efecto de la vitrificacin sobre la viabilidad de ovocitos bovinos

BOLETÍN DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
VOLUMEN 43, NO. 2, 2009, PP. 197–210
UNIVERSIDAD DEL ZULIA, MARACAIBO, VENEZUELA
EFECTO DE LA VITRIFICACIÓN SOBRE LA VIABILIDAD
DE OVOCITOS BOVINOS MADURADOS IN VITRO
F RANCISCO J. BÁEZ-CONTRERAS , A MARÚ P IRELA -P IRELA ,
J ULIO A. LANDINEZ Y P ATRICIA V ILLAMEDIANA -MONREAL*
Laboratorio de Citogenética, UNIBIO, Departamento de Biología, Facultad
Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Apartado 526,
Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela
*patriciavillamediana@cantv.net
Resumen. El objetivo de este estudio fue comprobar el efecto de la
vitrificación ovocitaria empleando la técnica de pajuela estirada abierta
(OPS) y microgota (MG) sobre la progresión meiótica y supervivencia
morfológica, utilizando para esto último dos métodos de valoración, la
evaluación morfológica bajo microscopio estereoscópico y la tinción vital
con ioduro de propidio. Para ello se llevó a cabo la maduración in vitro
durante 24 h de cultivo de ovocitos obtenidos mediante la técnica de
“slicing” a partir de ovarios colectados en matadero. Los ovocitos
madurados fueron vitrificados. Se valoró la progresión meiótica y la
supervivencia tras el choque térmico. Fueron estudiados 341 ovocitos
madurados in vitro, de los cuales 246 ovocitos fueron vitrificados. La tasa
de maduración fue de un 61,46%, siendo similar en los tres grupos
experimentales. El porcentaje de ovocitos óptimos para continuar el
desarrollo tras la vitrificación en microgotas fue menor al observado en
ovocitos sin vitrificar (P < 0,05). La valoración de la supervivencia de
ovocitos sin vitrificar y de ovocitos vitrificados en microgota difirió
dependiendo de la técnica utilizada. Los resultados aquí presentados
indican que la valoración de la supervivencia tras el choque térmico bajo
microscopio estereoscópico no sustituye a la valoración objetiva que
pueda realizarse mediante una tinción vital. A pesar de que los ovocitos
madurados in vitro sobrellevan mejor la vitrificación en pajuelas estiradas
abiertas cuando se valora la supervivencia bajo microscopio
estereoscópico, el recomendar una u otra técnica de vitrificación seria
precipitado. Recibido: 29 septiembre 2008, aceptado: 11 mayo 2009.
Palabras clave. OPS, microgota, vitrificación, supervivencia, ovocitos,
bovinos.
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Báez-Contreras et al.
[Bol. Centro Invest. Biol.
EFFECT OF VITRIFICATION ON VIABILITY OF
IN VITRO MATURED BOVINE OOCYTES
Abstract. We evaluated the effect of oocyte vitrification by using the
open-pulled straw (OPS) and microdrop (MG) methods on meiotic
progression and oocyte survival. Meiotic progression and oocyte survival
were determined under stereoscopic microscopy and by vital staining with
propidium iodide. In vitro maturation was accomplished during 24 culture
hours, using oocytes obtained by the slicing technique, from ovaries
collected in a slaughterhouse. Matured oocytes were vitrified, and meiotic
progression and oocyte survival were evaluated after thermic shock. Of
341 in vitro matured oocytes evaluated, 246 were vitrified. Mean
maturation rate was 61.46%, and similar among the three experimental
groups. Percentage of optimum oocytes, that continued to develop after
vitrification in microdrops, was less than that observed in unvitrified
oocytes (P < 0.05). Survival of unvitrified oocytes and oocytes vitrified in
microdrops differed, depending on the technique used. Evaluation of
oocyte survival after thermic shock, under stereoscopic microscopy, does
not serve as a substitute for an objective evaluation made by using a vital
stain. Although in vitro matured oocytes did better under vitrification in
open-pulled straws, when measuring oocyte survival under stereoscopic
microscopy, it is still too soon to recommend one or the other vitrification
technique. Received: 29 September 2008, accepted: 11 May 2009.
Key words. OPS, microdrop, vitrification, survival, oocytes, bovine.
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas, la criopreservación de embriones y ovocitos ha
sido una herramienta útil para interrumpir y controlar el ciclo reproductivo de
especies de interés zootécnico, sometiéndolos a temperaturas bajas para
interrumpir su ciclo celular, manteniendo su viabilidad y funcionalidad (Fuku
et al. 1995). El mantenimiento de bancos de ovocitos permitiría acelerar el
mejoramiento genético e incrementar la disponibilidad de material para
investigación básica y aplicada a la biotecnología.
Una característica dominante de la criopreservación de ovocitos
mamíferos mediante los protocolos establecidos es la pérdida de competencia
para el desarrollo. La criopreservación causa un incremento significativo en la
tasa de degeneración durante el cultivo posterior (Lim et al. 1992). Se hacen
esfuerzos en el mejoramiento de la criopreservación de ovocitos concentrados
en incrementar la tasa de congelación para minimizar los daños causados por
las bajas temperaturas (Martino et al. 1996).
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Viabilidad de Ovocitos Bovinos
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Durante la criopreservación, los ovocitos experimentan condiciones
fisiológicas adversas. Estas condiciones severas provocan en los ovocitos
varias alteraciones citológicas, como ruptura de membranas, pérdida o
ganancia de cromosomas, falla en la extrusión del corpúsculo polar,
fragmentación del DNA, endurecimiento y fractura de la zona pelúcida.
Además de las anomalías citológicas la criopreservación puede ocasionar
también anomalías bioquímicas al ovocito como la deshidratación y pérdida de
función de proteínas (Men et al. 2003).
Los métodos de criopreservación se pueden clasificar según el tiempo de
congelación y descongelación, en criopreservación lenta, rápida o ultrarrápida
y vitrificación (Shaw et al. 2000), siendo la vitrificación la técnica más
práctica para la criopreservación de ovocitos bovinos (Kim et al. 2007). Se ha
tratado de mejorar la tasa de congelación durante la vitrificación ovocitaria
utilizando métodos que permitan el uso de mínimos volúmenes de soluciones
crioprotectoras lo que permite pasar rápidamente la zona crítica de temperatura
(+15 ºC a -15 ºC), considerada la zona de letalidad (Isachenko et al. 1998).
Entre tales métodos se encuentran el uso de gradillas de microscopia
electrónica (Martino et al. 1996), cryoloops (Mavrides y Morroll 2002,
Mavrides y Morroll 2005), mallas de nylon (Matsumoto et al. 2001) y pajuelas
abiertas estiradas (“open pulled straws”, OPS; Otoi et al. 1995, Hurtt et al.
2000, Men et al. 2003, Diez et al. 2005, Albarracín et al. 2005, Mucci et al.
2006). La inclusión directa de los ovocitos al nitrógeno líquido (método de la
microgota; MG) es la forma más simple de mejorar la tasa de congelación
(Kim et al. 2007).
La viabilidad de los ovocitos puede ser determinada basándose en un
examen visual de la integridad de las membranas ovocitarias, zona pelúcida y
normalidad del citoplasma inmediatamente después de ser descongelados. La
validez de la clasificación morfológica debe ser confirmada con tinciones
vitales como el ioduro de propidio. El objetivo del presente trabajo es
determinar el efecto que causa la vitrificación de ovocitos madurado in vitro y
el tipo de técnica utilizada para tal fin sobre la viabilidad ovocitaria.
MATERIALES Y MÉTODOS
OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE OVOCITOS
Se utilizaron ovarios de vacas mestizas, sacrificadas en mataderos
comerciales, que fueron transportados al laboratorio en solución buffer fosfato
salino (PBS) a una temperatura de 35–37 ºC en un recipiente isotérmico.
Posteriormente, fueron lavados en PBS + 50 mg/L de gentamicina a 35–37 ºC.
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Báez-Contreras et al.
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Los complejos cumulus-ovocito (COC´s) fueron recuperados mediante la
técnica de “slicing” (Suss y Madison 1983), que consiste en realizar cortes
sucesivos en la superficie del ovario, liberándose los COC´s de los folículos de
distintos tamaños. Fueron seleccionados bajo un microscopio estereoscópico
(Olympus SZX12, EUA) los COC´s que presentaron un mayor tamaño, un
citoplasma homogéneo y al menos una capa completa de células del cúmulus
compacta.
MADURACIÓN Y FECUNDACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS
Una vez seleccionados los COC’s se cultivaron en grupos de 12, en
microgotas de 50 µL cubiertas con aceite mineral (69794, Fluka) durante 24 h
a 38,5 ºC, en una atmósfera con 5% CO2 en aire saturado de humedad,
utilizando el medio de maduración TCM–199 (M7528, Sigma) suplementado
con 275 mg/L de piruvato sódico (815990, Fluka), 50 mg/L de gentamicina,
146 mg/L de L-glutamina (G-15120, Sigma), 10 µg/mL de Folltropin-V®
(Vetrepharm, Canadá Inc), 1 µg/mL de 17β-estradiol (E8875-25G, Sigma) y
10% suero fetal bovino (SFB, F-2442, Sigma) (Marquant et al. 1989). Los
ovocitos fueron fecundados en grupos de 16 en gotas de 100 µL de FIV-Talp
suplementado con 6 mg/mL de BSA, Sigma A6003). Para la selección de los
espermatozoides se utilizó semen congelado de toros de probada fertilidad.
Una vez descongeladas las pajuelas a 37°C por 30 segundos, se centrifugó a
800 g durante 15 min en un gradiente discontinuo de Percoll (P4937, sigma,
45%/90%) se descartó el sobrenadante y el pellet de espermatozoides fue
lavado con 3 mL de mDM suplementado con 6 mg/mL de BSA, fracción V
(Sigma A3059) y centrifugado a 300 g por 10 minutos. La concentración
espermática se valoró en una cámara de Newbauer para alcanzar una
concentración de 4 x 106 spz/mL en 100 µl de medio de fecundación Fert-Talp
junto con grupos de 30 COC´s por 24 h, en una atmósfera con 5% de CO2 y
aire saturado de humedad.
VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS MADUROS
Los COC´s con al menos una capa completa de células del cumulus y
citoplasma homogéneo fueron vitrificados siguiendo el protocolo propuesto
por Asada et al. (2002) con ciertas modificaciones. Los COC´s fueron
transferidos a una solución vitrificadora 1 (SV1), la cual consistió en 10% de
etilenglicol, 0,2 M de sacarosa, 10% de FBS en PBS, por 5 minutos.
Posteriormente fueron expuestos a la solución vitrificadora 2 (SV2): 40% de
etilenglicol, 0,6 M de sacarosa, 10% de FBS en PBS, por 1 min. para luego ser
cargados en OPS o sumergiéndolos directamente en nitrógeno líquido (N2L)
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Viabilidad de Ovocitos Bovinos
201
aplicando la técnica de MG. Después de un periodo de al menos siete días en
N2L la descongelación se realizó sumergiendo la punta de la pajuela de OPS y
la MG directamente en solución desvitrificadora (SDV 1: 0,5 M de sacarosa
en PBS y 20% de FBS) exponiendo los ovocitos por 5 min. a 39 ºC. y a la
solución desvitrificadora 2 (SDV2: 0,25 M de sacarosa en PBS y 20% de
FBS). Finalmente los ovocitos fueron lavados dos veces en medio TCM-199 +
10% de FBS antes de ser transferidos al medio de maduración, momento en el
cual se valoró la supervivencia morfológica.
Técnica de Vitrificación en Pajuela Estirada Abierta (OPS): Se utilizaron
pajuelas de 0,25 mL. Estas se colocaron en una plancha de calentamiento a 90
ºC, durante 30 segundos, para ablandar el plástico permitiendo estirar la
pajuela por ambos extremos de manera horizontal, logrando disminuir su
diámetro interno a la mitad del inicial. Posteriormente se cortaron en los
extremos más delgados y se esterilizaron con etanol al 70% y luz ultravioleta.
Se cargaron a la pajuela por capilaridad, 10 COC`s contenidos en 20 µL de
solución crioprotectora (Hurtt et al. 2000).
Técnica de Vitrificación en Microgota (MG): Se utilizó la técnica descrita
por Kim et al. (2007), con algunas modificaciones, se dejó caer en N2L 20 µL
de solución vitrificadora, la cual contenía 10 COC’s madurados in vitro. Este
volumen al congelarse forma un esfera que inmediatamente se colocó en un
tubo criogénico de 20 µL y se almacenó sumergido en N2L.
EVALUACIÓN DE LA PROGRESIÓN MEIÓTICA
Los ovocitos fueron despojados de las células del cúmulus mediante
agitación mecánica y fijados en una mezcla de metanol-ácido acético en
proporción 3:1 durante al menos 24 h a 4 ºC y se tiñeron con aceto-orceína al
1,1%. Luego se evaluó la maduración nuclear en un microscopio de contraste
de fases (Olympus CX31, EUA; 400X), clasificándolos según el estadio
meiótico alcanzado en: maduros (MII o Telo I) o inmaduros (anafase I,
metafase I, condensación cromosómica y VG). Aquellos ovocitos que no
pudieron ser incluidos en ninguno de los grupos anteriormente nombrados
fueron clasificados como degenerados.
EVALUACIÓN DE LA SUPERVIVENCIA OVOCITARIA
La supervivencia ovocitaria, se determinó sobre la integridad de la
membrana, zona pelúcida y citoplasma después de la desvitrificación. Esta
clasificación morfológica se validó a través del microscopio estereoscópico, y
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se confirmó a través de una tinción vital con ioduro de propidio a una
concentración de 0,2 mg/mL en PBS (Men et al. 2003). Los ovocitos fueron
examinados en microscopio de fluorescencia con un filtro de 610 nm para
captar la emisión del ioduro de propidio, considerándose como viables los que
no pudieron ser penetrados por el ioduro de propidio.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las diferencias en las de tasa de progresión meiótica y supervivencia de
los ovocitos bovinos entre los diferentes grupos experimentales fueron
analizadas por medio de las pruebas de χ2 bajo la aplicación del paquete
estadístico SAS (2001), y se consideraron diferencias significativas aquellas
P < 0,05.
RESULTADOS
Se valoró un total de 341 ovocitos, 246 de los cuales fueron vitrificados
luego de ser madurados in vitro. En la Tabla 1 se presentan los datos referentes
a la progresión meiótica. El porcentaje de ovocitos inmaduros no difirió entre
los tres grupos experimentales (Cx: 15,46%; OPS: 21,62%; MG: 23,8%),
como tampoco resultaron diferentes los porcentajes de ovocitos degenerados
(Cx: 10,3%; OPS: 22,97%; MG: 7,69%), resultando por tanto tasas de
maduración similares: Cx 74,22%, OPS 54,76%, MG 55,4%.
Tabla 1. Progresión meiótica de ovocitos bovinos vitrificados.
Variable
Número Total de Ovocitos
Número de Ovocitos Madurados
MII + CP
Telo I
Total Ovocitos Madurados (%)
Número de Ovocitos Inmaduros
Ana I
MI
CCII
VG
Total Ovocitos Inmaduros (%)
Número Ovocitos Degenerados
Cx
97
Tratamiento
MG
84
OPS
74
55
17
72(74,22)
38
8
46(54,76)
32
9
41(55,40)
1
9
2
3
15(15,46)
10(10,30)
2
18
0
0
20(23,80)
18(21,42)
1
15
0
0
16(21,62)
17(22,97)
MG = microgota, OPS = “open pulled straw”, MII + CP = Metafase II +
Corpúsculo, TeloI = Telofase I, AnaI = Anafase I, MI = Metafase I, CCII =
Condensación cromosómica II y VG = Vesícula Germinal.
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Viabilidad de Ovocitos Bovinos
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En la Tabla 2 se presentan las tasas de supervivencia luego de la
vitrificación ovocitaria, analizadas bajo microscopio estereoscópico y su
corroboración mediante la tinción con ioduro de propidio. Al realizar la
valoración morfológica rutinaria bajo microscopio estereoscópico, la tasa de
ovocitos degenerados en el grupo control no resultó ser estadísticamente
diferente de la observada en el grupo de ovocitos vitrificados mediante la
técnica de OPS (3,15 vs. 7,14%, respectivamente). Sí se observó una
diferencia estadísticamente significativa en relación al porcentaje de ovocitos
degenerados evaluados con la técnica de MG (3,15 vs. 20,75%). Entre los
grupos de ovocitos vitrificados la tasa de degeneración fue estadísticamente
diferente (OPS: 7,14 vs. MG: 20,75%).
Tabla 2. Supervivencia morfológica de ovocitos bovinos vitrificados.
Total de Ovocitos Valoración
Cx
95
Vitrificados
(OPS)
140
Vitrificados
(MG)
106
Óptica
I.P
Óptica
I.P
Óptica
I.P
Ovocitos
óptimos (%)
92 (96,84)
88 (92,63)
130 (92,85)
111 (79,28)
84 (79,24)
87 (82,07)
Ovocitos
degenerados (%)
3 (3,15)a
7 (7,36)A
10 (7,14)a
29 (20,71)B
22 (20,75)b
19 (17,92)B
a, b, A, B
(%)
: Valores en la misma columna con diferentes superíndices difieren
significativamente (P < 0,05); IP = Ioduro de propidio.
En relación a la tasa de supervivencia ovocitaria valorada utilizando la
tinción con ioduro de propidio, si se observaron diferencias estadísticamente
significativas entre los ovocitos vitrificados y los ovocitos control. El
porcentaje de ovocitos degenerados valorados mediante esta tinción resultó ser
similar entre los grupos de ovocitos vitrificados (Cx 7,36%; OPS 20,71%; MG
17,92%).
El porcentaje de ovocitos óptimos para continuar el desarrollo luego de la
vitrificación valorados mediante microscopía estereoscópica y de
fluorescencia no difiere en el grupo de ovocitos vitrificados mediante la
técnica OPS (92,85 vs. 79,24%), pero si se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre dichos valores para el grupo control y el
grupo de ovocitos vitrificados mediante la técnica de MG (Cx: 96,84 vs.
95,85%; MG: 79,24 vs. 82,07%).
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DISCUSION
Con el propósito de superar los efectos de los diversos pasos involucrados
en los protocolos de congelación-descongelación sobre la estructura del
ovocito (Rodríguez et al. 2004), se ha planteado la vitrificación como uno de
los métodos más prometedores para solucionar los problemas que conlleva el
criopreservar este tipo de célula (Massip 2003). La vitrificación ha permitido
aumentar la velocidad de los cambios de temperatura, lo que ofrece ciertas
ventajas para la congelación, como lo son la disminución de la concentración
de los crioprotectores y además el paso más rápido por la zona de temperatura
crítica, lo que produce menos daños por enfriamiento (Silva y Berland 2004).
Sin embargo, los ovocitos mamíferos siguen siendo una de las células más
difíciles de criopreservar (Diez et al. 2005). Aun así, en la actualidad, se han
vitrificado ovocitos de varias especies animales: rata (Chen et al. 2004), cerda
(Men et al. 2005), búfala (Wani et al. 2004), yegua (Maclellan et al. 2002),
cabra (Beging et al. 2003), oveja (Al-Aghbari y Menino 2002, Dattena et al.
2004), vaca (Rodríguez 2004, Diez et al. 2005, Albarracín et al. 2005) y
humano (Boiso y Martí 1997, Chen et al. 2004).
Se sabe que el estadio de metafase II (MII) es el óptimo al evaluar el
proceso de maduración ovocitaria in vitro. Este se da por completado cuando
se observa el mayor porcentaje de ovocitos en MII. En el presente trabajo, la
maduración del ovocito se evaluó a través de la tinción in toto evaluando los
ovocitos en estadio de Telofase I y la presencia del corpúsculo polar
correspondiente a ovocitos en MII. El grupo control (ovocitos frescos),
presentó una tasa de maduración de 74,22%, similar a la alcanzada por los
ovocitos vitrificados OPS y MG. En 2005, Park et al., obtuvieron un 52,75%
de aquellos ovocitos que lograron alcanzar el estadío de MII después de
rasuración in vitro (MIV); Warzych et al. (2007), obtuvieron un porcentaje de
68,7%. Kim et al. (2007) encontraron un porcentaje de 71,2% y Báez et al.
(2008) obtuvieron una tasa de 61,36%, pudiéndose observar que estos valores
son similares a los obtenidos en el presente estudio.
Coincidiendo con los resultados de este estudio, Rodríguez et al. (2004),
estudiando la influencia del estadio de maduración de ovocitos bovinos
durante el proceso de congelación, obtuvieron tasas de maduración en el grupo
control y el de vitrificados luego de ser madurados in vitro similares (52,75%
y 39,61%, respectivamente; P < 0,01). Al igual que los resultados obtenidos
por Báez et al. (2008), mostrando un 61,36% y 52,85%, para el grupo control
y vitrificados MIV, respectivamente.
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Viabilidad de Ovocitos Bovinos
205
A pesar de los numerosos reportes y de resultados exitosos (Hochi et al.
1998), la efectividad de los métodos de vitrificación entre los que se incluyen
el uso de pajuelas, no ha llegado a alcanzar un nivel satisfactorio (Ambrosini
et al. 2006). Los ovocitos sufren daños morfológicos y funcionales durante la
vitrificación. El grado de daño depende de factores en los que se incluyen el
tamaño, forma y contenido lipídico de la célula, la permeabilidad de la
membrana y la calidad y sensibilidad del ovocito. De todos estos, quizás el de
mayor impacto es la especie donadora, estadio de desarrollo y origen (Vajta y
Kuwayama 2006). Si bien el objetivo de la vitrificación es minimizar el daño
que ocasiona el proceso de criopreservación y permitir a la célula a continuar
con su potencial de desarrollo, es conveniente revisar las técnicas de
evaluación de supervivencia, en especial la de ovocitos.
Se sabe que la supervivencia del ovocito bovino difiere de acuerdo a la
duración de exposición del ovocito al crioprotector, la concentración y la
forma de remover el mismo (Fabbri et al. 2000). Normalmente una vez que los
ovocitos son desvitrificados y equilibrados, son evaluados bajo microscopio
estereoscópico considerándose que han sobrevivido al proceso de vitrificación
aquellos que no presentan lisis celular, con una membrana celular intacta y
citoplasma homogéneo. Los ovocitos que no son incluidos en la descripción
anterior son clasificados como degenerados (Otoi et al. 1995). Men et al.
(2003) y Bogliolo et al. (2007) sugieren que una forma más objetiva de
evaluar la viabilidad ovocitaria después de la vitrificación, debe ser
determinada sobre la integridad de la membrana, zona pelúcida y citoplasma, a
través de una tinción vital con ioduro de propidio.
Al realizar la evaluación de la supervivencia morfológica bajo
microscopio estereoscópico, el método de vitrificación OPS no causó una
degeneración mayor a la observada tras la maduración in vitro. No así el
método de la microgota que mostró una tasa mayor de degeneración que la del
grupo control, pero similar a la observada en los ovocitos vitrificados en
pajuelas estiradas abiertas.
Al corroborar la valoración de la supervivencia ovocitaria mediante la
tinción vital con ioduro de propidio, se observa claramente que el choque
térmico la afecta negativamente, indistintamente del método de vitrificación
empleado.
En el presente estudio, la tasa de supervivencia de los ovocitos
vitrificados en OPS, independientemente del método utilizado para su
valoración, fue similar a la obtenida por Men et al. (2003) en la que emplea la
206
Báez-Contreras et al.
[Bol. Centro Invest. Biol.
misma técnica, contrario a las tasas obtenidas en la técnica de MG. Al
comparar la tasa de supervivencia ovocitaria luego de la maduración in vitro
no se observan diferencias en virtud de la técnica utilizada para su valoración.
Tampoco se observan diferencias en el porcentaje de ovocitos óptimos luego
de la vitrificación en microgotas. Cuando los ovocitos fueron vitrificados en
pajuelas estiradas abiertas, la tasa de supervivencia luego del choque térmico
difirió dependiendo de la técnica de valoración utilizada, siendo mayor la
proporción de ovocitos clasificados como degenerados bajo microscopio
estereoscópico que cuando se utilizó la tinción vital con ioduro de propidio.
En cualquier discusión acerca de la evaluación de la supervivencia del
ovocito, se debe enfatizar que la normalidad no puede ser confirmada por
medio de una evaluación morfológica. Son varios los autores que emplean la
tinción con ioduro de propidio para valorar los efectos de la vitrificación en
embriones bovinos (Mucci et al. 2006, Cesari et al. 2006, Lim et al. 2007),
siendo pocas veces implementada en ovocitos.
La valoración de la supervivencia ovocitaria bajo microscopio
estereoscópico resulta ser una metodología bastante sencilla y muy fácil de
incluir en la rutina del laboratorio. La tinción vital con ioduro de propidio
ofrece una evaluación de la supervivencia más objetiva, pero se requiere tener
a disposición la microscopia de fluorescencia, aparte de que involucra la
pérdida de una muestra de ovocitos.
Basados en la valoración morfológica de la supervivencia, los ovocitos
madurados in vitro sobrellevan mejor la vitrificación en pajuelas estiradas
abiertas que en microgotas. Luego de la tinción vital estas diferencias
desaparecen, por lo que recomendar una u otra técnica resultaría precipitado.
Men et al. (2002), vitrificaron ovocitos bovinos madurados in vitro usando
OPS, obteniendo una tasa de supervivencia de 88,41%. En el estudio realizado
por Luna et al. (2001), también obtuvieron tasas de supervivencia morfológica
similares en ovocitos bovinos vitrificados por OPS a las 0 y 22 h de MIV
(71,8–72,6%, respectivamente). Entre un 70–97,5% fueron las tasas encontradas por Hou et al. (2005), en las que vitrificaron ovocitos bovinos MIV con
OPS. Por otro lado, Mavrides y Morroll (2002) vitrificaron ovocitos de la
misma especie empleando cryoloop, encontrando una tasa de supervivencia de
90,5%. Recientemente, Kim et al. (2007) evaluaron el efecto de la vitrificación
con el método de MG sobre el potencial de maduración de ovocitos bovinos
encontrando tasas de supervivencia entre 60,9–84,0%.
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Viabilidad de Ovocitos Bovinos
207
El desarrollo de nuevas estrategias para reducir de diversas maneras el
stress asociado con la criopreservación es fundamental para lograr una mejor
comprensión de los principales cambios responsables de las bajas tasas de
supervivencia tras la descongelación. Con estos conocimientos, se espera que
el crioalmacenamiento de ovocitos llegue a ser una técnica reproductiva
totalmente confiable en el futuro cercano. Es claro que no hay una necesidad
urgente de implementar la congelación de ovocitos entre las tecnologías de
reproducción asistida que se utilizan en la actualidad. Siempre está la poderosa
metodología de la congelación de embriones como alternativa confiable. No se
trata de transformar la congelación ovocitaria en un sustituto de la congelación
de embriones, pero si de darle su destino propio. Hay áreas específicas en las
que la congelación ovocitaria puede ser válida. En producción animal clásica,
los productores pudieran preservar líneas femeninas de alto valor genético,
comercializar ovocitos más que embriones en los que el padre ya ha sido
escogido. En especies en peligro de extinción se podría conservar el material
genético femenino de esos animales vulnerables. En la producción y
mantenimiento de líneas de animales transgénicos, cuyas capacidades
reproductivas son pobres y más aun tomando en cuenta que la producción de
estas líneas es un proceso lento y costoso. Cuando esté completamente
optimizada, la criopreservación ovocitaria tendrá múltiples aplicaciones.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento al Consejo de Desarrollo
Científico y Humanístico (CONDES) de la Universidad del Zulia por el
financiamiento otorgado para la realización de este trabajo (CC-1187-06).
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