Iniciación y señalización celular en el sarcoma de Ewing ENRIQUE DE ALAVA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA-CSIC Spain Ewing/pPNET (now) Ewing sarcoma/PNET (WHO classification) Ewing’s sarcoma of bone Bone PNET Askin Peripheral neuroepithelioma Paraverterbral SRCT Ewing extraeskeletal Rabdomyosarcoma Neuroblastoma Neural differentiation Ewing and pPNET share… • Variable degree of neural differentiation • CD99 expression • Same chromosomal translocations (1983) EWS-NT-D 1 2 3 4 5 6 ETS-D 7 NH2 COOH Transactivation DNA Binding EWS-ETS Variability of Gene Structure in Fusion Transcripts Different Translocation Partners NTD-EWS 1 NH 2 3 4 5 6 7 ETS-D COOH 2 DNA Binding NTD-EWS 1 NH 2 3 4 5 EWS-FLI-1 6 7 ETS-D EWS-ERG 2 DNA Binding Same Translocation Partners, but different genomic breakpoints (different exon distribution) NTD-EWS 1 7-9 NH 2 3 4 5 6 7 ETS-D COOH 2 DNA Binding NTD-EWS 1 9-4 NH 2 3 4 5 6 7 8 9 ETS-D COOH 2 DNA Binding Molecular pathology of soft tissue tumors STT with specific reciprocal translocations (and gene fusions), and relatively simple karyotypes STT with complex and nonbalanced karyotypes, without specific translocations •Approx 1/3 of STT •Approx 2/3 of STT •About 15 different types of STT, and 30 described translocations •Genetic instability, telomeric disfunction •Gene fusions: chimerical proteins expressed in all cells throughout clinical course •Transcription factors OR •Altered kinases GOOD DIAGNOSTIC MARKERS NO DIAGNOSTIC MARKERS Chimeric transcription factors (i.e. EWS-ETS) Target cell 1 2 3 4 5 EWS-NT-D NH22 NH 6 7 ETS-D COOH Pheno -type Vías de señalización en el Sarcoma de Ewing La importancia del contexto celular Ewing sarcoma histogenesis shRNA EWS-FLI1 Ewing sarcoma silenced cells show features of hMSCs (CD44+, CD54+, CD59+ y CD73+) + EWS-FLI1 Less committed to a chondrogenic lineage MPCEWS-FLI1-T1 MPCEWS-FLI1-T2 Adipocyte (Oil-Red) Osteoblast (Von-Kossa) EWS-FLI1 expression induces tumorigenicity In mice mesenchymal progenitor cells References: 1.- Development of Ewing´s Sarcoma from Primary Bone Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells.(Riggi et al., 2005; Cancer Res) 2.- Mesenchymal Stem Cell Features of Ewing Tumors. (Tirode et al., 2007; Cancer Cell) The expression profile of hMSCEWS-FLI-1 closely mimics that of ESFT but not of other bone and soft tissue tumors. Transformed cells are not tumorigenic in vivo. Additional genetic events are required The expression profile of hMSCEWS-FLI-1 closely mimics that of ESFT but not of other bone and soft tissue tumors. Transformed cells are not tumorigenic in vivo. Additional genetic events are required Objetivos 2008-2009 • Interferencia estable EWS-FLI1 • Eventos previos a la translocación • Cambios en la señalización inmediatamente tras la transfección de EWS-FLI1 • Factores predictivos de respuesta a terapias anti IGF1R Objetivos 2008-2009 • Interferencia estable EWS-FLI1 • Eventos previos a la translocación • Cambios en la señalización inmediatamente tras la transfección de EWS-FLI1 • Factores predictivos de respuesta a terapias anti IGF1R Diseño de un sistema de ARN de interferencia estable. Cuatro líneas celulares de tumor de Ewing: A673,TC71 (7-6), SK-ES-1 (75) y A4573 (10-6). Diseño en torno al punto de unión. Plásmido pSUPER neo.gfp (Oligoengine): promotor RNA polimerasa III. EWS 793 656 FLI1 ADNc GCTACGGGCAGCAGA ACCCTTCTTATGA.. CAGAGCAGCAGCTACGGGCAGCAGA ACC GGGCAGCAGA ACCCTTCTT 7-6 (sentido) 7-6M (sentido) ARN de interferencia redujo los niveles de EWS-FLI1 Early stage EWS-FLI1 FLI1 Actin MM1S NB TC71wt 3 4 5 6 M2 Mock 6 M2 Late stage EWS-FLI1 Actin NB TC71wt Mock 3 4 5 Early stage TC71wt shRNAi Late stage Mock NB TC71wt shRNAi Mock EWS Relative expression value Actin EWS-FLI1 mRNA expression level * TC71 wt early TC71 wt late shRNAi early * shRNAi late Mock early Mock late Herrero et al., 2008 (under reviewing) La interferencia de EWS-FLI1 provoca un notable aumento en la actividad apoptótica Índice Apoptótico Estadío Temprano Número de células 120 100 Necrosis 80 Apoptosis Tardía 60 Apoptosis Inicial 40 Vivas 20 0 shARNi clon pS TC71wt Índice Apoptótico Estadío Tardío Número de Células 120,00 100,00 Necrosis 80,00 Apoptosis Tardía 60,00 Apoptosis Inicial 40,00 Vivas 20,00 0,00 shARNi clon pS TC71 wt Herrero et al., 2008 (under reviewing) Activación de caspasa 9 / PARP en el clon interferido Herrero et al., 2008 (under reviewing) La inhibición de EWS-FLI1 reduce la capacidad migratoria Valor de absorbancia relativa Índice de Migración Estadío Temprano 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 shARNi clon pS TC71wt Valor de absorbancia relativa Índice de Migración Estadío Tardío 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Herrero et al., 2008 (under reviewing) 0,2 0 shARNi clon pS TC71wt El clon shARNi posee una menor capacidad de crecimiento independiente de anclaje. Capacidad de Transformación Oncogénica Número de colonias por pocillo Ensayo de tumorigenicidad 1200,00 1000,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00 shARNi clon estadío temprano shARNi estadío tardío pS estadío temprano pS estadío tardío Herrero et al., 2008 (under reviewing) Correlación de los efectos con el grado de interferencia de EWS-FLI1. Valor de absorbancia relativa Índice de proliferación (MTT) 100% 80% Índice Apoptótico (Annexina V/FACS) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Necrosis 0,2 60% Apoptosis Tardía/Necrosis 0 TC71wt pS clon 1 (Mock) shARNi clon 5 shARNi clon M2 Apoptosis 40% temprana Vivas 20% 0% TC71 wt Ciclo Celular (FACS) pS clon1 sh ARNi clon shARNi clon (Mock) 5 M2 120% Número de células Número de células 120% 1,4 100% G2/M 80% S 60% G0/G1 40% A 20% 0% TC71wt pS clon1 (Mock) shARNi clon 5 shARNi clon M2 Herrero et al., 2008 (under reviewing) ARN de interferencia redujo el crecimiento tumoral in vivo Herrero et al., 2008 (under reviewing) Análisis de la vía de señalización de IGF-1/IGF-1R. Reducción en los niveles de IGF-1 en el clon shARNi mientras que los de su receptor no varían. Valor de expresión relativa IGF1 ARNm nivel de expresión 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 TC71 wt estadío temprano TC71 wt estadío tardío shARNi clon estadío temprano shRNAi clon estadío tardío pS estadío temprano pS estadío tardío Herrero et al., 2008 (under reviewing) Los niveles de fosforilación de AKT y MAPK42/44 están reducidos. El clon shARNi es más sensible a la acción de los inhibidores de la vía de IGF-1/IGF-1R. Herrero et al., 2008 (under reviewing) Las células del clon shARNi son capaces de responder a la acción de los inhibidores de IGF-1/IGF-1R incrementado aún más sus niveles de apoptosis. No se produce variación en los niveles de IGFBP3 Herrero et al., 2008 (under reviewing) TOPK es una diana directa de EWS-FLI1 EWS/FLI1 and some ETS family members as wild-type FLI1 require a 9 bp consensus sequence harboring a GGAA "core". A 9 bp sequence ,GAAGGAAGT, was found in the TOPK intron 1 that showed limited similarity to the high-affinity ETS binding consensus (ACCGGAAGT) Herrero et al., 2008 (under reviewing) Análisis de la expresión génica del clon shARNi. Búsqueda de nuevas dianas putativas de EWS-FLI1. Induced genes Probe set Gene symbol Gene name Map location Magnitude of Association 215706_x_at ZYX Zyxin 7q32 9,94 208211_s_at ALK anaplastic lymphoma kinase (Ki-1) 2p23 7,98 205467_at CASP10 Caspase 10, apoptosis-related cysteine protease 2q33-q34 6,88 203984_s_at CASP9 Caspase 9, apoptosis-related cysteine protease 1p36.3-p36.1 6,88 208796_s_at CCNG1 Cyclin G1 5q32-q34 10,47 202770_s_at CCNG2 Cyclin G2 4q21.22 8,36 216894_x_at CDKN1C cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (p57, Kip2) 11p15.5 33,16 204249_s_at LMO2 LIM domain only 2 (rhombotin-like 1) 11p13 9,43 55065_at MARK4 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4 19q13.3 11,16 200714_x_at OS-9 Amplified in osteosarcoma 12q13 9,26 221523_s_at RRAGD Ras-related GTP binding D 6q15-q16 7,4 1729_at TRADD TNFRSF1A-associated via death domain 16q22 7,33 204121_at GADD45G Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma 9q22.1-q22.2 7,82 Herrero et al., 2008 (under reviewing) Análisis de la expresión génica del clon shARNi. Búsqueda de nuevas dianas putativas de EWS-FLI1. Repressed genes Probe set Gene symbol Gene name 219148_at TOPK T-LAK cell-originated protein kinase 204971_at CSTA cystatin A (stefin A) 201017_at EIF1A 204409_s_at Map location Magnitude of association 8p21.2 -6,78 3q21 -7,26 Eukaryotic translation initiation factor 1A Xp22.13 -8,11 EIF1AY eukaryotic translation initiation factor 1A, Ylinked Yq11.222 -11,32 201435_s_at EIF4E Eukaryotic translation initiation factor 4E 4q21-q25 -6,51 205110_s_at FGF13 Fibroblast growth factor 13 Xq26.3 -15,12 214412_at H2AFB H2A histone family, member B Xq28 -10,91 207826_s_at ID3 inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein 1p36.13-p36.12 -7,17 207121_s_at MAPK6 Mitogen-activated protein kinase 6 15q21 -6,94 214321_at NOV Nephroblastoma overexpressed gene 8q24.1 -19,87 208690_s_at PDLIM1 PDZ and LIM domain 1 (elfin) 10q22-q26.3 -8,39 213791_at PENK proenkephalin 8q23-q24 -10,79 218009_s_at PRC1 Protein regulator of cytokinesis 1 15q26.1 -6,78 205880_at PRKCM Protein kinase C, mu 14q11 -8,32 206039_at RAB33A RAB33A, member RAS oncogene family Xq26.1 -9,81 209371_s_at SH3BP2 SH3-domain binding protein 2 4p16.3 -6,62 40420_at STK10 Serine/threonine kinase 10 5q35.1 -11,45 202338_at TK1 Thymidine kinase 1, soluble 17q23.2-q25.3 -6,79 Herrero et al., 2008 (under reviewing) Validación del clon interferido: análisis de la expresión de dianas descritas de EWS-FLI1 Los niveles de p57 aumentan al inhibir EWS-FLI1. Valor de expresión relativa CDKN1C/p57/Kip2 ARNm nivel de expresión 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 TC71 wt estadío temprano TC71 wt estadío tardío shARNi clon estadío temprano shARNi clon estadío tardío pS estadio temprano pS estadío tardío Herrero et al., 2008 (under reviewing) Validación del clon interferido: análisis de la expresión de dianas descritas de EWS-FLI1 Los nivels de DAX1/NR0B1 y NKX2.2 se reducen al inhibir EWS-FLI1 TC71wt pS shARNi clon Herrero et al., 2008 (under reviewing) Objetivos 2008-2009 • Interferencia estable EWS-FLI1 • Eventos previos a la translocación • Cambios en la señalización inmediatamente tras la transfección de EWS-FLI1 • Factores predictivos de respuesta a terapias anti IGF1R Plasticity of adult mesenchymal stem cells of the bone marrow Caracterización de las células madre mesenquimales humanas (hMSC). Las células mesenquimales muestran los marcadores de superficie característicos de las hMSC. Las células son capaces de diferenciarse en los 3 linajes celulares Las hMSC de pacientes de Sarcoma de Ewing carecen de la fusión EWS-FLI1. Sonda de fusión D=donante sano P1=paciente de sarcoma de Ewing; origen húmero P2= paciente de sarcoma de Ewing; origen intramuscular a nivel de escápula Osuna D et al., unpublished results Tumor initiation. hMSCs from bone marrow iliac crest of ES patients do not express ES markers Osuna D et al., unpublished results Affymetrix Human Arrays 1.0 ST ® - 3 donantes sanos vs. 3 pacientes Caracterización de genes candidatos está en progreso Análisis proteómico donantes vs. pacientes 9 9 8 8 37 3808(a) 380(b) 72 28 79 37 340 62 340 193 1129 193 1129 65 72 28 62 340 68 68 37 380(a) 380(b) 72 28 62 68 8 79 79 380(a) 380(b) 9 82 82 82 193 1129 65 65 N1 N2 53 29 77 N1 N2 N1 N2 84 106 77 53 77 84 53 84 ? ? 60 60 60 235 235 235 81 81 81 61 61 61 DONOR-3 Donante 2 DONOR-1 9 9 8 9 8 79 79 79 380(a) 380(b) 380(a) 37 380(b) 37 72 28 380(a) 380(b) 72 28 62 340 68 193 68 65 N2 N1 29 77 72 62 193 1129 65 N2 53 84 28 340 193 1129 1129 65 37 62 340 68 8 82 82 82 77 Donante 3 DONOR-2 Donante 1 29 N1 84 106 53 N2 77 106 53 N1 ???? 60 60 60 235 235 235 81 81 81 61 61 61 Paciente 1 PATIENT-1 COLOUR CODE: •RED : OVEREXPRESION •ORANGE: SLIGHTLY OVEREXPRESION Paciente 2 PATIENT-2 •BLUE: UNDEREXPRESION •BLUE: SLIGHTLY UNDEREXPRESION Paciente 3 PATIENT-3 Objetivos 2008-2009 • Interferencia estable EWS-FLI1 • Eventos previos a la translocación • Cambios en la señalización inmediatamente tras la transfección de EWS-FLI1 • Factores predictivos de respuesta a terapias anti IGF1R Clonación de la fusión EWS-FLI1 tipo I en pTet-Off combi EWS-FLI1 tipo I PCR en dos etapas NheI ClaI V5 Epitope Tag Inducción de la fusión EWS-FLI1 tipo I en hMSCs Patient 2 P2 Paciente 2 Patient 3 P3 Paciente 3 Análisis proteómico de las hMSC inducidas con EWS-FLI1. Análisis proteómico de las hMSC inducidas con EWS-FLI1. Eventos adicionales en la génesis del Sarcoma de Ewing. Objetivos 2008-2009 • Interferencia estable EWS-FLI1 • Eventos previos a la translocación • Cambios en la señalización inmediatamente tras la transfección de EWS-FLI1 • Factores predictivos de respuesta a terapias anti IGF1R from KIT to IGF1R C-KIT Imatinib PI3K STAT5 STAP1 IGF1R IGF1 SCF 742 AD W IRS RAS RAF AKT MEK1/2 BAD VCR Apoptosis DXR mTOR Síntesis proteica ERK proliferación Martins AS Figure 1 A) 5 4 5 Response to stress in ES cell lines treated with anti-IGF1R agents 3 2 1 5 B) cellular functions changed 17% stress response/chaperoning 21% cell proliferation apoptosis 4% transcription 4% cellular adhesion/motility 4% redox regulation 17% mithocondrial respiration 11% cell cycle others 11% 11% HSP90 C) * 180 * * 140 * * * 120 % signal A673 TC-71 SK-ES-1 A4573 TTC466 HSP90 expression 160 100 * * 80 * * 40 * * 60 * ** ** * * 20 0 control ADW IMA 24 hours treatment A+I control ADW IMA A+I 72 hours treatment Martins AS et al, Canc Res 2008, patent application Martins AS Figure 2 A) 17-AAG µM 24h 72h 1.33 0.57 +/- 0.17 +/- 0.05 1.12 0.49 +/- 0.08 +/- 0.06 1.01 0.42 +/- 0.08 +/- 0.04 1.24 0.45 +/- 0.11 +/- 0.04 1.62 0.72 +/- 0.1 +/- 0.06 Cell lines A673 TC-71 SK-ES-1 A4573 TTC466 ADW742* µM 24h 72h 5.2 1.41 +/- 0.67 +/- 0.28 5.03 0.67 +/- 0.74 +/- 0.08 5.11 0.55 +/- 0.71 +/- 0.05 4.30 0.64 +/- 0.63 +/- 0.06 5.1 1.20 +/- 0.43 +/- 0.30 Imatinib* µM 24h 72h 18.36 18.77 +/- 0.80 +/- 4.02 17.45 22.00 +/- 0.79 +/- 3.20 14.32 18.90 +/- 0.90 +/- 3.60 15.08 20.12 +/- 1.11 +/- 2.21 17.8 19.20 +/- 1.2 +/- 2.10 HSP90 inhibitor 17-AAG inhibited ES cell line proliferation and survival in a dose-dependent manner. 14 * previously published AV PI PI PI PI B) AV control AV AV 10uM Imatinib 0,25uM ADW742 PI PI 0,1uM 17-AAG AV AV 0,1AAG+0,25ADW 0,1AAG+10IMA C) Alive 120% A/N 100% A673 %cells 80% 60% 40% 20% IMA ADW 0,25AAG+0,1A 0,25AAG+0,25A 0,25AAG+0,5A 0,25AAG+5I 0,25AAG+10I 0,25AAG+15I 5IMA 10IMA 15IMA ADW 0,1AAG+0,1A 0,1AAG+0,25A 0,1AAG+0,5A 0,1AAG+5I 0,1AAG+10I 0,1AAG+15I 0,1ADW 0,25ADW 0,5ADW CONTROL 0,1AAG 0,25AAG 0% IMA IMA ADW AAG 17-AAG Alive 120% A/N 100% 60% 40% 20% ADW AAG IMA ADW 0,25AAG+15I 0,25AAG+5I 0,25AAG+10I 0,25AAG+0,5A 0,25AAG+0,1A 0,25AAG+0,25A 0,1AAG+15I 0,1AAG+5I 0,1AAG+10I 0,1AAG+0,5A 0,1AAG+0,1A 5IMA 15 IMA IMA 0,1AAG+0,25A ADW 10IMA 0,5ADW 0,25ADW 0,1ADW 0,25AAG 0,1AAG 0% CONTROL %cells A4573 80% IMA 17-AAG HSP90 stress-response development is a specific mechanism of resistance to IGF1R treatment in ES. Martins AS Figure 4 A) A673 - TTC466 + - + - + - + HSP90 GAPDH B) TTC466 A673 17-AAG or HSP90siRNA treatment effetcs on A673 proliferation no treatment siRNAHSP90 100 pro liferation (% ) 125 ** * * * * 50 * * ** ** 25 0,1 0,25 0,5 5 10 siRNAHSP90 17-AAG 75 * * 50 * * * ** * 25 0 15 control 0,1 0,25 0,5 IMA ADW siRNA technology for HSP90 in cell lines resistant to anti IGF1R * ** * 0 control siRNAneg.control 100 17-AAG 75 no treatment 17-AAG or HSP90siRNA treatment effects on TTC466 proliferation siRNAneg. Control proliferation (% ) 125 5 10 15 IMA ADW C) A4573 transfection 0h 24h SK-ES-1 48h 96h 0h 24h TC-71 48h 96h 0h 24h 48h 96h HSP90 GAPDH D) * HSP90 overexpression effetcs on A4573 proliferation * p roliferatio n (% ) 100 * no treatment HSP90clon mock * * * * 75 50 125 0 0 0,25 0,5 ADW 5 10 15 IMA no treatment HSP90clon mock * 50 25 0,1 HSP90 overexpression effetcs on T C71 proliferation * * 75 25 control * 100 pro liferation (% ) 125 control 0,1 0,25 0,5 ADW 5 10 15 IMA HSP90 over-expression in ES cell lines sensitive to anti IGF1R Martins AS et al, Canc Res 2008 patent application A) T u m o r v o lu m e e v o lutio n 3 tum or volum e (cm ) 2500 Ewing sarcoma cell lines resistant to ADW/IMA treatment respond to 17-AAG treatment, alone or combined with anti IGF1R control A E W 541 17-AA G 17-AA G+A E W 2000 1500 1000 * 500 * * * * 8 10 * * ** *** 12 15 0 0 3 5 days IGF1R 17-AA G+AE W combining HSP90 and inhibition in ES xenografts. control B) A significant subgroup of clinical samples showed diffuse HSP90 expression. Correlation between IGF1R and HSP90 expression in ES clinical samples IGF1R+ IGF1R- HSP90 + 18 5 HSP90 - 20 10 Martins AS et al, Canc Res 2008 , patent application Lab. PMS Ana Pastora Otero Ana Sofía Martins Ana Teresa Amaral Carlos Mackintosh Daniel Osuna David Herrero Gemma Caballero José Luis Ordóñez Juan Madoz Victoria Sevillano Universidad de Salamanca