Reconocimiento molecular y carbohidratos Metodologías para la determinación estructural de fármacos y el estudio de fenómenos de reconocimiento molecular Bacteria Virus Celula Glicoproteina Programa de doctorado en Química Médica Toxina Lectina Estructura 3D de carbohidratos Hormona Anticuerpo Enzima La conformación de los carbohidratos θ = 0º Conformaciones del ciclo (sillas) Orientación entre ellos dada por los ángulos dihedros f, y (w) alrededor del enlace glicosílico, distancias de átomos… silla semisilla Q 1S pole θ · 270º · 1S semisilla 3 O 210º 1C 4 φ bote O 5 equator Bote torcido 4C 1 2S O O O O O 330º O φ = 0º O 30º 330º 2 60º O θ = 180º OS O 300º θ = 90º θ = 180º O O O θ = 90º O 270º O O 90º 120º 240º 150º 210º 180º O O O θ = 0º 3S O 30º 1 O 5S 1 O 90º Análisis conformacional de carbohidratos Efectos anoméricos Torsiones Glicosídicas φ, y Ψ +O O Efecto anomérico H O H C φ ψ OH OH O HO OMe OH HO O OH OR .. Efecto exo-anomérico OR .. OH - R -180-120-60 0 180 O O O R O5 O5 C2 C2 R C2 120 60 60 0 0 H1 H1 exo no-exo ω H 6R H HO H 6S H H6S HO OR gg ( ω ≅−60º) 3 J H5,H6R J H5,H6S ω HO O O HO H O -H O O O H HO OR HO O O OR HO tg (ω ≅180º) gt ( ω ≅ 60º) 10.7 5.0 2.8 3.1 10.7 c O H O H O -120 -180 60 120 180 -180 -180-120-60 0 φ Mapa relajado 60 120 180 180 120 120 60 60 0 0 -60 -120 -60 -120 -180 -180-120-60 0 φφ -180 60 120 180 Mapa probabilidad mapa adiabático gtggcc gtggcr gtggrc gtggrr tgggcc tgggcr tgggrc tgggrr gtgtcc gtgtcr gtgtrc gtgtrr tggtcc tggtcr tggtrc tggtrr 16 mapas relajados mapa de 6400 estructuras probabilidad r O Modelo de disolvente H2O, GB/SA O H OO R -120 Constante Dieléctrica: 1, 80 H H -120 -60 -120 -180 60 120 180 16 configuraciones iniciales H ω H6R HO Torsiones de los hidroxilos secundarios H -60 φφ 60 0 -180-120-60 0 180 H6S H- O 0.9 O -60 0 -60 -180 -180-120-60 0 60 120 180 180 120 Mecánica y Dinámica Molecular con MM3* O -H HO 120 60 exo-anti Torsión ω del grupo hidroximetilo 6RH -180-120-60 0 180 Mapa rígido R R H1 3 O5 60 120 180 180 120 ψ R ψ C2 O ψ O O5 O O O H O R O O H Simulaciones de MD Espectros 1D Técnicas para obtener datos experimentales Pocos cristalizan bien y pocas estructuras se han resuelto Rayos-X Se pierde la información dinámica Desplazamientos químicos Cosntantes de acoplamiento escalar (J) NOEs RMN Residual dipolar couplings RDC Relajación cruzada Experimentos J-resueltos: HSQC Aproximación basada en pares de spines aislados (ISPA) t1 coupled CT-CE-HSQC t2 coupled HSQC OH HO OH OH HO O OH H1-C1 Gal OH O HO 1D - traces OH O O HO HO 90.0 OH HO OH O OH oriented H O H H 95.0 13C 4.80 ppm (f1) 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30 4.20 4.10 OH 4.00 D2O 100.0 H1-C1 Glcβ β oriented Distancia fija Experimentos: •COSY, TOCSY, HSQC •NOESY, ROESY Depende de φ/ψ ppm(f1) 5.00 ppm(f2) 4.50 1H H1’ 90.0 Glc 1α α D2O 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 NOE H1’-H4 H1-C1 Glcα α 95.0 NOE H1’-H3’ 100.0 Gal 1 oriented D2O ppm(f1) 5.00 H3’ ppm (f1) Glc 1β β 13C ppm(f2) H4 1H 4.50 5.40 ppm (f1) 5.30 5.20 5.10 5.00 Tolman et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1416-1424 r-6 H1’-H4 = r-6 H1’-H3’ -180 -120 -60 0 0 180 120 120 120 120 60 60 60 60 0 0 0 0 H H OH NOE H1’-H3’ -60 -60 2,0 -120 -120 -120 -120 -180 -180-120 -60 0 1,5 φ 1,0 60 120 180 180 120 120 60 60 0 0 0,0 NOE H1’-H3’ 0 250 500 750 1000 1250 1500 mixing time (ms) -180 -120 -60 0 180 -120 φ M H1’-H3’ f(t)= P0 (1-eP2t) (1-eP1t) M (0)= P0*P1 H1’-H3’ -60 -120 1'1'-3 -180-120 -60 0 180 120 120 60 60 60 0 0 0 0 -60 -60 -60 -60 -120 -120 -120 -120 -180 60 120 180 -180 -180-120 -60 0 ANTI φ /ψ : 60º / 180º 60 120 180 180 120 φ 2’ 4 H2O -180 60 120 180 φ /ψ : 180º / 0º G-G Conformación “virtual” de alta energía Consecuencias de la flexibilidad de oligosacáridos rAB -120 -180 60 120 180 60 φ A -60 120 -180 -180-120 -60 0 ε =80 0 -180 -180 -120 -60 0 60 120 180 180 1’ 60 1'1'-4 z 2'2'-4 φ -180-120 -60 0 180 ψ = r-6 0 3 120 60 z -180 60 120 180 -180 -180-120 -60 0 r-6 H1’-H4 φ /ψ : 60º / 0º 60 120 180 180 120 -60 -60 -120 M H1’-H4 SYN -180 60 120 180 φ -180 -120 -60 0 180 0,5 -180 -180-120 -60 0 -180 60 120 180 ψ OH H O 4 -60 ψ OH O 1’ ε =1 -60 ψ HO HO MM3* 60 120 180 180 2,5 ψ OH HO NOE(%) O 60 120 180 ψ ψ HO 180 -180-120-60 0 180 Aproximación basada en un par de spines aislado (ISPA) 2.7-3.0 A RO OH B H H2N O NOE AB = f (r-6 AB ) φ/ψ 0/− 0/−60 H H A B O H H R A B H H OH H NH2 H OH 2.5 A NOE AB = f ( <r-6 AB> ) E (Kcal/mol) d14=2.3A 180 350 300 60 250 -150 -100 0 -50 -60 0 Proceso de intercambio Conformación “virtual” de alta energía 17% 120 50 -120 100 150 -180 d15=2.5A 83% Simulación de NOE: programa NOEPROM Simulación de NOE: programa NOEPROM OH OH O Me OH O Características: HO O HO OH • • • • NOE estacionario, 2D NOESY y 2D ROESY Equilibrio conformacional Simulación simultánea de toda la red de protones Flexibilidad: modelos dinámicos Gal φ O ψ 1 -180 -120 -60 0 % NOE Distancias modelo/s Matriz de relajación OH Glc 60 120 180 180 180 120 120 60 ψ 60 Intensidades NOE 0 0 -60 -60 -120 -120 -180 -180 -120 -60 0 φ -180 60 120 180 Resumen de la determinación estructural en disolución con RMN Comparación con los datos de RMN NOE OH OH OMe 6’ 4’ 5’ HO HO 1’ O 4 3’ OH Gal Pareja de protones H-1’/H-2’ H-1’/H-3’ H-1’/H-4’ H-1’/H-5’ H-1’/H-3 H-1’/H-4 H-1’/H-5 H-1’/H-6R H-1’/H-6S EXP. MM3-1 500MHz 6.5 9.1 -2.3 10.0 3.5 12.7 -1.0 1.0 6.4 8.4 -1.8 10.9 0.2 17.0 -0.1 0.5 0.2 Acoplamientos 1 5 2 2’ Restricciones de desplazamiento Corr. cruzada O Enlaces de H 6 1 de ~1.8 a 4.5 Å OH Restricciones de distancia Glc Intensidad NOE ( % ) MM3-80 MM3-H2O MM3-80 MD 6.6 6.5 6.6 7.6 8.0 8.2 -1.7 -1.8 -1.7 11.2 10.8 10.9 0.0 -0.2 1.5 17.8 17.8 15.2 0.0 -0.1 -0.3 0.8 1.3 -0.4 1.9 -0.2 1.0 (proteinas) HN, Hα y Cα Correlacionados con estructura secundaria OH 3 O Desplazamientos Estructura localizada MM3-H2O MD 6.7 7.7 -1.8 11.0 AM1 1.1 12.9 9.2 10.7 -0.1 0.3 2.0 1.9 1.6 0.5 5.7 8.0 -1.5 8.0 csa,d 1.8 < dOH < 2.0 Å 1 - 3 enlaces Restricciones de ángulos O H ΓIM,IS d 2.7 < dON < 3.0 Å Restricciones de distancia Estructuras con largas distancias Residual dipolar couplings (RDC) Orientación de un fragmento “rigido” En relación al campo magnético Sin límite de distancia entre fragmentos I N Estructura localizada S M 2 - 3 enlaces Restricciones de ángulos Estructura con larga distancia Acoplamientos residuales dipolares (RDC) Acoplamientos dipolares Alineamiento al azar Cristal líquido Acoplamientos dipolares ∝ < 3 cos2 θ –1 1 > / < r3 > DMPC DHPC + Bicela B Bo 0 En RMN de líquidos se promedia a 0 Aunque se observa como NOE Bo θ O C r Típicos medios En sólidos estáticos causa desdoblamiento H Bicelas DMPC : DHPC OH OH En sólidos con MAS (Magic spinning angle) se promedia a 0 Bicelas CHAPSO:DMPC O O CPCl : Hexanol : Brine HO HO H O H O OH Reordenamiento isotrópico No RDC acoplamiento: J (escalar) OH Reorientación anisotrópica RDC desdoblamiento: J + D Fagos de bacterias Suspensión de V2O5 ….. …..