que el anillo S está unido a la pared celular en las Grampositivas y no rota. De esta manera, si los dos anillos interactúan de alguna manera,
el resultado es un movimiento giratorio. Los anillos O y L de las Gram-negativas
podrían actuar como orientadores para la rotación del eje. En contraste, hay alguna
evidencia de que el cuerpo basal es una estructura pasiva y rota dentro de un
complejo de proteínas embebidas en la membrana de una manera similar a como lo
hace un motor eléctrico en el centro de un anillo de electromagnetos.
30
El mecanismo exacto que regula la rotación del cuerpo basal aún no está
claro. Hay evidencia de que el flujo de protones pasando los dos anillos o entre el
cuerpo basal y circundando las proteínas de la membrana lleva a la rotación. No
parece que el ATP proporcione directamente la energía para la rotación flagelar en
las bacterias.
El flagelo es un dispositivo para nadar muy efectivo. Desde el punto de vista
de las bacterias, nadar es bastante difícil debido a que el medio acuoso circundante
parece muy denso y viscoso, como melaza. La célula debe perforar a través del agua
con su flagelo helicoidal o en forma de sacacorchos y, si la actividad flagelar cesa, se
detiene casi instantáneamente. A pesar de tal resistencia del ambiente a su
movimiento, las bacterias pueden nadar de 20 a casi 90 µ/segundo. Esto es
equivalente a viajar de 2 a 100 longitudes celulares por segundo; en contraste, un
humano excepcionalmente rápido de 1.5 m de altura, puede ser capaz de correr
cerca de cinco cuerpos de longitud por segundo.
Las bacterias pueden moverse por mecanismos diferentes a la rotación
flagelar. Las espiroquetas son bacterias helicoidales que viajan a través de
sustancias viscosas, tales como moco o fango, mediante movimientos de flexión y
expansión causados por un filamento axial especial. Un tipo diferente de motilidad,
motilidad por deslizamiento, es empleado por muchas bacterias: las cianobacterias,
los miembros de los órdenes Myxobacteriales y Cytophagales, y algunos
micoplasmas. Aunque no hay estructuras visibles asociadas con el deslizamiento,
estas bacterias pueden moverse a lo largo de superficies sólidas a tasas de 3
µ/segundo.
3.7 Quimiotaxis.
Las bacterias no siempre nadan de manera errática sino que son atraídas por
nutrientes tales como azúcares o aminoácidos y repelidas por muchas sustancias
dañinas y productos de desecho bacteriano (las bacterias también pueden responder
a otros factores ambientales como temperatura, luz y gravedad). El movimiento hacia
un atrayente químico o lejos de un repelente es conocido como quimiotaxis. Tal
comportamiento es una ventaja obvia para las bacterias.
La quimiotaxis positiva y negativa puede ser estudiada con cultivos en caja
petri. Si las bacterias son colocadas en el centro de una placa de agar que contiene
un atrayente, las bacterias agotarán los nutrientes locales y luego nadarán hacia el
gradiente del atrayente que han creado. El resultado es un anillo en expansión de
bacterias. Cuando un disco de repelente es colocado en una caja petri de agar
semisólido y bacterias, las bacterias nadarán lejos del repelente creando una zona
clara alrededor del disco.
Las bacterias pueden responder a niveles muy bajos del atrayente (cerca de
10-8 M para algunos azúcares), la magnitud de su respuesta se incrementa con la
concentración del atrayente. Usualmente los repelentes sólo son detectados a
concentraciones altas. Si un atrayente y un repelente están presentes juntos, la
31
bacteria comparará ambas señales y responderá al químico con la concentración
más efectiva.
Tanto los atrayentes como los repelentes son detectados por
quimiorreceptores, proteínas especiales que se unen a los químicos y transmiten
señales a otros componentes del sistema quimiosensitivo. Se han descubierto cerca
de 20 quimioreceptores de atrayentes y 10 para repelentes. Estas proteínas
quimioreceptoras pueden estar localizadas en el espacio periplásmico o en la
membrana plasmática. Algunos receptores participan en las etapas iniciales del
transporte de azúcar hacia el interior de la célula.
El comportamiento quimiotáctico de las bacterias ha sido estudiado usando el
microscopio de rastreo, un microscopio con una fase móvil que de manera
automática mantiene en foco a una bacteria individual. En ausencia de un gradiente
químico, E. coli y otras bacterias se mueven aleatoriamente. Una bacteria viaja en
línea recta o ligeramente curva, una corrida, por unos cuantos segundos: luego se
parará y cambiará de rumbo. El cambio de rumbo es seguido por una corrida en una
dirección diferente. Cuando la bacteria es expuesta a un gradiente del atrayente,
cambia de dirección con menos frecuencia (o tiene corridas más largas) cuando viaja
hacia el gradiente, pero regresa a su frecuencia normal de cambios de dirección
cuando se mueve lejos del gradiente. El comportamiento es moldeado por cambios
temporales en la concentración química: la bacteria compara su ambiente actual con
el experimentado en los momentos previos; si la concentración del atrayente es más
alta, los cambios en dirección se suprimen y la corrida es más larga. La respuesta
opuesta ocurre con un gradiente de repelente. La frecuencia de cambios de dirección
disminuye cuando la bacteria se mueve lejos del gradiente del repelente.
Como ya se dijo, las bacterias pueden responder a factores diferentes a los
químicos. Un ejemplo fascinante lo constituyen las bacterias magnetotácticas que en
los ambientes acuáticos se orientan a sí mismas en el campo magnético de la Tierra.
La mayoría de estas bacterias tienen cadenas intracelulares de partículas de
magnetita (Fe3O4) o magnetosomas, de cerca de 40 a 100 nm de diámetro y
rodeadas por una membrana. Algunas especies de hábitats sulfídricos tienen
magnetosomas que contienen greigita (Fe3S4) y pirita (FeS2). Puesto que cada
partícula de hierro es un pequeño magneto, las bacterias usan sus cadenas de
magnetosomas para determinar los rumbos hacia arriba o hacia abajo, y nadar hacia
los sedimentos ricos en nutrientes o localizar la profundidad óptima en ambientes
marinos o de agua dulce. Los magnetosomas también están presentes en la cabeza
de aves, atún, delfines, tortugas verdes y otros animales, para ayudar
presumiblemente a la navegación. Los animales y las bacterias comparten más
rasgos de comportamiento en común que lo que podríamos imaginarnos.
3.8 Endospora bacteriana.
Un número de bacterias Gram-positivas pueden formar una estructura de
resistencia llamada endospora. Las endosporas se desarrollan dentro de las células
32
bacterianas vegetativas de varios géneros: Bacillus y Clostridium (bacilos),
Sporosarcina (cocos) y otros. Estas estructuras son extraordinariamente resistentes
a estrés ambiental tal como calor, radiación ultravioleta, desinfectantes químicos, y
desecación. De hecho, algunas endosporas han permanecido viables por más de
500 años, y esporas de actinomicetes (las cuales no son esporas verdaderas) han
sido recuperadas vivas después de estar enterradas en el fango por 7,500 años.
Debido a su resistencia y al hecho de que varias especies de bacterias formadoras
de endosporas son patógenas peligrosas, las endosporas son de importancia
práctica en microbiología de alimentos, industrial y médica. Esto es debido a que es
esencial ser capaces de esterilizar soluciones y objetos sólidos. Las endosporas a
menudo sobreviven al calentamiento por una hora o más; por lo tanto las autoclaves
deben ser utilizadas para esterilizar muchos materiales. Las endosporas son también
de considerable interés teórico. Debido a que las bacterias fabrican estas intrincadas
entidades de una manera muy organizada en un periodo de pocas horas, la
formación de esporas es un modelo adecuado para la investigación sobre la
construcción de estructuras biológicas complejas. En el ambiente, las endosporas
ayudan a la supervivencia cuando los nutrientes son escasos.
Las endosporas pueden ser examinadas tanto con microscopio de luz como
electrónico. Debido a que las esporas son impermeables a la mayoría de los
colorantes, a menudo se les observa como áreas sin teñir en bacterias tratadas con
azul de metileno y otros colorantes simples; colorantes especiales para esporas son
utilizados para hacerlas claramente visibles. La posición de la espora en la célula
madre o esporangio difiere frecuentemente entre especies, haciendo esto de
considerable valor para la identificación. Las esporas pueden estar localizadas de
forma central, cerca de un extremo (subterminal), o definitivamente terminales.
Algunas veces una espora es tan larga que hace que el esporangio se hinche.
Las micrografías electrónicas muestran que la estructura de la endospora es
compleja. La espora a menudo está rodeada por una cubierta delgada y delicada
llamada exosporium. Por debajo del exosporium hay una cubierta de la espora que
está compuesta de varias capas de proteína y puede ser bastante gruesa. Es
impermeable y responsable de la resistencia de la espora a químicos. El córtex
(corteza), el cual puede ocupar tanto como la mitad del volumen de la espora,
descansa por debajo de la cubierta de la espora. Está hecho de un tipo de
peptidoglicano con menos entrecruzamientos que el de las células vegetativas. La
pared celular de la espora (o corazón de la pared) está dentro del córtex y rodea al
protoplasto o núcleo de la espora. El núcleo tiene las estructuras celulares normales,
tales como ribosomas y un nucleoide.
No se conoce con precisión por qué la espora es tan resistente al calor y a
otros agentes letales. Tanto como el 15 % del peso seco de la espora consiste en
ácido dipicolínico acomplejado con iones de calcio. Durante mucho tiempo se pensó
que el ácido dipicolínico estaba involucrado directamente en la resistencia de la
espora al calor, pero se han aislado mutantes resistentes al calor que carecen de
este tipo de ácido. Puede ser que el complejo calcio-dipicolinato estabilice los ácidos
nucleicos de las esporas. La deshidratación del protoplasto parece ser muy
33
importante en la resistencia al calor. El córtex puede remover agua osmóticamente
desde el protoplasto, así protege a la espora tanto del calor como del daño por
radiación. En resumen, la resistencia de la endospora al calor muy probablemente
sea debida a diversos factores: estabilización de diferentes componentes (como el
DNA) por el complejo calcio-dipicolinato, deshidratación del protoplasto, la mayor
estabilidad de proteínas celulares en bacterias adaptadas a crecer a altas
temperaturas, y otros.
La formación de la espora, llamada esporogénesis o esporulación, comienza
normalmente cuando cesa el crecimiento por la falta de nutrientes. Es un proceso
complejo y puede ser dividido en siete etapas. Se forma un filamento axial de
material nuclear (etapa I) seguido de una invaginación de la membrana celular para
encerrar parte del DNA y producir el septo de la espora preliminar (etapa II). La
membrana continúa creciendo y envuelve a la espora inmadura en una segunda
membrana (etapa III). En seguida, el córtex es colocado en el espacio entre las dos
membranas y se acumulan tanto el calcio como el ácido dipicolínico (etapa IV).
Después las proteínas de la cubierta son formadas alrededor del córtex (etapa V) y
ocurre la maduración de la espora (etapa VI). Finalmente, enzimas líticas destruyen
el esporangio dejando libre la espora (etapa VII). En Bacillus megaterium la
esporulación requiere de sólo 10 horas.
La transformación de una espora latente en una célula vegetativa activa
parece un proceso casi tan complejo como la esporulación. Ocurre en tres etapas:
(1) activación, (2) germinación y (3) eclosión. A menudo una espora no germinará
exitosamente, incluso en un medio rico en nutrientes, si no ha sido previamente
activada. La activación es un proceso reversible que prepara a la espora para la
germinación y usualmente es el resultado de tratamientos como el calor. La
activación es seguida por la germinación, el rompimiento del estado latente de la
espora. Este proceso está caracterizado por una hinchazón de la espora, ruptura y
absorción de la cubierta de la espora, pérdida de la resistencia al calor y otros tipos
de estrés, liberación de los componentes de la espora, e incremento de la actividad
metabólica. Muchos metabolitos normales o nutrientes (por ejemplo aminoácidos y
azúcares) pueden desencadenar la germinación después de la activación. La
germinación es seguida por la tercera etapa, la eclosión. El protoplasto de la espora
fabrica nuevos componentes, emerge del resto de la cubierta de la espora, y se
desarrolla de nuevo a una bacteria activa.
34
CAPÍTULO IV. NUTRICIÓN MICROBIANA.
Para obtener energía y construir nuevos componentes celulares, los
organismos deben tener una fuente de materias primas o nutrientes. Los nutrientes
son sustancias utilizadas en biosíntesis y en la producción de energía y por lo tanto
se requieren para el crecimiento microbiano. Este capítulo describe los
requerimientos nutricionales de los microorganismos, cómo son adquiridos los
nutrientes, y el cultivo de los microorganismos.
Factores ambientales tales como la temperatura, los niveles de oxígeno y la
concentración osmótica del medio son críticos para el cultivo exitoso de los
microorganismos. Estos tópicos se describirán en el siguiente capítulo.
4.1
Requerimientos Comunes de Nutrientes.
Un análisis de la composición de la célula microbiana muestra que cerca del
95% de su peso seco está basado en unos cuantos elementos principales: carbono,
oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, azufre, fósforo, potasio, calcio, magnesio y hierro.
Éstos son llamados macroelementos o macronutrientes debido a que el organismo
los requiere en cantidades relativamente grandes. Los primeros seis (C, O, H, N, S y
P) son componentes de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los
restantes cuatro macroelementos existen en la célula como cationes y juegan una
variedad de papeles. Por ejemplo, el potasio (K+) es requerido para la actividad de un
gran número de enzimas, incluidas algunas de las involucradas en la síntesis de
proteínas. El calcio (Ca2+), entre otras funciones, contribuye a la resistencia al calor
de las endosporas. El magnesio (Mg2+) sirve como cofactor de muchas enzimas,
acomplejado con ATP, y estabiliza los ribosomas y las membranas celulares. El
hierro (Fe2+ y Fe3+) es parte de los citocromos y cofactor de enzimas y proteínas
transportadoras de electrones.
Todos los microorganismos requieren de varios elementos traza (también
llamados microelementos o micronutrientes) además de macroelementos. Estos
elementos traza (manganeso, zinc, cobalto, molibdeno, níquel y cobre), son
necesarios para la mayoría de las células. Sin embargo, las células los requieren en
cantidades tan pequeñas que presentes como contaminantes en agua, recipientes de
vidrio o en medios regulares, son adecuados para el crecimiento. Normalmente los
elementos traza son parte de enzimas y cofactores y ayudan en la catálisis de
reacciones y en el mantenimiento de la estructura de las proteínas. Por ejemplo, el
zinc (Zn2+) está presente en el sitio activo de algunas enzimas y está también
involucrado en la asociación de subunidades regulatorias y catalíticas en la aspartato
carbamoiltransferasa de E. coli. El manganeso (Mn2+) ayuda a muchas enzimas a
catalizar la transferencia de grupos fosfato. El molibdeno (Mo2+) es requerido para la
fijación de nitrógeno y el cobalto (Co2+) es componente de la vitamina B12.
Los elementos pueden ser categorizados de una manera un poco diferente
con respecto a los requerimientos nutricionales. Los elementos mayores (C, O, H, N,
35
S, P) son necesario en cantidades de gramos por litro de medio de cultivo. Los
elementos menores (K, Ca, Mg, Fe) se requieren a menudo en cantidades de
miligramos. Los elementos traza (Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu) deben estar disponibles en
cantidades de microgramos.
Además de los macroelementos comunes y de los elementos traza, los
microorganismos pueden tener requerimientos particulares que reflejan la naturaleza
especial de su morfología o ambiente. Las diatomeas necesitan ácido silícico
(H4SiO4) para construir sus hermosas paredes celulares de sílica [(SiO2)n]. Aunque la
mayoría de las bacterias no requieren grandes cantidades de sodio, muchas
bacterias crecen en lagos salinos y en océanos dependiendo de la presencia de altas
concentraciones del ión sodio (Na+).
Requerimientos de carbono, hidrógeno y oxígeno.
A menudo, los requerimientos de carbono, hidrógeno y oxígeno son
satisfechos juntos. El carbono es requerido para el esqueleto de todas las moléculas
orgánicas, y las moléculas que sirven como fuente de carbono usualmente también
contribuyen al aporte de hidrógeno y oxígeno. Una fuente de carbono para la cual
esto no es verdad es el bióxido de carbono (CO2) debido a que está oxidado y carece
de hidrógeno. Probablemente todos los microorganismos pueden fijar CO2, esto es,
reducirlo e incorporarlo a moléculas orgánicas.
Sin embargo, por definición,
sólo los autótrofos pueden usar CO2 como su fuente principal o única de carbono.
Muchos microorganismos son autotróficos: muchos de ellos son fotosintéticos, pero
algunos autótrofos oxidan moléculas inorgánicas para obtener energía.
La reducción de CO2 es un proceso muy costoso en términos de energía. Por
ello, muchos microorganismos no pueden utilizarlo como su única fuente de carbono,
sino que dependen de la presencia de moléculas complejas más reducidas para
obtener el carbono. Los organismos que usan moléculas prefabricadas más
reducidas como fuente de carbono son heterótrofos (estas moléculas prefabricadas
normalmente proceden de otros organismos). La mayoría de los heterótrofos usan
nutrientes orgánicos tanto como fuente de carbono como de energía. Por ejemplo, la
vía glicolítica atrapa la energía como ATP y NADH y también produce esqueletos de
carbono para su uso en biosíntesis.
Una característica nutricional más remarcable de los microorganismos es su
extraordinaria flexibilidad con respecto a la fuente de carbono. No hay molécula
orgánica de ocurrencia en la naturaleza que no pueda ser utilizada por algún
microorganismo. Los Actinomicetos pueden degradar alcohol amílico, parafina, e
incluso caucho. Algunas bacterias parecen capaces de emplear casi cualquier cosa
como fuente de carbono; por ejemplo, Pseudomonas cepacia puede usar alrededor
de 100 diferentes compuestos de carbono. Desafortunadamente, muchas sustancias
hechas por el hombre, como plásticos y DDT son degradados muy lentamente o
incluso no son degradados. En contraste con las bacterias omnívoras, algunas
bacterias son extremadamente meticulosas y catabolizan pocas fuentes de carbono.
Las bacterias metilotróficas, por ejemplo, metabolizan sólo metano, metanol,
36
monóxido de carbono, ácido fórmico y unas cuantas moléculas relacionadas de un
carbono. Los miembros parasíticos del género Leptospira usan sólo ácidos grasos de
cadena larga como su principal fuente de carbono y energía.
Los requerimientos nutricionales de los microorganismos varían enormemente
entre las diferentes especies. Además, estos requerimientos pueden cambiar dentro
de una especie debido a mutaciones. Un microorganismo que requiere los mismos
nutrientes como la mayoría de los miembros de su especie es un protótrofo. Un
microorganismo prototrófico puede mutar de manera que no puede sintetizar una
molécula esencial para el crecimiento y reproducción. Requerirá entonces una
molécula, o un compuesto que pueda ser convertida a, como nutriente. Un
microorganismo mutado que carece de la habilidad para sintetizar un nutriente
esencial y por lo tanto debe obtenerlo, o a un precursor, de su entorno es un
auxótrofo. El requerimiento de un aminoácido específico es una forma común de
auxotrofía. Muchos microorganismos pueden sintetizar todos los aminoácidos
comunes necesarios para el crecimiento. Ocasionalmente una mutación bloquea la
síntesis de un aminoácido esencial y el microorganismo se volverá auxótrofo para
éste, esto es, el aminoácido debe estar disponible para que el crecimiento tenga
lugar. La producción de auxótrofos es utilizada en el estudio de genética microbiana,
entre otras áreas.
Requerimientos de nitrógeno, fósforo y azufre.
Para crecer, un microorganismo debe ser capaz de incorporar grandes
cantidades de nitrógeno, fósforo y azufre. Aunque estos elementos pueden ser
adquiridos de los mismos nutrientes que proveen el carbono, los microorganismos
usualmente también emplean fuentes inorgánicas.
El nitrógeno es necesario para la síntesis de aminoácidos, purinas, pirimidinas,
algunos carbohidratos y lípidos, cofactores de enzimas, y otras sustancias. Muchos
microorganismos pueden usar el nitrógeno de aminoácidos, y el amonio es a menudo
incorporado directamente por la acción de enzimas tales como la glutamato
deshidrogenasa o la glutamina sintetasa y la glutamato sintetasa. La mayoría de los
fotótrofos y muchos microorganismos no fotosintéticos reducen el nitrato a amonio e
incorporan el amonio en una nitrato reducción asimilatoria. Una variedad de bacterias
(por ejemplo muchas cianobacterias y la bacteria simbiótica Rhizobium) pueden
reducir y asimilar nitrógeno atmosférico usando el sistema nitrogenasa.
El fósforo está presente en los ácidos nucleicos, fosfolípidos, nucleótidos
como el ATP, diversos cofactores, algunas proteínas, y otros componentes celulares.
Casi todos los microorganismos usan fosfato inorgánico como fuente de fósforo y lo
incorporan directamente. Algunos microorganismos (como E. coli) adquieren fosfato
de manera activa directamente de su ambiente. Niveles bajos de fosfato limitan el
crecimiento microbiano en muchos ambientes acuáticos.
El azufre es necesario para la síntesis de sustancias como los aminoácidos
cisteína y metionina, algunos carbohidratos, biotina, y tiamina. La mayoría de los
37
microorganismos usan sulfato como fuente de azufre y lo reducen por sulfato
reducción asimilativa; unos cuantos requieren formas reducidas de azufre tales como
la cisteína.
4.2
Tipos Nutricionales de Microorganismos.
Todos los organismos requieren también de una fuente de energía, hidrógeno
y electrones para que el crecimiento tenga lugar. Los microorganismos pueden ser
agrupados en clases nutricionales de acuerdo a cómo satisfacen estos requerimiento
(Tablas 4.1 y 4.2). Hay sólo dos tipos de fuentes de energía disponibles para los
organismos: (1) energía lumínica atrapada durante la fotosíntesis, y (2) energía
derivada de la oxidación de moléculas orgánicas e inorgánicas. Los fototrofos usan
luz como fuente de energía; los quimiotrofos obtienen energía de la oxidación de
compuestos químicos (tanto orgánicos como inorgánicos). Los microorganismos
también tienen sólo dos fuentes de átomos de hidrógeno o electrones. Los litotrofos
(esto es, “comedores de rocas”) usan sustancias inorgánicas reducidas como fuente
de electrones, mientras que los organotrofos extraen electrones o hidrógeno de
compuestos orgánicos.
Tabla 4.1 Fuente de carbono, energía, e hidrógeno/electrones
Fuente de carbono
Autótrofos
CO2 como fuente única o principal de carbono para
biosíntesis.
Heterótrofos
Moléculas
orgánicas
reducidas
y
prefabricadas
procedentes de otros organismos.
Fuente de energía
Fototrofos
Luz.
Quimiotrofos
Oxidación de compuestos orgánicos o inorgánicos.
Fuente de hidrógeno o electrones
Litotrofos
Moléculas inorgánicas reducidas.
Organotrofos
Moléculas orgánicas.
Tabla 4.2 Principales tipos nutricionales de los microorganismos.
Principales tipos
Fuente de energía,
Microorganismos
a
nutricionales
hidrógeno/electrones y
representativos.
carbono.
Autótrofos Fotolitotrofos
Algas.
Energía lumínica.
Donador inorgánico de
Bacterias púrpura y verde
azufrosas.
hidrógeno/electrones (H/e )
CO2 como fuente de carbono
Bacterias verde-azules
(cianofíceas).
Heterótrofos
Energía lumínica.
Bacterias púrpura no
Fotoorganotrofos
Donador orgánico H/e
sulfurosas.
Fuente orgánica de carbono
Bacterias verdes no
(también pueden utilizar CO2). sulfurosas.
Autótrofos Quimiolitotrofos
Fuente de energía química
Bacterias oxidativas azufrosas
(inorgánica)
Bacterias del hidrógeno.
Donador inorgánico H/eBacterias nitrificantes
CO2 como fuente de carbono
Bacterias del hierro.
38
Heterótrofos
Quimiorganotrofos
Protozoarios.
Hongos.
La mayoría de las bacterias no
fotosintéticas (incluidas la
mayoría de las patógenas).
a
Se han encontrado bacterias en otras categorías nutricionales. Las categorías se definen en
términos de energía, electrones, y fuente de carbono.
Fuente de energía química
(orgánica).
Donador orgánico H/e
Fuente orgánica de carbono.
A pesar de la gran diversidad metabólica observada entre los
microorganismos, la mayoría puede ser colocada en una de cuatro clases
nutricionales en base a su fuente primaria de energía, hidrógeno y/o electrones, y
carbono (Tabla 4.2). La gran mayoría de los microorganismos más extensamente
estudiados son autótrofos fotolitotrofos o heterótrofos quimiorganotrofos. Los
autótrofos fotolitotrofos (a menudo llamados fotoautótrofos) usan la energía lumínica
y CO2 como fuente de carbono. Los heterótrofos quimiorganotrofos (a menudo
llamados quimioheterótrofos e incluso heterótrofos) usan compuestos orgánicos
como fuente de energía, hidrógeno, electrones y carbono para biosíntesis.
Frecuentemente los mismos nutrientes orgánicos satisfarán todos esos
requerimientos. Es de apuntar que esencialmente todos los microorganismos
patógenos son quimioheterótrofos. Las otras dos clases tienen menos
microorganismos pero a menudo son muy importantes ecológicamente. Algunas
bacterias púrpuras y verdes son fotosintéticas y usan materia orgánica como
donadora de electrones y fuente de carbono. Estos heterótrofos fotoorganotrofos son
habitantes comunes de lagos contaminados. Algunas de estas bacterias también
pueden crecer como fotoautótrofos con hidrógeno molecular como donador de
electrones. El cuarto grupo, los autótrofos quimiolitotrofos oxidan compuestos
orgánicos reducidos tales como moléculas de hierro, nitrógeno o azufre para obtener
tanto energía como electrones para biosíntesis. El bióxido de carbono es la fuente de
carbono. Unos cuantos quimiolitotrofos pueden obtener carbono de fuentes
orgánicas y ser así heterótrofos. Bacterias que dependen de fuentes inorgánicas de
energía y de fuentes orgánicas de carbono (o en ocasiones CO2) pueden ser
llamadas mixotróficas (son una combinación de procesos metabólicos autótrofos y
heterótrofos). Los quimiolitotrofos contribuyen enormemente a la transformación
química de elementos (por ejemplo, la conversión de amonio a nitrato o de azufre a
sulfato) que ocurre continuamente en los ecosistemas.
Aunque usualmente una especie particular pertenece a sólo una de las cuatro
clases nutricionales, algunas muestran una gran flexibilidad metabólica y alteran sus
patrones metabólicos en respuesta a cambios en el ambiente. Por ejemplo, muchas
bacterias púrpura no sulfurosas actúan como heterótrofos fotoorganotrofos en
ausencia de oxígeno, pero oxidan moléculas orgánicas y funcionan
quimiotróficamente a niveles normales de oxígeno. Cuando el oxígeno es bajo, la
fotosíntesis y el metabolismo oxidativo pueden funcionar simultáneamente. Este tipo
de flexibilidad parece complejo y confuso, incluso si da a quien lo posee una ventaja
definitiva si las condiciones ambientales cambian frecuentemente.
39
4.3
Factores de Crecimiento.
Los microorganismos, especialmente muchos autótrofos fotolitotrofos, crecen y
se reproducen cuando son suplementados minerales, fuente de energía, carbono,
nitrógeno, fósforo y azufre. Estos microorganismos tienen las enzimas y vías
metabólicas necesarias para sintetizar todos los componentes celulares requeridos
para su buen desarrollo. Por otra parte, muchos microorganismos carecen de una o
más enzimas esenciales. Por lo tanto no pueden fabricar todos los constituyentes
indispensables sino que deben obtenerlo, o a sus precursores, del ambiente. Los
compuestos orgánicos que son requeridos debido a que son esenciales para los
componentes celulares o para los precursores de dichos componentes y que no
pueden ser sintetizados por el microorganismo, son llamados factores de
crecimiento. Hay tres clases principales de factores de crecimiento: (1) aminoácidos,
(2) purinas y pirimidinas, y (3) vitaminas. Los aminoácidos son necesarios para la
síntesis de proteínas, y las purinas y pirimidinas para la síntesis de ácidos nucleicos.
Las vitaminas son pequeñas moléculas orgánicas que usualmente toman parte como
cofactores de enzimas y sostienen el crecimiento en cantidades muy pequeñas.
Algunos microorganismos requieren muchas vitaminas; por ejemplo, Enterococus
faecalis (una bacteria ácido láctica) necesita ocho diferentes vitaminas para crecer.
También se observan otros factores de crecimiento; el grupo hemo (de la
hemoglobina o los citocromos) es requerido por Haemophilus influenzae, y algunos
micoplasmas necesitan colesterol.
El conocimiento del factor de crecimiento específico requerido de muchos
microorganismos hace posible ensayos cuantitativos de crecimiento-respuesta para
una variedad de sustancias. Por ejemplo, las especies de los géneros bacterianos
Lactobacillus y Streptococcus pueden ser usados en análisis microbiológico de la
mayoría de las vitaminas y aminoácidos. La bacteria apropiada es crecida en una
serie de tubos de cultivo, cada uno conteniendo medio con una cantidad excesiva de
todos los componentes requeridos, excepto el factor de crecimiento a ser analizado.
A cada vaso se le añade una cantidad diferente del factor de crecimiento. Se prepara
una curva estándar graficando la concentración o cantidad del factor de crecimiento
contra el crecimiento bacteriano total. Idealmente, la cantidad de crecimiento
resultante es directamente proporcional a la cantidad de factor de crecimiento
presente; si la concentración del factor de crecimiento se dobla, el crecimiento final
se duplica. La cantidad de factor de crecimiento presente en una muestra problema
se determina comparando el crecimiento obtenido en la muestra desconocida con el
crecimiento resultante en la curva estándar. Los análisis microbiológicos son
específicos, sensibles y simples. Son aún usados en el análisis de sustancias como
la vitamina B12 y la biotina, además de los avances en técnicas de análisis químico.
4.4
Toma de Nutrientes por la Célula.
El primer paso para el uso de nutrientes es la toma del nutriente requerido por
la célula microbiana. Los mecanismos de toma deben ser específicos, esto es, debe
adquirirse la sustancia necesaria, y no otra. Esto vuelve a las células malas para
40
tomar una sustancia que no pueden usar. Puesto que los microorganismos a
menudo viven en hábitats pobres en nutrientes, deben ser capaces de transportar los
nutrientes de soluciones diluidas hacia la célula en contra del gradiente de
concentración. Finalmente, las moléculas de nutrientes deben pasar a través de una
selectivamente permeable membrana plasmática que no permite el paso libre de la
mayoría de las sustancias. En vista de la enorme variedad de nutrientes y la
complejidad de la tarea, no es de sorprender que los microorganismos hagan uso de
varios mecanismos de transporte diferentes. Los más importantes de éstos son la
difusión facilitada, el transporte activo, y la translocación de grupos. Los
microorganismos eucariotas no parecen emplear translocación de grupos, pero
toman nutrientes por procesos de endocitosis.
Difusión facilitada.
Unas cuantas sustancias, tales como el glicerol, pueden cruzar la membrana
plasmática por difusión pasiva. La difusión pasiva, a menudo llamada simplemente
difusión, es el proceso en el cual las moléculas se mueven de una región de alta
concentración a una de menos concentración debido a la agitación térmica aleatoria.
La tasa de difusión pasiva depende del tamaño del gradiente de concentración entre
el exterior celular y el interior. Un gradiente de concentración grande es requerido
para una adecuada toma de nutrientes por difusión pasiva y, a menos que los
nutrientes sean utilizados de manera inmediata, la tasa de toma de nutrientes
decrece conforme éstos son adquiridos. La difusión pasiva es un proceso ineficiente
y no es empleado de manera extensiva por los microorganismos. Moléculas muy
pequeñas tales como H2O, O2 y CO2 a menudo se mueven a través de la membrana
por difusión pasiva.
La tasa de difusión a través de membranas selectivamente permeables se
incrementa enormemente usando proteínas transportadoras, algunas veces llamadas
permeasas, las cuales están embebidas en la membrana plasmática. Debido a que
los transportadores ayudan al proceso de difusión, este mecanismo es llamado
difusión facilitada. La tasa de difusión facilitada se incrementa con el gradiente de
concentración mucho más rápido y a concentraciones más bajas de la molécula que
se difunde que la difusión pasiva. Nótese que los niveles de difusión alcanzan un
plato por encima de valores específicos de gradiente debido a que el transportador
se satura, esto es, la proteína transportadora está unida y transportando tantas
moléculas de soluto como es posible. La curva que resulta se asemeja a una curva
enzima-sustrato y es diferente de la respuesta linear que se observa con difusión
pasiva. Las proteínas transportadoras también se asemejan a las enzimas en su
especificidad por la sustancia a ser transportada; cada transportador es selectivo y
transportará sólo solutos cercanamente relacionados. Aunque hay proteínas
transportadoras involucradas, la difusión facilitada es realmente una difusión. Un
gradiente de concentración a lo largo de la membrana dirige el movimiento de
moléculas y no se requiere energía extra; si el gradiente de concentración
desaparece, el movimiento hacia el interior de la célula cesa.
41
Aunque se ha hecho mucha investigación sobre el mecanismo de la difusión
facilitada, el proceso no es aún comprendido por completo. Parece que los complejos
de proteínas transportadoras cruzan la membrana. Después de que la molécula de
soluto se une en el exterior, el transportador puede cambiar su conformación y llevar
la molécula hacia el interior celular. El transportador puede subsecuentemente
regresar a su forma original y estar listo para tomar otra molécula. El efecto neto es
que una molécula no liposoluble puede entrar a la célula en respuesta a su gradiente
de concentración. Hay que recordar que el mecanismo es reversible; si la
concentración del soluto es más grande adentro de la célula, éste se moverá hacia
afuera. Debido a que la célula metaboliza los nutrientes al entrar, el influjo se ve
favorecido.
La difusión facilitada no parece ser importante en procariotas. El glicerol es
transportado por difusión facilitad en E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas,
Bacillus y muchas otras bacterias. El proceso es mucho más prominente en células
eucariotas donde es usado para transportar una variedad de azúcares y
aminoácidos.
Transporte activo.
Aunque los transportadores de difusión facilitada pueden mover
eficientemente moléculas hacia el interior cuando la concentración del soluto es más
alta en el exterior, éste no puede ser tomado cuando la concentración es mayor en el
interior de la célula (es decir, en contra del gradiente de concentración). Los
microorganismos a menudo viven en hábitats caracterizados por fuentes diluidas de
nutrientes y, para desarrollarse, deben ser capaces de transportar y concentrar
dichos nutrientes. Así, el mecanismo de difusión facilitada no siempre es adecuado, y
deben utilizarse otras formas. Los dos procesos de transporte más importantes en
tales situaciones son el transporte activo y la translocación de grupos.
El transporte activo es el transporte de moléculas de soluto hacia una
concentración más alta, o en contra del gradiente de concentración, con el uso de
energía metabólica. Debido a que el transporte activo involucra actividad de
proteínas acarreadoras, en algunos aspectos de parece a la difusión facilitada. Las
proteínas transportadoras se unen a solutos particulares con gran especificidad.
Moléculas de solutos similares pueden competir por la misma proteína
transportadora tanto en la difusión facilitada como en el transporte activo. El
transporte activo también se caracteriza por el efecto de saturación de acarreadores
a altas concentraciones de solutos. Sin embargo, el transporte activo difiere de la
difusión facilitada en el uso de energía metabólica y en su habilidad para concentrar
sustancias. Los inhibidores metabólicos que bloquean la producción de energía
inhibirán el transporte activo, sin afectar la difusión facilitada (al menos en el corto
plazo). El sistema de unión con proteínas transportadoras emplea proteínas
especiales de unión con el sustrato localizadas en el espacio periplásmico de las
bacterias gram-negativas. Estas proteínas periplásmicas, que también participan en
la quimiotaxis, se unen a la molécula a ser transportada y luego interactúan con las
proteínas de transporte de la membrana para mover la molécula de soluto hacia el
42
interior celular. Estos complejos de membrana tienen al parecer varias subunidades y
forman un poro en la membrana. La fuente de energía es ATP, aunque también
pueden utilizarse otros compuestos fosfatados de alta energía. E. coli transporta una
variedad de azúcares (arabinosa, maltosa, galactosa, ribosa) y aminoácidos
(glutamato, histidina, leucina) por este mecanismo. El transporte mediado por ATP
está también presente en gram-positivas, pero no está tan bien entendido como en
organismos gram-negativos.
Las bacterias también usan fuerza protonmotriz (usualmente en la forma de un
gradiente de protones generado durante el transporte de electrones) para realizar el
transporte activo. Las proteínas transportadoras de membrana responsables de este
proceso carecen de proteínas especiales de unión a solutos en el periplasma. La
lactosa permeasa de E. coli es un ejemplo bien estudiado. La permeasa es una
proteína sencilla que tiene un peso molecular de 30,000. Transporta una molécula de
lactosa hacia el interior conforme un protón entra de manera simultánea (una alta
concentración de protones es mantenida fuera de la membrana por actividad de la
cadena transportadora de electrones). Este transporte ligado de dos sustancias en la
misma dirección es llamado simportador. Aquí, la energía almacenada como
gradiente de protones dirige el transporte de solutos. Aunque el mecanismo de
transporte no está completamente entendido, se cree que la unión del protón a la
proteína transportadora le cambia su forma y afinidad por el soluto a ser
transportado. E. coli también usa simportadores para adquirir aminoácidos y ácidos
orgánicos tales como el succinato y el malato.
La fuerza protonmotriz también puede accionar el transporte activo
indirectamente, a menudo a través de la formación de un gradiente de sodio. Por
ejemplo, un sistema de transporte de sodio en E. coli bombea sodio hacia el exterior
en respuesta al movimiento de protones hacia el interior. Tal transporte ligado en el
cual las sustancias transportadas se mueven en direcciones opuestas es llamado
antiportador. El gradiente de sodio generado por este sistema dirige entonces la
toma de azúcares y aminoácidos. Un ión sodio puede unirse a una proteína
transportadora ocasionando un cambio en su configuración; el transportador puede
unirse luego al azúcar o al aminoácido y orientar sus sitios de unión para conducirlos
al interior celular. Debido a la baja concentración de sodio intracelular, el ión sodio
puede disociarse del trasportadora y enseguida lo hará la otra molécula también. Las
proteínas transportadoras en E. coli llevan el azúcar melibiosa y al aminoácido
glutamato cuando el sodio se mueve simultáneamente al interior de la célula. El
simportador de sodio es también un proceso importante en células eucariotas, donde
es usado en la toma de azúcares y aminoácidos. El ATP, más que la fuerza
protonmotriz, dirige usualmente el transporte de sodio en este tipo de células.
Parece razonable que los microorganismos pudieran tener un solo sistema de
transporte para cada nutriente, pero a menudo esto no es así, como se ha observado
en E. coli. Esta bacteria tiene al menos cinco sistemas de transporte para el azúcar
galactosa, tres sistemas para cada uno de los aminoácidos glutamato y leucina, y
dos complejos de transporte de potasio. Cuando hay varios sistemas de transporte
para la misma sustancia el sistema difiere en propiedades tales como su fuente de
43
energía, su afinidad por el soluto transportado, y la naturaleza de su regulación.
Presumiblemente esta diversidad da a su poseedor una ventaja competitiva adicional
en un ambiente variable.
Translocación de grupos.
En el transporte activo, las moléculas de soluto se mueven a través de una
membrana sin ser modificadas. Muchas procariotas también toman moléculas por
translocación de grupos, un proceso en el cual una molécula es transportada dentro
de la célula mientras es químicamente alterada. El mejor sistema de translocación
conocido es el sistema fosfoenolpiruvato: azúcar fosfotransferasa (PTS). Este
sistema transporta una variedad de azúcares hacia dentro de la célula procariota
mientras las fosforila usando fosfoenolpiruvato (PEP) como donador de fosfato.
PEP + azúcar (exterior) -------------> Piruvato + azúcar-P (interior)
El PTS es bastante complejo. En E. coli y Salmonella typhimurium consiste de
dos enzimas y una proteína termoestable de bajo peso molecular (HPr). La HPr y la
enzima I (EI) son citoplásmicas. La enzima II (EII) es más variable en estructura y a
menudo está compuesta de tres subunidades o dominios. EIIA (anteriormente
llamada EIII) es citoplásmica y soluble. EIIB también es hidrofílica, pero
frecuentemente está unida a EIIC, una proteína hidrofóbica que está embebida en la
membrana. Un fosfato de alta energía es transferido del PEP a la enzima II con la
ayuda de la enzima I y la HPr. Luego, conforme una molécula de azúcar es
transportada a través de la membrana por la enzima II, es fosforilada. La enzima II
transporta sólo azúcares específicos y varía con el PTS, mientras que la enzima I y la
HPr son comunes a todos los PTS.
Los PTS están ampliamente distribuidos entre los procariotas. Excepto para
algunas especies de Bacillus que tienen tanto la vía de Embden-Meyerhof como el
sistema fosfotransferasa, las bacterias aerobias parecen carecer de PTS. Los
miembros de los géneros Escherichia, Salmonella, Staphylococcus y otras bacterias
anaerobias facultativas tienen sistema fosfotransferasa; algunas bacterias
anaerobias obligadas (como Clostridium) también tienen PTS. Muchos carbohidratos
son transportados por este sistema. E coli toma glucosa, fructosa, manitol, sacarosa,
N-acetilglucosamina, celobiosa, y otros carbohidratos por translocación de grupos.
Además de su papel en el transporte, las proteínas del PTS pueden actuar como
receptores para quimiotaxis.
Toma de hierro.
Casi todos los microorganismos requieren hierro para usarlo en citocromos y
en muchas enzimas. La toma de hierro se dificulta por la gran insolubilidad del ión
férrico (Fe3+) y sus derivados, los cuales dejan poco hierro libre disponible para el
transporte. Muchas bacterias y hongos vencen esta dificultad secretando sideróforos.
Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que son capaces de
44
acomplejarse con iones de hierro y suplementarlos a la célula. Estas moléculas
transportadoras de hierro son normalmente hidroxamatos o fenolatos-catecolatos.
El ferrocromo es un hidroxamato producido por muchos hongos: la
enterobactina es un catecolato producido por E. coli. Al parecer tres grupos
sideróforos de acomplejan con los orbitales del hierro para formar un complejo
hexacoordinado octahédrico.
Los microorganismos secretan sideróforos cuando hay poco hierro disponible
en el medio. Una vez que los complejos hierro-sideróforo han alcanzado la superficie
celular, se unen a una proteína receptora de sideróforos. Luego el hierro es liberado
para entrar directamente a la célula, o bien el complejo entero es transportado hacia
el interior. En E. coli el receptor sideróforo está en la membrana externa de la
envoltura celular; cuando el hierro alcanza el espacio periplásmico se mueve a través
de la membrana plasmática con la ayuda de otras proteínas. Después de que el
hierro ha entrado a la célula, se reduce a su forma ferrosa (Fe2+). El hierro es tan
crucial para los microorganismos que ellos pueden usar más de una ruta de
adquisición para asegurar su suplemento adecuado.
4.5
Medios de Cultivo.
Gran parte de la microbiología depende de la habilidad para crecer y mantener
los microorganismos en el laboratorio, y esto es posible sólo si están disponibles
medios de cultivo adecuados. Además, los medios especializados son esenciales en
el aislamiento e identificación de microorganismos, el análisis de sensibilidad a
antibióticos, análisis de agua y alimentos, microbiología industrial, y otras
actividades. Aunque todos los microorganismos necesitan una fuente de energía,
carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un
medio satisfactorio dependerá de la especie que se pretende cultivar debido a que
los requerimientos nutricionales varían enormemente. El conocimiento del hábitat
normal de un microorganismo es a menudo útil en la selección de un medio de
cultivo apropiado debido a que sus requerimientos nutricionales reflejan su ambiente
natural. Frecuentemente un medio es usado para seleccionar y crecer
microorganismos específicos o ayudar a identificar una especie en particular. En tal
caso la función del medio también determinará su composición.
Medio definido o sintético.
Algunos microorganismos, particularmente autótrofos fotolitotrofos tales como
cianobacterias y algas eucariotas, pueden crecer en medios relativamente simples
que contengan CO2 como fuente de carbono (a menudo añadido como carbonato de
sodio o bicarbonato), nitrato o amonio como fuente de nitrógeno, sulfato, fosfato, y
una variedad de minerales. Tales medios en los cuales se conocen todos los
componentes, son conocidos como medios definidos o medios sintéticos. Muchos
heterótrofos quimiorganotrofos también pueden ser crecidos en medios definidos con
45
glucosa como fuente de carbono y sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los
medios definidos son usados ampliamente en investigación, ya que a menudo es
deseable conocer lo que el microorganismo experimental está metabolizando.
Medio complejo.
Los medios que contienen algunos ingredientes de composición química
desconocida son llamados medios complejos. Tales medios son muy útiles ya que
pueden ser lo suficientemente ricos y completos como para garantizar los
requerimientos nutricionales de muchos microorganismos diferentes. Además, los
medios complejos son a menudo necesarios debido a que no se conocen los
requerimientos nutricionales de un microorganismo en particular. Esta es la situación
con muchas bacterias meticulosas, algunas de las cuales incluso requieren un medio
que contenga sangre o suero.
Los medios complejos contienen componentes indefinidos tales como
peptonas, extracto de carne y extracto de levadura. Las peptonas son hidrolizados de
proteínas preparados por digestión proteolítica parcial de carne, caseína, soya,
gelatina, y otras fuentes de proteína. Pueden servir como fuente de carbono, energía
y nitrógeno. El extracto de carne y el extracto de levadura son extractos acuosos de
carne magra y levadura de cerveza, respectivamente. El extracto de carne contiene
aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales. El
extracto de levadura es una excelente fuente de vitaminas B así como de nitrógeno y
compuestos de carbono. Tres medios complejos usados comúnmente son (1) caldo
nutritivo, (2) caldo soya-tripticasa, y (3) agar McConkey.
Si se necesita un medio sólido para cultivo de microorganismos en superficie,
el medio líquido puede ser solidificado con la adición de 1.0% a 2.0% de agar, más
comúnmente 1.5%. El agar es un polímero sulfatado compuesto principalmente de Dgalactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa, y ácido D-glucorónico. Usualmente es extraído
de algas rojas. El agar es adecuado como agente solidificante debido a que después
de que ha sido calentado en baño maría puede ser enfriado a 40-420C antes de
endurecer y no se fundirá de nuevo hasta que la temperatura alcance de 80 a 900C.
El agar es también un excelente agente solidificante debido a que la mayoría de los
microorganismos no pueden degradarlo.
A menudo se emplean también otros agentes solidificantes. Por ejemplo, la
sílica gel es usada para crecer bacterias autótrofas sobre medio sólido en ausencia
de sustancias orgánicas y para determinar la fuente de carbono para bacterias
heterótrofas suplementando el medio con varios compuestos orgánicos.
Tipos de medios.
Los medios como el caldo soya-tripticasa y el agar soya-tripticasa son
llamados medios para propósitos generales ya que soportan el crecimiento de
muchos microorganismos. La sangre y otros nutrientes especiales pueden añadirse a
los medios de propósitos generales para fomentar el crecimiento de bacterias
46
heterótrofas meticulosas. Estos medios especialmente fortificados (por ejemplo el
agar sangre) son llamados medios enriquecidos.
Los medios selectivos favorecen el crecimiento de microorganismos en
particular. Las sales biliares o los colorantes como la fucsina básica y el cristal violeta
favorecen el crecimiento de bacterias gram-negativas inhibiendo el crecimiento de
bacterias gram-positivas. El agar endo, el agar eosina azul de metileno y el agar
McConkey tres medios ampliamente usados para la detección de E. coli y bacterias
relacionadas en fuentes de agua, contienen colorantes que suprimen el crecimiento
de bacterias gram-positivas. El agar McConkey también contiene sales biliares. Las
bacterias también pueden ser seleccionadas por incubación con nutrientes que
pueden usar específicamente. Un medio que contiene sólo celulosa como fuente de
carbono y energía es bastante efectivo en el aislamiento de bacterias que digieren
celulosa. Las posibilidades de selección son inmensas, y hay docenas de medios
selectivos especiales en uso.
Los medios diferenciales son medios que distinguen entre diferentes grupos
de bacterias e incluso permiten la identificación tentativa de microorganismos en
base a sus características biológicas. El agar sangre es tanto un medio diferencial
como enriquecido ya que distingue entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas. Las
bacterias hemolíticas (por ejemplo muchos estreptococos y estafilococos aislados de
la garganta) producen zonas claras alrededor de sus colonias debido a la destrucción
de las células rojas. El agar McConkey es tanto selectivo como diferencial. Puesto
que contiene lactosa y el colorante rojo neutro, las colonias que fermentan la lactosa
aparecen de rosa a rojo y se distinguen fácilmente de las colonias no fermentativas.
4.6
Aislamiento de Cultivos Puros.
En hábitats naturales los microorganismos usualmente crecen en poblaciones
mezcladas y complejas que contienen diversas especies. Esto representa un
problema para el microbiólogo ya que un tipo específico de microorganismo no
puede ser estudiado adecuadamente en un cultivo mezclado. Es necesario un cultivo
puro, una población de células originadas a partir de una única célula, para
caracterizar una especie individual. Los cultivos puros son tan importantes que el
desarrollo de las técnicas de cultivo puro por el bacteriólogo Roberto Koch
transformó la microbiología. Hay varias maneras de preparar cultivos puros; a
continuación se explican algunas de las más comunes.
Extendido en placa y estriado en placa.
Si una mezcla de células es extendida sobre una superficie de agar de manera
que cada célula crezca en una colonia completamente separada, un crecimiento
macroscópicamente visible en medio sólido, cada colonia representará un cultivo
puro. El extendido en placa es una técnica fácil y directa para obtener este resultado.
Un pequeño volumen de mezcla microbiana diluida conteniendo alrededor de 100 a
47
200 células o menos es transferido al centro de una caja petri con agar y extendida
uniformemente sobre la superficie con un asa de vidrio en forma de bastón. Las
células dispersadas se desarrollarán en colonias aisladas. Debido a que el número
de colonias debería igualar al número de organismos viables en la muestra, la
técnica de extendido en placa puede ser usada para contar la población microbiana.
También pueden obtenerse colonias puras por estriado en placa. La mezcla
microbiana es transferida al borde de una caja petri con agar con un asa de
inoculación (o bacteriológica) y luego distribuida por estriado sobre la superficie
siguiendo diferentes patrones. En algún punto del proceso células solitarias serán
separadas en la superficie y se desarrollaran en colonias individuales. Tanto en la
técnica de extendido como en la de estriado, el éxito del aislamiento depende de la
separación espacial de células únicas.
Vertido en placa.
La técnica de vertido en placa, usada extensivamente para bacterias y
hongos, también produce colonias aisladas. La muestra original es diluida varias
veces para reducir la población microbiana lo suficiente para obtener colonias
separadas cuando se los coloca en la caja petri. Luego, volúmenes pequeños de
varias muestras diluidas son mezclados con agar líquido que ha sido enfriado a cerca
de 450C, y las mezclas son vertidas inmediatamente en cajas petri estériles. La
mayor parte de las bacterias y hongos no mueren por una corta exposición al agar
tibio. Después de que el agar se ha solidificado cada célula queda fija en lugar y
forma como una colonia individual. El número total de colonias iguala al número de
microorganismos viables en la muestra diluida. Las colonias que crecen en la
superficie pueden también ser utilizadas para preparar medio fresco y preparar
cultivos puros.
Los métodos descritos son incluso más efectivos cuando se utilizan con
medios selectivos o diferenciales. Un buen ejemplo es el aislamiento de bacterias
que degradan el herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Las bacterias
capaces de metabolizar el 2,4-D pueden obtenerse con un medio líquido que
contenga 2,4-D como fuente única de carbono y los componentes requeridos de
nitrógeno, fósforo, azufre y minerales. Cuando este medio es inoculado con suelo,
sólo crecerán las bacterias capaces de utilizar el 2,4-D. Después de la incubación,
una muestra del cultivo original se transfiere a un matraz con medio selectivo fresco
para enriquecimiento adicional de las bacterias metabolizadoras de 2,4-D. Después
de varias transferencias similares se obtendrán poblaciones mixtas de bacterias
degradadoras de 2,4-D. Los cultivos puros pueden obtenerse cultivando esta mezcla
en agar que contenga 2,4-D como fuente única de carbono. Sólo las bacterias
capaces de crecer en 2,4-D formarán colonias visibles y pueden ser subcultivadas.
Esta misma metodología general es utilizada para aislar y purificar una gran cantidad
de bacterias seleccionándolas por características fisiológicas específicas.
48
Morfología colonial y crecimiento.
El desarrollo de colonias sobre superficies de agar ayuda al microbiólogo a
identificar bacterias debido a que especies individuales forman colonias de tamaño y
apariencia característicos. Cuando una población mixta ha sido cultivada en placa de
manera apropiada, es algunas veces posible identificar la colonia deseada en base a
su apariencia y usarla entonces para obtener un cultivo puro. La estructura de las
colonias bacterianas ha sido examinada también con el microscopio electrónico de
barrido. La estructura microscópica de las colonias es a menudo tan variable como la
apariencia visible.
En la naturaleza, las bacterias y muchos otros microorganismos crecen a
menudo como colonias sobre superficies. Por lo tanto, el entendimiento del
crecimiento colonial es esencial para los ecomicrobiológos. Generalmente el
crecimiento celular más veloz ocurre en el extremo de la colonia. El crecimiento es
más lento en el centro, y la autolisis celular tiene lugar en la porción central más vieja
de algunas colonias. Estas diferencias en crecimiento aparecen debido a la creación
de gradientes de oxígeno, nutrientes y productos tóxicos dentro de la colonia. En los
extremos de la colonia el oxígeno y los nutrientes son más abundantes. El centro de
la colonia, por supuesto, es mucho más delgado que el extremo. Consecuentemente,
el oxígeno y los nutrientes no se difunden rápidamente hacia el centro, mientras que
los productos de desecho no pueden ser rápidamente eliminados, y entonces el
crecimiento en el centro de la colonia disminuye y se detiene. Debido a estas
variaciones ambientales dentro de una colonia, las células en la periferia pueden
estar creciendo a tasa máxima mientras que las células en el centro están muriendo.
49
CAPÍTULO V. CRECIMIENTO MICROBIANO.
El crecimiento puede ser definido como un incremento en los constituyentes
celulares. Si el microorganismo es cenocítico, esto es un organismo multinucleado en
el cual las divisiones nucleares no se acompañan de división celular, el crecimiento
resulta en un incremento en el tamaño celular, pero no el número de células. El
crecimiento lleva a un aumento en el número de células cuando los microorganismos
se reproducen por un proceso como la fisión binaria. Al final, las células individuales
se alargan y dividen dos hijas de aproximadamente igual tamaño. Usualmente no es
conveniente investigar el crecimiento y reproducción de microorganismos
individuales debido a su pequeño tamaño. Por lo tanto, cuando se estudia el
crecimiento, los microbiólogos siguen normalmente los cambios en la población total.
5.1 Curva de Crecimiento.
El crecimiento de una población se estudia analizando la curva de crecimiento
de un cultivo microbiano. Cuando los microorganismos son cultivados en medio
líquido usualmente son crecidos en cultivo batch o sistema cerrado, esto es, se
incuban en un vaso de cultivo cerrado con sólo un lote de medio. Debido a que no se
proporciona medio fresco durante la incubación, la concentración de nutrientes
declina y la concentración de desechos se incrementa. El crecimiento de lo
microorganismos reproduciéndose por fisión binaria puede graficarse como el
logaritmo del número de células contra el tiempo de incubación. La curva resultante
tiene cuatro fases distintivas.
a. Fase Lag. Cuando los microorganismos son introducidos en medio de cultivo
fresco, el número de células no se incrementa usualmente de manera
inmediata y por lo tanto este período es llamado fase lag. Aunque no tiene
lugar la división celular y no hay incremento en masa, la célula está
sintetizando nuevos componentes. Una fase lag previa al inicio de la división
celular puede ser necesaria por diversas razones. Las células pueden ser
viejas y deficientes de ATP, cofactores esenciales, y ribosomas; todo esto
debe ser sintetizado antes de que el crecimiento pueda iniciar. El medio puede
ser diferente de aquel en el que el microorganismo estaba creciendo
previamente. Así, pueden requerirse nuevas enzimas par usar los diferentes
nutrientes. Posiblemente el microorganismo ha sido dañado y requiere tiempo
para recuperarse. Sin importar las causas, eventualmente las células se
revitalizan, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa, y finalmente
se dividen.
La fase lag varía considerablemente en longitud con las condiciones del
microorganismo y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser bastante larga
si el inóculo proviene de un cultivo viejo o uno que ha sido refrigerado. La
inoculación de un cultivo en un medio químicamente diferente también resulta
en una fase lag larga. Por otra parte, cuando un cultivo joven, vigoroso y en
fase exponencial es transferido a medio fresco de la misma composición, la
fase lag será muy corta o incluso estará ausente.
50
b. Fase Exponencial. Durante la fase exponencial o fase log los microorganismos
están creciendo y dividiéndose a la tasa máxima posible dada por su potencial
genético, la naturaleza del medio, y las condiciones bajo las cuales ellos están
creciendo. Su tasa de crecimiento es constante durante la fase exponencial, el
microorganismo se divide y dobla su número a intervalos regulares. Debido a
que cada individuo se divide en momentos ligeramente diferentes, la curva de
crecimiento se eleva suavemente más que a saltos discretos. La población es
más uniforme en términos de sus propiedades químicas y fisiológicas durante
esta fase; por lo tanto, los cultivos en fase exponencial son usados en
estudios bioquímicos y fisiológicos.
c. Fase Estacionaria. Eventualmente el crecimiento de la población cesa y la
curva de crecimiento de vuelve horizontal. Esta fase estacionaria usualmente
es alcanzada por las bacterias a un nivel de población de cerca de 109 células
por mililitro. Otros microorganismos no alcanzas niveles tan altos de densidad
de población; los cultivos de protozoarios y de algas a menudo tienen
concentraciones máximas de cerca de 106 células por mililitro. Por supuesto
que el tamaño final de la población depende de la disponibilidad de nutrientes
y de otros factores, así como del tipo de microorganismo que está siendo
cultivado. En la fase estacionaria el número total de microorganismos viables
permanece constante. Esto puede resultar de un balance entre la división
celular y la muerte celular, o la población puede simplemente cesar su división
aunque mantengan su actividad metabólica.
Las poblaciones microbianas entran a fase estacionaria por diversas razones.
Un factor obvio es la limitación de nutrientes; si un nutriente limitante está
severamente escaso, la población crecerá muy lentamente. Los
microorganismos aerobios están usualmente limitados por la disponibilidad de
O2. El oxígeno no es muy soluble y puede agotarse muy rápidamente de
manera que sólo en la superficie se encuentra en concentraciones adecuadas
para el crecimiento. Las células pro debajo de la superficie no serán capaces
de crecer a menos que el cultivo sea agitado o aireado de otra manera. El
crecimiento de la población también puede cesar debido a la acumulación de
producto de desecho tóxicos. Este factor parece limitar el crecimiento de
muchos cultivos anaerobios. Por ejemplo, los estreptococos pueden producir
mucho ácido láctico y otros ácidos orgánicos por la fermentación del azúcar de
manera que el medio se vuelve ácido y se inhibe el crecimiento. Los cultivos
de estreptococos también pueden entrar en fase estacionaria debido al
agotamiento de su fuente de azúcar. Así, la entrada en fase estacionaria
puede ser el resultado de diversos factores operando en conjunto.
d. Fase de Muerte. El deterioro ambiental ocasionado por el agotamiento de
nutrientes o la acumulación de desechos tóxicos lleva a la disminución del
número de células viables, característica distintiva de la fase de muerte
celular. La muerte de una población microbiana, como su crecimiento durante
a fase exponencial, es usualmente logarítmica (esto es, una proporción
constante de células muere cada hora). Este patrón se mantiene incluso
cuando el número total de células permanece constante debido a que las
células simplemente fallan en lisarse después de morir. A menudo la única
manera de decidir si una célula bacteriana es viable o no es mediante
51
incubación en medio fresco; si no crece y se reproduce, se asume que está
muerta.
Aunque usualmente la mayor parte de la población microbiana muere en
forma logarítmica, la tasa de muerte puede disminuir después de que la
población ha sido reducida drásticamente. Esto es debido a la presencia de
células sobrevivientes o particularmente resistentes.
Las matemáticas del crecimiento.
El conocimiento de la tasa de crecimiento microbiano durante la fase
exponencial es indispensable para los microbiólogos. Los estudios de la tasa de
crecimiento contribuyen a la investigación básica de fisiología y ecología y a la
solución de problemas aplicados en la industria. Por lo tanto, los aspectos
cuantitativos del crecimiento en fase exponencial se discutirán a continuación.
Durante la fase exponencial cada microorganismo se divide a intervalos
constantes. Así, la población se duplica en número en una longitud específica de
tiempo llamada tiempo de generación o tiempo de duplicado. Esta situación puede
ser ilustrada con un ejemplo simple. Suponga que un tubo de cultivo es inoculado
con una célula que se divide cada 20 minutos (Tabla 5.1). La población será de 2
células después de 20 minutos, 4 células después de 40 minutos, y así. Debido a
que la población se duplica cada generación, el incremento en la población es
siempre 2n, donde n es el número de generaciones. El incremento resultante en la
población es exponencial o logarítmico.
Tabla 5.1 Un ejemplo de crecimiento exponencial.
a
n
Tiempo
Número de
2
Población
Log10Nt
n
divisiones
(N0 x 2 )
0
0
0
2 =1
1
0.000
1
20
1
2 =2
2
0.301
40
2
22 = 4
4
0.602
3
60
3
2 =8
8
0.903
4
80
4
2 = 16
16
1.204
5
2 = 32
100
5
32
1.505
6
120
6
2 = 64
64
1.806
a
El cultivo hipotético comienza con una célula que tiene un tiempo de generación de 20
minutos.
Estas observaciones pueden ser expresadas como ecuaciones para el tiempo
de generación.
Sea
N0 = número inicial de la población.
Nt = la población al tiempo t
n = el número de generaciones al tiempo t
52
La inspección de resultados de la tabla 5.1 muestra que
N t = N 0 x2 n
Resolviendo para n, el número de generaciones, donde todos los logaritmos son
en base 10,
log N t = log N 0 + (nx log 2 )
y
n=
log N t − log N 0 log N t − log N 0
=
log 2
0.301
La tasa de crecimiento en un cultivo batch puede ser expresada en términos
de la constante de velocidad de crecimiento (k). Este es el número de generaciones
por unidad de tiempo, a menudo expresada como las generaciones por hora.
k=
n log N t − log N 0
=
t
0.301t
El tiempo que toma una población para doblar su tamaño, esto es el tiempo
medio de generación o tiempo medio de duplicación (g), puede ahora ser calculado.
Si la población se duplica (t=g), entonces
N t = 2N 0
Sustituyendo 2N0 en la ecuación para la constante de crecimiento y
resolviendo para k.
k=
log(2 N 0 ) − log N 0 log 2 + log N 0 − log N 0
=
0.301g
0.301g
k=
1
g
El tiempo medio de generación es el recíproco de la constante de crecimiento.
g=
1
k
El tiempo medio de generación (g) puede determinarse directamente de una
gráfica semilogarítmica de los datos de crecimiento y la constante de velocidad
calculada a partir del valor de g. El tiempo de generación también puede ser
53
calculado directamente de las ecuaciones previas. Por ejemplo, suponga que una
población bacteriana se incrementa de 103 células a 109 células en 10 horas.
k=
log 10 9 − log10 3 9 − 3
=
= 2.0 generaciones / h
(0.301)(10h )
3.01h
Los tiempos de generación varían marcadamente con las especies de
microorganismos y con las condiciones ambientales. Su rango va desde menos de
10 minutos (0.17 h) para unas cuantas bacterias, hasta varios días para el caso de
algunos microorganismos eucariotas. Los tiempos de generación en la naturaleza sin
usualmente más largos que en cultivo.
5.2 Medición del Crecimiento Microbiano
Hay muchas maneras de medir el crecimiento microbiano para determinar la
velocidad de crecimiento y el tiempo de generación. Puede monitorearse tanto la
masa como el número de la población ya que el crecimiento lleva al incremento en
ambos. Las técnicas más comúnmente empleadas para la medición del crecimiento
se examinan brevemente y se señalan las desventajas de cada una de ellas.
Medición del número de células.
La manera más obvia de determinar números microbianos es a través de su
cuenta directa. El uso de una cámara contadora es fácil, barato, y relativamente
rápido; además se obtiene también información sobre el tamaño y morfología de los
microorganismos. La cámara de Petroff-Hausser para conteo puede ser usada para
contar bacterias; los hemocitómetros pueden ser usados para los más grandes
microorganismos eucariotas. Estas laminillas especialmente diseñadas tienen
cámaras de profundidad conocida con una cuadrícula grabada sobre el fondo de la
cámara. El número de microorganismos en una muestra puede ser calculado
considerando en la cuenta el volumen de la cámara y cualquier dilución de la
muestra requerida. Hay algunas desventajas en esta técnica. La población
microbiana debe ser bastante grande para tener exactitud debido a que sólo se
analiza un volumen pequeño. Esa bastante difícil o imposible distinguir entre células
vivas y células muertas en la cámara de conteo.
Microorganismos más grandes como protozoarios, algas y levaduras no
filamentosas pueden ser contados directamente con contadores electrónicos tales
como el Contador Coulter. La suspensión microbiana es forzada a pasar a través de
un pequeño orificio. Una corriente eléctrica fluye a través del orificio y electrodos
colocados a ambos lados miden la resistencia eléctrica. Cada vez que una célula
microbiana pasa a través del orificio la resistencia eléctrica se incrementa (o la
conductividad disminuye) y la célula es contada. El contador Coulter da resultados
exactos con células grandes y es extensamente utilizado en laboratorios de
hospitales para contar células rojas y blancas. No es útil para contar bacterias debido
54
a la interferencia por pequeñas partículas de polvo, la formación de filamentos, y
otros problemas.
Las cámaras de conteo y los contadores eléctricos producen cuentas de
células, estén vivas o no. Hay también diversas técnicas de cuanta de viables,
procedimientos específicos para células capaces de crecer y reproducirse. En la
mayoría de los procedimientos de cuenta de viables una muestra diluida de bacterias
u otros microorganismos es dispersada sobre una superficie sólida. Cada
microorganismo o grupo de microorganismos se desarrolla en una colonia distintiva.
El número original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse a
partir del número de colonias formadas y la dilución de la muestra. Por ejemplo, si
1.0 mL de una dilución 1x10-6 produce 150 colonias, la muestra original contenía
cerca de 1.5 x 108 células por mililitro. Usualmente la cuenta se hace más exacta
usando un contador especial de colonias. De esta manera, las técnicas de vertido y
estriado en placa pueden emplearse para determinar el número de microorganismos
presentes en una muestra.
Las técnicas en placa son simples, sensibles, y ampliamente usadas para
contar bacterias y otros microorganismos en muestras de alimentos, agua y suelo.
Varios problemas, sin embargo, pueden llevar a un conteo inexacto. Un bajo conteo
puede resultar si grupos de células no son dispersados. Debido a que no es posible
estar absolutamente seguros de que cada colonia fue originada de una célula
individual, el resultado a menudo se expresa como unidades formadoras de colonias
(UFC) más que como número de microorganismos. Las muestras deben producir
entre 25 y 250 colonias para mejores resultados. Por supuesto que la cuenta será
también baja si el medio empleado no puede soportar el crecimiento de todos los
microorganismos viables presentes. El agar caliente usado en la técnica de vertido
en placa puede dañar o matar a células sensibles.; así, a veces la técnica de
estriado en placa da cuentas mayores que la de vertido.
El número de microorganismos se determina frecuentemente a partir de
cuentas de colonias que crecen sobre filtros especiales de membrana que tienen
poros lo suficientemente pequeños para atrapar bacterias. En esta técnica, llamada
de filtro de membrana, la muestra es pasada a través de filtros de membrana
especiales. El filtro es luego colocado sobre un medio con agar o en una almohadilla
empapada con medio líquido, e incubado hasta que cada célula forma una colonia
separada. El número de colonias contadas da el número de microorganismos en la
muestra filtrada y un medio especial puede ser utilizado para seleccionar
microorganismos específicos.
Los filtros de membrana también son utilizados para contar bacterias
directamente. Primero la muestra se filtra a través de un filtro de membrana de
policarbonato que ha sido teñido de negro para proporcionar un buen fondo de
observación de objetos fluorescentes. Luego las bacterias son teñidas con un
colorante fluorescente tal como el naranja de acridina y observadas
microscópicamente. Los microorganismos teñidos con naranja de acridina brillan de
color naranja o verde y son fácilmente contados con un microscopio de
55
epifluorescencia. Usualmente la cuentas obtenidas con esta técnica son más altas
que las obtenidas con cultivos. En la actualidad existen kits comerciales con
colorantes que diferencian entre células vivas y células muertas.
Medición de la masa celular.
El incremento en la masa celular, así como en el número de células,
acompaña al crecimiento de la población. Por lo tanto, las técnicas de medición de la
masa celular pueden utilizarse para medir el crecimiento. La técnica más directa es la
determinación del peso seco microbiano. Las células creciendo en medio líquido se
recolectan por centrifugación, lavadas, secadas en un horno, y pesadas. Esta es una
técnica especialmente útil para medir el crecimiento de los hongos. Sin embargo, es
tardada y poco sensible. Debido a que el peso de las bacterias es pequeño, puede
ser necesario centrifugar varios cientos de mililitros de cultivo para colectar suficiente
muestra.
Una técnica más rápida y sensible depende del hecho de que las células
microbianas dispersan la luz que incide sobre ellas. Debido a que las células
microbianas en una población son aproximadamente de tamaño constante, la
cantidad de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes.
Cuando la concentración de bacterias alcanza cerca de 10 millones de células (107)
por mililitro, el medio se vuelve turbio. Incrementos posteriores en la concentración
resultan en mayor turbidez y menos luz es transmitida a través del medio. El grado
de luz dispersada puede ser medido con un espectrofotómetro y es casi lineal
respecto a la concentración bacteriana a niveles bajos de absorbancia. De esta
manera, el crecimiento de la población puede ser medido fácilmente
espectrofotométricamente mientras la población sea lo suficientemente grande para
dar turbidez detectable.
Si la cantidad de sustancia en cada célula es constante la cantidad total de los
constituyentes celulares de dicha célula está relacionada directamente con la masa
celular microbiana total. Por ejemplo, una muestra de células lavadas colectadas de
un volumen conocido de medio puede ser analizado por proteína o nitrógeno total.
Un incremento en la población microbiana se reflejará en mayor nivel de proteína
total. Similarmente, pueden usarse determinaciones de clorofila para medir las
poblaciones de algas, y la cantidad de ATP puede usarse para estimar la cantidad de
masa microbiana viva.
5.3 Productividad del Crecimiento y Efecto del Nutriente Limitante.
Cuando el crecimiento microbiano está limitado por una concentración baja de
un nutriente requerido, el crecimiento neto final o producción de células se
incrementa con la cantidad inicial del nutriente limitante presente. Esta es la base del
análisis microbiológico de vitaminas y otros factores de crecimiento. La tasa de
crecimiento también se incrementa con la concentración del nutriente, pero de
manera hiperbólica. La forma de la curva parece reflejar la velocidad de toma del
56
nutriente por las proteínas de transporte del microorganismo. A niveles
suficientemente altos del nutriente los sistemas de transporte están saturados y la
velocidad de crecimiento no mejora con el incremento en la concentración del
nutriente.
La cantidad de masa microbiana producida a partir de un nutriente puede
expresarse cuantitativamente como la producción de crecimiento (Y):
Y=
masa de microorganismos formados
masa de sustrato consumido
La producción de crecimiento de bacterias fermentativas se ha estudiado
extensivamente. Cuando crecen en medio nutricionales ricos las bacterias pueden
utilizar la fermentación de carbohidratos sólo para generación de energía y emplear
otras sustancias, como aminoácidos, como materia prima para biosíntesis. La
eficiencia del ATP usado durante la fermentación se refleja en el valor YATP:
YATP =
gramos de células formadas
moles de ATP producidos
Aunque los valores de YATP pueden variar a concentraciones muy bajas de
azúcar, el YATP de la mayoría de las bacterias es de cerca de 10.5 g/mol a niveles
altos de azúcar. Así, parece que las bacterias usan generalmente la energía en
biosíntesis con una eficiencia bastante constante. Más aún, el valor medido de YATP
es mucho más bajo que el máximo teórico de 32, el cual es el valor de YATP esperado
si todo el ATP fuera usado en biosíntesis. Mucho del ATP es usado en transporte,
trabajo mecánico, y probablemente otras formas.
5.4 Cultivo Continuo de Microorganismos.
Hasta este punto, se ha puesto atención en sistemas cerrados, denominados
cultivos batch, en los cuales el aporte de nutrientes no se renueva y los desechos no
son removidos. El crecimiento exponencial dura sólo unas pocas generaciones y la
fase estacionaria se alcanza pronto. Sin embargo, es posible crecer microorganismos
en un sistema abierto, un sistema en el cual se mantienen condiciones ambientales
constantes a través de la provisión continúa de nutrientes y la remoción de desechos.
Estas condiciones se alcanzan en el laboratorio por medio de sistemas continuos de
cultivo. Una población microbiana puede ser mantenida en fase de crecimiento
exponencial y a una concentración constante de biomasa por largos periodos en un
sistema de este tipo.
El quimiostato.
Los dos tipos principales de sistemas continuos de cultivo comúnmente
usados son: (1) quimiostato y (2) turbidostato. Un quimiostato se construye de
57
manera que el medio estéril es alimentado al vaso de cultivo a la misma velocidad
que se remueve el medio conteniendo microorganismos. El medio de cultivo para un
quimiostato posee un nutriente esencial (por ejemplo un aminoácido) en cantidad
limitante. Debido a la presencia de este nutriente limitante, la velocidad de
crecimiento está determinada por la velocidad a la cual se alimenta medio nuevo en
la cámara de crecimiento y la densidad celular final depende de la concentración del
nutriente limitante. La tasa de intercambio de nutrientes está expresada como la tasa
de dilución (D), la velocidad a la cual el medio fluye a través del vaso de cultivo, con
respecto al volumen de dicho vaso, donde f es la velocidad de flujo (ml/h) y V es el
volumen del vaso (mL):
D=
f
V
Por ejemplo, si f es 30 mL/h y V es 100 mL, la velocidad de dilución es 0.30 h1
.
Tanto los niveles de población microbiana como el tiempo de generación se
relacionan con la tasa de dilución. La densidad de población microbiana permanece
sin cambio en un rango amplio de valores de la tasa de dilución. El tiempo de
generación decrece al incrementarse la tasa de dilución. El nutriente limitante estará
casi completamente agotado bajo estas condiciones balanceadas. Si la tasa de
dilución aumenta demasiado el microorganismo puede de hecho ser lavado fuera del
vaso de cultivo antes de que pueda reproducirse debido a que la tasa de dilución es
más grande que la velocidad máxima de crecimiento. La concentración del nutriente
limitante aumenta a tasas de dilución altas debido a que pocos microorganismos
están presentes para utilizarlo.
A tasas de dilución muy bajas un incremento en D causa un aumento tanto en la
densidad celular como en la velocidad de crecimiento. Esto es debido al efecto de la
concentración del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces llamado
relación de Monod. A bajas tasas de dilución hay una baja disponibilidad de
nutrientes. Mucha de la energía disponible debe ser utilizada para mantenimiento
celular, no para crecimiento y reproducción. Conforme la tasa de dilución se
incrementa, la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultante aumentan
debido a que hay energía disponible tanto para mantenimiento como para
crecimiento. La velocidad de crecimiento se incrementa cuando la energía total
disponible excede a la energía de mantenimiento.
El turbidostato.
El segundo tipo de sistema continuo de cultivo, el turbidostato, tiene una
fotocelda que mide la absorbancia o turbidez del cultivo en el vaso de crecimiento. La
velocidad de flujo del medio a través del vaso es regulada automáticamente para
mantener una turbidez o densidad celular predeterminada. El turbidostato difiere del
quimiostato en varios aspectos. La tasa de dilución en el turbidostato varía más que
58
permanecer constante y el medio de cultivo carece de un nutriente limitante. El
turbidostato opera mejor a tasas de dilución altas; el quimiostato es más estable y
efectivo a tasas bajas de dilución.
Los sistemas continuos de cultivo son muy útiles debido a que proporcionan
una fuente constante de células en fase exponencial y que crecen a velocidad
conocida. Esto hace posible el estudio del crecimiento microbiano a niveles muy
bajos de nutrientes, concentraciones cercanas a aquellas que se encuentran en
ambientes naturales. Estos sistemas son esenciales para la investigación en muchas
áreas, por ejemplo en estudios sobre interacciones entre especies microbianas bajo
condiciones ambientales semejantes a pozas o lagos dulces.
5.5 Crecimiento Balanceado y No Balanceado.
El crecimiento exponencial, ya sean en sistema batch o continuo, es
crecimiento balanceado. Esto es, todos los constituyentes celulares se sintetizan a
tasas constantes y relacionadas con los otros componentes. Si los niveles de
nutrientes u otras condiciones ambientales cambian, resulta un crecimiento no
balanceado debido a que la tasa de síntesis de los componentes celulares varía con
respecto a la de otros hasta que se alcance un nuevo estado balanceado. Esta
respuesta es observada en un experimento en el cual se transfieran bacterias de un
medio nutricional pobre a uno rico. Las células primero construyen nuevos ribosomas
para mejorar su capacidad de síntesis de proteínas; esto es seguido por un
incremento en la síntesis de proteínas y DNA. Finalmente, tiene lugar el esperado
aumento en la velocidad de reproducción.
El crecimiento no balanceado también resulta cuando una población
bacteriana es desplazada de un medio rico a uno pobre. El microorganismo puede
previamente haber sido capaz de obtener muchos componentes celulares
directamente del medio. Cuando se le cambia aun medio nutricionalmente
inadecuado necesita tiempo para sintetizar las enzimas requeridas para la biosíntesis
de los nutrientes no disponibles. Consecuentemente la división celular y la
replicación del DNA continúan después del desplazamiento, pero la síntesis de
proteínas se vuelve lenta. Las células se vuelven más pequeñas y se reorganizan a
sí mismas metabólicamente hasta que sean capaces de crece nuevamente y el
crecimiento balanceado sea reanudado.
Estos experimentos de desplazamiento demuestran que el crecimiento
microbiano está bajo control preciso y coordinado y responde rápidamente a cambios
en las condiciones ambientales.
5.6 Influencia de Factores Ambientales Sobre el Crecimiento Microbiano.
El crecimiento de los microorganismos es afectado enormemente por la
naturaleza física y química de su ambiente. El entendimiento de la influencia
59
ambiental ayuda al control del crecimiento microbiano y al estudio de la distribución
ecológica de los microorganismos.
Solutos y actividad del agua.
Debido a que una membrana selectiva y semipermeable separa a los
microorganismos de su ambiente, éstos pueden ser afectados por cambios en la
concentración osmótica de su entorno. Si un microorganismo es colocado en una
solución hipotónica el agua entrará a la célula y causará su estallido a menos que de
algún modo se impida el flujo de agua. La mayoría de las bacterias, algas y hongos
tienen paredes celulares rígidas que mantienen la forma e integridad de la célula.
Además, muchos microorganismos mantienen la concentración osmótica de su
protoplasma por encima de la del medio circundante con el uso de solutos
compatibles, así la membrana plasmática está siempre presionada firmemente contra
la pared celular. Los solutos compatibles son solutos que son compatibles con el
metabolismo y el crecimiento a altas concentraciones intercelulares. La mayoría de
las bacterias incrementan su concentración osmótica interna a través de la síntesis o
toma de colina, botaina, prolina, ácido glutámico y otros aminoácidos; niveles
elevados de ión potasio están también involucrados en algún grado. Las algas y los
hongos emplean sacarosa y polioles (arabitol, glicerol, y manitol) para el mimo
propósito. Los polioles y aminoácidos son solutos ideales para esta función porque
normalmente no destruyen la estructura enzimática y su función. Unas pocas
bacterias, como Holobacterium salinarium, mejoran su concentración osmótica con
iones potasio. Las enzimas de este microorganismo han sido alteradas de manera
que requieren altas concentraciones de sal para su actividad normal. Puesto que los
protozoarios no tiene una pared celular, deben usar vacuolas contráctiles para
eliminar el exceso de agua cuando viven en ambientes hipotónicos.
Cuando microorganismos con pared celular rígida son colocados en un
ambiente hipertónico, el agua fluye hacia fuera y la célula se encoge, un proceso
conocido como plasmólisis. Esto deshidrata la célula y puede dañar la membrana
plasmática: usualmente la célula se vuelve metabólicamente inactiva y cesa de
crecer.
La cantidad de agua disponible para los microorganismos puede reducirse por
interacción con moléculas de soluto (efecto osmótico) o por adsorción a la superficie
de sólidos (efecto de matriz). Debido a que la concentración osmótica de un hábitat
tiene un efecto profundo sobre los microorganismos, es útil tener la capacidad de
expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad de agua. Los microbiólogos
por lo general usan el la actividad del agua (aw) para este propósito. La actividad del
agua de una solución es 1/100 de la humedad relativa de la solución (cuando se
expresa como por ciento). Esto es equivalente a la tasa de presión de vapor de la
solución (Psoln) sobre la del agua pura (Pagua).
aw =
Pso ln
Pagua
60
La actividad del agua de una solución o un sólido puede determinarse en una
cámara sellada midiendo la humedad relativa después de que el sistema ha
alcanzado el equilibrio. Suponga que después de que una muestra ha sido tratada de
esta manera el aire por encima esta 95% saturado, esto es, al aire contiene el 95%
de la mezcla que podría tener en el equilibrio a la misma temperatura con una
muestra de agua pura. La humedad relativa sería 95% y la actividad de agua de la
muestra 0.95. La actividad del agua se relaciona inversamente a la presión osmótica;
si una solución tiene alta presión osmótica, su aw es bajo.
Los microorganismos difieren ampliamente en su habilidad para adaptarse a
hábitats con baja actividad de agua. Un microorganismo debe hacer un esfuerzo
extra para crecer en hábitats con bajo aw porque debe mantener una alta
concentración interna de solutos para retener agua. Algunos microorganismos
pueden hacer esto y se les llama osmotolerantes; crecen en un amplio rango de
actividades de agua y concentración osmótica. Por ejemplo, Staphylococcus aureus
puede cultivarse en medios que contienen cualquier concentración de cloruro de
sodio por arriba de 3 M. La levadura Saccharomyces rouxii crecerá en soluciones de
azúcar con valores de aw tan bajos como 0.6. El alga Dunaliella viridis tolera
concentraciones de cloruro de sodio desde 1.7 M hasta soluciones saturadas.
Aunque unos pocos microorganismos son en verdad osmotolerantes, la
mayoría sólo crecen bien a actividades de agua de alrededor de 0.98 (el aw
aproximado del agua de mar) o más altos.
Las halófilas se han adaptado de tal manera a condiciones salinas que
requieren cerca de 2.8 M a saturación (cerca de 6.2 M) para bacterias halofílicas
extremas. Halobacterium y otras bacterias halofílicas extremas han modificado
significativamente la estructura de sus proteínas y membranas más que simplemente
modificar la concentración intracelular de solutos, la estrategia utilizada por la
mayoría de las osmotolerantes. Las halofílicas extremas se han adaptado
exitosamente a un ambiente que destruye a la mayoría de los microorganismos. En
el proceso se han vuelto tan especializadas que han perdido flexibilidad ecológica y
sólo pueden prosperar en pocos hábitats extremos.
pH.
No es de sorprender que el pH afecte dramáticamente el crecimiento
microbiano. Cada especie tiene un rango definido de pH de crecimiento y un pH
óptimo.
-
Acidófilas. Tienen su pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
Neutrófilas. Tienen su pH óptimo de crecimiento entre 5.5 y 8.0.
Alcalófilas. Tienen su pH óptimo de crecimiento entre 8.5 y 11.5.
Alcalófilas extremas. Prefieren pH por encima de 10.0.
En general los diferentes grupos microbianos tienen preferencias de pH
características. La mayoría de las bacterias y los protozoarios son neutrófilos. La
61
mayoría de los hongos prefieren entornos ligeramente ácidos, de cerca de 4 a 6; las
algas también parecen preferir estas condiciones. Hay muchas excepciones a esta
generalización. Por ejemplo, el alga Cyanidium caldarium y la bacteria Sulfolobus
acidocaldarius son habitantes comunes de manantiales termales ácidos; ambos
crecen bien a pH de alrededor de 1 a 3 y altas temperaturas.
Aunque los microorganismos generalmente crecen bien a rangos amplios de
pH, hay límites a su tolerancia. Variaciones drásticas en el pH pueden dañar al
microorganismo rompiendo la membrana plasmática o inhibiendo la actividad de
enzimas y proteínas transportadoras de membrana. La muerte bacteriana ocurre si el
pH interno baja más allá de 5.0 y 5.5. Cambios en el pH externo también pueden
alterar la ionización de las moléculas de nutrientes y reducir así su disponibilidad
para el organismo.
A pesar de la amplia variación en el pH de su hábitat, el pH interno de la
mayoría de los microorganismos es cercano a la neutralidad. Los microorganismos a
menudo deben adaptarse a cambios de pH en su ambiente para sobrevivir. Los
microorganismos frecuentemente cambian el pH de su propio hábitat produciendo
desechos metabólicos ácidos o básicos.
Temperatura.
La temperatura ambiental afecta profundamente a los microorganismos, al
igual que a otros organismos. Además, los microorganismos son especialmente
susceptibles porque usualmente son unicelulares y poiquilotermos, es decir, su
temperatura varía con la del ambiente externo. Por estas razones, la temperatura de
la célula microbiana refleja directamente la de su entorno. Un factor más importante
para la influencia de la temperatura sobre el crecimiento es la sensibilidad de las
reacciones catalizadas por enzimas a la temperatura. A bajas temperaturas un
aumento en la temperatura incrementa la velocidad de crecimiento debido a que la
velocidad de una reacción catalizada por enzimas, al igual que cualquier reacción
química, se dobla cada 100C de incremento en temperatura. Debido a que la
velocidad de cada reacción se incrementa, el metabolismo en su totalidad es más
activo a temperaturas altas, y el microorganismo crece más rápido. Más allá de cierto
punto incrementos adicionales desaceleran el crecimiento y temperaturas
suficientemente altas son letales. Las temperaturas altas dañan al microorganismo
desnaturalizando las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras proteínas. Las
membranas microbianas son también rotas por el calor. Así, aunque las enzimas
funcionales operan más rápidamente a temperaturas altas, el microorganismo puede
ser dañado a tal grado que el crecimiento sea inhibido debido a que el daño no
puede se reparado adecuadamente.
Debido a esta influencia opuesta de la temperatura, el crecimiento microbiano
tiene una dependencia característica de la temperatura con temperaturas cardinales
distintivas, temperaturas de crecimiento mínima, óptima, y máxima. Aunque la forma
de a curva de dependencia de la temperatura puede variar, la temperatura óptima es
siempre más cercana a la máxima que a la mínima. Las temperaturas cardinales de
62
una especie en particular no son fijas de manera rígida sino que a menudo dependen
hasta cierto grado de otros factores ambientales tales como el pH y los nutrientes
disponibles.
Las temperaturas cardinales varían ampliamente entre los microorganismos.
El rango de temperatura óptima va desde 00C hasta 750C, mientras que el
crecimiento microbiano ocurre a temperaturas que se extienden desde -200C hasta
arriba de 1000C. El rango de temperatura de crecimiento de un microorganismo en
particular tiene usualmente un rango de 30 grados. Algunas especies (como
Neisseria gonorrhoeae) tienen rangos pequeños y son llamados estenotermales;
otros, como Enterococcus faecalis, crecen en rangos amplios de temperatura y son
llamados euritermales. Los principales grupos de microorganismos difieren en sus
temperaturas máximas de crecimiento. El límite superior para los protozoarios es de
cerca de 500C. Algunas algas y hongos pueden crecer a temperaturas tan altas como
55 a 600C. Se han encontrado bacterias creciendo a o cerca de 1000C, el punto de
ebullición del agua. Claramente, las procariotas pueden crecer a temperaturas
mayores que los eucariotas.
Los microorganismos pueden ser colocados en una de cinco clases de
acuerdo a su rango de temperatura de crecimiento.
-
-
-
-
Psicrófilas. Crecen bien a 00C y tienen una temperatura óptima de
crecimiento de 150C o menos; la máxima es de alrededor de 200C.
Psicrotrofas o psicrófilas facultativas. Pueden crecer a 00C aunque tienen
una óptima entre 20 y 300C y una máxima de cerca de 350C. Estas bacterias
son importantes en el deterioro de alimentos refrigerados.
Mesófilas. Temperatura óptima de crecimiento entre 20 y 450C; mínima de
150C y máxima de cerca de 450C. La mayoría de los microorganismos caen
probablemente en esta categoría.
Termófilas. Pueden crecer a temperaturas de 550C o más altas. Su mínima
es de cerca de 450C y a menudo tienen una óptima de entre 55 y 650C.
Máxima entre 90 y 1000C.
Hipertermófilas. Tienen una temperatura óptima de crecimiento entre 80 y
1100C. Usualmente no crecen bien por debajo de 550C.
Concentración de oxígeno.
Un organismo capaz de crecen en presencia de O2 atmosférico es un aerobio,
mientras que uno que puede crecer en su ausencia es un anaerobio. Casi todos los
organismos superiores son completamente dependientes del O2 atmosférico para
crecer, esto es, son aerobios obligados. El oxígeno sirve como el aceptor final de
electrones para la cadena transportadora de electrones en la respiración aerobia.
Además, las eucariotas aerobias emplean O2 en la síntesis de esteroles y ácidos
grasos insaturados. Las anaerobias facultativas no requieren oxígeno para crecer,
pero crecen mejor en su presencia. Las anaerobias aerotolerantes, tales como
Enterococcus faecalis, simplemente ignoran el O2 y crecen igualmente bien si está
presente o no. En contraste, las anaerobias estrictas u obligadas no toleran el
63
oxígeno y mueren en su presencia. Las aerotolerantes y las anaerobias estrictas no
pueden generar energía a través de la respiración y deben emplear la fermentación o
respiración anaerobia para este propósito. Finalmente, hay unas pocas aerobias
tales como Campylobacter, llamadas microerófilas, que son dañadas por niveles
normales de O2 atmosférico (20%) y requieren niveles de O2 en un rango del 2 al
10% para crecer.
Un grupo microbiano puede mostrar más de un tipo de relación para el O2. Los
cinco tipos se encuentran entre las bacterias y protozoarios. Los hongos son
normalmente aerobios, pero algunas especias, particularmente levaduras, son
anaerobias facultativas. Las algas son casi siempre aerobias obligadas.
Presión.
La mayoría de los microorganismos pasan su vida en tierra o en la superficie
del agua, siempre sujetos a presiones de 1 atmósfera (atm) y nunca son afectados
significativamente por la presión. Pero la presión hidrostática puede alcanzar 600 a
1100 atm en el fondo del océano, con temperaturas de 2 a 30C. A pesar de estos
extremos, las bacterias sobreviven y se adaptan. Muchas son barotolerantes: el
incremento en la presión no las afecta adversamente tanto como a las bacterias no
tolerantes. Algunas bacterias del intestino de invertebrados del fondo del océano,
tales como anfípodos, son barofílicas, esto es, crecen más rápidamente a presiones
altas. Estas bacterias juegan un papel importante en el reciclado de nutrientes en el
fondo del océano.
Radiación.
Nuestro planeta es bombardeado con radiación electromagnética de varios
tipos. Muchas formas de esta radiación son muy dañinas para los microorganismos.
Esto es en particular valido para la radiación ionizante, radiación de muy corta
longitud de onda o alta energía la cual puede causar que los átomos pierdan
electrones y se ionicen. Los dos tipos principales de radiación ionizante son los rayos
X (producidos artificialmente) y los rayos gamma (emitidos el desintegrarse
radioisótopos). Bajos niveles de radiación ionizante producirán mutaciones que
pueden resultar indirectamente en la muerte, mientras que niveles altos son
directamente letales. Aunque los microorganismos son más resistentes a la radiación
ionizante que los organismos mayores, pueden ser destruidos por dosis
suficientemente largas de radiación. La radiación ionizante puede ser utilizada para
esterilizar. Algunas bacterias (como Deinococcus radiodurans) y algunas esporas
bacterianas, pueden sobrevivir a grandes dosis de radiación ionizante.
La radiación ultravioleta (UV) mata todo tipo de microorganismos debido a su
corta longitud de onda (aproximadamente 10 a 400 nm) y alta energía. La radiación
UV más letal tiene una longitud de onda de 260 nm, la longitud de onda más
efectivamente absorbida por el DNA. El mecanismo primario de daño por UV es la
formación de dímeros de timina en el DNA. Dos timinas adyacentes en una cadena
de DNA son unidas covalentemente e inhiben la función y replicación del DNA. Este
64
daño es reparado de diversas maneras. En la fotoreactivación, la luz azul es utilizada
por una enzima fotoreactivadora para romper los dímeros de timina. Una secuencia
corta que contenga los dímeros de timina puede también ser cortada y reparada.
Este proceso ocurre en ausencia de luz y es llamado reactivación oscura. Cuando la
exposición a UV es demasiado larga, el daño es tan extenso que la reparación es
imposible.
65
CAPÍTULO VI. CONTROL DE MICROORGANISMOS POR AGENTES FÍSICOS Y
QUÍMICOS.
La gente ha practicado desinfección y esterilización desde el comienzo del
registro histórico, incluso antes de que se sospechara la existencia de
microorganismos. En nuestros días, la habilidad para destruir microorganismos no es
menos importante; esto hace posible el uso de técnicas asépticas en investigación
microbiológica, preservación de alimentos, y prevención de enfermedades. Las
técnicas descritas en este capítulo también son esenciales para la seguridad
personal tanto en el laboratorio como en el hospital.
La terminología es especialmente importante cuando se discute sobre el
control de microorganismos debido a que palabras como desinfectante y antiséptico
son a menudo usadas erróneamente. Esta situación es incluso más confusa porque
un tratamiento puede inhibir el crecimiento o matar dependiendo de las condiciones.
La habilidad para controlar poblaciones microbianas u objetos inanimados,
como utensilios para comida e instrumentos quirúrgicos, es de considerable
importancia práctica. Algunas veces es necesario eliminar todos los microorganismos
de un objeto, mientras que en otras situaciones sólo se requiere destrucción parcial
de la población microbiana. La esterilización es el proceso mediante el cual todas las
células vivas, esporas viables, virus y tiroides, son destruidos y removidos de un
objeto o hábitat. Un objeto estéril está totalmente libre de microorganismos viables,
esporas, y otros agentes infecciosos. Cuando la esterilización es alcanzada por un
agente químico, el químico es llamado esterilizante. En contraste, la desinfección es
la muerte, inhibición, o remoción de microorganismos que pueden causar
enfermedades. Los desinfectantes son agentes, usualmente químicos, usados para
realizar la desinfección y normalmente son usados sólo en objetos inanimados. Un
desinfectante no necesariamente esteriliza un objeto porque pueden permanecer
esporas y algunos pocos microorganismos. La sanitización está muy cercanamente
relacionada con la desinfección. En la sanitización la población microbiana es
reducida a niveles considerados seguros según estándares de salud pública. A
menudo objetos inanimados son limpiados y parcialmente desinfectados; por
ejemplo, se utilizan sanitizadores para limpiar los utensilios en los restaurantes.
Frecuentemente es necesario controlar los microorganismos en los tejidos
vivos con el uso de agentes químicos. La antisepsia es la prevención de infecciones
o sepsis y es lograda con el uso de antisépticos, los cuales son agentes químicos
que se aplican a los tejidos para prevenir infecciones matando o inhibiendo el
crecimiento de patógenos. Debido a que no deben destruir mucho el tejido del
hospedero, generalmente loa antisépticos no son tan tóxicos como los
desinfectantes.
Puede emplearse un sufijo para denotar el tipo de agente antimicrobiano. Las
sustancias que matan al microorganismo llevan a menudo el sufijo -cida: un
germicida mata microorganismos patógenos (y muchos no patógenos), pero no
necesariamente endosporas. Un desinfectante o antiséptico puede ser
66
particularmente efectivo contra un grupo específico, en este caso puede ser llamado
bactericida, fungicida, algicida, o viricida. Otros químicos no matan sino que
previenen el crecimiento. Sus nombres terminan en –estáticos; por ejemplo,
bacteriostáticos o fungistáticos.
Aunque estos agentes han sido descritos en términos de su efecto sobre
patógenos, debe observarse que también pueden matar o inhibir no patógenos. Su
habilidad para reducir la población microbiana total, no sólo de afectar los niveles de
patógenos, es muy importante en muchas situaciones.
6.1
Patrón de Muerte Microbiana.
Una población microbiana no muere instantáneamente cuando es expuesta a
un agente letal. La muerte poblacional, como el crecimiento poblacional, es
generalmente exponencial o logarítmico, esto es, la población se reducirá en la
misma fracción a intervalos constantes. Si el logaritmo de la población remanente es
graficado contra el tiempo de exposición del microorganismo al agente, la gráfica
resultantes es una línea recta. Cuando la población ha sido reducida en gran medida,
la velocidad de muerte puede disminuir debido a la supervivencia de cepas más
resistentes de microorganismos.
Para estudiar la efectividad de un agente letal, uno debe ser capaz de decidir
cuándo el microorganismo está muerto, una tarea nada fácil. Una bacteria es definida
como muerta si no crece cuando es inoculada en un medio de cultivo que
normalmente soportaría su crecimiento. De esta manera, un virus inactivo no puede
infectar a un hospedero adecuado.
6.2
Condiciones que Influyen Sobre la Efectividad de la Actividad de Agentes
Microbianos.
La destrucción de los microorganismos y la inhibición del crecimiento
microbiano no son asuntos simples porque la eficacia de un agente antimicrobiano
(un agente que mata microorganismos o inhibe su crecimiento) es afectada por al
menos seis factores.
1) El tamaño de la población. Debido a que una fracción igual de una población
microbiana es eliminada durante cada lapso de tiempo, una población grande
requiere de un mayor tiempo de exposición que una más pequeña.
2) La composición de la población. La efectividad de un agente varía
enormemente con la naturaleza de los organismos que son tratados debido a
que los microorganismos difieren ampliamente en susceptibilidad. Las
endosporas bacterianas son mucho más resistentes a la mayoría de los
agentes antimicrobianos que las formas vegetativas, y las células jóvenes son
usualmente destruidas más fácilmente que los organismos maduros. Algunas
especies son capaces de resistir condiciones adversas mejor que otras.
67
3)
4)
5)
6)
6.3
Mycobacterium tuberculosis, el cual causa la tuberculosis, es mucho más
resistentes a los agentes antimicrobianos que la mayoría de otras bacterias.
Concentración o intensidad de un agente antimicrobiano. A menudo, pero no
siempre, a mayor concentración de un agente químico o mayor intensidad de
uno físico, mayor rapidez en la destrucción de los microorganismos. La
dependencia de la eficacia con respecto a la concentración o la intensidad
generalmente es no linear. En un rango corto, pequeños incrementos en la
concentración llevan a un aumento exponencial en la eficacia; más allá de
cierto punto, incrementos posteriores no aumentarán la tasa de muerte en
gran medida. Algunas veces un agente es más efectivo a concentraciones
bajas. Por ejemplo, el etanol al 70% es más efectivo que el etanol al 95%.
Duración de le exposición. Cuanto mayor sea la exposición de una población
a un agente antimicrobiano, más organismos serán eliminados. Para alcanzar
la esterilización, debe usarse una la duración de la exposición que reduzca la
probabilidad de supervivencia a 10-6 o menos.
Temperatura. Un incremento en la temperatura a la cual actúa un químico
mejora a menudo su actividad. Frecuentemente puede usarse una
concentración más baja de agente desinfectante o esterilizante a temperatura
más alta.
Ambiente local. La población a ser controlada no está aislada, sino rodeada
por factores ambientales que pueden ya sea ofrecerle protección o bien
ayudar a su destrucción. Por ejemplo, debido a que el calor mata más
rápidamente a un pH ácido, los alimentos y bebidas ácidos tales como frutas y
tomates, son mucho más fáciles de pasteurizar que los alimentos más
neutrales como la leche. Un segundo factor ambiental importante es la materia
orgánica que puede proteger a los microorganismos contra el calor y
desinfectantes químicos. Puede ser necesario limpiar un objeto antes de su
desinfección o esterilización. Las jeringas y el equipo médico o dental debe
limpiarse antes de su esterilización debido a la presencia de mucha materia
orgánica que podría proteger a los patógenos e incrementar el riesgo de
infección. Los mismos cuidados deben tomarse cuando los patógenos son
destruidos durante la preparación de agua potable. Cuando la fuente de
abastecimiento de agua de una ciudad tiene un alto contenido de materia
orgánica, debe añadirse más cloro para la desinfección.
Uso de Métodos Físicos en Control.
El calor y otros agentes físicos son comúnmente utilizados para esterilizar
objetos, como puede verse por el usos continuo del autoclave en cada laboratorio de
microbiología. Los cuatro agentes físicos más utilizados son calor, filtración, radiación
ultravioleta, y radiación ionizante.
68
Calor.
El fuego y el agua hirviendo han sido utilizados para esterilizare y desinfectar
desde tiempos de los Griegos, y el calor es aún uno de los métodos más populares
para destruir microorganismos, ya sea como calor húmedo o como calor seco.
El calor húmedo mata fácilmente virus, bacterias y hongos. La exposición a
agua hirviendo por 10 minutos es suficiente para destruir células vegetativas y
esporas eucariotas. Desafortunadamente, la temperatura de ebullición del agua
(1000C ó 2120F) no es lo suficientemente alta para destruir endosporas bacterianas
que pueden sobrevivir horas en ebullición. Por lo tanto, este método puede ser usado
para desinfección de agua potable y objetos que no se dañan con el agua, pero
hervir no esteriliza.
Debido a que el calor es tan útil para controlar microorganismos, es esencial
tener una medición precisa de la eficacia del calor para matar. Inicialmente la
efectividad fue expresada en términos del punto de muerte termal (TDP), la
temperatura más baja a la cual una suspensión microbiana es matada en 10 minutos.
Debido a que la TDP implica que cierta temperatura es inmediatamente letal a pesar
de las condiciones, ahora es más comúnmente usado el tiempo de muerte termal
(TDT). Éste es el tiempo más corto necesario para matar todos los microorganismos
en una suspensión microbiana a una temperatura específica y bajo condiciones
definidas. Sin embargo, tal destrucción es logarítmica y teóricamente no es posible
destruir completamente a los microorganismos presentes en una muestra, incluso
con exposiciones grandes al calor. Por lo tanto, un concepto aún más preciso, el
tiempo de reducción decimal (D) o valor D, ha ganado amplia aceptación. El tiempo
de reducción decimal es el tiempo requerido para matar al 90% de los
microorganismos o esporas en una muestra a una temperatura específica. En una
gráfica semilogarítmica de la población remanente contra el tiempo de calentamiento,
el valor D es el tiempo requerido para que la línea baje un ciclo logarítmico ó 10
veces. Usualmente el valor D se escribe con un subíndice que indica la temperatura
a la cual se aplica. Los valores D son usados para estimar la resistencia relativa de
un microorganismo a diferentes temperaturas a través del cálculo del valor de z. El
valor z es el incremento en la temperatura requerido para reducir D a 1/10 de su
valor o reducirlo en un ciclo logarítmico cuando D se grafica contra temperatura. Otra
manera de describir la efectividad del calentamiento es con el valor F. El valor F es el
tiempo en minutos a una temperatura específica (usualmente 2500F ó 121.10C)
necesario para matar una población de células o esporas.
La esterilización por calor húmedo puede realizarse a temperaturas por
encima de 1000C para destruir endosporas bacterianas, y esto requiere el uso de
vapor saturado bajo presión. La esterilización con vapor se realiza en un autoclave,
un equipo que parece una extravagante olla de presión. El agua es hervida para
producir vapor el cual es llevado hacia la cámara del autoclave. El aire presente
inicialmente en la cámara es forzado a salir hasta que la cámara está llena con vapor
saturado y las salidas son cerradas. El caliente vapor saturado continúa entrando
hasta que la cámara alcanza la temperatura y presión deseados, usualmente 1210C y
69
15 libras de presión. A esta temperatura el vapor saturado destruye todas las
células vegetativas y endosporas en un volumen pequeño de líquido en un tiempo de
10 a 12 minutos. El tratamiento se continúa usualmente por 15 minutos para
proporcionar un margen de seguridad.
El autoclavado debe realizarse apropiadamente o el material procesado no
estará estéril. Si el aire no es completamente desalojado de la cámara, ésta no
alcanzará 1210C incluso aunque alcance las 15 libras de presión. La cámara no debe
empacarse muy apretadamente porque el vapor necesita circular libremente y estar
en contacto con cada cosa en el autoclave. Las endosporas bacterianas serán
eliminadas sólo si se mantienen a 1210C por 10 a 12 minutos. Cuando debe
esterilizarse un gran volumen de líquido será necesario un tiempo mayor de
esterilización ya que tomará más tiempo para que el centro del líquido alcance
1210C; 5 litros de líquido pueden requerir cerca de 70 minutos. En vista de estas
potenciales dificultades, un indicador biológico es a menudo autoclavado junto con
otro material. Estos indicadores consisten comúnmente en un tubo de cultivo que
contiene una ámpula estéril de medio y una tira de papel cubierta con esporas de
Bacillus stearothermophilus o Clostridium PA3679. Después del autoclavado, la
ámpula es asépticamente rota y el cultivo incubado por varios días. Si la bacteria de
la prueba no crece en el medio, la esterilización ha sido exitosa. En algunos casos
una cinta especial que tiene escrita la palabra “estéril” de manera invisible o una tira
de papel indicador que cambia de color con suficiente calentamiento, es autoclavada
con una carga de material. Si la palabra aparece en la cinta o la tira cambia de color,
se supone que el material está estéril. Esta metodología es útil y ahorra tiempo, pero
no son tan confiables como el uso de endosporas bacterianas.
Muchas sustancias, tales como la leche, son tratadas con calentamiento
controlado a temperaturas por debajo del punto de ebullición, un proceso conocido
como pasteurización en honor de su desarrollador, Luis Pasteur. La leche puede ser
pasteurizada de dos maneras. En el método antiguo la leche se mantiene por 30
minutos a 630C. Pero en la actualidad grandes cantidades de leche son procesadas
por pasteurización flash o pasteurización de temperatura de corto tiempo (HTST) la
cual consiste en calentarla rápidamente a cerca de 720C por 15 segundos y luego
enfriarla rápidamente. La industria láctea también usa a menudo esterilización por
temperatura ultraalta (UHT). La leche y los productos lácteos son calentados a 140 ó
1500C por uno a tres segundos. La leche procesada por UHT no requiere
refrigeración y puede ser almacenada a temperatura ambiente por cerca de dos
meses sin cambio de sabor. Las pequeñas porciones de crema para café utilizadas
en los restaurantes son a menudo preparadas por esterilización UHT.
Algunos objetos son esterilizados mejor en ausencia de agua por esterilización
con calor seco. Los productos a ser esterilizados son colocados en un horno a 160 o
1700C por 2 a 3 horas. Aparentemente la muerte microbiana resulta de la oxidación
de los constituyentes celulares y la desnaturalización de proteínas. Aunque el calor
con aire seco es menos efectivo que el calor húmedo, las esporas de Clostridium
botulinum son eliminadas en 5 minutos con calor húmedo a 1210C pero sólo después
de 2 horas a 1600C con calor seco, hay algunas ventajas. El calor seco no corroe los
70
vasos de vidrio y los instrumentos de metal como lo hace el calor húmedo, y puede
ser usado para esterilizar polvos, aceites y productos similares. La mayor parte de la
esterilización de material de vidrio como cajas petri y pipetas s realiza con calor seco.
A pesar de estas ventajas, la esterilización por calor seco es lenta y no adecuada
para materiales sensibles al calor como muchos artículos de plástico y de caucho.
Filtración.
La filtración es una excelente manera para reducir las poblaciones
microbianas en soluciones de materiales sensibles al calor, y en algunos casos
puede ser utilizada para esterilizar soluciones. Más que destruir directamente los
microorganismos contaminantes, el filtro simplemente los remueve. Hay dos tipos de
filtros. Los filtros de profundidad consisten en materiales fibrosos o granulares que
han sido unidos en una capa delgada llena con canales retorcidos de diámetro
pequeño. La solución que contiene los microorganismos es absorbida a través de
esta capa al vacío y las células son removidas por atrapamiento y por adsorción a la
superficie del material del filtro. Este tipo de filtros están hechos de tierra de
diatomeas, vidrio porcelanizado, asbestos, y otros materiales similares.
Recientemente los filtros de membrana han reemplazado a los filtros de
profundidad para muchos propósitos. Estos filtros circulares son membranas
porosas, de 0.1 mm de espesor, hechos de acetato de celulosa, nitrato de celulosa,
policarbonato, y otros materiales sintéticos. Aunque están disponibles una gran
variedad de tamaño de poro, las membranas con poro de cerca de 0.2 µ de diámetro
son usadas para remover células vegetativas de soluciones que van desde 1 mL
hasta varios litros en volumen. Las membranas son mantenidas en contenedores
especiales y a menudo precedidas por filtros de profundidad hechos de fibra de vidrio
para remover partículas grandes que pudieran tapar el filtro de membrana. La
solución es forzada a través del filtro con vacío, o a presión con una jeringa, bomba
peristáltica o tanque de gas nitrógeno, y colectada en contenedores previamente
esterilizados. Los filtros de membrana remueven microorganismos separando
partículas pequeñas de las grandes. Estos filtros son utilizados para esterilizar
farmacéuticos, medios de cultivo, aceites, antibióticos, y otras soluciones sensibles al
calor.
El aire también puede ser esterilizado por filtración. Dos ejemplos comunes
son las máscaras quirúrgicas y los tapones de algodón de los vasos de cultivo que
dejan pasar el aire pero no los microorganismos presentes en él. Las campanas de
seguridad biológica de flujo laminar emplean filtros de alta eficiencia de aire
particulado (HEPA) los cuales remueven 99.97% de las partículas de 0.3 µ y son uno
de los sistemas de filtración de aire más importantes.
Radiación.
Los tipos de radiación y la manera en que dañan o destruyen a los
microorganismos se mencionaron en el capítulo anterior. El uso práctico de las
71
radiaciones ultravioleta e ionizante para esterilizar objetos se describe brevemente a
continuación.
La radiación ultravioleta de alrededor de 260 nm es bastante letal pero no
penetra muy efectivamente al vidrio, películas de polvo, agua, y otras sustancias.
Debido a estas desventajas, la radiación UV es usada como agente esterilizante sólo
en una pocas situaciones específicas. Lámparas UV son algunas veces colocadas en
los techos de habitaciones o en campanas de seguridad biológica para esterilizar el
aire y cualquier superficie expuesta. Debido a que la radiación UV quema la piel y
daña los ojos, la gente que trabaja en dichas áreas debe cerciorarse de que las
lámparas están apagadas cuando las áreas están en uso. Existen unidades UV
disponibles para el tratamiento de agua. Patógenos y otros microorganismos son
destruidos cuando una delgada capa de agua es pasada bajo estas lámparas.
La radiación ionizante es un excelente agente esterilizante y penetra
profundamente en los objetos. La radiación gamma de una fuente de cobalto 60 es
usada en la esterilización en frío de antibióticos, hormonas, suturas, y desechables
plásticos como las jeringas. La radiación gamma ha sido también utilizada para
esterilizar y “pasteurizar” carne y otros alimentos. Tanto la FDA (Food and Drug
Administration) como la Organización Mundial de la Salud (OMS) han aprobado la
irradiación de alimentos y la han declarado segura.
6.4
Uso de Agentes Químicos en Control.
Aunque los objetos son algunas veces desinfectados con agentes físicos, los
químicos se emplean más a menudo en desinfección y antisepsia. Muchos factores
influyen sobre la efectividad de los desinfectantes y antisépticos químicos. Factores
tales como el tipo de microorganismo potencialmente presente, la concentración y
naturaleza del desinfectante a ser usado, y la extensión del tratamiento, deben
considerarse. Las superficies sucias deben limpiarse antes de que el desinfectante o
antiséptico sea aplicado. El uso apropiado de agentes químicos es esencial para la
seguridad en laboratorios y hospitales. Es importante mencionar que los químicos
también son usados para prevenir el crecimiento microbiano en alimentos.
Hay muchos químicos diferentes disponibles para usarse como desinfectantes
y cada uno de ellos tiene sus propias ventajas y desventajas. En la selección de un
agente es importante tener en mente las características del desinfectante deseado.
Idealmente el desinfectante debe ser efectivo contra una amplia variedad de agentes
infecciosos (bacterias gram-positivas y gram-negativas, bacterias ácido resistentes,
endosporas bacterianas, hongos, y virus) a diluciones altas y en presencia de
materia orgánica. Aunque los químicos deben ser tóxicos para los agentes
infecciosos, no deben ser tóxicos para la gente ni corrosivos para los materiales
comunes. Deben ser estables en almacenamiento, inodoros o con olor agradable,
solubles en agua y lípidos para poder penetrar en el microorganismo, y tener una
baja tensión superficial. Si es posible, los desinfectantes deben ser relativamente
baratos.
72
A continuación se generaliza sobre las propiedades y usos de varios grupos
comunes de desinfectantes y antisépticos.
Compuestos fenólicos.
El fenol fue el primer antiséptico y desinfectante usado ampliamente. En 1867
Joseph Lister lo empleó para reducir el riesgo de infección durante las operaciones.
Hoy en día el fenol y los compuestos fenólicos (derivados del fenol) tales como los
cresoles, los xilenoles, y el ortofenilfenol son usados como desinfectantes en
laboratorios y hospitales. Los fenólicos actúan desnaturalizando proteínas y
rompiendo las membranas celulares. Estos compuestos tienen algunas ventajas
reales como desinfectantes: los fenólicos son tuberculocidas, efectivos en presencia
de materia orgánica, y permanecen activos sobre las superficies por un período largo
después de la aplicación. Sin embargo, tienen un olor desagradable y pueden causar
irritación en la piel.
El hexaclorofeno ha sido uno de los antisépticos más populares debido a su
persistencia sobre la piel una vez aplicado y porque reduce la cantidad de bacterias
en la piel. Sin embargo, puede causar daño cerebral y ahora es utilizado sólo en
guarderías de hospitales como respuesta a brotes de estafilococos.
Alcoholes.
Los alcoholes están entre los desinfectantes y antisépticos más ampliamente
usados. Estos compuestos son bactericidas y fungicidas pero no esporocidas;
algunos virus que contienen lípidos también son destruidos. Los dos alcoholes
germicidas más populares son el etanol y el isopropanol, comúnmente usados a
concentración de 70 a 80%. Actúan por desnaturalización de proteínas y
posiblemente disolviendo lípidos de membrana. Un empapado durante 10 a 15
minutos con alcohol es suficiente para desinfectar termómetros e instrumentos
pequeños.
Halógenos.
Un halógeno es cualquiera de los cinco elementos (flúor, cloro, bromo, yodo y
astato) del grupo VIIA de la tabla periódica. Existen como moléculas biatómicas en
estado libre y forman sales con sodio y la mayoría de los otros metales. Los
halógenos yodo y cloro son importantes antimicrobianos. El yodo es usado como
antiséptico en piel y mata oxidando los constituyentes celulares y yodizando
proteínas celulares. A altas concentraciones puede incluso matar algunas esporas. El
yodo se aplica a menudo como tintura de yodo, 2% ó más de yodo en una solución
de yoduro de potasio en agua-etanol. Aunque es un antiséptico efectivo, la piel
puede ser dañada, se mantiene la coloración, y puede ocasionar alergias al yodo.
Más recientemente el yodo ha sido acomplejado con un acarreador orgánico para
formar un iodóforo. Los iodóforos son solubles en agua, estables, no tiñen y liberan
el yodo lentamente para minimizar la irritación en la piel. Los iodóforos son usados
73
en hospitales para limpiar la piel antes de las operaciones y en hospitales y
laboratorios para desinfectar.
El cloro es el desinfectante usual para el abasto de agua municipal y en las
albercas y también se emplea en la industria láctea y de alimentos. Puede ser
aplicado como gas cloro, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio; todos ellos
producen ácido hipocloroso (HCIO) y luego oxígeno atómico. El resultado es la
oxidación de materiales celulares y la destrucción de bacterias vegetativas y hongos,
aunque no esporas.
Cl 2 + H 2 O → HCl + HClO
Ca (OCl )2 + 2 H 2 O → Ca (OH )2 + 2 HClO
HClO → HCl + O
La muerte de casi todos los microorganismos usualmente ocurre dentro de los
30 minutos. Puesto que la materia orgánica interfiere con la acción del cloro al
reaccionar con éste y sus productos, se añade un exceso de cloro para asegurar la
destrucción microbiana.
El cloro es también un excelente desinfectante para uso individual debido a
que es efectivo, barato y fácil de emplear. Pequeñas cantidades de agua para beber
pueden ser desinfectadas con tabletas de halazono. El halazono (ácido parasulfono
dicloroamidobenzóico) libera lentamente el cloro cuando se añade al agua y la
desinfecta en cerca de media hora.
Metales pesados.
Por muchos años los iones de metales pesados tales como el mercurio, la
plata, el arsénico, el zinc y el cobre, fueron usados como germicidas. Más
recientemente estos elementos han sido reemplazados por otros germicidas menos
tóxicos y más efectivos (muchos metales pesados son más bateriostáticos que
bactericidas), pero hay algunas excepciones. Una solución al 1% de nitrato de plata
es a menudo añadida a los ojos de infantes para prevenir gonorrea oftálmica (en
muchos hospitales la eritromicina se utiliza en lugar de nitrato de plata ya que es más
efectiva contra Chlamydia y contra Neisseria). En quemaduras de utiliza sulfadiacina
de plata. El sulfato de cobre es un algicida efectivo en lagos y albercas.
Los metales pesados se combinan con proteínas, a menudo con grupos
sulfhidrilo, y las inactivan. También pueden precipitar las proteínas celulares.
Compuestos de amonio cuaternario.
Los detergentes son moléculas orgánicas que sirven como agentes
humectantes y emulsificantes debido a que tienen tanto extremos hidrofílicos polares
como hidrofóbicos no polares. Debido a su naturaleza amfipática solubilizan residuos
74
insolubles y son muy efectivos como agentes limpiadores. Los detergentes son
diferentes de los jabones, los cuales derivan del las grasas.
Aunque
los
detergentes
aniónicos
tienen
algunas
propiedades
antimicrobianas, sólo los detergentes catiónicos son desinfectantes efectivos. Los
más populares de estos desinfectantes son los compuestos de amonio cuaternario,
caracterizados por un nitrógeno cuaternario cargado positivamente y una larga
cadena alifática hidrofóbica. Estos compuestos rompen las membranas microbianas
y pueden también desnaturalizar proteínas.
Los detergentes catiónicos matan a la mayoría de las bacterias, pero no a M.
tuberculosis ni a endosporas. Tienen la ventaja de ser estables, no tóxicos y suaves,
pero son inactivados por el agua dura y el jabón. Los detergentes catiónicos se
utilizan a menudo como desinfectantes para utensilios de alimentación, instrumentos
pequeños, y como antisépticos en piel.
Aldehídos.
Los dos aldehídos más comúnmente usados, el formaldehído y el
glutaraldehído, son moléculas altamente reactivas que se combinan con las
proteínas y las inactivan. Son esporocidas y pueden usarse como esterilizantes
químicos. El formaldehído normalmente se disuelve en agua o en alcohol antes de
su uso. Una solución amortiguadora al 2% de glutaraldehído es un desinfectante
efectivo. Es menos irritante que el formaldehído y es usado para desinfección en
hospitales y en equipo de laboratorio. El glutaraldehído generalmente desinfecta
objetos en cerca de 10 minutos, pero puede requerir tanto como 12 horas para
destruir esporas.
Gases esterilizantes.
Muchos artículos sensibles al calor tales como cajas petri desechables de
plástico y jeringas, componentes de respiradores artificiales, suturas y catéteres, son
esterilizados en la actualidad con el gas óxido de etileno (EtO). Este gas es tanto
microbicida como esporocida y mata al combinarse con las proteínas celulares. Es
un agente esterilizante particularmente efectivo debido a que penetra rápidamente
materiales empacados, incluso envolturas plásticas.
La esterilización de realiza en esterilizadores especiales, que en su
apariencias recuerdan mucho a los autoclaves, que controlan la concentración de
EtO, temperatura y humedad. Debido a que el EtO puro es explosivo, usualmente se
suministra en una concentración de 10 a 20% mezclado ya sea con CO2 o
diclorodifluorometano. La concentración el EtO, la temperatura y la humedad influyen
en la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si es tratado por
5 a 8 horas a 380C o por 3 a 4 horas a 540C cuando la humedad relativa es
mantenida a 40-50% y la concentración de EtO a 700 mg/L. Es necesaria una
aireación extensiva del material esterilizado para eliminar el EtO residual ya que es
tóxico.
75
La betapropiolactona (BPL) es empleada ocasionalmente como gas
esterilizante. En forma líquida se ha utilizado para esterilizar vacunas y suero. La
BPL se descompone a una forma inactiva después de varias horas y por lo tanto no
es tan difícil de eliminar como el EtO. También destruye a los microorganismos más
fácilmente que el óxido de etileno pero no penetra bien los materiales y puede ser
carcinogénico. Por estas razones, la BPL no ha sido utilizada tan ampliamente como
el EtO.
Recientemente se ha usado peróxido de hidrógeno en fase de vapor para
descontaminar campanas de seguridad biológica.
6.5
Evaluación de le Efectividad de Agentes Antimicrobianos.
La evaluación de los agentes antimicrobianos es un proceso complejo
regulado, en estado Unidos, por dos agencias diferentes. La Agencia de Protección
Ambiental (EPA) regula los desinfectantes, mientras que los agentes usados en
humanos y en animales están bajo el control de la Administración de Alimentos y
Drogas (FDA). La evaluación de un agente antimicrobiano comienza a menudo con
un análisis de búsqueda inicial para ver si es efectivo y a que concentración.
El mejor examen de evaluación de desinfectantes conocido es el examen de
coeficiente fenólico en el cual la potencia de un desinfectante se compara con la del
fenol. Una serie de diluciones de fenol y del desinfectante experimental, se inoculan
con las bacterias de prueba Salmonella typhi y Staphylococcus aureus, luego son
colocados en baño de agua a 20 ó 370C. Estos tubos con desinfectante inoculados
son enseguida subcultivados en un medio regular fresco e incubados por dos o más
días. La más alta dilución que mate a las bacterias después de 10 minutos de
exposición, pero no después de 5, se usan para calcular el coeficiente fenólico. El
recíproco de la dilución apropiada del desinfectante es dividido por el del fenol para
obtener el coeficiente. Suponga que la dilución del fenol fue 1/90 y la dilución máxima
efectiva del desinfectante X fue de 1/450. El coeficiente fenólico de X será 5. A mayor
coeficiente fenólico, mayor efectividad del desinfectante bajo esas condiciones. Un
valor mayor de 1 significa que el desinfectante es más efectivo que el fenol.
El examen del coeficiente fenólico es un procedimiento adecuado de
evaluación inicial, pero es un error tomarlo como un indicativo directo de la potencia
de un desinfectante durante su uso normal. Esto es debido a que el coeficiente
fenólico se determina bajo condiciones cuidadosamente controladas con cepas
bacterianas puras, mientras que los desinfectantes normalmente son usados sobre
poblaciones complejas en presencia de materia orgánica y con variaciones
significativas en los factores ambientales tales como pH, temperatura, y presencia de
sales.
Para un estimado más realista de la efectividad de un desinfectante, se usan a
menudo otras pruebas. La velocidad a la cual una bacteria seleccionada es destruida
con varios agentes químicos puede ser determinada y comparada. Puede realizarse
76
un examen de la dilución usada. Cilindros de acero inoxidable son contaminados con
especies bacterianas específicas bajo condiciones cuidadosamente controladas. Los
cilindros son brevemente secados, sumergidos en el desinfectante por 10 minutos,
transferidos a un medio de cultivo e incubados por dos días. Se determina entonces
la concentración de desinfectante que mata a los organismos en la muestra con un
nivel de 95% de confianza bajo estas condiciones. Los desinfectantes también
pueden ser evaluados bajo condiciones diseñadas para simular situaciones de uso
normal.
77
CAPÍTULO VII.
MICROORGANISMOS COMO COMPONENTES DEL MEDIO AMBIENTE.
El medio ambiente es un componente de un ecosistema y se define como el
total de las condiciones externas que influyen sobre un organismo o un grupo de
organismos. Los ambientes naturales, ya sea suelo, lagos, ríos, océanos u otros
hábitats, tienen muchas características en común, incluyendo la presencia de
microorganismos.
Estos
microorganismos
pueden
tener
dos
papeles
complementarios: la síntesis de nueva materia orgánica a partir de CO2 y otros
compuestos orgánicos a través de la producción primaria, y la descomposición de
esta materia orgánica acumulada.
7.1
Microorganismos y la estructura de los ambientes naturales.
Los microorganismos juegan muchos papeles importantes en los ambientes
naturales. Las relaciones generales entre los productores primarios que acumulan
materia orgánica, los descomponedores heterótrofos y los consumidores, son obvias.
Microorganismos de diferentes tipos contribuyen a cada una de estas relaciones
complementarias.
En ambientes terrestres los productores primarios son usualmente plantas
vasculares. En ambientes acuáticos y marinos las cianobacterias y las algas juegan
un papel similar. La fuente principal de energía que maneja la producción primaria es
la luz solar y ambos hábitats. Los consumidores superiores, incluyendo los humanos,
son quimioheterótrofos. Estos consumidores dependen de tal sistema básico de
soporte de la vida proporcionado por organismos que acumulan y descomponen
materia orgánica. El reto es apreciar mejor el papel que desempeñan los
microorganismos en el funcionamiento de la gran variedad de ambientes naturales.
Este punto de vista sobre la naturaleza de la producción primaria y el papel de
los microorganismos en este proceso ha cambiado desde 1977 cuando se
descubrieron grietas hidrotermales en las profundidades marinas las cuales
producían sulfuro de hidrógeno. Estas grietas soportan grandes poblaciones de
gusanos con forma de tubo y mejillones gigantes. La fuente de carbono orgánico de
la cual dependían estos organismos consumidores resulto ser bacterias
quimiolitoautotróficas. Estas bacterias con principalmente de los géneros
Thiobacillus, Thiomicrospyra, Thiothrix y Beggiatoa.
Otra cadena alimenticia única involucra a microorganismos fijadores de
metano como el primer paso para proporcionar materia orgánica a los consumidores.
En este caso las metilótrofas, bacterias capaces de utilizar metano, ocurren como
simbiontes intracelulares de mejillones.
La materia orgánica, una vez disponible, puede ser utilizada por muchos
organismos diferentes, incluyendo al humano. El proceso de descomposición de la
78
materia orgánica
mineralización.
hacia
compuestos
inorgánicos
más
simples
se
llama
Además, microorganismos como protozoarios actúan como consumidores, tal
y como lo hacen los insectos y los animales. Los consumidores microbianos usan
materia orgánica producida por plantas superiores, cianobacterias y algas.
Los microorganismos juegan otro papel importante en el funcionamiento de los
ambientes naturales. Las células microbianas, en base a su peso seco, consisten
típicamente de aproximadamente 50% carbono, 14% nitrógeno, y 3% fósforo, por
nombrar sólo a los elementos principales, y son ricos en nutrientes. Esto los
convierte en una fuente de nutrientes muy deseada para otros organismos.
Así, los microorganismos llevan a cabo muchas funciones en los ambientes
naturales, donde puede ocurrir crecimiento. Algunos ejemplos incluyen los
siguientes:
1. Descomposición (mineralización) de sustratos orgánicos.
2. Servir como fuente de alimentos rico en nutrientes para otros microorganismos
quimioheterótrofos. Esto resulta en la transformación de materiales orgánicos
a formas minerales.
3. Servir como alimento para protozoarios, nemátodos e insectos del suelo,
creando así una red alimenticia.
4. Modificar sustancias para su uso por otros organismos.
5. Cambiar la cantidad de materiales en forma soluble y gaseosa. Esto ocurre
directamente por procesos metabólicos o indirectamente modificando el
ambiente.
6. Producir compuestos inhibidores que disminuyen la actividad microbiana o
limitan la supervivencia y funcionamiento de plantas y animales.
Los microorganismos existen en hábitats naturales tanto como poblaciones de
tipos de organismos similares, así como en comunidades formadas de diferentes
tipos de poblaciones interactuantes. El ambiente microbiano es complejo y cambia
constantemente. Se caracteriza por la presencia de gradientes superpuestos de
recursos, materiales tóxicos, y otros factores limitantes. Por ejemplo, se pueden
formar gradientes cuando regiones aerobias y anaerobias intersectan o cuando una
zona iluminada cambia a una zona oscura, creándose así microambientes únicos. El
estudio de los microorganismos y sus relaciones en ambientes particulares de
denomina ecología microbiana. Donde las condiciones de un microambiente son
adecuadas grupos especializados de microorganismos pueden mantenerse a sí
mismos con competencia mínima de otros microorganismos que tienen
requerimientos funcionales ligeramente diferentes.
Los gradientes de factores esenciales también influyen en la supervivencia y
funcionamiento de las poblaciones microbianas, una expresión de la Ley de Liebig
del mínimo que establece que el crecimiento de un organismo depende de los
nutrientes disponibles sólo en cantidades mínimas. Los factores que pueden limitar a
79
los microorganismos (y a otros organismos vivos) incluyen agua, energía en forma de
luz y compuestos químicos, temperatura, nutrientes, presión, pH, y salinidad. La
situación puede ser incluso más compleja que esto. Múltiples factores limitantes
pueden influir a poblaciones en particular, y los factores limitantes pueden cambiar
en el tiempo y en el espacio. Demasiado de algunos factores (metales, sales,
hidrógeno, iones, calor) pueden también limitar la actividad microbiana, una
expresión de la Ley de la tolerancia de Shelford, la cual establece que: “la existencia
y prosperidad de un organismo depende del carácter completo de un conjunto de
condiciones. La ausencia o el mal estado de un organismo podrán ser debidos a la
deficiencia o al exceso, cualitativo o cuantitativo, con respecto a uno cualquiera de
diversos factores que se acercarán tal vez a los límites de tolerancia del organismo
en cuestión”.
7.2
El estado fisiológico de los microorganismos en el medio ambiente.
La mayoría de los microorganismos están confrontados con deficiencias que
limitan
sus actividades, excepto cuando los nutrientes en exceso permiten
crecimiento ilimitado. Tal rapidez de crecimiento agotará rápidamente los nutrientes y
resultará posiblemente el la generación de productos tóxicos de desecho, los cuales
limitarán aún más el crecimiento.
En respuesta a niveles bajos de nutrientes y a la intensa competencia, muchos
microorganismos se vuelven más competitivos en la toma de nutrientes y en la
explotación de los recursos disponibles. A menudo la morfología de los organismos
cambiará para incrementar su área superficial y su habilidad para absorber
nutrientes. Esto puede involucrar la conversión de bacterias con forma de bacilo a
“mini” o “ultramicro” células o cambiar a la morfología de prosteca (una extensión de
la célula, incluyendo la membrana plasmática y la pared celular, que es más estrecha
que la célula madura) en respuesta a la hambruna. La incrementará la adhesión
específica e inespecífica a superficies, creando biopelículas. Estas biopelículas
permiten a los microorganismos usar nutrientes que a menudo están presentes a
altas concentraciones localizadas sobre las superficies.
Los microorganismos pueden también secuestrar nutrientes limitantes críticos,
tales como el hierro, haciéndolos menos disponibles para los microorganismos
competidores. De hecho, muchos microorganismos pueden sobrevivir en estos
ambientes pobres en nutrientes y crecer bajo condiciones oligotróficas.
Las sustancias naturales pueden también inhibir directamente el crecimiento
microbiano en ambientes con pocos nutrientes. Estos agentes incluyen fenólicos,
taninos, amonio, etileno y compuestos volátiles de azufre. La presencia de tales
compuestos puede llevar a un fenómeno generalizado de microbiostasis, o
bacteriostasis y fungistasis, que afectan a las bacterias y a los hongos,
respectivamente. Esto puede ser una forma por medio de la cual los
microorganismos evitan gastar la limitada reserva energética a menos que haya
disponibilidad de una fuente adecuada de nutrientes. Tales químicos son también
80
importantes en patología de plantas y pueden ayudar en el control de las
enfermedades microbianas generadas en el suelo.
7.3
Procesos de reciclamiento de nutrientes.
Las comunidades microbianas juegan un papel principal en los ciclos
biogeoquímicos. Tal como lo sugiere este término, procesos tanto biológicos como
químicos están involucrados en el reciclamiento y transformación de nutrientes
importantes para microorganismos, plantas y animales. Esto involucra a menudo
reacciones de oxido-reducción que pueden cambiar las características físicas y
químicas de los nutrientes.
Los microorganismos juegan papeles esenciales en la transformación de
carbono, nitrógeno, azufre y hierro. Componentes gaseosos significativos se
presentan en los ciclos de carbono y nitrógeno, y de manera menos extendida en los
ciclos de azufre y fósforo. Así, un microorganismo del suelo, acuático o marino puede
a menudo fijar formas gaseosas de compuestos de carbono y nitrógeno. En los ciclos
sedimentarios, tales como el del hierro, no hay componentes gaseosos.
Un importante punto a enfatizar es que estos ciclos no operan
independientemente de otros ciclos, sino que están ligados operando a diferente
escala de tiempo y a distancias que van desde lo microbiano a lo global.
Ciclo del Carbono.
El carbono puede estar presente en formas reducidas, tales como metano
(CH4) y materia orgánica, y en más formas oxidadas, tales como monóxido de
carbono (CO) y bióxido de carbono (CO2). Los reductores (e.g. hidrógeno, el cual es
un reductor fuerte) y los oxidantes (e.g. O2) influyen en el curso de las reacciones
biológicas y químicas involucradas en el ciclo del carbono. El hidrógeno puede se
producido durante la degradación de la materia orgánica, especialmente bajo
condiciones anaerobias cuando ocurre fermentación. Si se generan hidrógeno y
metano, pueden movilizarse desde regiones anaerobias a regiones aerobias.
Los niveles de metano en la atmósfera se han incrementado
aproximadamente 1% por año, desde 0.7 hasta 1.6 a 1.7 ppm (volumen) en los
últimos 300 años. Este metano deriva de una serie de fuentes diversas. Si una
columna aerobia de agua está encima de una zona anaerobia donde se localizan las
metanogénicas, el metano puede ser oxidado antes de alcanzar la atmósfera. En
muchas situaciones, tales como los arrozales, donde no hay una zona aerobia por
encima, el metano alcanza directamente la atmósfera, contribuyendo así al
incremento global del metano atmosférico. Los rumiantes pueden producir de 200 a
400 litros de metano por día. Otras fuentes son las minas de carbón, las plantas de
tratamiento de aguas residuales, los pantanos y las ciénegas. Los microorganismos
anaerobios en el intestino de las termitas también pueden contribuir en la producción
de metano.
81
La fijación del carbono ocurre a través de la actividad de las cianobacterias y
las algas verdes, bacterias fotosintéticas, y quimiolitoautótrofos.
Ciclo del Azufre
Los microorganismos contribuyen enormemente al ciclo del azufre. Los
microorganismos fotosintéticos transforman azufre utilizando sulfuro como fuente de
electrones. En ausencia de luz el sulfuro puede cruzar en ambientes oxidantes,
permitiendo el funcionamiento de Thiobacillus y géneros quimiolitoautótrofos
similares. En contraste, cuando el sulfato se difunde en habitats reducidos,
proporciona una oportunidad para diversos grupos de microorganismos que realizan
sulfato reducción. Por ejemplo, cuando está presente un reductor orgánico utilizable,
Desulfovibrio puede derivar energía utilizando al sulfato como oxidante. Este uso del
sulfato como un aceptor de electrones externo para formar sulfuro, el cual se
acumula en el ambiente, es un ejemplo de un proceso de reducción desasimilatoria y
respiración anaerobia. En comparación, la reducción del sulfato para su uso en la
biosíntesis de aminoácidos y proteínas es descrita como un proceso de reducción
asimilatoria. Se ha encontrado que otros organismos llevan a cabo reducción
desasimilatoria de azufre elemental. Éstos incluyen Desulfuromonas, una
arqueobacteria termofílica, y también cianobacterias en sedimentos hipersalinos. El
sulfito es otro intermediario crítico que puede ser reducido a sulfuro por una amplia
variedad de microorganismos, incluyendo Alteromonas y Clostridium, así como
Desulfovibrio y Desulfotomaculum.
Cuando las condiciones de pH y oxido-reducción son favorables, también
ocurren varias transformaciones clave en el ciclo del azufre como resultado de
reacciones químicas en ausencia de microorganismos. Un importante ejemplo de
tales procesos abióticos es la oxidación del sulfuro a azufre elemental, Esto tiene
lugar rápidamente a pH neutro, con una vida media de aproximadamente 10 minutos
a temperatura ambiente.
Ciclo del Nitrógeno.
El ciclo del nitrógeno es más simple que el del carbono o el del nitrógeno, ya
que nos hay distinción y usos diferentes por os microorganismos fotosintéticos. A
pesar de esta simplificación, deben enfatizarse varios aspectos importantes del ciclo
del nitrógeno: los procesos de nitrificación, desnitrificación, y fijación de nitrógeno.
La nitrificación es el proceso aerobio de oxidación del ión amonio (NH4+) a
nitrito (NO2-) y la subsecuente oxidación del nitrito a nitrato (NO3-). Las bacterias de
los géneros Nitrosomonas y Nitrosococcus, por ejemplo, juegan papeles importantes
en el primer paso, y Nitrobacter y otras bacterias quimiolitoheterótrofas relacionadas
realizan el segundo paso. Además, la nitrificación heterotrófica realizada por
bacterias y hongos contribuye significativamente a este proceso en ambientes más
ácidos.
82
El proceso de desnitrificación requiere un set diferente de condiciones
ambientales. Este proceso desasimilatorio, en el cual el nitrato es utilizado como
oxidante en la respiración anaerobia, involucra usualmente heterótrofos como
Pseudomonas denitrificans. Los productos principales de la desnitrificación incluyen
gas nitrógeno (N2) y óxido nitroso (N2O), aunque el nitrito (NO2-) también suele
acumularse. El nitrito es importante desde el punto de vista ambiental debido a que
contribuye a la formación de nitrosaminas carcinogénicas. Finalmente, el nitrato
puede ser transformado a amonio en la reducción desasimilatoria por una variedad
de bacterias que incluyen Geobacter metallireducens, Desulfovibrio spp., y
Clostridium.
La asimilación del nitrógeno ocurre cuando el nitrógeno inorgánico es usado
como nutriente y es incorporado en nueva biomasa microbiana. El ión amonio,
debido a su estado reducido, puede ser incorporado directamente sin mayor costo de
energía. Sin embargo, cuando el nitrato es asimilado, debe ser reducido con un gasto
significativo de energía. En este proceso el nitrito puede acumularse como un
intermediario.
La fijación del nitrógeno puede ser realizada por bacterias aerobias o
anaerobias. Bajo condiciones aerobias un rango amplio de géneros microbianos de
vida libre (Azotobacter, Azospirillum) contribuye a este proceso. Bajo condiciones
anaerobias los fijadores de vida libre más importantes son los pertenecientes al
género Clostridium. La fijación del nitrógeno por cianobacterias tales como Anabaena
y Oscillatoria, pueden llevar al enriquecimiento con nitrógeno de aguas dulces y
marinas. Además, la fijación del nitrógeno puede ocurrir a través de la actividad de
bacterias que desarrollan asociaciones simbióticas con plantas. Estas asociaciones
incluyen Rhizobium y Bradyrhizobium con leguminosas, Frankia en asociación con
muchos arbustos leñosos, y Anabaena con Azolla, un helecho acuático de
importancia en el cultivo de arroz.
El proceso de fijación del nitrógeno involucra una secuencia de pasos de
reducción con importante gasto energético. El amonio, el producto de la reducción
del nitrógeno, es inmediatamente incorporado a materia orgánica como una amina.
Los procesos reductores son extremadamente sensibles al O2 y deben ocurrir bajo
condiciones anaerobias incluso en organismos aerobios. La protección de las
enzimas fijadoras de nitrógeno se logra por medio de una variedad de mecanismos,
incluyendo barreras físicas, como ocurre con le heterocistos en algunas
cianobacterias, barredoras de moléculas de O2, y tasas altas de actividad metabólica.
La fijación de nitrógeno es catalizada por la enzima nitrogenasa, la cual utiliza
ferredoxina como fuente inmediata de poder reductor.
Otros procesos cíclicos.
El ciclo del hierro es especialmente importante en términos del funcionamiento
microbiano. Los principales géneros que lleva a cabo la oxidación del hierro,
transformándolo en ión ferroso (Fe2+) a ión férrico (Fe3+), son Thiobacillus
ferrooxidans bajo condiciones ácidas, Gallionella bajo condiciones de pH neutro, y
83
Sulfolobus bajo condiciones ácida, todos en ambientes termofílicos. Mucha de la
literatura inicial sugiere que géneros adicionales podrían oxidar el hierro, incluyendo
Sphaerotilus y Leptothrix; estos dos géneros son aún llamados “bacterias del hierro”
por los no microbiólogos. La confusión sobre el papel de estos géneros proviene de
la ocurrencia de oxidación química del ión ferroso a ión férrico (formado precipitados
insolubles de hiero) a valores de pH neutros, donde los microorganismos también
crecen sobre sustratos orgánicos. Estos microorganismos están actualmente
clasificados como quimioheterótrofos.
La reducción del hierro ocurre bajo condiciones anaerobias resultando en la
acumulación de de ión ferroso. Aunque muchos microorganismos pueden reducir
pequeñas cantidades de hierro durante su metabolismo, la mayor parte de la
reducción de hierro la realiza microorganismos especializados tales como Geobacter
metallireducens y Shewanella putrefaciens, los cuales pueden obtener energía para
crecer sobre materia orgánica usando al ión férrico como oxidante.
En adición a estas reducciones relativamente simples a ión ferroso, algunas
bacterias magnetotácticas tales como Aquaspirillum magnetotacticum transforman
hierro extracelular al óxido de hierro magnetita (Fe3O4) y construyen brújulas
magnéticas intracelulares. Más aún, las bacterias hierro reductoras desasimilatorias
acumulan magnetita como producto extracelular.
La magnetita ha sido detectada en sedimentos, donde se encuentra en
partículas similares a las detectadas en bacterias, indicando una contribución a largo
plazo de las bacterias a los procesos del ciclo del hierro. Se ha sugerido que la
reducción del Fe3+ pudo haber sido el primer proceso significativo global para la
oxidación de materia orgánica a CO2. La magnetita también es importante en la
bioremediación ambiental y particularmente en medicina. Las partículas pueden ser
cubiertas con reactivos inmunológicos y con sus propiedades magnéticas pueden
recuperarse del torrente sanguíneo simplemente con un magneto. Además, los
genes para la síntesis de magnetita han sido clonados en otros microorganismos,
creando nuevos microorganismos magnéticamente sensibles.
La importancia de los microorganismos en el ciclo del manganeso es fácil de
apreciar. El ciclo del manganeso involucra la transformación del ión manganoso
(Mn2+) a MnO2 (equivalente al ión mangánico, Mn4+) el cual ocurre en grietas
hidrotermales, ciénegas, y como parte importante de rocas resinosas. Leptothrix,
Arthrobacter y Metallogenium son importantes en la oxidación del Mn2+. Shewanella,
Geobacter y otros quimioorganótrofos puede llevar a cabo procesos
complementarios de reducción de manganeso. El ciclo del manganeso está
relacionado muy cercanamente con el ciclo del hierro.
Los microorganismos también pueden usar una amplia variedad de metales
como aceptor de electrones. Metales tales como el europio, telurio, selenio y rodio
pueden ser reducidos. Entre los microorganismos importantes que realizan esta
actividad se incluyen los fotoorganótrofos Rhodobacter, Rhodopirillum y
Rhodopseudomonas. Para selenio son activos, Pseudomonas stutzeri, Thauera
84
selenatis y Wolinella succinogenes. Tales reducciones pueden disminuir la toxicidad
de un metal.
La transformación microbiana del fósforo
involucra primariamente la
transformación de fósforo (valencia +5) de ortofosfato simple a diversas formas más
complejas, incluyendo polifosfatos encontrados en los gránulos metacromáticos. Un
producto único (presumiblemente microbiano) es la fosfina (PH3) con valencia -3, el
cual es liberado en los pantanos y que arde cuando entra en contacto con el aire.
Esto puede luego prender al metano producido en ese mismo ambiente.
7.4
Interacción en la utilización de recursos.
La sucesión microbiana puede ocurrir cuando la materia orgánica es usada
como fuente de nutrientes y energía. Bajo condiciones aerobias los productos
oxidados tales como nitrato, sulfato, y bióxido de carbono se producirán por la
degradación de materia orgánica compleja. En comparación, bajo condiciones
anaerobias se tienden a acumular productos reducidos. El uso de productos de
desecho de un grupo de microorganismos por otros organismos es una relación de
comensalismo que se ve a menudo en ambientes naturales.
Las interacciones microbianas y la sucesión también ocurren cuando están
disponibles mezclas de aceptores de electrones. Si el O2, nitrato, ión manganeso, ión
férrico, sulfato, CO2 o cualquier combinación similar está disponible en un ambiente
en particular, tiene lugar una secuencia predecible de uso de oxidantes cuando un
sustrato oxidable está disponible. El oxígeno es empleado como primer aceptor de
electrones debido a que inhibe el uso de nitrato por parte de microorganismos
capaces de respirar con uno u otro. Mientras el O2 esté disponible, los sulfato
reductores y los metanógenos estarán inhibidos debido a que estos grupos son
anaerobios obligados.
Una vez que el oxígeno y los nitratos se han agotado y los productos de la
fermentación, incluyendo hidrógeno, se han acumulado, comienza la competencia
por el uso de otros oxidantes. Las formas oxidadas de manganeso y hierro serán
utilizadas primero, seguidas de la competencia entre sulfato reductoras y
metanógenas. Esto es influenciado por la mayor cantidad de energía obtenida con el
sulfato utilizado como aceptor de electrones. Diferencias en la afinidad enzimática
por el hidrógeno, un sustrato importante utilizado por ambos grupos, juegan también
un papel crítico. La sulfato reductora Desulfovibrio crece rápidamente y usa el
hidrógeno disponible a una tasa mayor que Methanobacterium. Cuando el sulfato es
agotado, Desulfovibrio no oxida más hidrógeno, y la concentración de hidrógeno
aumenta. Las metanógenas finalmente dominan el hábitat y reducen el CO2 a
metano.
Ester orden del uso de oxidantes se repite siempre que el O2, nitrato, Mn4+,
Fe , y/o sulfato estén disponibles. En base a estas interacciones, el uso microbiano
de los oxidantes disponibles puede ser entendido, predicho, y manejado.
3+
85
7.5
Sustratos orgánicos utilizados por los microorganismos.
En las discusiones anteriores sobre los ciclos de nutrientes no se hizo
distinción entre los diferentes tipos de sustratos orgánicos. Esto es simplemente
debido a que los sustratos orgánicos difieren en su susceptibilidad a ser degradados.
Los factores que influyen en la degradación incluyen los siguientes:
-
Composición elemental.
Estructura de unidades básicas repetitivas.
Enlaces entre las unidades repetitivas.
Nutrientes presentes en el ambiente.
Condiciones abióticas (pH, potencial de oxido-reducción, O2, condiciones
osmóticas)
Comunidad microbiana presente.
De los sustratos complejos utilizados por los microorganismos, sólo la biomasa
microbiana previamente producida contiene todos los nutrientes requeridos para el
crecimiento microbiano. La quitina, las proteínas, la biomasa microbiana y los ácidos
nucleicos contienen nitrógeno en grandes cantidades. El resto de lo sustratos
complejos contienen primariamente, o incluso sólo, carbono, hidrógeno y oxígeno. Si
los microorganismos están creciendo usando estos sustratos, deben adquirir del
ambiente el resto de los nutrientes necesarios para su desarrollo.
Las relaciones de O2 para el uso de estos sustratos son también de interés
debido a que la mayoría de lo sustratos pueden ser fácilmente degradados con o en
ausencia de oxígeno. La principal excepción es la lignina.
Los hidrocarburos son únicos en que la degradación microbiana,
especialmente la de aquellos de forma ramificada, involucra la adición inicial de
oxígeno molecular. Recientemente se ha observado la degradación anaerobia de
hidrocarburos con sulfato o nitrato como oxidante. Con sulfato presente, organismos
del género Desulfovibrio están activos. Esto ocurre sólo lentamente y con
comunidades microbianas que han sido expuestas a estos compuestos por largos
períodos.
La lignina, un componente estructural importante en material vegetal maduro,
es un caso especial en el cual la biodegradabilidad depende de la disponibilidad de
oxígeno. A menudo no hay degradación significativa debido a que la mayoría de los
hongos filamentosos que degradan lignina nativa in situ sólo funcionan en presencia
de oxígeno. La falta de biodegradabilidad de lignina bajo condiciones anaerobias
resulta en la acumulación de materiales lignificados.
86
VIII. HONGOS. GENERALIDADES.
A diferencia de los protozoarios, los hongos poseen pared celular y esporas de
diversos tipos y forman un grupo coherente filogenéticamente hablando (Tabla 10.1).
Se reconocen tres grandes grupos: mohos u hongos filamentosos, levaduras y setas.
Los hábitat de los hongos son bastante diversos. Algunos son acuáticos,
principalmente de agua dulce, aunque existen también algunos de medios marinos.
La mayoría de ellos son de medios terrestres, crecen en suelos o sobre materia
orgánica en descomposición y contribuyen notablemente a la mineralización del
carbono orgánico. Un gran número de hongos es parásito de plantas terrestres. De
hecho, los hongos causan pérdidas económicas muy notables en la producción
hortofrutícola. Algunos hongos son parásitos de animales, incluido en hombre,
aunque, en general, desde este punto de vista, son mucho menos importantes que
las bacterias y los virus.
a
Tabla 8.1 Clasificación y principales propiedades de los hongos .
Grupo
Nombre
Hifas
Representante
Tipos de
común
s típicos
esporas
sexuales
Neurospora,
Saccharomyce
Ascomicetos
Hongos
Septadas
Ascospora
s, Morchela
Amanita
Basidiomiceto
Setas
Septadas
(venenosa),
Basidiospo
Agaricus
s
ra
(comestible)
Hábitat
Enfermedades
Suelo, materia
vegetal en
descomposición
Tizón del
castaño, ergot,
podedumbre.
Tallo negro en
trigo, maíz, etc.
Suelo, materia
vegetal en
descomposición
Hongos
del pan
Cenocítica
s
Mucor,
Rhizopus
(deterioro de
alimentos)
Zigospora
Suelo, materia
vegetal en
descomposición
Oomicetos
Hongos
acuáticos
Cenocítica
s
Allomyces
Oospora
Acuáticos
Ninguna
Deuteromicet
os
Hongos
imperfectos
Septadas
Penicillium,
Aspergillus,
Candida
Suelo, material
vegetal en
descomposición,
piel de animales
Zigomicetos
Deterioro de
alimentos, rara
vez implicados
en
enfermedades
parasitarias.
Ciertas
enfermedades
de los peces
Incluyen
parásitos de
plantas y
animales (pie de
atleta,
dermatomicosis,
infecciones
sistémicas).
a
Con excepción de los oomicetos, que son filogenéticamente distintos, los otros grupos de hongos están muy
relacionados entre si.
Las paredes fúngicas se parecen a las de las plantas, pero sólo desde el
punto de vista de su arquitectura y no desde la composición química. Aunque la
celulosa está presente en ciertos hongos, muchos de ellos poseen paredes no
87
celulósicas. La quitina, un polímero de N-acetil-D-glucosamina es un constituyente
común de las paredes celulares fúngicas. Se dispone en grupos de microfibrillas
como la celulosa y en algunas especies existen otros polímeros como mananos,
galactanos o quitosán. En un 80-90%, las paredes celulares fúngicas están
compuestas de polisacáridos, mientras que los lípidos, polifosfatos e iones
inorgánicos forman una matriz cementante. El conocimiento de la pared celular
fúngica es muy importante por la aplicación biotecnológica de estos microorganismos
y, además, porque su naturaleza química se ha usado en la clasificación de los
hongos.
Los hongos son típicamente quimioorganotrofos y tienen pocos requerimientos
nutricionales. Muchas especies pueden crecer en ambientes extremos con pHs bajos
o altas temperaturas de hasta 620C y esto, junto con la ubicuidad de las esporas
fúngicas, hacen que sean los contaminantes más frecuentes de alimentos, medios de
cultivo microbianos, etc. Sin embargo, los mohos y las levaduras no son clasificados
sobre bases fisiológicas, sino por sus diferentes ciclos celulares que incluyen la
formación de una gran diversidad de esporas.
8.1
Hongos Filamentosos. Mohos.
Los mohos son hongos filamentosos. Están ampliamente distribuidos en la
naturaleza y se ven frecuentemente sobre pan viejo, queso o frutas. Cada filamento
crece fundamentalmente en el extremo por un mecanismo de extensión celular. Cada
filamento se denomina hifa. Las hifas crecen en masa en lo que se denomina micelio,
que puede verse fácilmente sin ayuda del microscopio. En la mayoría de los casos,
las hifas fúngicas contienen más de un núcleo, a veces cientos de núcleos. Por tanto,
una hifa es como un tubo nucleado con citoplasma (referida como cenocítica).
A partir del micelio, otras hifas buscan la superficie donde forma esporas o
conidios. Los conidios son esporas asexuales (su formación no implica la fusión de
gametos), a menudo muy pigmentadas y resistentes a la desecación, que sirven
como forma de dispersión del hongo en nuevos hábitat. Cuando se forman los
conidios, cambia el color blanco del micelio adquiriendo el de éstos que puede ser
negro, rojo, azul-verdoso, amarillo o marrón. La presencia de esas esporas da a la
masa micelial la apariencia de ser una capa de polvo.
Algunos mohos también producen esporas sexuales, formadas como
resultado de una reproducción sexual. Esta se produce por fusión de gametos
unicelulares o de hifas especializadas llamadas gametangios. Alternativamente, las
esporas sexuales se pueden originar de la fusión de dos células haploides que sufren
meiosis y mitosis para dar esporas individuales. Dependiendo a qué grupo
pertenezca el hongo en cuestión se pueden formar diversos tipos de esporas
sexuales. Cuando se forman dentro de un saco o asca se denominan ascosporas y si
se forman en los extremos de estructuras en forma de porra se denominan
basidiosporas. Las zigosporas producidas por los zigomicetos como es Rhizopus son
estructuras macroscópicamente visibles. Eventualmente, la zigospora madura y
88
produce esporas asexuales que son dispersadas en el aire y germinan para dar un
nuevo hongo.
Las esporas sexuales de los hongos son generalmente resistentes a la
desecación, congelación y a algunos compuestos químicos. No son tan resistentes
como las endosporas bacterianas. Tanto una espora sexual como asexual puede
germinar para originar un nuevo micelio.
Una actividad ecológica muy significativa de los hongos es la descomposición
de la madera, papel, tela y otros productos derivados de fuentes naturales, utilizando
estos productos como fuentes de carbono y de energía. La lignina es un polímero
complejo en el que las unidades son compuestos fenólicos. Es una parte muy
importante de las plantas leñosas y junto con la celulosa proporciona rigidez a la
planta. La descomposición de la lignina en la naturaleza se produce casi
exclusivamente a través de la acción de ciertos basidiomicetos que producen «la
podredumbre de la madera». Se conocen dos tipos: podredumbre marrón en la que
se degrada la celulosa, pero no la lignina y podredumbre blanca en la que se
descomponen ambos polímeros. Los hongos que producen esta última forma de
podredumbre son muy importantes, ya que están activamente implicados en la
descomposición del material leñoso de los bosques.
8.2
Hongos Unicelulares. Las Levaduras.
Las levaduras son hongos unicelulares, la mayoría perteneciente a los
Ascomicetos. Normalmente son ovales, esféricas o casi cilíndricas y la división es,
casi siempre, asimétrica o por gemación. En este proceso, la nueva célula forma
como un pequeño bulto en la célula madre que crece hasta separarse de ella.
Aunque la mayoría de las levaduras se reproducen como células aisladas, bajo
ciertas condiciones pueden filamentar. Por ejemplo, la fase filamentosa es esencial
para la patogenicidad de Candida albicans, una levadura que puede causar
infecciones bucales, vaginales o de pulmones, e incluso, en enfermos de SIDA, daño
sistémico tisular.
Las células de levaduras son mucho más grandes que las bacterias y pueden
distinguirse de ellas no solamente por su tamaño sino también por poseer sistemas
membranosos intracitoplasmáticos así como núcleo. Algunas levaduras poseen
reproducción sexual por conjugación en la que se fusionan dos células. La célula
resultante es un zigoto verdadero y de él emergen esporas sexuales por reducción
meiótica.
Las levaduras prosperan típicamente en hábitat con azúcares, tales como
frutos, flores y cortezas de los árboles. Un buen número vive simbionte con animales,
especialmente insectos y algunas son patógenas para animales, incluido el hombre.
La levadura más conocida es Saccharomyces cerevisiae. El hábitat original de estas
levaduras son indudablemente las frutas y zumos de frutas, pero las levaduras
comerciales de hoy en día son muy diferentes de su ancestro silvestre, ya que ha
89
sido manipulada por el hombre voluntaria o involuntariamente durante los últimos
7000 años. Fue el primer eucariota cuyo genoma se secuenció por vez primera.
8.3
Hongos mucosos.
Los hongos mucosos son microorganismos eucarioticos que poseen
similitudes fenotípicas con hongos y protozoos. Como los primeros, pueden producir
esporas y como los protozoos pueden moverse por superficies con un movimiento
flexible a modo de amebas. Desde una perspectiva filogenética, los hongos mucosos
son más antiguos que hongos y protozoos tales como los ciliados, pero más
derivados que los flagelados.
Los hongos mucosos pueden dividirse en dos grupos: los celulares
(semejantes a amebas) y los acelulares, que son masas amorfas de protoplasma que
llamamos plasmodios. Algunos hongos mucosos viven principalmente en material
vegetal en descomposición, tales como restos de hojas, troncos, etc. Su alimento
suele ser otros microorganismos, especialmente bacterias que ingieren por
fagocitosis. Pueden mantenerse durante mucho tiempo en fase vegetativa o, por
diversas razones, desarrollar esporas que al germinar regeneran el estado
ameboideo.
Hongos mucosos acelulares.
En la fase vegetativa, hongos mucosos acelulares tales como Physarum
existen como una masa protoplásmica de tamaño indefinido. Esta forma o plasmodio
es móvil por movimiento ameboideo englobando por fagocitosis las partículas de
alimento a medida que se mueve. Este peculiar movimiento es el resultado de las
corrientes citoplasmáticas que empujan contra un extremo del plasmodio que es
menos viscoso y, lógicamente, la corriente sigue el camino de mínima resistencia.
Estas corrientes, como en el resto de los microorganismos eucarióticos que las
poseen, están facilitadas por microfilamentos que forman una delgada capa debajo
de la membrana citoplasmática. En hongos mucosos acelulares, las corrientes
citoplasmáticas forman unas bandas bien definidas y cada una rodeada de una
delgada membrana citoplasmática. Las corrientes en sí mismas son unos
mecanismos de distribución celular de los metabolitos.
El plasmodio de hongos mucosos es diploide. A partir de esta masa
protoplásmica, se produce un esporangio y esporas haploides. Bajo condiciones
favorables las esporas germinan y producen una forma natatoria. La fusión de dos de
estas formas regenera al plasmodio diploide.
90
Hongos mucosos celulares.
Dictyostelium discoideum es un hongo mucoso celular que tiene un ciclo de
vida muy característico en el que Ias células vegetativas se agregan, migran como
una masa y eventualmente producen cuerpos fructíferos en los que las células se
diferencian y forman esporas. A medida que sus células entran en fase de
deprivación, se agregan para formar un seudo plasmodio, una estructura en la que
las células pierden su individualidad pero no se fusionan. Esta agregación se inicia
por la producción de adenosinmonofosfato cíclico (cAMP) y una glicoproteína; ambos
funcionan como agentes quimiotácticos. Aquellas células que son las primeras en
producir estos compuestos, sirven como centros de atención de otras formas
vegetativas lo que conduce a la formación de una masa que se mueve
coordinadamente.
A partir de esta masa, emerge un cuerpo fructífero cuando cesa el movimiento
de la misma y se pone en posición vertical. El cuerpo fructífero consta de dos partes:
un pedúnculo y una cabeza. Las células en la parte delantera de la masa se
diferencian en pedúnculo las de la parte trasera en esporas. Las células que se
diferencian en pedúnculo comienzan a producir celulosa, que da rigidez al sistema.
En la maduración de la cabeza, las esporas se liberan y se dispersan. Cada espora
germina y regenera una ameba.
El ciclo del cuerpo fructificante y formación de esporas de Dictyostelium es un
proceso asexual. Sin embargo, se pueden producir también esporas sexuales o
macrocistos. Los macrocistos se forman de agregados de amebas que quedan
encerrados en una pared celulósica. Siguiendo la conjugación de dos amebas, se
desarrolla una más grande que procede a fagocitar al resto de las amebas. En este
punto, se forma una gruesa pared celulósica alrededor de la ameba gigante
originando así el macrocisto que puede permanecer durmiente durante largos
periodos de tiempo. Eventualmente, el núcleo diploide sufre meiosis para formar
núcleos haploides, que se integran en las nuevas amebas que, una vez más, inician
el crecimiento vegetativo.
91
IX.
PROTOZOARIOS. GENERALIDADES
Los protozoarios o protozoos son microorganismos eucariotas unicelulares que
carecen de pared celular. En general no poseen color y son móviles. Los protozoos
se distinguen fácilmente de los procariotas porque son inconfundiblemente más
grandes; de las algas porque carecen de clorofila; de los hongos y levaduras por su
movilidad y ausencia de pared celular y de los hongos mucosos por su incapacidad
para originar cuerpos fructíferos. Además, los protozoarios son filogenéticamente
diversos, apareciendo en varios linajes en el árbol de Eukarya. Los protozoos se
encuentran tanto en hábitat de aguas dulces como marinas; un gran número de ellos
son parásitos del hombre y animales y otros son saprofitos en otros hábitats como
suelo, el aire o la superficie de los árboles.
La mayoría de los protozoos se alimentan por fagocitosis, proceso por el que una
partícula de alimento es rodeada por una porción de su membrana celular flexible,
introduciéndola en la célula. Algunos protozoos pueden “tragar” literalmente bacterias
o células eucarióticas pequeñas a través de una estructura especial, más o menos
desarrollada, que funciona a modo de boca y que se conoce como citostoma.
Como es lógico, y por ser organismos que podríamos considerar como
“cazadores”, los protozoos son móviles. De hecho, el tipo de movilidad es una de las
características que se emplean para dividirlos en grupos taxonómicos (Tabla 11.1).
Los protozoos que se mueven por movimientos ameboides se llaman Sarcodina; los
que utilizan flagelos, Mastigophora y los que utilizan cilios, Ciliophora. Existe un
cuarto grupo Apicomplexa, generalmente inmóviles, que son parásitos de animales
superiores.
Tabla 9.1 Características de los principales grupos de protozoarios.
Grupo
Nombre común
Representantes
Hábitat
típicos
Mastigophora
Flagelados
Trypanosoma,
Agua dulce;
Giardia,
parásitos de
Leishmania,
animales.
Trichomonas
a
Euglenoides
Flagelados
Euglena
Agua dulce,
fototrópicos
algunos marinos.
Sarcodina
Amebas
Amoeba,
Aguas dulces y
Entamoeba
saladas;
parásitos de
animales.
Ciliophora
Ciliados
Balantidium,
Agua dulce y
Paramecium
marina; parásitos
de animales;
rumen.
Apicomplexa
Esporozoos
Plasmodium,
Parásitos de
Toxoplasma
animales:
insectos
(vectores).
a
Este grupo es considerado también como algas.
Enfermedades
Enfermedad del
sueño; giardiasis;
leismaniasis.
Ninguna
conocida.
Disentería
amebiana
(amebiasis)
Disentería
Malaria;
toxoplasmosis.
92
9.1
Mastighopora: los Flagelados.
Los miembros de este grupo de protozoos son móviles por la acción de
flagelos. Aunque muchos protozoos flagelados son de vida libre, un buen número de
ellos son parásitos de animales, incluido el hombre. El más importante de ellos es
Trypanosoma. Estos organismos causan una serie de enfermedades graves en el
hombre, como la enfermedad del sueño. En Trypanosoma, género que infecta a
humanos, el protozoo es bastante pequeño, aproximadamente de 20 µ de longitud,
son organismos delgados con forma curvada. El flagelo se origina en un cuerpo
basal y se repliega lateralmente a través de la célula quedando rodeado por una
ondulación de la membrana de la superficie. Tanto el flagelo como la membrana
están implicados en el movimiento a través de sustancias viscosas, como es el caso
de la sangre. Trypanosoma gambiense es la especie que produce la enfermedad del
sueño africana, una enfermedad crónica y generalmente mortal. En el hombre, el
parásito vive y se multiplica inicialmente en el torrente sanguíneo, invade el sistema
nervioso central, causando una inflamación del cerebro y de la espina dorsal
responsable de los síntomas neurológicos característicos de la enfermedad. El
parásito se transmite por la mosca tse-tse Glossina que, al contrario que el resto de
las moscas, se alimenta chupando la sangre de los animales de sangre caliente y
vive en ciertas partes de África. El parásito prolifera en el tracto intestinal de la mosca
e invade sus glándulas salivares, desde donde se transmite por picadura al
hospedador humano.
Los flagelados fototróficos son los euglenoides, flagelados que contienen
clorofila que permite el crecimiento fotosintético. Sin embargo, en la oscuridad
Euglena puede sobrevivir y crecer como un quimioorganotrofo y, como tal, es
indistinguible de los protozoos. Se conocen muchos euglenoides y son
exclusivamente acuáticos; por lo general, se encuentran en aguas dulces siendo
saprofitas. A diferencia de otros protozoos flagelados, los euglenoides no son
patógenos.
9.2
Sarcodina: las Amebas.
Dentro de las sarcodinas se encuentran organismos como Amoeba, que en
fase vegetativa se encuentran siempre desnudos; y los foraminíferos, amebas que
secretan una especie de concha durante el crecimiento vegetativo. Se conocen un
buen número de amebas «desnudas» parásitas de humanos y otros vertebrados,
cuyo hábitat es la cavidad bucal y el tracto intestinal. En estos hábitats, se mueven
por movimiento ameboide, un mecanismo que también emplean los hongos
mucosos. Entamoeba histolytica es un buen ejemplo de amebas parásitas. En
muchos casos la infección es asintomática, pero en algunos individuos produce
ulceraciones en el tracto intestinal, que produce un estado diarreico denominado
disentería amebiana (amebiasis). El organismo se transmite de persona a persona
como cistos cuando hay contaminación fecal de las aguas o los alimentos.
93
Las sarcodinas con concha presentan una interesante variedad de formas. Las
mejor estudiadas son los foraminíferos. Los foraminíferos son organismos
exclusivamente marinos, que viven en zonas próximas a las costas. Las conchas,
llamadas testas, de las diferentes especies tienen diversas características y a
menudo están decoradas (ornamentadas). Las testas están hechas de carbonato
cálcico y las células no se anclan firmemente a ellas, de modo que la célula puede
extenderse cuando se alimenta.
Debido al peso de la concha, los foraminíferos se hunden hasta el fondo y se
piensa que estos organismos se alimentan de depósitos particulados en los
sedimentos, principalmente bacterias y detritus. Las conchas son bastante
resistentes y, por ello, se fosilizan rápidamente (los acantilados de Dover, Inglaterra,
son en gran medida conchas de foraminíferos). Debido a que dejan un excelente
registro fósil, se tiene una mejor idea de su distribución a través de las edades
geológicas que a partir de cualquier otro protozoo.
9.3
Ciliophora: los Ciliados.
Los ciliados son aquellos protozoos que al menos en alguna fase de su vida,
poseen cilios. Son únicos entre los protozoos y poseen dos clases de núcleo: el
micronúcleo que está implicado en la herencia y en la reproducción sexual y el
macronúcleo que está implicado en la formación de diversos mRNAs de crecimiento
y otras funciones celulares.
Probablemente, el ciliado mejor estudiado es Paramecium, que será utilizado
aquí como ejemplo grupo. La mayor parte de los ciliados obtienen su alimento
ingiriendo partículas a través de una especie de boca hasta una zona ciliada que es
como un esófago. Al llegar al citoplasma, la partícula es englobada en una vacuola
digestiva en la que se vierten las enzimas digestivas. Además de cilios, muchos
ciliados poseen tricocistos que son filamentos largos, de naturaleza contráctil
anclados debajo de la capa más externa de la célula. Estas estructuras permiten a
los protozoos asirse literalmente a sustratos sólidos y también sirven para dar
señales de peligro cuando están siendo atacados por otros predadores. En el caso
de Didinium, los tricocistos paralizan la presa como preludio a la ingestión.
Muchas especies de Paramecium (así como muchos otros protozoos) sirven
de eficientes hospedadores para bacterias endosimbiontes que viven en su
citoplasma o, incluso, dentro del macronúcleo. Existen evidencias de que en muchos
casos juegan un importante papel en la nutrición del protozoo, sintetizando vitaminas
u otros factores nutricionales, que de lo contrario tendrían que ser obtenidos del
medio exterior. En el caso de los protozoos del tracto intestinal de las termitas,
poseen un endosimbionte metanogénico que elimina el hidrógeno producido por la
oxidación del piruvato en el hidrogenosoma; el metano producido es liberado a la
atmósfera.
94
Aunque algunos ciliados son parásitos, no es ésta una forma de vida habitual
en el grupo. La especie Balantidium coli es primariamente una especie parásita de
animales domésticos, pero ocasionalmente infecta el intestino de humanos dando
lugar a cuadros disentéricos que pueden confundirse con Entamoeba histolytica.
Además, existe una fauna característica de ciliados anaerobios obligados en el
rumen; estos protozoos juegan un papel beneficioso en los procesos digestivos y
fermentativos que ocurren allí.
9.4
Sporozoa (Apicomplejos).
Los apicomplejos o esporozoos es un gran grupo de protozoos que son
parásitos obligados. Se caracterizan por ser inmóviles en estado adulto y porque los
alimentos los toman disueltos en fase acuosa a través de las envolturas celulares
como ocurre en los procariotas y hongos. Aunque el nombre esporozoos implica la
formación de esporas, estos organismos no las forman; no al menos en el sentido en
que se entiende este tipo de formaciones para procariotas u hongos, en su lugar
originan formaciones semejantes que se llaman esporozoitos, que están implicados
en la transmisión a un nuevo hospedador. Tanto animales vertebrados como
invertebrados pueden ser hospedadores de los esporozoos e incluso en algún caso
pueden tener lugar fases alternas. Los miembros más importantes de esporozoos
son los coccidios, normalmente parásitos de pájaros y los plasmodios (parásitos de
la malaria) que infectan pájaros y mamíferos incluyendo el hombre.
95
X.
VIRUS. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES.
Los virus son elementos genéticos que pueden replicarse independientemente de
los cromosomas de una célula pero no independientemente de dicha células. A fin de
multiplicarse, los virus deben entrar en una célula en la cual puedan replicarse. Dicha
célula se denomina hospedadora. Los virus se caracterizan también por tener una
forma infecciosa madura que es típicamente extracelular.
Los virus, al igual que los plásmidos y otros elementos genéticos, se aprovechan
de la maquinaria metabólica codificada por los cromosomas de la célula
hospedadora. Como otros elementos, los virus pueden conferir importantes
propiedades a la célula hospedadora. Estas propiedades serán heredadas cuando la
célula se divida, si las dos células hijas heredan el genoma vírico. Estos cambios
frecuentemente no son dañinos, e incluso pueden ser beneficiosos. Sin embargo, los
virus a diferencia de los otros elementos genéticos como los plásmidos, tienen una
forma extracelular que los capacita para ser fácilmente transmitidos de un
hospedador a otro. Esta forma extracelular ha capacitado a los virus a replicarse
dentro de un hospedador de una manera dañina para la célula hospedadora. Esta
replicación destructiva es la causa de que algunos virus sean agentes de
enfermedades. En muchos casos, el que un virus cause enfermedad o cambio
hereditario depende de la célula hospedadora y de las condiciones ambientales.
Debido a que los virus tienen una fase independiente de las células, algunas
personas los denominan «organismos vivos» o «formas de vida». Sin embargo
algunas de las propiedades que caracterizan a los sistemas vivientes no se dan en la
forma extracelular de los virus. Sin células en las que replicarse, los virus no podrían
existir.
Los virus están entre los más numerosos “microorganismos” de nuestro planeta e
infectan todos los tipos de organismos celulares. Por tanto, son interesantes por si
mismos. Sin embargo, los científicos han estudiado y siguen estudiando los virus por
lo que pueden enseñarnos sobre la genética y bioquímica del metabolismo celular en
el caso de algunos virus, sobre el desarrollo de las enfermedades. Además, los virus
son también importantes herramientas para la genética microbiana y la ingeniería
genética.
10.1
Propiedades Generales de los Virus.
Describiremos aquí los estados intra y extracelular de los virus. En el estado
extracelular, un virus es una partícula minúscula que contiene ácido nucleico rodeado
por proteína y que, dependiendo del virus específico, ocasionalmente contiene otros
componentes macromoleculares. En este estado extracelular, la partícula vírica,
también llamada virión, es metabólicamente inerte y carece de funciones
respiratorias y biosintéticas. El virión es la estructura mediante la cual el genoma del
virus se transporta desde la célula en la que se ha producido a otra célula en la que
el ácido nucleico vírico puede ser introducido. Una vez dentro de la nueva célula, se
96
inicia el estado intracelular. Durante este estado tiene lugar la replicación del virus:
se producen nuevas copias del genoma vírico, y se sintetizan los componentes de la
cubierta del virus. Cuando un genoma vírico se introduce y se reproduce en una
célula hospedadora, el proceso se denomina infección. La célula que puede ser
infectada por un virus que, además, se reproduce en ella, se denomina hospedador.
Los genomas virales son muy limitados en tamaño y codifican primariamente las
funciones que no pueden adaptar de sus hospedadores. Por tanto, durante la
replicación dentro de una célula, los virus dependen de manera determinante de los
componentes estructurales y metabólicos de las células hospedadoras. El virus
reconduce las funciones metabólicas la maquinaria del hospedador al servicio de su
propia replicación y al ensamblaje de los nuevos viriones. (Por tanto, para la mayoría
de los virus pueden encontrarse viriones dentro de la célula al final de la infección).
10.2
Genomas Víricos.
Como es bien sabido, todas las células tienen ácido desoxirribonucleico de
doble cadena (DNA) como material genético. Por el contrario, los virus contienen o
bien DNA o ácido ribonucleico (RNA) como material genético, y en ambos casos
puede ser de cadena sencilla o doble. Los virus se dividen a veces en dos tipos,
según contengan DNA o RNA como material genético, y todos los virus contienen
uno u otro en el virión. Sin embargo, existe un tercer tipo de virus que usan ambos,
DNA y RNA, como material genético, pero en distintos estadios de su ciclo
reproductivo. El último grupo incluye los retrovirus, que contienen un genoma de
RNA en el virión pero se replican a través de un intermediario de DNA, y el virus de
la hepatitis B, que contiene DNA en el virión pero tiene RNA como intermediario de
replicación. Estas clases pueden ser subdivididas sobre la base de si el ácido
nucleico del virión es de cadena sencilla o doble. La clasificación de los virus basada
en el tipo de ácido nucleico en los viriones y las estrategias de replicación asociadas
a los mismos ha sido formalizada como el Sistema de Clasificación de Baltimore.
A pesar de la diversidad en la estructura del genoma, los virus obedecen al
dogma central de la biología molecular: toda la información genética fluye desde el
ácido nucleico a la proteína. Además, todos los virus usan la maquinaria traduccional
de la célula; y así, con independencia de la estructura del genoma vírico, debe
generarse RNA mensajero (mRNA) que pueda ser traducido en los ribosomas del
hospedador.
10.3
Hospedadores de Virus y Taxonomía.
Los virus pueden clasificarse también en función de los hospedadores que
pueden infectar. Así, tenemos virus de animales, virus de plantas y virus bacterianos.
Los virus de bacterias, a veces llamados bacteriófagos (o, abreviadamente, fago, del
griego phagein que significa «comer»), han sido estudiados primariamente como
sistemas modelo convenientes de investigación en biología molecular y genética de
la reproducción vírica.
97
Muchos de los conceptos básicos de virología se generaron trabajando con
virus bacterianos y se aplicaron posteriormente a virus de organismos superiores.
Dada su frecuente importancia médica, los virus de animales también llamados virus
animales han sido estudiados extensamente. Los dos grupos de virus animales más
estudiados son los que infectan insectos y los que infectan animales de sangre
caliente. Los virus de plantas o virus vegetales son importantes en agricultura y han
sido menos estudiados que los virus de animales.
Finalmente, existe un sistema formal de taxonomía vírica que organiza los virus
en niveles taxonómicos jerárquicos: orden, familia (y subfamilia), genero y especie.
Aunque, a veces, este sistema taxonómico formal puede parecer bastante arbitrario
(y a pesar de que los nombres comunes están todavía en uso), su utilidad aumenta
continuamente debido al incremento de los datos filogenéticos que se van
acumulando. El taxón familia parece particularmente útil. Los miembros de una
familia de virus poseen morfología (del virión), estructura del genoma y/o estrategias
de replicación distintivas. Las familias de virus tienen nombres que incluyen el sufijo ‘iridae’ (como en Poxviridae).
98
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. Glick, B.R. and J.J. Pasterak. 1998. Molecular Biotechnology. Principles and
Applications of Recombinant DNA. Second edition. American Society for
Microbiology Press. Washington, D.C. U.S.A. 683 p.
2. Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 1997. Brock, Biología de los
Microorganismos. Octava edición revisada. Prentice Hall Inc. España. 986 p.
3. Prescott, L.M., J.P. Harley and D.A. Klein. 1996. Microbiology. Third edition. WCB
Publishers. U.S.A. 936 p.
4. Stryer, L. 1993. Bioquímica. Tercera edición. Editorial Reverté, S.A. Barcelona,
España. 1084 p.
5. Talaro, K. and A. Talaro. 1996. Foundations in Microbiology. Second edition. WCB
Publishers. U.S.A. 861 p.
99