informe final detección y tipificación de los virus del

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTFACULTAD DE CIENCIAS MEDICASUNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA.
INFORME FINAL
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DE LOS VIRUS DEL
PAPILOMA HUMANO DE ALTO RIESGO EN PACIENTES CON
LESIONES PREINVASIVAS E INVASIVAS DEL CÉRVIX POR
MEDIO DE PCR.
PROYECTO FODECYT No. 06-2007
Dr. ALBERTO GARCÍA GONZÁLEZ
Investigador Principal
GUATEMALA, junio del 2008.
i
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología-SENACYT- y al consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología –CONCYT-.
ii
ii
Resumen
Objetivo. Determinar la frecuencia y tipificación de los virus del papiloma humano de
alto riesgo en las diferentes lesiones preinvasivas e invasivas del cáncer cérvix.
Material y métodos. Es un estudio descriptivo, cuyas muestras fueron colectadas
durante mayo del 2007 a abril del 2008, en pacientes que asistieron a los departamentos
de colposcopía de Aprofam y del Instituto Nacional de Cancerología de Guatemala. El
procesamiento de las muestras y el análisis de los datos se realizaron en el Laboratorio
de Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de
San Carlos de Guatemala. Para la detección del virus se utilizó la técnica de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos universales los cuales
reconocen diferentes regiones del gen L1 (MY09/11; GP5/6; L1C1/2), y
oligonucleótidos específicos para el VPH 16 y el VPH 18, así como secuenciación
directa de los productos de la PCR de la región L1. Resultados. Se analizaron 99
muestras: 45 (45.45%) lesiones de bajo grado, 28 (28.28 %) lesiones de alto grado, y
26 (26.26 %) de cáncer invasor. De estos casos se detectaron Virus de Alto Riesgo en
66 muestras (66.66%). El VPH de Alto Riesgo fue detectado en 24 casos de 32
( 75%) de lesiones de bajo grado , en 17 casos de 33 ( 73.9 % ) de lesiones de alto
grado y en los 25 casos (100 % ) de los casos de cáncer invasor. El VPH de alto riesgo
más frecuente fue el 16, detectado en el 50% para Leibg, 50.0 % y en Leiag el 47.06% y
para cáncer invasor el 60 %. El resto de virus detectados de alto riesgo fueron según su
orden de frecuencia: 58, 18, 59, 53, 31, 51, 39, 56, 33, 66 y 52.Conclusión: Los VPH de
Alto Riesgo están presentes en todos los casos de Cáncer del Cérvix. El VPH tipo 16 es
el más frecuente. Recomendación: especialmente a las autoridades máximas de salud
de nuestro país, gestionar la vacunación contra el VPH ya que protegería contra el VPH
16 y 18 .
iii
Summary
Aim. To determine the frequency and classification of human papillomavirus high-risk
in different preinvasive lesions and invasive cervical cancer. Material and methods. It is
a descriptive study, whose samples were collected during May 2007 to April 2008,
patients attending the departments of APROFAM colposcopy and the National Cancer
Institute in Guatemala. The processing of samples and data analysis were conducted at
the Laboratory of Molecular and Cell Biology, Faculty of Medical Sciences, University
of San Carlos de Guatemala. For virus detection technique was used chain reaction
polymerase chain reaction (PCR) with primers which recognize different regions of the
L1 gene (MY09/11, GP5 / 6; L1C1 / 2) and primers specific for the HPV 16 and HPV
18, and direct sequencing of PCR products of the region of L1. Results. We analyzed
99 samples: 45 (45.45%) low grade lesions, 28 (28.28%) high grade lesions and 26
(26.26%) invasive cervical cancer. Of these viruses are high risk in 66 samples
(66.66%).
High-risk
HPV
was
detected
in
24
cases
of
32
(75%) of low-grade lesions in 17 cases of 33 (73.9%) of high grade lesions and in 25
cases (100%) of invasive cervical cancers. The high-risk HPV 16 was the most
frequent, detected in 50% to Leibg, 50.0% and 47.06% in the Leiag for invasive cancer
and 60%. The other viruses were detected at high risk in order of frequency: 58, 18, 59,
53, 31, 51, 39, 56, 33, 66 and 52.Conclusión: high risk HPV is present in all cases
Cancer of the cervix. HPV type 16 is the most frequent. Recommendation: especially
the highest authorities of our country's health, managing HPV vaccination because it
protects against HPV 16 and 18.
iv
Sinopsis del Investigador Principal
Dr. Alberto García González
Nació en la ciudad de Guatemala en el año de 1965. Realizó estudios de primaria y
nivel Medio en el Colegio Liceo Javier. Graduado de Médico y Cirujano en el año 1989,
en la Universidad de San Carlos de Guatemala; realiza estudios de posgrado en
Ginecología y Obstetricia del año 1991 al 1994 en el hospital San Juan de Dios.
Profesor titular por oposición de Biología Celular y Molecular, Facultad de
Medicina , Universidad de San Carlos de Guatemala, desde 1995 a la fecha, actualmente
coordinador de esta unidad académica.
Realizó estudios en Biología Molecular en Italia, Milán, Centro de investigaciones
para la Leucemia “Tettamanti” hospital San Gerardo. Con énfasis en Anomalías
cromosómicas en Leucemia infantil.
Así mismo obtuvo capacitaciones en Detección y tipificación del Virus del
Papiloma Humano en el Instituto Nacional de Cancerología de México en el año 2006 y
2008.
Inicia líneas de investigación en Biología Molecular en la Facultad de Medicina de
la Universidad de San Carlos de Guatemala; gestionando la formación del primer
laboratorio de este tipo en dicha institución.
Ha obtenido reconocimientos dentro de su labor investigativa, siendo el último en
noviembre del 2,008 el reconocimiento del Investigador del año, otorgado por la
Dirección General de Investigación –DIGI- de la Universidad de San Carlos de
Guatemala.
v
Sinopsis de Investigador Asociado
Dr. César Vásquez Galván
Médico y Cirujano egresado de la USAC y ha sido profesor de Biología Celular y del
Centro de Investigación en Ciencias de la Salud –CICS- de la Facultad de Ciencias
Médicas, siendo actualmente Profesor Titular de Microbiología en la misma Facultad.
Ha estudiado las siguientes maestrías: Maestría en Ciencias (Biología Celular),
Maestría en Docencia Universitaria y actualmente estudia el doctorado en Investigación
de la Universidad Mariano Gálvez.
Ha desarrollado los siguientes trabajos de investigación: “Bases bioquímicas de la
Isquemia y reperfusión”, “Modelos experimentales fisiológicos para estudios
bioquímicos: el corazón aislado refundido”, “Influencia de los antiinflamatorios no
esteroideos sobre la fosforilación oxidativa” en el Instituto Nacional de cardiología
“Ignacio Chávez” de México, en donde participó en la organización de la unidad de
corazón prefundido.
Ha escrito las siguientes tesis de maestrías: “Modulación de la contractilidad y de la
fosforilación oxidativa en corazones prefundidos” y “Secuenciación Genética de las
Pseudomonas”.
Ha publicado diferentes artículos en revistas nacionales e internacionales.
Actualmente es el representante de la Facultad de Ciencias Médicas ante la
Comisión Intersectorial de Biotecnología, de la cual ha sido electo como Secretario,
Presidente alterno y Presidente.
Institución Ejecutora
Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Facultad de
Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala,
USAC.
Instituciones Colaboradoras:
Instituto Nacional de Cancerología INCAN de Guatemala
Aprofam
Instituto Nacional de Cancerología de México INcan
vi
Agradecimientos
Especialmente
Al Dr. Jesús Arnulfo Oliva Leal, Decano de la Facultad de Ciencias Médicas, por su confianza y
apoyo al desarrollo de la investigación.
A la Dra. Marcela Lizano Soberón por su colaboración en la capacitación en la
secuenciación de genes, en el laboratorio de INCAN de México D.F.
A los doctores Walter Guerra, Edwin Morales, Miguel Angel Echeverría, Guillermo Alfredo
Lima, Carlos Armas Lemus, Enrique López Sánchez, Jorge Alvarez, por su apoyo
institucional.
A La Facultad de Ciencias Medicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala
Al Dr. César Vásquez Galván Dra. Patrizia Lupo Norma Marroquín Lang por su valiosa y
activa labor en la realización de la investigación.
vii
Dedico la presente investigación
A Dios Omnisciente, fortaleza mía
A mi esposa Brenda e hijos Alberto Carlos y Brenda Abigail por su amor y comprensión
viii
INDICE GENERAL
PARTE I
I.1 Introducción
I.2 Planteamiento del problema
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
I.2.2 Justificación del Trabajo de investigación
I.3 Objetivos
I.3.1 Objetivo General
I.3.2 Objetivos Específicos
I.4 Materiales y Métodos
I.4.1 Localización del Laboratorio
I.4.2 Muestras Obtenidas
I.4.3 Criterios de la población estudiada
I.4.4 Duración del trabajo
I.4.5 Procesamiento de las muestras
I.4.6 Variables e indicadores
I.4.7 Material y equipo utilizado en el laboratorio
I.4.7.1 Reactivos utilizados en la investigación
I.4.7.2 Descartables
I.4.7.3 Aparatos y equipos en el laboratorio
I.5 Plan de Investigación
I.5.1 Etapa Uno. Selección de participantes
I.5.1.1 Clasificación de los casos
I.5.1.2 Solicitud del Consentimiento Informado
I.5.1.3 Boleta de recolección de datos del paciente
I.5.2 Etapa dos, Recolección y procesamiento de muestras
I.5.2.1 Obtención de muestras
I.5.2.2 Ingreso de las muestras al laboratorio
I.5.2.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio
I.6 Fórmulas para el análisis e interpretación de datos
I.6.1 Fórmula porcentaje de muestras positivas VPH Alto Riesgo y Lesión con
respecto a la totalidad de las muestras
I.6.2 Porcentaje de muestras positivas de VPH según tipo de lesión en cérvix
I.6.3 Porcentaje según tipo de VPH de alto riesgo y lesión en cérvix
I.7 Tratamiento de desechos
I.8 Resultados e impacto del estudio
Parte II
Marco teórico (Conceptual)
II.1.Biología Molecular del Virus del Papiloma Humano (VPH)
II. 2. Trastornos en la célula huésped del VPH
II.3. Tipificación del VPH
II.4. Criterios de géneros y especies
II.5. Epidemiología a nivel mundial del cáncer del cérvix
II.6 Epidemiología del cáncer del cérvix en Latino América
II.7 Frecuencia del Cáncer del cérvix en Centro América
II.8 Informe epidemiológico del cáncer del cérvix en Guatemala
II.9 Pruebas del ADN del VPH
II.10 Secuenciación del ADN
II.11 Importancia de la prueba del ADN del VPH en la Medicina Clínica
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ix
II.12 Vacunas contra el VPH
II.12.1 Vacunas terapéuticas
II.12.2 Vacunas preventivas
II.13 Futuro de las investigaciones de la tipificación del VPH
PARTE III
30
31
31
32
Resultados
III 1. Detección de Virus de Papiloma Humano según tipo de Lesión Histopatológico
Del cérvix
III 2. Detección de los virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo según tipo de lesión
Histopatológica en cérvix
III 3. Tipificación del virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo según tipo de lesión
Histopatológica en cérvix
III 4. Discusión de Resultados
34
35
36
40
PARTE IV
IV 1
IV 2
IV 3
IV 4
Conclusiones
Recomendaciones
Referencias bibliográficas
Anexos
41
42
43
46
PARTE V Informe Financiero
V.1
Descripción del Presupuesto Global del Proyecto, ejecutado
87
x
TABLAS
Tabla 1
Tabla 2
Tabla 3
Tabla 4
Tabla 5
Tabla 6
Tabla 7
Tabla 8
Los tipos virales más estudiados y sus propiedades clínicas
Primers ó cebadores para análisis de B-globina
Primers ó cebadores para análisis de región MY
Primers ó cebadores para GP
primers ó cebadores para análisis de GEN LCR 16
primers ó cebadores para análisis de REGIÓN E HPV16
primers ó cebadores para análisis de GEN LCR 18
primers ó cebadores para análisis de GEN región E6 HPV 18
33
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xi
FIGURAS
Figura 1. Escobilla descartable
Figura 2 Toma de la muestra del cérvix
Figura 3 Colocación de muestra en solución buffer
Figura 4 Actividades generales del estudio
Figura 5 Estructura de las partículas parecidas al VPH
Figura 6 Genoma del VPH
Figura 7 La organización del ADN circular del HPV y su integración dentro la célula
Huésped.
Figura 8 Árbol filogenético del VPH
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13
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21
24
xii
GRAFICAS
Gráfica 1 Incidencia por edad estandarizada y rangos de mortalidad del cáncer del
Cérvix por 100,000.
25
Gráfica 2 Incidencia del cáncer del cérvix en Centro América
26
Gráfica 3 Registro del hospital INCAN de Guatemala del año 2,004
27
Gráfica 4 Tendencias de localizaciones según los tipos de cáncer en el sexo femenino,
Registros del INCAN año 2004.
28
Gráfica 5 Porcentaje de casos positivos y negativos de VPH según tipo de Lesión
Histológica en cérvix.
35
Gráfica 6 Porcentaje de VPH de Alto y Bajo riesgo según tipo de lesión Histológica
En cérvix
36
Gráfica 7 Porcentaje de tipos de VPH de Alto Riesgo según tipo de Lesión Histológica
Del cérvix.
38
Gráfica 8 Tipos de Virus de Papiloma Humano de Alto Riesgo según tipo Histopatológico
De cáncer invasivo del cérvix.
39
xiii
CUADROS
Cuadro 1 Variables del estudio según definición e indicador
Cuadro 2 Incidencia del Cáncer del cérvix representado en países de Centroamérica
Cuadro 3 Detección de Virus de Papiloma Humano según tipo de lesión Histopatológica
Del cérvix
Cuadro 4 Detección de los virus del Papiloma Humano de Alto y Bajo Riesgo según
Tipo de lesión Histopatológica en cérvix.
Cuadro 5 Tipos de Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo según tipo de Lesión
Histopatológica en cérvix.
8
27
34
35
37
xiv
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
El cáncer del cérvix es un problema de salud pública en países en subdesarrollo. Se estima
que cada año se diagnostican 500,000 casos nuevos en el mundo. Es responsable de
190,000 de muertes anuales, de los cuales 78 % ocurren en países en subdesarrollo.(Alonzo
de Ruiz Patricia a,2005)
Los estudios sobre la epidemiología del cáncer del cérvix han demostrado que esta
identidad se comporta como una enfermedad de transmisión sexual, y diversos factores de
riesgo parecen estar involucrados en su desarrollo tales como tabaquismo, edad temprana
en el inicio de relaciones sexuales, número de parejas, infecciones bacterianas, etc. Sin
embargo, múltiples estudios han concluido que el factor definitivo en la etiología del cáncer
del cérvix es debido a la infección del cérvix por algunos tipos de virus del papiloma
humano ,VPH.( Zur Hausen, 2002)
Los virus genitales tanto oncogénicos como no oncogénicos, pueden causar lesiones
intraepiteliales ó denominadas preinvasivas. A nivel celular se caracteriza por presentar
mitosis y células inmaduras, debido a la alteración ó descontrol en el ciclo celular que
causan los virus del papiloma.
El VPH es clasificado como ADN virus, ya que su genoma es a base de Acido
Desoxirribonucleico; conteniendo en el mismo aproximadamente 8,000 pares de bases.
Dentro de este genoma existen genes denominados E 6 y E7, abreviatura en Inglés Earlie ó
llamados en español tempranos, los cuales están asociados con la capacidad de algunos
genes de producir cáncer del cérvix.
El VPH puede infectar epitelios y mucosas del ser humano y se clasifican de acuerdo
con homologías en su material genético, En la actualidad se reconocen más de 100 tipos
diferentes. Un estudio mundial reportó que la presencia del material genético del virus
(ADN) en más del 95% de casos de cáncer del cérvix Posteriormente, mediante técnicas de
biología molecular más sensibles, la detección del virus se ha optimizado, hasta tener el
99.7% de positividad al VPH en los tumores malignos analizados. (Carrillo Adela, et al.
2004).
Las Instituciones colaboradoras que aprobaron el estudio fueron el Instituto Nacional de
Cancerología y APROFAM. Dos de los centros que atienden a pacientes con lesiones
preinvasivas e invasivas del cérvix. Las muestras se obtuvieron en los departamentos de
Colposcopía de estos dos centros.
En este estudio para detectar VPH se utilizó un método, el más sensible, denominado
Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés PCR, el cual detecta el virus
amplificando las secuencias de su ADN. Utilizando primers universales para las regiones
L1 ver tablas No 3 y 4 páginas 52 y 53 . Posteriormente se determinó la presencia de los
virus tipo 16 y 18 con primers descritos en las tablas No 6 a la 9 páginas de la 55 a la 58.
Al concluir con la recolección de muestras y procesamiento de las mismas, todas aquellas
1
muestras positivas para VPH fueron llevadas a México D.F. al laboratorio del Instituto
Nacional de Cancerología, para realizar la secuenciación de genes de la región L.
En el Presente estudio participaron 99 pacientes, cuyas muestras fueron analizadas en el
laboratorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM. A cada muestra se le
practicó un PCR de control de calidad, detectando el gen de la β Globina ; posteriormente
se realizó un PCR con primers MY09-11 y HBO1 detectando la presencia del VPH en 78
casos. Ver cuadro 3 página 35 .
En esta investigación se encontró una prevalencia para el VPH, que incluyen Virus de
Alto y Bajo Riesgo, de 96.15% en CaCu, 82.14% para lesiones de alto grado, 71.11% para
lesiones de bajo grado.Ver cuadro 3 y gráfica 5 ver pagina 34 y 35 respectivamente.
En el presente estudio fueron detectados los tipos VPH de alto riesgo,según el tipo de
lesión histopatológica del cérvix; siendo el orden de frecuencia 16,58,18, 59, 53,
31,51,33,39,56 y 52. Ver cuadro No 5 y gráfica 7 ver páginas 37 y 38.
El tipo 16 es el más frecuente, detectado en el 50% en Lesiones escamosa intraepitelial
de bajo grado Leibg, 47.06% en Lesiones escamosa Intraepiteliales de alto grado Leiag y el
60% para cáncer invasor ver gráfica 8 ver página 39.
En estudios de otras partes del mundo como Estados Unidos y México han detectado al VPH 16
y 18 los más frecuentes asociados a cáncer del cérvix. A partir de los estudios previos han propuesto
la vacuna contra el Virus del Papiloma Humano 16 y 18 considerados de alto riesgo y para 6 y 11
considerados de bajo riesgo.
En nuestra población femenina es preciso conocer cuales son los tipos más frecuentes
de Alto Riesgo según las diferentes lesiones preinvasivas e invasivas del cáncer del cérvix.
Al conocer cuales son los tipos de Virus de Alto Riesgo del Papiloma Humano se puede
apoyar a la vacuna y hacer más estudios acerca del porque en nuestra población femenina
existen la suceptibilidad ó riesgo de desarrollar el cáncer del cérvix.
Todos los esfuerzos para prevenir y tratar lesiones preinvasivas del cérvix podrán ser
valiosas en un futuro, ya que la efectividad de los mismos disminuirán costos y sobre todo
vidas humanas.
Palabras claves
VPH: Virus del papiloma humano
PCR: reacción en cadena de la Polimerasa
Oligonucleótidos: secuencias de nucleótidos sintéticas, llamados cebadores ó primers
LEIBG, Lesión Escamosa intraepitelial de bajo grado: lesión de displasia de leve, que
afecta el epitelio del cérvix, no invasivo.
LEIAG, Lesión Escamosa Intraepitelial de Alto grado: Lesión de displasia ó neoplasia
moderada a severa, incluye Carcinoma In-situ
Cáncer del cérvix: lesión invasiva ó maligna del cérvix
2
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
Actualmente se conoce que las lesiones de bajo y alto grado intraepiteliales cervicales son
precursoras de cáncer invasor cervical; se ha determinado la presencia de Virus del
Papiloma Humano por sus siglas en ingles VPH en 60-90 % respectivamente asociado a
dichas lesiones. Algunos estudios extranjeros han determinado 15 serotipos virales de los
100 conocidos a la fecha, clasificándolos como de alto riesgo denominados 16, 18, 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52 ,56, 58 , 59.67,68 y 70 debido a su potencial riesgo de transformar a las
células en malignas; aunque los últimos tres pueden detectarse en lesiones preinvasivas de
bajo riesgo; los VPH de bajo riesgo son 6 y 11.
Dentro de las enfermedades de transmisión sexual que se logran diagnosticar por
papanicolaou se encuentra el VPH, el cual esta asociado íntimamente con la génesis del
cáncer cervico uterino . Se ha reportado que la incidencia del cáncer del cérvix en los países
de América Latina varía de acuerdo al país, nivel socioeconómico, procedencia urbano o
rural; ocupando Guatemala el cuarto lugar de incidencia por 39 por cada 100,000
habitantes. En forma global la incidencia es mayor en los países de Centroamérica con una
incidencia de 51 casos por 100,000 habitantes. Ver figura No 10 página 27.
En concordancia, la Organización Panamericana de la Salud –OPS- estima que el 79 %
de los casos de cáncer cervical se encuentran en países en vías de desarrollo, y que en
América Latina se producen de 5 a 6 muertes por cada 100,000 mujeres . Para el caso
concreto de Guatemala, el cáncer de cérvix es la tercera causa de muerte por cáncer en
personas mayores de 30 años, siendo la primera causa de mortalidad en mujeres y
corresponde al 50% de neoplasias femeninas. (Ferlay J, et al.: GLOBOCAN 2002)
En dos centros de toma del papanicolaou, INCAN y APROFAM, reportan
aproximadamente 5 % de los casos algún tipo de lesión intraepitelial de bajo y alto grado
cervical; de estos casos el 30% de los casos se evidencia el VPH debido a las imágenes
patológicas denominadas coilocitosis, sin embargo en este estudio puede tener limitada la
sensibilidad al diagnóstico de VPH y no puede tipificarlo.
El estudio de las muestras determinó la presencia de estos virus mencionados con una
alta sensibilidad y especificidad ya que fueron procesadas por la técnica de PCR por sus
siglas en inglés Reacción en Cadena de la Polimerasa, técnica que amplifica in Vitro el
ADN de los virus del Papiloma Humano, así como identificó los serotipos más frecuentes.
Las muestras se tomaron a pacientes por medio de un frote del exudado del cérvix por
un especialista en colposcopia, a todas aquellas pacientes con diagnóstico de Lesión
epidermoide intraepitelial de bajo ó de alto grado, ó cáncer invasivo de diversos tipos
histopatológicos epidermoide, adenocarcinoma ó mixto.
3
En diversos países han investigado la presencia del HPV y los serotipos de alto riesgo,
pudiendo iniciar diversas medidas preventivas como por ejemplo, aplicar la vacuna
bivalente ó tetravalente dependiendo de la frecuencia del los virus. Los estudios en cada
región geográfica de las variantes intratipo, son importantes para establecer una base de
datos sobre la diversidad y patogenicidad de distintas especies, tipos y variantes de VPH,
que ayude al diseño y optimización de protocolos de tratamiento y vacunación.
Existen diversas formas de detectarlos, las más utilizadas son Captura de Hibridación
de segunda generación y PCR.
El presente estudio utilizó el diagnóstico de biotecnología PCR y secuenciación de
genes del VPH, siendo sensibles, logrando detectar no solamente la presencia del virus del
papiloma en las diferentes lesiones del cérvix sino la tipificación de los mismos.
I.2.2 Justificación del trabajo de Investigación
El cáncer del cérvix ó conocido como cuello de la matriz es la causa de mayor ingreso y
mortalidad en pacientes femeninas, al INCAN ver gráfica No 11 página 27 . Se sabe que
el Virus del Papiloma Humano es el agente causal biológico del cáncer del cérvix; en
países con biotecnología han detectado que existen diferentes tipos Virus de Alto Riesgo
que tienen el potencial de desarrollarlo.
Cada país debe estudiar la enfermedad y sus posibles causas, en este caso el cáncer del
cérvix está asociado al Virus del Papiloma Humano; sabiendo la variedad de los tipos del
VPH en nuestro país la presente investigación evidencia el riesgo de desarrollar la
enfermedad según el tipo de Virus contraído por la paciente.
El presente trabajo determinó la presencia de distintos Virus de Papiloma Humano de
Alto Riesgo desde lesiones preinvasivas hasta invasivas. Evidenciando el potencial
oncológico de los mismos en pacientes guatemaltecas.
Pudiendo aportar a la comunidad científica datos que apoyan a las medidas preventivas
como es la aplicación de la vacuna contra el VPH y continuar con las campañas de
papanicolaou.
4
1.3 OBJETIVOS:
1.3.1 Objetivo General
1. Detectar los Virus del Papiloma Humano (HPV) de Alto Riesgo en lesiones
preinvasivas e invasivas del cérvix.
1.3.2 Objetivos Específicos
1. Determinar los serotipos de alto riesgo de HPV, en pacientes con
diagnóstico de Lesiones Epidermoide Intraepiteliales del cérvix de bajo ó
alto grado.
2. Determinar los serotipos de alto riesgo de HPV en pacientes con diagnóstico
de lesiones Invasivas según el tipo histológico epidermoide, mixto ó
adenocarcinoma.
5
I.4 MATERIALES Y MÉTODOS
I.4.1 Localización del laboratorio: Las muestras se procesaron en el laboratorio de
Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de
Guatemala, Centro Universitario Metropolitano. Ciudad de Guatemala. El laboratorio está
ubicado en la zona 11 de la ciudad de Guatemala. La latitud es 14° 37´15´´ Norte y a una
longitud de 90° 31´36´´ Oeste.
I.4.2 Muestras Obtenidas:
Las muestras fueron obtenidas de mujeres que asistieron a las Unidades de
Colposcopía de Aprofam e INCAN, para realizarse el examen de colposcopía. La muestra
del cérvix fue obtenida por los médicos colposcopistas, por medio de brocha marca
Colpotre, ver página 13. Fue transportada la muestra en solución de buffer a ph de 7 , al
laboratorio . Se mantuvo en refrigeración a 4°C.
I.4.3 Criterios de la población estudiada:
I.4.3.1 Criterios de Inclusión
Las pacientes femeninas, que asistieron a las unidades de colposcopía en INCAN ó
APROFAM, sin antecedentes de terapia antineoplásica ó inmunomoduladora, no
embarazadas y que accedieron voluntariamente a participar en el estudio mediante la firma
de la carta de consentimiento informado, previamente deberán leer un folleto de
información a la paciente. Ver anexo 12 páginas 83 y 84.
I.4.3.2 Criterios de Exclusión
Pacientes que ya hayan recibido tratamientos previos antineoplásicos o inmunomoduladora,
ó estar embarazada.
I.4.4 Duración del trabajo de campo: elaborado en un período de 12 meses, se concluyó
en mayo del 2008.
I.4.5 Procesamiento de las muestras:
a) Extracción y purificación del ADN
Las muestras de exudado cervicovaginal se resuspendieron en 1 ml de Buffer de Lisis (TrisHCl 10mM pH 8, EDTA 0.1M pH 8, SDS 0.5%, Proteinasa K 200 mg/ml, RNAsa 20
mg/ml), se incubaron a 37 °C y 55 °C, respectivamente, toda la noche.La extracción del
ADN en ambos tipos de muestras se realizó con fenol-cloroformo, y la precipitación con
etanol, según la técnica descrita en Sambrook J, Fritsch E, Maniatis, 1987.
6
b) Detección y tipificación del VPH
Las 99 muestras de ADN fueron sometidas a diagnóstico de VPH. Estas muestras fueron
positivas a la previa amplificación del gen de ß-globina por PCR que amplifica un
fragmento de aproximadamente 268 pb a una Tm de 55 °C, como lo describen Resnick y
colaboradores, 1990 Para la detección del VPH se utilizaron tres diferentes juegos de
oligonucleótidos universales: (MY09/ MY11, GP5/GP6 y L1C1/L1C2) que amplifican
fragmentos de diferente tamaño de la región L1 del VPH.
Cada reacción se llevó a cabo en un termociclador A & B Sistems, modelo 2700, en un
total de 40 ciclos, un primer ciclo de desnaturalización a 94 °C por 10 min y un ciclo final
de extensión a 72 °C por 7 min; los 38 ciclos intermedios se llevaron a cabo a una Tm de
55 °C para los oligonucleótidos MY09/11 y de 48 °C, tanto para GP5/6, como para L1C1/2.
El resultado se visualizó por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1% , identificando
la banda amplificada del tamaño esperado.
c) Amplificación de la región L1 del papilomavirus
1. Todas las muestras se amplificaron con los oligonucleótidos universales MY09/MY11,
localizados dentro de la región L1 del genoma del VPH, lo que dió un fragmento
aproximado de 450 pb.segun Resnick y colaboradores, 1990.
2. Todas las muestras que resultaron negativas a la amplificación con MY09/MY11 fueron
sometidas a amplificación con oligonucleótidos universales (GP5/GP6), localizados
dentro de la secuencia reconocida por los oligonucleótidos MY09/MY11 y que
amplifican un fragmento de 150 pb. Según Snijders P, Van den Brule A, Schrijnemaker
H, et al.1990.
3. Las muestras que siguieron negativas se analizaron con otro par de oligonucleótidos
universales L1C1/L1C2 que generan un fragmento de 240-250 pb de la región L1.Según
Yoshikawa, Kawana, et. Al 1991
d) Determinación del tipo del VPH
Se procedió a la tipificación de las muestras que resultaron positivas para el VPH por
cualquiera de los juegos de oligonucleótidos utilizados para la región L1.Para tal caso se
eligieron oligonucleótidos específicos para la región E6/E7 de VPH16 bajo las condiciones
descritas por Berumen y colaboradores, que amplifican un fragmento de 792 pb a una Tm
57 °C. De la misma manera, se utilizaron los oligonucleótidos que, a una Tm de 57 °C,
amplifican un fragmento de 360 pb de la región larga de control (LCR) de VPH18,
descritos por Ong y colaboradores, 1993.
e) Secuenciación del ADN
Finalmente, para determinar el tipo del VPH en todas aquellas muestras que no fueron
VPH 16 ni VPH 18, se realizó la técnica de secuenciación directa de los productos de la
PCR mediante el kit de Thermo Sequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing
(Amersham Pharmacia Biotech) y marcaje con fósforo 33 (Amersham Pharmacia
Biotech).según Sanger F., Nicklen S.,1997 Para determinar el tipo viral, la secuencia
obtenida se incorporó a un banco de datos (BLAST) para su comparación con las
7
secuencias del ADN existentes del VPH. El investigador principal Dr. Alberto García
González llevó las muestras a INCan Mèxico D.F. siendo aprovechada la oportunidad para
capacitarlo en secuenciación de genes del VPH.
1.4.6 VARIABLES e INDICADORES
Las variables del estudio son presentadas a continuación en el cuadro 1 , en ella se describe
las variables, su definición y el indicador utilizado.
Cuadro 1. Variables del estudio según definición e indicador
DEFINICIÓN
INDICADOR
VARIABLE
Lesiones Preinvasivas del
cérvix
Diagnóstico Histopatológico
Incluye la suma de los casos con Lesiones Epidermoide Intraepitelial de Bajo grado
lesiones intraepiteliales de bajo y ( LEIBG )
alto grado del cérvix
Y Lesiones Epidermoide Intraepitelial de Alto grado
( LEIAG )
Lesión epidermoide
intraepitelial de bajo grado
del cérvix
Diagnóstico Histopatológico
Neoplasia intraepitelial, abarca
1/3 inferior del epitelio del cervix Lesión Epidermoide Intraepitelial de Bajo Grado
acompañado ó no de coilocitosis ( LEIBG )
LEIBG
Diagnóstico Histopatológico
Neoplasia intraepitelial, con
Lesión epidermoide
intraepitelial de alto grado
del cérvix
LEIAG
Lesión de Cáncer Invasor
Lesión Epidermoide Intraepitelial de Alto Grado
hipercromasia, aumento de
imágenes de mitosis, atípias
celulares que incluye 2/3 ó la
totalidad del epitelio cervical
respetando la membrana basal
Diagnóstico Histopatológico
( LEIAG )
Carcinoma Invasivo epidermoide
Adenocarcinoma
Mixto (adeno-escamoso)
Diagnóstico Biomolecular
HPV de alto riesgo
Amplificación del ADN viral
específica para Serotipos
Prueba de PCR(para el 16 y 18) y secuenciación del
gen región L de los VPH para el resto de los VPH de
Alto Riesgo.
8
16 ,18, 31 ,,33,
Positivo _________
35,39,45,51,52,56, 58 y 59
Negativo_________
Prevalencia de cada serotipo Muestras positivas para HPV con
serotipos de alto riesgo dividido
de HPV de alto riesgo en
No de casos positivos según serotipo x 100
la totalidad de muestras con
lesiones
lesiones Epidermoide de bajo
Total de LEIBG
LEIBG del Cérvix
grado intraepiteliales por 100
Prevalencia de cada serotipo Muestras positivas de HPV
según el serotipo de alto riesgo
de HPV de alto riesgo en
dividido por la totalidad de
lesiones LEIAG
muestras con lesiones
intraepiteliales de Alto grado por
100
Prevalencia de cada serotipo
de HPV de alto riesgo en
lesiones de cáncer invasor
tipo Epidermoide
No de casos positivo según serotipo X 100
Total de LEIAG
Muestras positivas de HPV
según el serotipo de alto riesgo
No de casos positivo según serotipo X 100
dividido por la totalidad de
muestras con lesiones Cáncer
No casos con lesiones de Cáncer
invasor tipo Epidermoide por 100
Epidermoide
Prevalencia de cada serotipo
de HPV de alto riesgo en
lesiones de cáncer invasor
tipo Adenocarcinoma
Prevalencia de cada serotipo
de HPV de alto riesgo en
lesiones de cáncer invasor
tipo Mixto
Muestras positivas de HPV
según el serotipo de alto riesgo
dividido por la totalidad de
muestras con lesiones Cáncer
invasor tipo Adenocarcinoma
por 100
Muestras positivas de HPV
según el serotipo de alto riesgo
dividido por la totalidad de
muestras con lesiones Cáncer
invasor tipo Mixto por 100
No de casos positivo según serotipo X 100
No casos con lesiones de Cáncer
Adenocarcinoma
No de casos positivo según serotipo X 100
No casos con lesiones de Cáncer
Mixto
9
I.4.7 Material y Equipo utilizado en el laboratorio
1.4.7.1 Reactivos utilizados en la investigación
Kit para 100 muestras de PCR (Biomed platìnium )
invitrogen, código 10966034 de 10000 unidades.2.5 U/ul para 250 reacciones, 4 kits
Marker VIII, para electroforesis marca Invitrogen 1 frasco Peso 1 kb de rango
0,5-12kb para 200 aplicaciones
DNTPs 10 mM, 1x1ml mezcla, 2 en total
KIT para extracción de ADN marca Sigma
Primers ò cebadores en número de 20, para gen B globina, productos My`s 9, 11
y HBO1, LC1, LC2 , GP 5 ,GP 6 , Gen E6 de HPV 16 y 18 .
Citrato de Amonio for molecular biology, ~98% Marca sigma Frasco de 250g
Alcohol libre de RNasa
Isopropanolol , 500 ml, marca sigma 1 frasco
Agarosa en polvo, frasco de de 2 kg. En total 5
Agua Ultra Pura , grado pura molecular 2 litros
Solución madre(BUFFER) tampon de 1x, para agarosa, (electroforesis) buffer
TBE 10X, 5 litros
solución Buffer PBS, frasco de tabletas, para preparar en 200 ml
Solución cloroformo Isoamílico Frasco 1 PT, 24:1, marca sigma
Fenolácido refrigerado (menor 4 grados), 0.1 M citrato buffer ph 8. 500 ml
Solución Acetato de sodio PH8, 500 ml. Marca sigma
Trizma® base cell culture tested, meets EP & USP testing specifications,
Biotechnology Performance Certified Marca sigma Frasco de 1kg
Proteinase K from Tritirachium album for molecular biology, >30 units/mg
protein, lyophilized powder Marca sigma Frasco de 10mg
Solución madre(BUFFER) tampon de 1x, para agarosa, (electroforesis) buffer
TBE 10X, 1 litro
Etanol al 100%, marca sigma, 1 frasco de 500 ml
Mercaptoetanol 1 frasco de 100 ml
Tinte para colorear productos de PCR
Buffer Loading 50 ml (colorante electroforesis) unidad 5ml 5x
10
1.4.7.2 DESCARTABLES
Los materiales descartables requeridos para la investigación
Tubos cónicos 15 ML falcon , en número de1,000
Probetas estériles, paquete de 1,000 tubos de 0.5 ml
Probetas estériles, paquete de 1,000 tubos de 0.2 ml
Brochas cervicales tipo Colpotre, en número 200.
Criotubos 2ml, 500 unidades
Micropipetas descartables tipo pasteur, plástico , 500 unidades
Puntas de pipetas, estériles con filtro de 20ul , en # 960
Puntas de pipetas, estériles sin filtro de 20 µl, en # de 960 (10 cajas)
Puntas de pipetas, estériles con filtro de 200 µl, en # de 960
Espéculos descartables tamaño mediano en número 200
puntas de pipetas, estériles sin filtro de 1000ul, en # de 1000
Caja de guantes descartables mediano sin talcos, en # 20 Cajas, 100 C/una
Tubos de tipo eppendorff de 1.5 ml en número de 1,000
Tubos para PCR de 0.2 ml en número de 2,000
Tubos de 2 ml en número de 1,000.
1.4.7.3 Aparatos y equipos utilizados en el laboratorio
Refrigeradora para 4 °C mediana
Congelador con capacidad de congelar a menos 20 °C
Vortex para mezclar muestras de laboratorio , eléctrico
Cuantificador de PH, digital marca
Cámara para electroforescis de 15 pozetas
Termoblock, digital con agitador automático
Cuantificador de ADN marca eppendorff
Cámara de flujo para extraer ADN
3 juegos de micropipetas de volumen variable de 2-20 ul, 20-200 ul y 100-1000
ul,
11
I.5.1 PLAN DE INVESTIGACION
Etapa I Selección de participantes
I.5.1.1 Clasificación de los casos
Durante el transcurso de 12 meses, fueron seleccionados todos los casos de las pacientes
con diagnóstico Histopatológico, por medio de biopsia dirigida, de lesiones en cérvix de
bajo, alto grado ó cáncer invasivo, previo a cualquier tratamiento. El diagnóstico clínico lo
efectuaron en los departamentos de colposcopía del Instituto Nacional de Cancerología y
Aprofam.
I.5.1.2 Solicitud del Consentimiento Informado para participar
A cada paciente se le explicó con palabras claras el motivo del estudio, en que consiste
su participación y los beneficios del estudio. Toda paciente con diagnóstico de Lesiones de
bajo y alto riesgo ó cáncer invasivo, al tener los resultados previa autorización, se le
extrajo muestra de exudado de cérvix para el presente estudio.
El proceso del consentimiento informado consistió básicamente en:
2.1 Explicación del estudio e importancia de la investigación a nivel social.
2.2 Beneficios potenciales para el participante.
2.3 Riesgos mínimos para el paciente.
2.4 Firma del documento de Consentimiento Informado (ver anexo 13 página 85 )
2.5 Explicar que el estudio es voluntario y si niega su participación no altera el
tratamiento en INCAN ó Aprofam.
I.5.1,3 Boleta de recolección de datos
Fue llenada una boleta y posteriormente se envió al laboratorio de la Facultad de
Medicina, CUM
Ver boleta en anexo 14 página 86
I.5.2 Etapa II Recolección de datos
I.5.2.1 Obtención de las muestras
A las pacientes que aceptaron participar con el estudio se les tomó la muestra del exudado
del cérvix bajo las siguientes condiciones:
Equipo para la toma: Espéculo de plástico descartable
Escobilla para cérvix y endocérvix descartable
Frasco con solución de PBS
12
Guantes descartables
Solución salina normal al 0.9 %
• Condiciones de la Paciente: Sin menstruación, no embarazada y estar 72 horas
sin relaciones sexuales, ni haber tenido tratamientos Vaginales (gel, cremas ni
óvulos)
• A la toma de la muestra: El examinador debe colocarse guantes descartables, si se
desea lubricar el espéculo hacerlo con solución salina normal al 0.9%, para la toma
de la muestra del cérvix utilizar escobilla para ecto y endocérvix descartable,
rotarlo 3 veces en dirección de las manecillas del reloj, la escobilla deberá
introducirlo en el frasco con solución PBS y cortar el mango de plástico, tapar el
frasco y dejarlo a temperatura ambiente. Ver las siguientes figuras 1,2 y 3
Figura 1
Escobilla descartable, la zona más larga y central se introduce en el
canal endocervical, el resto de las hebras hacen contacto con el
ectocérvix.
Figura 2 Al introducir la escobilla vía vaginal, se coloca la zona
larga dentro del canal endocervical, luego se rota suavemente 3
vueltas en dirección a las manecillas del reloj.
Figura 3 La muestra se coloca en el frasco en solución de
PBS, cortar el mango de la escobilla, justo por debajo del
tapón ó cierre del frasco. Etiquetar el frasco con el Nombre,
fecha y registro médico. El recipiente puede quedar a
temperatura ambiente.
I.5.2.2 Ingreso de las muestras al laboratorio
Debidamente rotuladas se anotan los pacientes en “libro de Registro de ingreso”, se
anotaron los siguientes datos: Fecha, nombre del paciente, número de historia clínica
diagnóstico Histopatológico.
I.5.2.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio.
a) Extracción y purificación del ADN
Las muestras de exudado cervicovaginal se resuspendieron en 1 ml de Buffer de Lisis
(Tris-HCl 10mM pH 8, EDTA 0.1M pH 8, SDS 0.5%, Proteinasa K 200 mg/ml, RNAsa 20
mg/ml), se incubaron a 37 °C y 55 °C, respectivamente, toda la noche. La extracción del
ADN en ambos tipos de muestras se realizó con fenol-cloroformo, y la precipitación con
etanol, según la técnica descrita en Sambrook. (Carrillo Adela, et Al.,2004)
13
b) Detección y tipificación del VPH
Las 99 muestras de ADN fueron sometidas a diagnóstico de VPH. Estas muestras fueron
positivas a la previa amplificación del gen de ß-globina por PCR que amplifica un
fragmento de aproximadamente 268 pb a una Tm de 55 °C, como lo describen Resnick y
colaboradores. Para la detección del VPH se utilizaron tres diferentes juegos de
oligonucleótidos universales: (MY09/ MY11, GP5/GP6 y L1C1/L1C2) que amplifican
fragmentos de diferente tamaño de la región L1 del VPH.
Cada reacción se llevó a cabo en un termociclador A & B Sistems, modelo 2700, en un
total de 40 ciclos, un primer ciclo de desnaturalización a 94 °C por 10 min y un ciclo final
de extensión a 72 °C por 7 min; los 38 ciclos intermedios se llevaron a cabo a una Tm de
55 °C para los oligonucleótidos MY09/11 y de 48 °C, tanto para GP5/6, como para
L1C1/2. El resultado se visualizó por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1% ,
identificando la banda amplificada del tamaño esperado.
c) Amplificación de la región L1 del papilomavirus
c.1 Todas las muestras se amplificaron con los oligonucleótidos universales MY09/MY11,
localizados dentro de la región L1 del genoma del VPH, lo que dió un fragmento
aproximado de 450 pb
c.2 Todas las muestras que resultaron negativas a la amplificación con MY09/MY11
fueron sometidas a amplificación con oligonucleótidos universales (GP5/GP6), localizados
dentro de la secuencia reconocida por los oligonucleótidos MY09/MY11 y que amplifican
un fragmento de 150 pb.
c.3 Las muestras que siguieron negativas se analizaron con otro par de oligonucleótidos
universales L1C1/L1C2 que generan un fragmento de 240-250 pb de la región L1
d) Determinación del tipo del VPH
Se procedió a la tipificación de las muestras que resultaron positivas para el VPH por
cualquiera de los juegos de oligonucleótidos utilizados para la región L1.Para tal caso se
eligieron oligonucleótidos específicos para la región E6/E7 de VPH16 bajo las condiciones
descritas por Berumen y colaboradores, que amplifican un fragmento de 792 pb a una Tm
57 °C. De la misma manera, se utilizaron los oligonucleótidos que, a una Tm de 57 °C,
amplifican un fragmento de 360 pb de la región larga de control (LCR) de VPH18,
descritos por Ong y colaboradores
e) Secuenciación del ADN
Finalmente, para determinar el tipo del VPH en todas aquellas muestras que no fueron
VPH 16 ni VPH 18, se realizó la técnica de secuenciación directa de los productos de la
PCR mediante el kit de Thermo Sequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing
(Amersham Pharmacia Biotech) y marcaje con fósforo 33 (Amersham Pharmacia Biotech).
Para determinar el tipo viral, la secuencia obtenida se incorporó a un banco de datos
(BLAST) para su comparación con las secuencias del ADN existentes del VPH.
14
Figura No 4 Actividadess generales del estudio
paciente
acepta
participar
Envío de
muestras
Control de
Calidad de
ADN
PCRVPH
• SELECCIÓN D
DE PACIENTES
• Diagnóstico Lesión de bajo grado, alto grado ó Cáncer Invasivo
• Toma de Mu
uestras por cepillado ó biopsias cervical
• Envío de mu
uestras al Laboratorio
•Extracción de ADN
•PCR Beta Globi
bina
•Pasa al siguien
nte paso todos aquellos con β-globina positiva
• PCR con Prim
imers Universales de MYs 09, 11 y HB01, si neg
egativos LC1/2
y GP5/6 passaron a la siguiente etapa todos los positivos
•PCR con primers para VPH 16 y 18, todos aquellos que NO saalieron
positivos para estos tipos, fueron llevados a Secuenciar los gene
nes MYs a
PCR VPH 16 y
México
INCan
18
Secuenciación
de Genes L1 de
los VPH
•Secuenciación
n de Genes región L1 de los Virus de Papiloma Hum
umano, INCAN
México D.F.
Figura 4 Representa las actividades desde la captación de la muestra hasta el procesamiento de las
muestras. Se utilizan Oligonuc
nucleótidos ó primers universales, Para la región MY
Y9/11 si es negativa se
identifica LC1, si es negativa se
s identifica GP5/6. Si todos son negativos se conssidera muestra negativa
para VPH. Si en alguna etapa sale positiva no es necesario continuar con las otrass regiones y se inicia la
tipificación del VPH, utilizando
do oligonucleótidos específicos para los diferentes tipo
os de VPH (ver cuadro
tipificar los casos positivos de VPH)
V
15
I.6 Análisis de datos e interpretación de resultados
Al obtener los resultados
I.6.1 En general la totalidad de muestras positivas con virus de alto riesgo con
respecto a la totalidad de las muestras sometidas a estudio
1)
No HPV de Alto riesgo X 100= ______%
T
No HPV de Alto riesgo = Número de Muestras positivas para HPV de alto riesgo
T = Totalidad de Muestras positivas para HPV
I.6.2 Según Muestras positivas con Virus de alto riesgo en general, con respecto al
tipo de Lesión cervical
2)
No HPV de Alto riesgo X 100= ______%
M Liebg = Muestras con Lesión intraepitelial de bajo grado
No HPV de Alto riesgo = Número de Muestras positivas para HPV de alto riesgo
M Liebg = Muestras con Lesión intraepitelial de bajo grado
3)
No HPV de alto riesgo X 100= ______%
M Lieag
No HPV de alto riesgo = Número de muestras positivas para HPV de alto riesgo
M Lieag = Muestras con lesión epidermoide intraepitelial de alto grado
5)
No HPV de alto riesgo X 100= ______%
M CA cu (epidermoide, adenocarcinoma ó mixto)
No HPV de alto riesgo = Número de muestras positivas para HPV de alto riesgo
M Ca cu = suma de las Muestras de Cáncer Invasor del cuello del útero (epidermoide, adenocarcinoma y
mixto)
I.6.3 Según el tipo del Virus específico de alto riesgo detectado, con respecto al tipo de
Lesión cervical
6) No HPV X X 100= _______%
M Liebg
No HPV X = Número de muestras positivas para un tipo específico de HPV de
alto riesgo (según el tipo identificado por PCR)
M Liebg = Muestras con lesión epidermoide intraepitelial de bajo grado
16
7)
No HPV x X 100=
M Lieag
%
No HPV X = Número de muestras positivas para un tipo específico de HPV de alto
riesgo (según el tipo identificado por PCR)
M Lieag = Muestras con lesión epidermoide intraepitelial de alto grado
10) No HPV X X 100=
M Ca cu Y
%
No HPV X = Número de muestras positivas para un tipo específico de HPV de
alto riesgo (según el tipo identificado por PCR)
M Cacu Y = Muestras con lesión cancerígena , según tipo histológico (Epidermoide,
Adenocarcinoma ó Mixto)
La presente investigación analizó, en una muestra de exudado de cérvix de pacientes
que asistieron a las unidades de colposcopia de Aprofam ó INCAN de Guatemala.
Los pasos a seguir en el proceso desde la extracción de la muestra se indican en la
sección de recolección de Datos. Así también el procesamiento de las muestras se indica
en esta sección (procesamiento de muestras en el laboratorio).
I.7
Tratamiento de deshechos:
El laboratorio de la facultad de Medicina cuenta con los servicios de deshechos
ECOTERMO.
1
El material descartable punzo-cortante (jeringas en estos casos), pipetas plásticas,
tubos de toma de muestra de exudados cervicales con sus brochas, puntas de
micropipetas. Se descartaron en depósitos rígidos color rojo.
2
Material descartable No punzo cortante, papel higiénico, gel de agarosa, probetas
En bolsas rojas.
El procesamiento de las muestras, sus productos y deshechos no contaminan el medio
ambiente al tomar las medidas de precaución respectivas. El uso de guantes en algunas
etapas del procesamiento de muestra es para evitar contaminación del ADN de las manos
del investigador con las muestras a estudio. También se advierte el uso de guantes para
manipular el bromuro de etidio, ya que el contacto constante y prolongado con la piel
podría producir cáncer.
17
I.8 Resultados y su impacto:
Según los resultados obtenidos de esta investigación, establece la relación del Virus del
Papiloma Humano con los casos de cáncer invasivo del cérvix en un 96.15 % de los casos.
Siendo dentro de los VPH de alto riesgo el tipo 16 el de mayor frecuencia en un 60% en
los casos de Cáncer Invasivo , 50 % en los casos de Lesión de Bajo y Alto riesgo, ver
gráfica 15 página 39.
El resto de tipos de Virus de Papiloma Humano son en su orden de frecuencia 58,53,
59, 18, 31,51,33,39,56 y 52. La presencia del VPH de alto riesgo está en todos los tipos
de Lesiones, sin embargo no en la misma frecuencia.
Actualmente existen medidas de prevención tales como la vacuna contra el VPH 16 y
18. El presente estudio muestra el papel del virus del VPH en lesiones preinvasivas e
invasivas, en especial el 16.
Los datos obtenidos en el presente estudio podrán complementar futuras
investigaciones, tales como saber el subtipo y variedad de los virus más frecuentemente
detectados; así como evaluar poblaciones inmunizadas y el comportamiento de los tipos
ante estas medidas de prevención.
18
PARTE II
MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)
II 1. Biología Molecular del Virus del Papiloma Humano (VPH)
Los Virus del Papiloma Humano VPH, son muy diversos, y probablemente se producen en
la mayoría de los mamíferos y aves. Cientos de tipos VPH se han detectado en los seres
humanos. Ha pasado tres décadas de investigación, de un gran número de especialistas y
las secuencias de miles de VPH aislados, para establecer una base de datos que nos
permite proponer un sistema de clasificación que probablemente será más estable, mientras
que VPH tipos se encuentran. Se realizó una revisión de esta base de datos y su
interpretación por criterios filogenéticos que llevó a niveles taxonómica ''familia'',
''género'', ''especie'' y ''tipos''.( Ethel-Michele de Villiers, a Claude Fauquet, et;al)
El virus del papiloma, VPH, pertenece a la familia Papillomaviridae, una familia
recientemente reconocida como distinta de los polyomavirus por el Consejo Internacional
para la Taxonomía de los Virus, (ICTV) . Estos virus están ampliamente distribuidos en la
naturaleza. Infectan específicamente el epitelio escamoso de más de 20 especies diferentes
de mamíferos, así como aves y reptiles. La partícula viral del papiloma humano tiene una
cápside de 72 capsómeros (60 hexámeros y 12 pentámeros),con un diámetro aproximado
de 55 nm y que contiene al genoma viral ver Figura 6. Los capsómeros están hechos de dos
proteínas estructurales: L1 en mayor proporción y L2.
El VPH es relativamente estable y debido a que no tiene una envoltura, permanece
infeccioso en un ambiente húmedo por meses. (Alejandro López Saavedra y Marcela
Lizano Soberon 2,006)
Figura No5_ Estructura del Las partículas parecidas al VPH
(VLP). Reconstrucción tridimensional de micrografía en crioelectron de un
virus VPH. Las VLP está compuesta por 60 hexavalentescapsómeros y 12
pentavalentes capsómeros, todos consisten de pentámeros de L1. La proteína
L2 no es visible en esta micrografía representada de color amarilla
19
Un amplio y diverso grup
po de Virus del Papiloma Humano (VPH) de los aislamientos
tradicionalmente se describ
ibe como ''tipo''. Los tipos de VPH se han deteectado , examinando
cuidadosamente todos loss mamíferos
ma
y aves.
El VPH tiene un gen
noma circular de doble ADN con tamaños de
d cerca de 8 kb. A
pesar de su pequeño tamaaño, su biología molecular es muy compleja
ja. En resumen, tres
oncogenes, E5, E6 y E7, modulan
mo
el proceso de transformación, dos pro
roteínas reguladoras,
E1 y E2, modula la transc
scripción y replicación, y dos proteínas estru
ructurales, L1 y L2,
componen la cápside viral.
l. El E1, E2, L1 y L2 ORFs están especialmen
nte bien conservados
entre todos los miembross de
d la familia. La mayoría de cis-son elementtos que responden a
la región larga del contro
rol (LCR) entre L1 y E6, un segmento con
n poca secuencia de
conservación. Ver figura abajo
ab
Figura No 6
Los últimos 30 añ
ños se ha observado un desarrollo de la
l taxonomía VPH
inicialmente sobre la base de genómica transversal hibridaciones y pattrones de restricción
a un sistema basado en laa comparación de algoritmos filogenética, yaa sea en su conjunto
del VPH y secuencias del genoma
g
o subgenómica segmentos.
Este progreso cien
ntífico ha llevado a un refinamiento, pero
p
nunca a las
contradicciones de anteriiores taxonomías. También hay fuertes in
ndicios de que los
genomas del VPH son muyy estáticos, y la secuencia de cambios mutaciión o recombinación
son muy raros eventos dee hecho. Mutacional aparentemente se produ
ucen cambios en las
frecuencias no muy difere
rentes de los de los genomas de ADN del organismo huésped
infectado.( Ethel-Michel dee Villier, et al.2004).
II. 2 Trastornos en la Céllula Huésped del VPH
Los virus del papiloma viirus del papiloma, quienes tienen un genomaa de ADN circular,
pueden algunos infectar laa mucosa escamosa o epitelial de tejidos. Dad
do que los virus del
papiloma humano (VPH) no codifican las enzimas necesarias para su
u propia replicación;
20
han desarrollado estrategiaas para asegurar que ingresen a las células dee la suprabasal; estas
células siguen su ciclo paara proporcionar un entorno que es permisivaa para la replicación
viral. En el caso de las de
d bajo riesgo VPH genital, como el 6 o 11, el aumento de
proliferación de células beenignas da como resultados un crecimiento de verrugas. Por el
contrario, el VPH de alto riesgo
r
como el HPV16 o 18, más ampliameente interfiere en los
puntos de control del ciclo celular, que normalmente vigilan la fidelidad
d de la replicación y
la segregación de los cromo
mosomas, preparando el escenario para los cambios
c
que pueden
conducir al cáncer. Ver Figgura No 7.
La precisión las interaacciones entre proteínas de la cápside y su recceptor celular (s) no
están claros, aunque los anticuerpos
a
dirigidos principalmente contra lla L1, sino también
contra la L2, puede bloqueear infeccion. VPH expresar sólo un pequeño
o repertorio de genes
virales en las células basalles en estado episomal (ADN viral aún no in
ntegrado en el ADN
del huésped) amplifican ell genoma por ejemplo, E1 y E2, y, probableemente, E6 y E7. La
expresión de E6 y E7 en las capas suprabasal de la epitelio bloquess de salida del ciclo
celular, pero sólo ligeram
mente En contraste con el estado episomaal del genoma en
infecciones productivas, ell VPH es a menudo integrado en el genoma de
d células de cáncer.
La integración puede dar lugar a cambios en la expresión de genes virales
v
que dan a la
célula una ventaja selectivaa de crecimiento a través de la regulation dee E6 y E7. Al mismo
tiempo, hay expresión de E1,
E E2, E4, L1 y L2. Ver figura No7.
Figura No 7
Varios estudios han deemostrado que prácticamente todos los cánceeres cérvico-uterinos
pueden seguir expresando genes virales E6 y E7; y formar oncoproteín
ínas manteniendo así
la neoplasia. Cánceres cérvico-uterinos
c
tienen una constelación de
d las alteraciones
genéticas, además de loss VPH genes que promueven la invasión, metástasis y la
angiogénesis. Además, co
on frecuencia el cáncer cervical ha disminuiido en la expresión
superficial de moléculass HLA clase I, que proporciona un mecan
nismo para evasion
inmunológica.(Zur Hausen
n, 2002)
21
II.3 Tipificación del VPH
Como se mencionó previemente los virus del papiloma Humano (VPH) habían sido
originalmente agrupado juntos con los poliomavirus en una sola familia, la familia
Papovaviridae. Esto se basa en las mismas cápsides que tiene en común y la circular
genoma de doble ADN. Tal como se reconoció más tarde que los dos grupos de virus
tienen diferentes tamaños genoma, completamente diferentes organizaciones del genoma,
y no grandes secuencias de nucleótidos o aminoácidos semejanzas, son ahora reconocidos
oficialmente por el Comité Internacional sobre la Taxonomía de Virus (ICTV) como dos
familias, Papillomaviridae y Polyomaviridae.
Como se tiene en cuenta la falta de homología general entre los genomas virales en las
dos familias, uno debería tomar nota, sin embargo, de una helicasa motivo de la proteína
E1 PV, un dominio se extiende sobre más de 230 aminoácidos, que tiene similitud con
alguna secuencia del SV40 T-antígeno, la proteína NS1 parvovirus, y un planarian viruscomo elemento (Rebrikov et al., 2002).
Si bien no hay duda de que la helicasa respectivos dominios de estos virus son
homólogos, no hay pruebas de que este establece un origen monofilético de estos cuatro
grupos diferentes de virus. Los tipos VPH: la tradicional y futuro taxonómica plazo en la
clasificación PV ORF L1 es la más conservada de genes en el genoma y por lo tanto, ha
sido utilizado para la identificación de nuevos tipos de PV en los últimos 15 años. Un
nuevo VPH aislado es reconocido como tal si el genoma completo había sido clonado y la
secuencia de ADN de la ORF L1 difiere en más del 10% de los más cercanos conocidos
PV tipo. Las diferencias entre el 2% y el 10% de homología de definir un subtipo y menos
del 2% es una variante. Esta definición se acordó entre todos los científicos que trabajan
acerca del VPH sobre la taxonomía y el diagnóstico en el Taller Internacional del Virus
del Papiloma celebrada en Quebec en 1995.
Nuevos tipos de VPH han sido identificados después de la llegada de la PCR y la
aplicación de degenerar o cebadores consenso. La amplificación de regiones conservadas,
en
su
mayoría
dentro
de
la
ORF
L1,
se
ha
utilizado.
Estos fragmentos parciales suelen ser etiquetados utilizando las iniciales de un
individuo o de laboratorio, seguido de un número de laboratorio (véase, por ejemplo,
Chow y Leong, 1999).
El rápido aumento del número de aislamientos VPH ha puesto claramente de
manifiesto la necesidad de una clasificación taxonómica dentro de la familia
Papillomaviridae. Esta clasificación debe tener por lo menos tres objetivos: (i) Se debe
establecer la relación entre los tipos VPH, (ii) debería comparar el término VPH tipo
contra los términos de la taxonomía de especies y género, que se utilizan para la
sistemática de todos organismos biológicos y aplicado con frecuencia en virología, y (iii)
que debería investigar la relación entre la clasificación taxonómica y biológicos y
patológicos de las propiedades del virus. La comprensión de la relación entre los tipos
VPH sobre la base de la comparación de sus secuencias de nucleótidos empezó a surgir
hace más de 10 años donde se observaron la secuencias de los genes L1y E6 por medio de
22
PCR MY´s (Chan et al., 1995).
En conclusión un tipo nuevo del virus del papiloma humano (VPH) se define como
una VPH cuya secuencia del gene de L1, es al menos el 10% diferente a la de cualquier
otro tipo, mientras que un subtipo es de 2 a 10% diferente de cualquier tipo de VPH.
II. 4 Criterios de géneros y especies
Amplia comparación de secuencias utilizando L1 ORF de 96 virus del papiloma humano
tipos 22 y animal del virus del papiloma ha llevado a la creación de las siguientes
clasificaciones:
1. De orden superior agrupaciones de tipos de VPH (por ejemplo, los genitales
VPH)los cuales habían sido llamado supergrupos ó ramas principales (Myers et al.,
1994; Chan et al., 1995). Por estos taxones, ahora introducen el término''género''.
Diferentes géneros con una secuencia de nucleótidos inferior al 60% de identidad
en la L1 ORF. De larga duración de las secuencias de genomas completos tienen
más de 23%, pero menos del 43% de la secuencia de nucleótidos de identidad
cuando se comparan los géneros de la Papillomaviridae.
2. Baja para las agrupaciones de tipos de VPH (por ejemplo, el VPH-6, 11, 44,55) han
sido llamados ''subgrupos'', ó ramas menores. Por estos taxones, ahora introducen
el término''especie''. Estas especies dentro de un género tiene entre el 60% y el 70%
de secuencias de nucleótidos similares.
3.
Los tradicionales tipos VPH dentro de una especie tienen entre el 71% y el 89%
de nucleótidos dentro de la identidad completa L1 ORF.
La introducción del término''género''es útil, ya que esta expresión conciste ahora en
sustituir una vaga expresión, las principales ramas ó supergroups. A lo largo de la biología,
incluida la virología, géneros específicos suelen unir a las especies, que están claramente
relacionadas filogenéticamente, pero a menudo biológicamente muy diverso. Lo mismo se
aplica a géneros de VPH. Un resumen de las propiedades biológicas conocidas para cada
género se presenta en la tabla 1 , junto con las características específicas de su
organización del genoma en los casos en que se diferencian del patrón típico.
La introducción del término “especie” es biológicamente útil, ya que estos son los
taxones naturales basada en una estrecha relación filogenética de determinados tipos y
debido a que estas especies típicamente globales tipos VPH, que tienen en común
propiedades biológicas y patológicas, un requisito de ICTV directrices. Para dar ejemplos,
todos los tipos de VPH que forman una especie junto con el VPH-2 se encuentran
típicamente en las verrugas comunes de la piel, y todos los tipos de VPH que forman una
especie junto con el VPH-16 son llamados de ''alto riesgo'' ya que estos tipos de VPH se
encuentra en cáncer cervical y sus lesiones precursoras.
23
El tipo de especies han
h
sido elegidos ya sea porque son loss más ampliamente
investigado tipo, o porquee representan mejor la especie, o porque sólo
o hay un tipo en ese
taxón. La figura No 8 es un
u referencia importante que los trozos con ell tipo de especies en
muchos de tipo rico taxones todos los tipos de VPH que pertenecen a la misma especie.
El número de tipos de VPH y completamente se han aislado 96 y see prevee que pronto
supere los 100. Varios info
formes han aparecido recientemente en varioss animales VPH.
Figura 8 Árbol filogenético que contiene los 118 tipos de Virus de Papiloma Humaano. La región L1 ORF
fue utilizada para diferenciar a cada uno. Fueron construidos en el programa de investigación de la
Universidad de Glasgow. El numero
nume del final de las ramas identifica un tipo de virus
rus; c- número refiere al
candidato del tipo del VPH. Toda
odas las demás abreviaciones refieren a los tipos de virus
v
en los animales. El
símbolo semicircular identificaa el género del papiloma virus ejemplo el género alpha-papillomavirus.
a
El
número por dentro del la línea semicircular
s
refiere a la especie del papilomavirus. Parra dar un ejemplo vea la
parte superior de la figura, los
os VPH tipos 7, 40, 43 y 91 juntos son de la especcie 8 del género alphapapillomavirus. Fuente:
II. 5 Epidemiología a niveel mundial del cáncer del cérvix
Cáncer de cérvix es el sép
ptimo en la frecuencia en general, pero el segundo
se
cáncer más
común entre las mujeress en todo el mundo, con una cifra estimada de 493.000 nuevos
casos y 274.000 muertes en
n el año 2002.
En términos generalees, es mucho más común en los países en desarrollo,
d
donde el
83% de los casos ocurren en
e ellos; y el cáncer cervical tiene el 15% dee cáncer en la mujer,
con un riesgo antes de
d los 65 años del 1,5%. En los paaíses desarrollados,
el cáncer de cuello uterino
o representa sólo el 3,6% de los nuevos cáncceres, con un riesgo
acumulado (0 a 64) del 0,8
8%. ( D. Max Parkin, Freddie Bray, J. Ferlay,, et al.2,002)
Como resultado de est
stas tendencias, el cáncer de cuello uterino ha cedido su lugar
como el principal cáncer en
e los países en desarrollo para el cáncer de mama; sólo en el
África subsahariana, Améérica Central, southcentral Asia, Melanesi
esia y es ahora el
24
principal cáncer que afectaan a las mujeres.( Muñoz N, Bosch FX, Shah KV, et. Al, 1995).
En la gráfica No 1 se observa que América Central ocupa la 5ta
5 región, con más
diagnósticos de Cáncer deel cérvix según la incidencia y mortalidad . ( D. Max Parkin,
Freddie Bray, J. Ferlay, ett al.2,002)
ortalidad
Gráfica No 1 Incidencia por edad estandarizada y rangos de mor
del Cáncer del cérv
rvix por 100,000.
Fuente: (©Americaan Cancer Society, Inc.) by on August 15, 2008 caonliine.amcancersoc.org .
II. 6 Epidemiología del cá
áncer del Cérvix en latino América
La alta incidencia de Cán
ncer del cérvix en la región Latino Américaa se observa en las
estadísticas mundiales. Así
A mismo las tendencias en los países en
n desarrollo no han
modificado su incidencia a lo largo de los años. (Restrepo HE. 1993).
Se reconoce la dificulltad en recaudar los datos epidemiológicos de
d esta enfermedad
debido a que el control y registro
re
de algunos países es deficiente.( Alon
nso Patricia de Ruiz,
et al. 2005).
Según los datos obtenidos y publicados por GLOBOCAN 2,000 se
s observa que los
países como Haití, Nicaraagua y Bolivia tienen las más alta tasa de incidencia
in
en Latino
25
América. Guatemala tiene un incidencia similar con México, Honduras,
s, El Salvador y Perú
siendo la tasa por 100,000 del 39 aproximadamente. (Drain PK
K, Holmes KK, et.
Al.2002). ver gráfica No. 2
Gráfica No 2 Inc
ncidencia del Cáncer del Cérvix representado en tasa por
or 100,000, en
los países de Latino Americanos.
A
Fuente GLOBOCAN 2,000.
II.7 Frecuencia del Cánccer del cérvix en Centro América
Según la última estadísticaa del 2,004 de casos reportados en Centro América y México con
Panamá. Se observa que Guatemala
G
tiene la tasa de 39.6 incidencia dee Cáncer del cérvix,
estando la situación similaar en los países de El Salvador, Honduras y México. Nicaragua
tiene la más alta tasa inciidencia del 61.1; caso contrario es Costa Ricca que tiene la más
baja tasa de incidencia de la región. ( Alonso Patricia de Ruiz, et al.2,0
005) Ver Cuadro No
2
II. 8 Informe epidemioló
ógico del Cáncer del Cérvix en Guatemala
Según los datos presenta
tados por el Instituto Nacional de Cancerrología INCAN de
Guatemala, en el año 2,0
004. Se establece que la mayor frecuencia de tumores, según
localización en las mujeres,
s, es el cáncer Invasivo del cérvix en un 39.6
.6 % . Seguida por el
Cáncer In-situ del cérvix, que es un estadio previo al cáncer invasivo 7.8.
7 Ver Gráfica No
3.
Se observa que la suma
ma de los casos de cáncer invasivo e In-situ dell cérvix da el 47.4%
del total de los tumores según
s
localización del cuerpo en las mujere
res que asistieron al
INCAN de Guatemala.( Instituto Nacional de Cancerología “Bernaardo del Valle” de
Guatemala, 2,004)
26
Cuadro No 2 Incidencia del Cáncer del cérvix representado poor tasa
por 100,000 en países de Centro América, México y Panamá. Fuent
nte
GLOBOCAN
N 2000.
Así mismo se observa la
l tendencia del cáncer del Cérvix según las
as localizaciones del
cáncer en mujeres desde ell año 1995 al 2004. Siendo en primer lugar eel cáncer del cérvix;
situación que no ha modifiicado a lo largo de estos años. Ver gráfica No4.
No
( Instituto Nacional de Can
ncerología “Bernardo del Valle” de Guatemalla, 2,004).
Gráfica No 3
Grá
04.
Gráfica No 3 Reegistro del Hospital INCAN de Guatemala del año 2,004.
Representa en porceentaje los casos según tipo del cáncer del sexo femeniino. El
cérvix representa ell 39.6%.Fuente Registros anuales del INCAN de Guattemala
http://espanol.geociities.com/registrocancer_guate/.
27
Gràfica No 4
Gráfica No 4 Registro Hospitalario del INCAN de Guatemalaa del año 2,004.
Representan lass tendencias según los tipos de cáncer en el sexo femeenino desde 1995
hasta 2,004. Se observa que el cáncer del cérvix tiene el primer lugaar y la incidencia
ha sido similar, representado
r
en la línea roja superior.
Fuente Registro
os anuales del INCAN de Guatemala
http://espanol.geeocities.com/registrocancer_guate/.
II.9 Pruebas del ADN deel VPH
La identificación de Tiposs de los VPH, como causantes del cáncer del cérvix y en lesiones
precursoras del mismo deenominadas en conjunto preinvasivas. Es imp
portante conocer y
aplicar, con una metodollogía sensible y específica, la tipificación del VPH en áreas
diferentes del mundo; ya que
q podrían servir como marcadores molecullares para establecer
medidas preventivas, curaativas y persistentes de la infección posteriorr a tratamientos.(H.
Zur Hausen, 2002).
Diversas técnicas se utilizan para la detección de ADN de VPH
H: (i) Métodos de
sondas directas, tales como
mo hibridación in situ, (ii) Métodos de amp
plificación de señal,
tales como la captura híbrrida 2 (HC2) , y (iii) amplificación de objetivo, realizado por una
variedad de PCR basado en las técnicas. Genotipo, ITP se están sigguiendo la señal de
lectura de los métodos, como
c
el análisis de secuencias, longitud dee los fragmentos de
restricción polimórficos análisis, o tipo de hibridación con son
ndas específicas de
diferentes formatos, tales como
c
la membrana a base de invertir la líneaa blot (RLB) ensayo.
Recientemente, varios RLB
B ensayos basados en diferentes Protocolos de PCR con primer
MY09/11 (Gravitt et al , 1998),
1
SPF , o GP5_/6_ (Van de Brule 2,002
2) Los cuales se han
desarrollado y validado.
set (el retroceso es
GP5_/6_-RLB generaal emplea el primer GP5_/bio6_ primer se
28
GP6_primer biotina) para amplificar una gran variedad de tipos de VPH mucosatropic.
Después de PCR amplificación, las secuencias de VPH son detectados por inmunoensayo
enzimático (EIA), y la posterior tipificación se realiza por la hibridación de la biotina PCR
productos con el tipo específico de oligonucleótidos inmovilizadas en membranas seguido
de su detección utilizando una mayor reacción de quimiluminiscencia. Debido al formato
de las líneas mancha tiras, los actuales ensayos están restringidos a un máximo de
alrededor de 40 sondas de oligonucleótidos por la hibridación y la reacción dependerá de
lectura visual de la señal. Luminex (xMAP) la suspensión gama de tecnología se basa en
bolsas de polietileno con un diámetro de 5,6 cm. que son internos teñidas con diferentes
coeficientes de dos espectralmente diferentes fluoróforos. Por lo tanto, una gama de 100
diferentes juegos con bolas de absorción específica Spectra es creado. Diferentes
moléculas, como la individual sondas de oligonucleótidos, puede ser enganchado a
diferentes conjuntos de bolas. Estos conjuntos se combinan con una suspensión serie y,
debido a sus únicos espectros de absorción, permite hasta 100 diferentes sondas que se
medirán simultáneamente en una misma reacción (multiplexado). La tecnología es capaz
de realizar ambas proteínas y ácidos nucleicos basada en análisis.
En cuanto a las proteínas análisis, el desarrollo de la serología del VPH multiplex ha
sido recientemente descrita (Waterboer, T. et al 2005). Detección de ácidos nucleicos
Luminex utilizando la tecnología se ha descrito anteriormente. Recientemente, la
tecnología ha sido empleada para la determinación del genotipo de 45 tipos de VPH
usando PCR productos generados con PGMY09/11-PCR .
Este ensayo, sin embargo, ha demostrado una reducción de la sensibilidad para
identificar los de alto riesgo, los tipos de VPH en lesiones cervicales en comparación con
el HC2 ensayo (60,9% versus 81,8%). Hemos desarrollado múltiplex genotipo VPH
(MPG), a base de alto rendimiento que el método de hibridación permite la detección
simultánea y genotipificación de hasta 100 Tipos de VPH. Se describe su aplicación a 15
de alto riesgo Tipos de VPH, 1 putativo de tipo del alto riesgo VPH, y los 6 más
prevalentes de bajo riesgo, los tipos de VPH. En comparación con RLB, MPG parece ser
más sensible para la detección de VPH en GP5 / 6-PCR productos de muestras clínicas, y
es adecuado para epidemiológica y también aplicaciones para el diagnóstico. (Partes de
este trabajo se han presentado como un cartel en el 22a Conferencia Internacional del
Virus del Papiloma, Vancouver, Canadá, mayo de 2005.)
II.10 Secuenciación del ADN
Finalmente, para determinar el tipo del VPH en todas aquellas muestras que hay duda en el
PCR ó que los primers no estén diseñadas adecuadamente se realiza la técnica de
secuenciación directa de los productos de la PCR mediante el kit de Thermo Sequenase
Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing (Amersham Pharmacia Biotech) y marcaje con
fósforo 33 (Amersham Pharmacia Biotech).28 Se realizó electroforesis en gel de
acrilamida 8%, urea 7M, a 1 800 volts. Para determinar el tipo viral, la secuencia obtenida
se incorporó a un banco de datos (BLAST) para su comparación con las secuencias del
ADN existentes del VPH.(Adela Carrillo et. Al. 2004).
29
II.11 Importancia de la Prueba del ADN del VPH en la Medicina clínica
El screening ó tamizage del cáncer cervical sobre la base de pruebas para el virus del
papiloma humano (VPH) aumenta la sensibilidad de detección de alto grado (grado 2 o
3) la presencia de neoplasia intraepitelial cervical, pero si este aumento representa
sobrediagnóstico o la protección contra el futuro de alto grado la neoplasia cervical o de
cuello uterino el cáncer es desconocida.
En un estudio realizado en Suecia , en una población de 12,527 mujeres entre 32 a 38
años de edad fueron asignados aleatoriamente en una proporción de 1:1 para tener una
prueba del VPH además de un Papanicolaou (PAP) prueba (grupo de intervención) o una
prueba de Papanicolaou por sí sola (grupo control).
Las mujeres que hayan dado positivo en VPH y una prueba de Papanicolaou normal, se
les ofreció una segunda prueba del VPH por lo menos 1 año más tarde, y los que resultaron
ser persistentemente infectados con el mismo alto el tipo de VPH se ofreció entonces
colposcopia con biopsia de cuello uterino. (Pontus Naucler, et al. 2,007)
La sensibilidad de Papanicolaou más la prueba de VPH aumenta en un 51% en las
pacientes con Lesiones NIC 2 ó 3 que las que no se utilizaron. Así mismo se sabe de la
importancia de las pacientes con Papanicolaou con ASCUS, en el cual se ha detectado el
70% la presencia del VPH; siendo esta la mayor utilidad clínica en los departamentos de
colposcopia (Apgar et al. 2,003)
Sin embargo se ha establecido la utilidad en mujeres arriba de 30 años, ya que se han
observado que aún los VPH de alto riesgo han sido pasajeros su presencia en lesiones de
bajo grado, como NIC I.(Cuzick J. et al: 1999).
La sensibilidad mediana de la prueba del VPH en mujeres con NIC 2 ó NIC 3 y
enfermedad invasora fue del 93%, a diferencia de 75 % con solamente el frotis
convencional del Papanicolaou.(Schiffman, et al: 2000).
Por lo tanto la Prueba de VPH se ha utilizado en la práctica médica y clínica:
1. Pacientes mayores de 35 años, practicándola cada 2 a 3 años
2. Pacientes con Papanicolaou con diagnóstico ASCUS
3. Pacientes tratadas con conización por Ca Insitu ó Lesiones de alto Grado
recurrentes. (Apgar et al. 2,003).
II. 12 Vacunas contra el VPH
La comprensión de la patogénesis molecular del VPH la infección es importante para la
elección de la vacuna contra objetivos figura No. 1. VPH viriones consistirá en una sin
envoltura cápside que contiene las principales proteínas estructurales L1, junto con la
cápside menor de proteínas L2l.En el desarrollo del cáncer del cérvix, ocurren cambios a
nivel del epitelio del cérvix, respondiendo el tejido a los cambios tales como infección del
Virus del Papiloma Humano. Tales respuestas ocurren en los Linfocitos T citotóxicos,
Ayudadores, Células asesinas Naturales y macrófagos.(J. Berumen, N. Villegas, 1997).
Sin embargo estas células de defensa celular actúan cuando las lesiones son de Bajo
Grado ó conocidas como LIEBG, ya que el virus puede dejar a nivel de la membrana
celular huésped del cérvix antígenos que los puede reconocer el sistema de defensa celular.
Se ha propuesto 2 tipos de vacunas contra el VPH las terapéuticas y las de prevención
(siendo estas últimas las más efectivas).
Hay dos tipo de vacunas propuestas: las Terapéuticas y las Preventivas. Que pueden
30
disminuir el desarrollo de las células con neoplasias a partir de células ya infectadas ó en
las segundas proteger al huésped de la infección del VPH . (Berumen Villegas,1997)
II. 12.1 Vacunas terapéuticas
Vacunas terapéuticas están dirigidas a erradicar o reducir las células infectadas. Estrategias
iniciales dirigidas a la eliminación de residual de células malignas en pacientes con cáncer
de cuello uterino, aunque la prevención de la progresión de HSIL, de bajo grado SIL
(LSIL), o incluso citológicamente las células normales son todos los posibles criterios de
valoración. Las vacunas terapéuticas se han utilizado también como un enfoque para
erradicar las verrugas genitales. (Zhou, J., Sun, X. et al.1991).
Una vez que la infección por VPH ha ha establecido es poco probable que los
anticuerpos participará en la erradicación de las células infectadas. Linfocitos T citotóxicos
(CTLs) los principales efectores del rechazo del tumor. Hay muchas estrategias para
generar CTLs, que la participación de todos los antígenos que causan células presentadoras
(APC) para el proceso tumoral o antígeno vírico y lo presentará en el contexto de MHC del
receptor, junto con adhesión y moléculas estimuladoras para estimular linfocitos
antitumorales. En muchos casos el VPH asociados a tumores sólo expresar la E6 y E7
Oncoproteínas, con lo que la mayoría de los esfuerzos se han centrado en obtener CTLs
contra E6 o E7. (Berumen Villegas, 1997).
Estas proteínas virales se expresan también en toda una epitelio que está
experimentando lítico la replicación viral. Es incierto, sin embargo, si estas proteínas se
expresan en células basales. Dado que las células basales son capaces de proliferación, es
posible que sólo E1 y E2 se expresan a mantener la genoma viral. CTLs reacciona frente a
antígenos de la cápside podría tienen un papel en la reducción de la magnitud de la
infección, pero no ser eficaces en la orientación células neoplásicas.
II. 12.2 Vacunas preventivas
La familia de VPH genital se compone de 35 diferentes tipos. Estos tipos de VPH se
dividen en alto riesgo (asociados con el desarrollo de cáncer anogenital) y de bajo riesgo
(relacionados con el desarrollo de displasia y anogenital verrugas, pero rara vez el cáncer).
Cuatro tipos de VPH se han asociado con la mayoría de VPH relacionados con la
enfermedad clínica. Los VPH tipos 16 y 18 causan aproximadamente el 70% de los
cánceres cérvico-uterinos, VPH-6 y VPH-11 causa aproximadamente el 90% de los
genitales verrugas (hombres y mujeres) y los tipos HPV-6/11/16/18 juntos causan una
proporción significativa de Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) que conducen a
Papanicolaou anormal (PAP) smears. El vínculo bien establecido entre el VPH y
anogenital los cánceres de alto y bajo grado de displasia y las verrugas genitales, ha
conducido al desarrollo de profilácticas Vacunas contra el VPH.
Recientes estudios en mujeres adultas jóvenes han demostrado que la administración
profiláctica de virus como de partículas (VLP) vacunas basadas en la cápside L1 del VPH
son proteínas altamente eficaces y immunogenicas.( Keith S. Reisinger, MD, MPH,* Stan
L. Block, MD, Eduardo Lazcano-Ponce , 2007)
31
II. 13 Futuro de las investigaciones de la tipificación del VPH
Cada vez más se ha interesado en la investigación del VPH y su comportamiento del
mismo en el cérvix; como agente biológico que desencadena lesiones preinvasivas e
invasivas. El diagnóstico clínico de la presencia del VPH en lesiones preinvasivas,
especialmente VPH de Alto Riesgo, sin embargo el costo es alto en relación a la
accesibilidad de nuestra población.
La necesidad de estandarizar métodos de biología Molecular parece ser una pronta
solución en relación a costo beneficio. Uno de los métodos que se han estado probando es
PCR-Multiplex con el uso de los primers en grupos de 5 a 6 por corrida en gel ;
evidenciando la presencia tanto de Virus de Bajo como Alto Riesgo. ( Waterboer, T. et al
2005).
Una de las pruebas automatizadas es la Captura Híbrida de segunda generación, siendo
esta de alto costo, sin embargo es de alta sensibilidad y especificidad. Se realiza en un
período de tiempo de aproximadamente 2 horas. (Cox JT, AT Schiffman MH, et al: 1995).
Realizar estudios de ADN VPH en poblaciones que han sido vacunadas, es importante
el seguimiento de las mujeres en especial, ya que se evaluaría el control de costo-beneficio.
Lamentablemente estos estudios serían de mayor impacto en las poblaciones más pobres,
quienes no tienen por el momento accesibilidad a la vacunación. (Alonso Patricia de Ruiz
b
, et al. 2005).
32
TABLA No 1
33
PARTE III
RESULTADOS
III. 1 Detección de Virus de Papiloma Humano según tipo de Lesión histopatológico
del Cérvix
De las 99 muestras obtenidas de pacientes, con algún tipo de lesión en cérvix, fueron
procesadas por medio de PCR, para detectar el Virus de Papiloma Humano con primers
universales MY´s 09/11 y HBO1 y así mismo PCR LC1/LC2 y GP5 y 6 Todos estos para
evidenciar cualquier tipo de VPH.
Se detectaron 32 muestras positivas para VPH en 45 casos con Lesión Intraepitelial de
Bajo Grado (LEIBG) representando el 71 %. Así como 23 muestras fueron positivas de 28
casos de Lesión de Alto Grado (LEIAG), ó sea el 82.14% . Por último 25 muestras fueron
positivas de 26 casos con Càncer Invasivo del Cérvix representando el 96.15%. Véase
Cuadro No3 y gráfica No 5
Cuadro No 3 Detección de Virus del Papiloma
Humano según tipo de lesión Histopatológica del
cérvix
Lesión Preinvasiva
LEIBG
LEIAG
Càncer Invasivo
TOTAL
VPH
positivo
32
23
25
80
VPH
negativo TOTAL
13
45
5
28
1
26
18
99
Fuente: Libro de datos del labotatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma Humano por medio de PCR MY09-11-HBO1 en ADN extraído en muestras
del Cérvix de pacientes con diagnósticos de Lesión Intraepitelial de Bajo Grado,LEIBG, Lesión Intra epitelial
de Alto Grado LEIAG y de Cancer Invasivo.
Formula NoCasos positivos(LEIBG, LEIAG ó Cáncer Invasivo del Cérvix)X 100= %
No Casos Totales (LEIBG,LEIAG ó Cáncer Invasivo del Cérvix)
Se reprensentan estos porcentajes en el gráfico No 5
III. 2 Detección de los virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo según tipo de
Lesión Histopatológica en cérvix.
Así mismo se detectaron los VPH de Alto Riesgo en las muestras, según el tipo de
lesión Histopatológica en Cérvix (LEIBG, LEIAG y en Cáncer Invasivo del cérvix).
34
% de casos positivo y negativo
Gráfica No 5 Porcentaje de casos positivos y
negativos de VPH según tipo de lesión histológica
en cérvix
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
LEIBG
LEIAG
Càncer
Invasivo
VPH Positivo %
71,11
82,14
96,15
VPH Negativo %
28,89
17,86
3,85
Fuente: Libro de datos del labotatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma Humano por medio de PCR MY09-11-HBO1 en ADN extraído en muestras
del Cérvix de pacientes con diagnósticos de Lesión Intraepitelial de Bajo Grado,LEIBG, Lesión Intra epitelial
de Alto Grado LEIAG y de Cancer Invasivo. A mayor tipo de lesión mayor detección del VPH. Los casos
negtivos se representan en línea roja y los positivos de color azul.
Cuadro No 4 Detección de los Virus del Papiloma Humano de Alto y Bajo Riesgo
según tipo de lesión Histopatológica en Cérvix.
Lesión Preinvasiva
LEIBG
LEIAG
Cáncer Invasivo
VPH Alto
Riesgo
24
17
25
66
VPH Bajo
Riesgo
8
6
0
14
Fuente: Libro de datos del labotatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma Humano por medio de PCR y Secuenciación de genes del VPH en ADN
extraído en muestras del Cérvix de pacientes con diagnósticos de Lesión Intraepitelial de Bajo Grado,LEIBG,
Lesión Intra epitelial de Alto Grado LEIAG y de Cancer Invasivo.
Se detectó el VPH de Alto Riesgo en los tres tipos de Lesiones del cérvix; en el 75%,
73.15% y 100% para LEIBG, LEIAG y Cáncer Invasivo del Cérvix respectivamente.
Veáse Gráfica No 6
Para lo cuál se aplicó la siguiente fórmula y estableciendo los respectivos porcentajes
mencionados anteriormente.
No VPH de Alto riesgo de cada Grupo de lesiones X 100= ______%
T
No VPH de Alto riesgo = Número de Muestras positivas para HPV de alto riesgo de cada
grupo de lesiones (LEIBG, LEIAG y Càncer Invasivo del Cérvix)
T = Totalidad de Muestras positivas para HPV de cada grupo
35
% de VPH de Alto y Bajo riesgo
Grafica No 6 Porrcentaje de VPH de Alto y Bajo Riesgo según
n
tipo de Lesión Histológica en cérvix
100,00
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
LEIBG
LEIAG
VPH Alto riesgo
75,00
73,91
Cáncer
Invasivo
100
VPH bajo Riesgo
25,00
26,09
0
Fuente: Libro de datos del labota
otatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma
oma Humano por medio de PCR y Secuenciación de genes
g
del VPH en ADN
extraído en muestras del Cérvix de pacientes con diagnósticos de Lesión Intraepiteliall de Bajo Grado,LEIBG,
Lesión Intra epitelial de Alto Grrado LEIAG y de Cancer Invasivo. Expresado en porrcentaje. Las barras azul
representan VPH de alto riesgo
o y las rojas VPH de bajo riesgo. Está anexa en estta figura un cuadro que
representa los porcentajes respecctivos a cada lesión Histopatológica del cérvix
III. 3 Tipificación de Virus del Papiloma Humano de Alto Rieesgo según tipo de
Lesión Histopatológ
gica en Cèrvix.
Se efectuó la tipificación d
de todas las muestras positivas para VPH, en
e el Laboratorio de
Biología Molecular del Inst
stituto Nacional de Cancerología ubicado en México D.F. Los
datos obtenidos se presenttan en la siguiente tabla, donde se indican
n los Virus de Alto
Riesgo según el tipo de lesiión Histopatológico en cérvix.
Los tipos de VPH de Allto riesgo detectados fueron 16, 58, 18, 59, 53
3,31, 51, 39, 56, 33,
66 y 52. Encabezando la
l lista el VPH tipo 16 en las lesiones
es Histopatológicas,
representando el 50%, 47%
% y 60 % en las lesiones LEIBG, LEIAG
AG y Càncer Invasivo
respectivamente.
Los otros tipos varían su frecuencia dependiendo del tipo de lesión
n histopatológica, el
tipo 58 y el 18 tienen el seggundo y tercer lugar respectivamente. Vease el
e cuadro No 5
36
Cuadro No 5 Tipos de Virus del Papiloma de Alto Riesgo según tipo de Lesión
Histopatológica en cérvix.
Tipo de
Lesión/
VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH
Tipo de
16
58
18
59
53
31
51
39
56
33
66
52 TOTAL
VPH
12
2
1
1
3
1
1
2
1
0
0
0
LEIBG
24
8
3
2
0
0
1
2
0
0
1
0
0
LEIAG
17
Cáncer
15
1
2
3
1
1
0
0
0
0
1
1
Invasivo
25
35
6
5
4
4
3
3
2
1
1
1
1
TOTAL
66
Fuente: Libro de datos del labotatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma Humano por medio de PCR y Secuenciación de genes del VPH en ADN
extraído en muestras del Cérvix de pacientes con diagnósticos de Lesión Intraepitelial de Bajo Grado,LEIBG,
Lesión Intra epitelial de Alto Grado LEIAG y de Cancer Invasivo. Especificando el tipo de VPH y su
frecuencia..
Se analizó la presencia de cada VPH de Alto Riesgo dependiendo de la lesión
Histológica en base a porcentaje los cuales se establecieron de la siguiente manera:
No cada tipo de VPH de alto riesgo
_____________________________ x 100 %
T Muestras según Tipo de Lesión
37
Gráfica No 7 Po
orcentaje de tipos de VPH de Alto Riesgo seggún tipo de lesión
Histológica del cérvix
60,00
Porcentaje de VPH de alto Riesgo
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
LEIBG
VPH
16
50,00
VPH
18
4,17
VPH
59
4,17
VPH
53
12,50
VPH
31
4,17
VPH
51
4,17
VPH
39
8,33
VPH
56
4,17
VPH
33
0,00
VPH
66
0,00
VPH
52
0,00
LEIAG
47,06 17,65 11,76
0,00
0,00
5,88
11,76
0,00
0,00
5,88
0,00
0,00
12
4
4
0
0
0
0
4
4
Cáncer Invasivo
60
VPH
58
8,33
4
8
Fuente: Libro de datos del labota
otatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo, por medio de PCR y Secue
uenciación de genes del
VPH en ADN extraído en muesttras del Cérvix de pacientes con diagnósticos de Lesió
ión Intraepitelial de Bajo
Grado,LEIBG, Lesión Intra epittelial de Alto Grado LEIAG y de Cancer Invasivo. Especificando
Es
el tipo de
VPH en porcentaje
38
Gráfica No 8 Tipos de Virus de Papiloma Humano de Alto Ries
iesgo según
tipo histopatológico de cáncer invasivo del Cérvixx
14
12
Típo de VPH
10
8
6
4
2
0
Epidermoide invasivo
Adenocarcinoma invasivo
VPH 16
14
1
VPH 59
3
VPH 18
1
VPH 58
1
VPH 31
1
VP
PH 66
1
VPH 52
1
VPH 53
1
1
Fuente: Libro de datos del labota
otatorio de la Facultad de Ciencias Médicas, USAC, CUM.
Detección del Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo, por medio de PCR y Secue
uenciación de genes del
VPH en ADN extraído en muestr
tras del Cérvix de pacientes con diagnóstico de Cancerr Invasivo. Según el tipo
Histopatológico Epidermoide y Adenocarcinoma.
A
39
III. 5
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
1.
En las 99 muestras de pacientes del estudio, se observó diferencia en el porcentaje
de detección del VPH, dependiendo del tipo Histológico de Lesión en cérvix .
preinvasiva (LEIBG y LEIAG) ó Càncer Invasivo de Cèrvix. Ya que la LEIBG se
detectó el virus en 71.11 % , en LEAG el 82.14% y en Càncer invasivo del Cérvix
en el 96.15 %. Ver Cuadro 3 y Gráfica No 5, páginas 34 y 35.
2.
A todas aquellas muestras de pacientes con positividad para VPH, se procedió a
Tipificar Los Virus de Alto Riesgo , por medio de PCR y Secuenciación de los
genes del VPH, logrando así detectar a los que tienen VPH de Alto Riesgo y los de
Bajo Riesgo. En las muestras con LEIBG se detectaron el 75% con Virus de Alto
Riesgo, en LEAG el 73.91% y en Càncer Invasivo del Cèrvix el 100%. Observando
así la presencia de VPH de alto riesgo en todos los casos de Càncer Invasivo del
Cèrvix. Ver cuadro 4 y Gráfica No 6 páginas 35 y 36.
3.
La tipificación de VPH de Alto Riesgo en las muestras fueron detectados los
siguientes virus: 16, 58, 18, 59, 53, 31, 51, 39, 56, 33, 66 y 52. Observando la
presencia en primer lugar del VPH 16 en todas las Lesiones Histopatológicas del
cérvix, estando presente en LEIBG en el 50% , en LEIAG en el 47.06% y en
Cáncer Invasivo del Cérvix en el 60% . Ver cuadro No 5 y Gráfica No 7, páginas
37 y 38.
4.
Se tipificaron los VPH de Alto Riesgo en las muestras con lesiones de Cáncer
Invasivo del Cérvix, de diferente histopatología: Epidermoide y Adenocarcinoma,
no hubo casos mixtos reportados en el presente estudio. En los casos de Cáncer
Epidermoide y adenocarcinoma se detectaron tanto el VPH tipo 16 así como el VPH
tipo 18. Sin embargo se detectaron otros tipos de VPH en las muestras de pacientes
con Càncer Invasivo epidermoide siendo en segundo lugar de frecuencia el VPH 59;
el VPH 18 y 58 ocupan el tercer lugar en frecuencia. En algunos estudios de España
ha encontrado al VPH 18 en tercer lugar, no así en otros países donde este ocupa el
segundo lugar.Ver cuadro No 6 y Gráfia No 8, páginas 38 y 39.
40
PARTE IV.
IV.1
CONCLUSIONES
1. Existe la presencia del Virus del Papiloma Humano, VPH, tanto en Lesiones
Preinvasivas, denominadas LEIBG y LEIAG así como en Cáncer Invasivo del
cérvix. A mayor grado de lesión mayor Número de casos positivos de VPH. De tal
manera que las muestras de pacientes con Cáncer invasivo tienen el 96.15% de
positividad para VPH. El VPH es un agente biológico causante tanto de lesiones
preinvasivas como invasivas.
2. Los Virus del Papiloma Humano denominados de Alto Riesgo se encuentran en las
lesiones preinvasivas así como en Cáncer invasivo del cérvix. Para las Lesiones
Preinvasivas no hubo diferencia significativa, con respecto a la presencia de VPH
de Alto riesgo. En las Lesiones Preinvasivas llamadas LEIBG se detectaron el 75%
y en LEIAG el 73 % .
3. las muestras de pacientes con Càncer Invasivo del cérvix tienen VPH de Alto
Riesgo en el 100% . Concluyendo que los VPH de Alto Riesgo pueden tener la
capacidad de transformar las células del cérvix desde lesiones preinvasivas hasta
invasivas.
4. Dentro de los VPH de Alto Riesgo se detectó más frecuentemente el tipo 16; el
cual invariablemente encabeza su presencia en cada tipo de Lesión preinvasiva e
invasiva. Se concluye que el VPH 16 es el más peligroso agente causal biológico
del cáncer del Cérvix.
5. La presente investigación detectó VPH de Alto Riesgo en más muestras de
pacientes con lesiones Invasivas de tipo histológico Epidermoide, que en
Adenocarcinoma las cuales fueron 2 muestras solamente. El VPH 16 y 18 fueron
detectados en ambos tipos de lesiones Invasivas.
41
IV.2
RECOMENDACIONES
1. En base a la información obtenida en la tipificación , por secuenciación de genes del
VPH, se recomienda realizar estudios , por secuenciación de genes virales, para
determinar la Variedad y subtipo de estos. Ya que según estudios en otros países
hay variedades y subtipos de VPH más agresivos ó peligrosos.
2. Se recomienda
realizar estudios de PCR multiplex, ya que algunos estudios
sugieren que una misma muestra con lesiones preinvasivas e invasivas pueden tener
coinfección, es decir tener dos ó más tipos de VPH. Dando una cobertura a todas
las posibles asociaciones de estos. El presente estudio sólo puede detectar 1 tipo de
VPH en cada muestra, ya sea por PCR simple ó por secuenciación.
3. Proponer en los protocolos de manejo, en clínicas de detección del cáncer del
cérvix, la implementación del test de VPH.Como método diagnóstico molecular de
control y seguimiento especialmente en lesiones preinvasivas del cérvix.
4. Como medida preventiva hacer la sugerencia al Ministerio de Salud pública para
iniciar campañas de vacunación contra el VPH. Sin embargo, hacer la advertencia
de que se necesitan más estudios de control en poblaciones vacunadas contra el
VPH y la posibilidad de que ocurran casos de cáncer secuendarios a otros tipos de
virus del papiloma que no proteja estas vacunas.
5. A la población femenina realizar Papanicolaou anualmente y seguir las
recomendaciones al momento de recibir el resultado; ya que dependiendo del
mismo se debe complementar el estudio con la Colposcopía y la prueba del Virus
del Papiloma Humano.
42
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÌCAS
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Cáncer Cervicouterino diagnóstico, prevención y control. 2 ed. México:
Panamericana, 2005. (pp 57- 66).
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Cervicouterino en América Latina. En Cáncer Cervicouterino diagnóstico,
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3. Alonso de Ruiz Patricia, Lazcano, et al. Estudios para la detección del cáncer
cervicouterino: nuevas alternativas e investigación. En Cáncer
Cervicouterino diagnóstico, prevención y control. 2 ed. México:
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34. World Health Organization, WHO Mortality Databank. Internet adress: htt://wwwdep.iarc.fr/dataava.htm.
45
IV.4 ANEXOS
46
INDICE DE ANEXOS
INDICE
1.- Extracción de ADN de frotes cervicales con cepillado
Ecto y endocervical y/ó cultivos de células.
2.- PCR Beta Globina
3.- PCR MY09/MY11
4.- PCR LC1 Y LC2
5.- PCR GP5/GP6
6.- PCR LCR HPV 16
7.- PCR HPV 16 E6 (Hz27/Hz28)
8.-PCR HPV 18 F7405/R 165
9. PCR HPV 18 E6-5´BAMH1/E6´Ecori
10.-SECUENCIACIÓN DE GENES DEL VPH
11.- SECUENCIAS DE ADN OBTENIDAS DE MUESTRAS
12.- FOLLETO DE INFORMACIÓN A LA PACIENTE
13.- CONSENTIMIENTO INFORMADO
14.- BOLETA DE RECOLECCIÓN DE DATOS DE LAS PACIENTES
Pag 48
Pag 50
Pag 51
Pag 52
Pag 53
Pag 54
Pag 55
Pag 56
Pag 57
Pag.58
pag 60
pag 83
pag 85
pag 86
47
ANEXO 1
EXTRACCION DE ADN DE FROTES CERVICALES CON CEPILLADO
ENDOCERVICAL Y/O CULTIVOS DE CÉLULAS
Las células del frote se transportan en frascos con PBS aproximadamente 200 a 300 µl.
Si se desea que perdure deberá almacenarlo en congelador a menos 70 °C si no a menos 20
°C para que se preserve por 6 a 12 meses.
En caso de cepillados cervicales:
Colocar el microtubo (con cepillo y muestra) en vortex por 3 minutos
Separar en dos tubos 1 con el citobrush y el otro con el residuo que dejó el citobrush.
Agregar buffer lisis 600 ul Temperatura ambiente + proteinasa 10 ul
Termoblock 37 grados a 450 RPM por 1 noche
Mezclar fenol ph de 8, a 4 °C, 600 ul vortex, centrifugar a 13,000 RPM 24°C en 10
minutos.
Recuperar la fase superior y colocarlo en otro nuevo
Agregar 600 ul cloroformo isoamílico 24:1 a 4 °C vortex, centrifugar 13,000 RPM
24 °C en 10 minutos.
Recuperar fase superior y colocarlo en uno nuevo
Agregar etanol 100% 600 ul se divide si no cabe la solución y agregar Acetato de
amonio (-20°C) 8 M.
Si se tienen congelador a menos 70 °C dejarlo una hora, de lo contrario dejarlo toda
la noche a menos 20°C.
Centrifugar a 14,000 RPM, 4°C, 30 minutos
Eliminar la fase líquida, se observa pellet blanco, algunas veces no es visible.
Agregar etanol frio 70% 400 ul, centrifugar 14,000 RPM 4°C , 15 minutos
Vaciar el etanol y agregar nuevamente etanol 400ul frío, centrifugar a 14,000 RPM,
4°C, 15 minutos.
Vaciar el contenido, dejarlo evaporar el residuo de etanol en termoblock a 55 °C
con tapadera abierta sin agitador.
El pellet se observa seco, agregar agua 100 ó 50 ul , dependiendo del pellet.
Cuantificar DNA, 77 agua+ 3 ml del ADN.
Dependiendo de esto diluir el ADN en alícuota de 50 ng/µl y continuar con el
protocolo de PCR
Cuantificación del ADN
Se cuantifica el ADN en el espectrofotómetro, se prepara en otro tubo 77ul de agua estéril
más 3 ul del ADN, Realizar la lectura introduciendo en la cubeta los 80 ul de la mezcla y
leerlo. Idealmente debe tener pureza de 1.5 a 2 y concentración 200 ng/ul. Deberá
calibrarse el espectrofotómetro entre 260/280
48
Puede dejarse la muestra a temperatura ambiente para procesarse el PCR. Ó a menos 20 °C
Previo a efectuarse el PCR para HPV las muestras de ADN deberá estar a una
concentración de 50 ng/ul. Podrá utilizar la fórmula siguiente
V1C1= V2C2
V2= V1C1
C2
V2 volumen de la muestra a la que hay diluir en cierto volumen por ejemplo 30 ul
Ejemplo Si tenemos un muestra con 705 ng/ul de ADN Debemos hacer dos diluciones,
primero llevarla a una concentración 200 ng/ul y después a 50 ng/ul.
V2= 30ul x 200ng/ul= 8.5 ul
705 ng/ul
8.5 ul es la cantidad que hay extraer del frasco con el ADN a concentración 705 ng/ul. Y
diluirlo en 21.5 ul de H20 para tener un volumen total 30 ul.
Luego diluir esta concentración a 50 ng/ul, de la siguiente manera:
V2=30ul X 50ng/ul= 7.5 ul
200 ng/ul
Agregarle 22.5 ul de H20 para llevarlo a un volumen total de 30 ul.Si las muestras tienen
menor de 90 ng/ul tomarlo directamente.
49
ANEXO 2 PCR Beta Globina
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control (Hella ó Silha) + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x ______= ________
1.6ul x ______=_________
MgCl2
Primer 50pmol GH20 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol PCO4 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.13ul x ______=_________
3.87ul x ______=_________
H20
TOTAL 10 ul
ADN muestra (50ng/ul) en total 200 ng/ul = 4 ul
*primers ver en tabla No 2 La secuencia de los mismos
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 40 segundos
55°C 40 segundos
72°C 55 segundos
30 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5Ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador (100bp) ,
Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras. Dejarlo a 100 Voltios
por 45 minutos.
Tomar foto en el transiluminador de Rayos Ultravioleta.
Tabla No 2 primers ó cebadores para análisis de B-globina
PRIMER
tamaño
Secuencia 5´ - 3´_____________
GH20
20
GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC
PCO4
20
CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC____
Nota Todas las muestras deberán evidenciar el gen Beta Globina para evidenciar la calidad
del ADN extraído. Si no empezar de nuevo el procesamiento desde el paso 4 de la
extracción del ADN (llevarlo a 400 ul)
50
ANEXO 3
PCR MY09/MY11
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x ______= ________
1.8ul x ______=_________
MgCl2
Primer 50pmol MY09 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol MY11 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol HMBO1 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.15ul x ______=_________
3.45ul x ______=_________
H20
TOTAL 10 ul
*Ver abajo tabla No 3 La secuencia de los mismos para MY09 y MY11
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 50 segundos
49°C 50 segundos
72°C 55 segundos
38 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador (100bp) ,
Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras. Dejarlo a 100 Voltios
por 45 minutos. Tomar foto en el transiluminador de Rayos Ultravioleta.
TABLA No 3 Primers ó cebadores para análisis de REGIÓN MY
Primer
tamaño
secuencia 5´ - 3
__________________________________________________________
MY 09
20
CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC
MY 11
20
GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG
HMB01
20
GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT
Nota Todas las muestras que salgan negativas deberán ser sometidas al PCR L1C1 y C2.
Las Positivas pasarán a ser tipificadas
51
ANEXO No 4
PCR LC1 Y LC2
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x ______= ________
1.6ul x ______=_________
MgCl2
Primer 50pmol LC1 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol LC2 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.13ul x ______=_________
3.87ul x ______=_________
H20
TOTAL 10 ul
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
*Primers para LC1 y LC2
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 50 segundos
49°C 50 segundos
72°C 55 segundos
38 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador (100bp) ,
Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras. Dejarlo a 100Voltios por
45 minutos. Tomar foto en el transiluminador de Rayos Ultravioleta.
Nota Todas las muestras que salgan negativas deberán ser sometidas al PCR GP5/GP6. Las
Positivas pasarán a ser tipificadas
52
ANEXO No 5 PCR GP5/GP6
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x ______= ________
1.6ul x ______=_________
MgCl2
Primer 50pmol GP5 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol GP6 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.13ul x ______=_________
3.87ul x ______=_________
H20
TOTAL 10 ul
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
*ver abajo tabla No5 secuencia de primers
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 1 minuto
40°C 2 minutos
72°C 1min 30 seg
40 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador (100bp) ,
Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras. Dejarlo a 100Voltios por
45 minutos.Tomar foto en el transiluminador de Rayos Ultravioleta.
TABLA No 4 Primers ó cebadores para GP
Primer
tamaño
secuencia 5´ a 3´
_________________________________________________
GP5
20
TTT GTT ACT GTG GTA GAT AC
GP6
20
GAA AAA TAA ACT GTA AAT CA____
Nota Todas las muestras que salgan negativas son catalogadas negativas para HPV
53
ANEXO No 6 PCR LCR HPV 16 AB
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x ______= ________
1.6ul x ______=_________
MgCl2
Primer 50pmol LCR16A 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol LCR16B 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.13ul x ______=_________
3.87ul x ______=_________
H20
TOTAL 10 ul
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
*ver tabla No 6 secuencia de los primers utilizados
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 50 segundos
40°C 50 segundos
72°C 55 segundos
30 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Uso de ADN
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha:
Marcador (100bp) , Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las
muestras. Dejarlo a 100Voltios por 45 minutos.Tomar foto en el transiluminador de Rayos
Ultravioleta.
TABLA No 5 primers ó cebadores para análisis de GEN LCR 16
Primer
tamaño
secuencia
5´ a 3´
LCR 16B 20
GTT TGC ACA CAC CCA TGT GC
LCR 16A 23
ATT CGG TTG CAT GCT TTT TGG CA
_____________________________________________________________
54
Nota Todas las muestras que salgan positivas se corroboran con PCR HPV Hz27/Hz28
ANEXO No 7 PCR HPV 16
E6 VPH H Z27/HZ28
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x ______= ________
MgCl2
1.6ul x ______=_________
Primer 50pmol H z27 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol Hz28 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.13ul x ______=_________
3.87ul x ______=_________
H20
TOTAL 10 ul
*ver abajo tabla No 7, secuencia de primers
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
*primers utilizados ver abajo en tabla No 7
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 50 segundos
40°C 50 segundos
72°C 55 segundos
30 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador
(100bp) , Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras.
Dejarlo a 100Voltios por 45 minutos.Tomar foto en el transiluminador de Rayos
Ultravioleta.
Tabla No 6 primers ó cebadores para análisis de REGIÓN E HPV16
Primer tamaño
secuencia 5´ - 3’ ______________
HZ27
33 GGG GGA TCC ATG TTT CAG GAC CCA CAG GAG CGA
HZ28
33 GGG GGA TTC TTA CAG CTG GGT _TTC TCT ACG TGT__
Nota las muestras positivas se corroboran con LCR/HPV
55
ANEXO No 8 PCR HPV 18
F 7405/R 165
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x
dNTP´s
2ul x
MgCl2
1.6ul x
Primer 50pmol F7405 0.2ul x
Primer 50pmol R 165 0.2ul x
Polimerasa gold taq 0.13ul x
3.87ul x
H20
TOTAL 10 ul
______=________
______= ________
______=_________
______=_________
______=_________
______=_________
______=_________
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
*Secuencia de primers utilizados , ver abajo en tabla No 8
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 40 segundos
40°C 40 segundos
72°C 55 segundos
30 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Uso de ADN de células control hella
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador
(100bp) , Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras.
Dejarlo a 100Voltios por 45 minutos.
Tomar foto en el transiluminador de Rayos Ultravioleta.
TABLA No 7 primers ó cebadores para análisis de GEN LCR 18
PRIMER
LCR18 F-7405
LCR18 R-165
tamaño
19
18
Secuencia 5´ a 3´
CTG CAC ACC TTA CAG CAT C
GTT CCG TGC ACA GAT CAG__
56
Nota Todas las muestras que salgan positivas serán corroboradas con E/18HPV
ANEXO No 9 PCR HPV 18
E6-5´BAMHI/E6-3´ECORI
Reactivos
Cálculo de la mezcla
No de muestras + 2 ADN control + 1 negativo + 1 extra=________
Buffer 10x
2ul x ______=________
dNTP´s
2ul x
______= ________
1.6ul x ______=_________
MgCl2
Primer 50pmol E6-5´BAMHI 0.2ul x ______=_________
Primer 50pmol E6-3´ECORI 0.2ul x ______=_________
Polimerasa gold taq 0.13ul x ______=_________
3.87ul x
______=_________
H20
TOTAL 10 ul
*ver abajo tabla No 9 , secuencia de los primers utilizados
ADN (50ng/ul) 200ng/ul = 4ul
Programar termociclador
94°C 10 minutos (1 ciclo)
94°C 40 segundos
40°C 40 segundos
72°C 55 segundos
30 ciclos
72°C 7 minutos ( 1 ciclo)
∞ 4°C
Ctrol de células control Hella
Electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del número de muestras colocar los peines respectivos, cada pozeta tendrá un
volumen de 10 ul.
Preparar gel al 1.2 %, mezclar con TBS 1X.
Mezclar Bromuro de Etidio 1.5ul por cada 100ml solución preparada.
Colocar el ó los peines respectivos y dejar enfriar.
Mezclar 5ul del ADN amplificado con 5ul de Loading buffer (puede mezclarse en papel
parafinado)
Por el orden depositar en los respectivos pozos de izquierda a la derecha: Marcador (100bp) ,
Negativo, 2 de ADN celular control (Hella y Silha) y en orden las muestras. Dejarlo a 100Voltios por
45 minutos.
Tomar foto en el transiluminador de Rayos Ultravioleta.
TABLA No 8 primers ó cebadores para análisis de GEN región E6 HPV 18
Primer
tamaño
secuencia 5´ --- 3´
________________________________________________________________
HZ30
33 GGG GAA TTC TTA TAC TTG TGT TTC TCT GCG TCG
E6-BAM-HI-18 33 GGG GGA TCC ATG GCG CGC TTT GAA GAT CCA ACA
________________________________________________________________
57
Los demás serotipos serán tipificados por medio de la secuenciación de un gen específico E6 en
laboratorio del INCan Mexico D.F.
ANEXO 10
SECUENCIACIÓN DE GENES DEL HPV
Desarrollado en INCan México D.F. bajo la tutoría de la Dra. Marcela Lizano Soberón
Se procedió aplicar EXONUCLEASA EXOSAP, marca Invitrogen a las muestras para eliminar
secuencias extras fuera de la estudiada.
El cálculo de la mezcla fue:
EXOSAP 2ul + Muestra de cada muestra (PCR-MYs) 5 ul
Posteriormente se lleva al termociclador y se programa de la siguiente manera
37 °C 15 minutos (1ra Hold)
80°C 15 minutos (2da Hold)
Se procedió a realizar una MIX con primer MY 11 para realizar una PCR reacción de
polimerasa en cadena, El primer MY marcado con fluocromo.
BD
primer
Buffer
H 2O
total
0.5 ul x 62
0.5 ul. X “
0.75 ul X “
6.25 ul X “
8.0 ul X “
31.0
31.0
46.5
387.5
496.0
Se toma 8 ul. De la MIX y se mezcla con 2 ul de la muestras preparadas conla EXOSAP.
Se colocan las muestras en el termociclador y se programa de la siguiente manera
94° C
5 minutos
1 ciclo
96° C 10 segundos
55°C 10 segundos
25 ciclos
60°C 4 minutos
60°C 7 minutos
1 ciclo
4°C ∞
El procedimiento dura 2:30 hrs
Guardar productos a - 20°C protegidos de la luz
58
Día dos
Se efectuó la precipitación con Isopropanolol (2-propanol)
Se realizaron los siguientes pasos:
Mezclar 10 ul la reacción de cada muestra + 60 ul Isopropanolol al 100% a temperatura
ambiente. Se transfieren en tubos de 0.5 ml
Mezclar en el vortex
Incubar por 20 minutos, protegiéndolos de la luz
Centrifugar a 14,000 rpm por 25 minutos a temperatura ambiente
Eliminar el sobrenadante con pipeta (dejar una gota en el fondo)
Lavar el pellet con 250 ul de alcohol frío al 70 % a temperatura ambiente.
Mezclar en el vortex
Centrifugar nuevamente a 13,000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante con pipeta, secar el pellet en el vacum speed vac, por 10 a 20
minutos. Deben observarlos secos hay que protegerlos de la luz.
Resuspender en Hi-Diformamida 20 ul
Desnaturalizar en termociclador por 5 minutos a 96 °C
Colocar en placa especial de secuenciador
Se guardó en refrigeración a 4 °C protegidos con papel aluminio.
Día TRES
Se procedió a colocar la placa especial con las muestras y programar el secuenciador. El
procesamiento es automatizado. Tiempo estimado 36 horas para la lectura de todas las muestras.
Sin embargo se pueden leer datos parciales, ya que cada 2 horas analiza 4 muestras. Por lo cual
en la tarde se obtuvieron los 12 primeros resultados.
Se obtuvo un programa por internet para la interpretación de las secuencias de muestras, se
interpretaron las primeras muestras.
Día CUATRO
Se procedió a extraer la información ó lectura de las secuencias del ADN de las muestras
procesadas en el secuenciador. Se interpretan las muestras por medio de un software
denominado ChromasPro.
Día CINCO
Se realiza el análisis de los resultados obtenidos por medio de la secuenciación de genes del
Virus del Papiloma Humano VPH.
59
ANEXO No 11 SECUENCIAS DE ADN OBTENIDAS DE MUESTRAS
De cada muestra se obtuvo las siguientes secuencias colocadas a continuación
CASO 1
AATCCCGGGCGGAGGATGTTACTGTTGCTGATCTACACGCAGTACANATATGTCATTATGTGCTGCCATATC
TACTTCAGAACCTACATATAAAAATACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACA
GTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACT
ATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTTTACAACCCCCTCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGGTTGGT
AACATCCCCAGGCANTGGCTNGNCCAAAACATACCCCCNCCNGCCNCCTAAAGAAAAACCCCCTTAAAAAA
TANACNTTTTNGGGGAGN
Caso 2
ACCAANNGGCCCNAAAGTCTACATGACTATTAGTACTGGCTATNCAACAGTTAAGTAAATATGATGCACGA
AAAATTAATCAGTACCTTAGACATGTGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACANNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
AGNNNNNNNCNNNCNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNN
Caso 3
GGAGTNCNNATGTAGTGGAACTACCCGTAGTACCAACTTTACATTATCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACC
TTCTACATATGATCCTTCTAAGTTTAAGGAATATACCAGGCACGTGGAGGAGTATGATTTACAATTTATATTT
CAACTGTGANCTGTCACATTAACAACTGATGTTATGTCTTATATTCACACTATGAATTCCTCTATATTGGACA
ATTGGAATTTTGCTGTAGCTCCTCCACCATCTGCCAGTTTGGTAGACACTTACAGATACNTTACAGTCTGCAG
CCNTTTACATGTCNAAANGNATGCTCCNGCCNCCTGGAAAAGAAAGANCCCTTATGAACGGGCNTAAGGN
TTTNGGAANGGTGGACTTAAGGGAAAAGGTTANGTTGGGAACTTGNANCNGTTCCCCNTGGGGANGGGG
NN
Caso 4
TTTNTTNGCCNNNCNGNCCAATTTAACAATATGTGCTTCTACTCCGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGC
TACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAANNNNNNNNNN
N
Caso 5
CNATTCTCTGGGGGAGGNGTTATGTTCTNGATCTACACGCAGTNCNCNTATGTCACTATGTGCTGCCATATC
TACTTCAGAAACTACATATNNAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTAC
AGTTGTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAGCTGCNGACGTTATGACATACNTACNTTCTATGAATTCCA
CTATNTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCNCACTAGANGATACTTATAGGTTT
60
GTAACATCCCCANGCAANTGCTTGTCAANAACCATACACCTCCTGCACCTAAGGAAGANCCCCTTAAAAAAT
AACCCCTTTTTGGGGNAAGTNANTTTNAAAGNAAAANNTTTTCNGGCAAAACCAAAAACAATTTCCCCCCT
NGGGGGGGGGGGGN
CASO 6
CTAGTCGGNGTGGAGGAGTTGTTATGTTNNTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCA
TATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATT
TACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTC
CACTATTTTGGAGGACTGGANTTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGGT
TGGTACATCCCCAGGCANTTGCTNGTCAAAACATACNCCTCCCGCCCNTAAGAAGATCCCCTTAAAAAACCC
NTTTTGGGGANGTAATTTAAAGNAAA
CASO 7
GGCCNGTNTNNACTTTCATTATCTAACTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTACATATGATCCTTCTAAGTTTAA
GGAATATACCAGGCACGTGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCACANNNNGNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 8
CNAGTTGNGGTGNCAGGTANNTGTTNTGTTGCTGATACTACTCGCAGTGACANATATGTCATTATGTGNTG
CCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATG
ATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAA
TTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAG
GNTTGGTANCATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAACATACACCTCCNGCNCCTAAAGAANATCCCCTTAAAA
AAACNCTTTTGGGAAGTAANTTNAAGGAAAGTTTCNGGN
CASO 9
AAATTNGCACAAATCTATTTGACCATTAGCTCTGCTGCTACTCCATCAGTTGCNCAGACNTTCACTCCAACN
NACTTTNAGCAGCATNTTAGGCNCGGGGAAGAATATGATTTNCAGTTTATTNNTCAAGGNGNNNTGNGN
NNGGNNGNGTGNNTNNNNGNNNGAGGGNGCNNNGNANNCTNNGTGANNNNATTGACATTCGAGNCG
NAGNCCNNCANGNTCTGGNNNGNGGGGNGTGAGGGGNNNNNNNGGCCNGNANNGNGNNNNTACGC
NNANGGNCNNGNNNNGNGNTGGANNNNNNGGNNGNNNNNGNNNTNNNGGCCNNNAGGGNNNNG
GGGNCNNNNCNTNNNNGNCNGGCCTNCCCNCNANGNGNAGNNAANNNCCNNGNGGGNTNNGNNNN
CNNNNNNNCNNGNNCNGGNTCANNNNNNNN
CASO 10
CCANATCATTTACAATATGTGCTTCTCTCAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAG
TATAGCCGACATGTTGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCACANNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNN
NNNNNNNNNNANNGCCNNNNNCNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNCCNCNNCCCCNNNCCCCNNCCC
CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNCNNNNNNNCNNNANNNNNNN
61
NNNNNNNCNNNNNCNCNNCCNCCCNTNNNCNNNCNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNN
NAGNNNCNCNNNNCCNNNNNNNNNNNNCNNCNCNNNCCNNCCNCNNNGNNNNNNNNNNNNNNNN
NNCCCCNCCCCCCCCCCCCNNNCCCNCNNNNNNNNNCNNCNNNGNNCNCNNCNNNN
CASO 11
CNAATCCNTGGNTAGGTANNNTGTTATGTTGCNGATACTACANGCAGTACTNNTATGNCNNTATGTGCTG
CCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATG
ATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAA
TTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAG
GTTTGTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCNTTAAAA
AATACNCTTTTTGGGGAAGGTAAATTTAANGGNAAAGGTTTTCCGGNNGGACCNTAAATCANGTTNCCCCT
TGGGGAGGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 12
ATGTCATTATGTGCATCCGTACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGT
GGAAGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAANGGGGNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNCC
CCNCCCCCCNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CCGCNNNNNNTTNNNNNNNNNNNNNGNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNCGNNNGNNNNNNCCNNN
NNNNCNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCNNNNNCNNCCCCCNCCNCCNNCCNNNNNNNNNNNC
NNNNNNNNNNCCNCNNNN
CASO 13
NGNTCCTNTGNGNNGGGGTGNAATGTCCTNATCCNCACGTNGNCCNATATGNCNGNGTGTGCTGCAATT
GCAAACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTA
CAATTTATATTTCAGTTATGCAAAATAACATTATCTGCAGACATAATGACATATATTCACAGTATGAATCCTG
CTATTTTGGAAGATTGGAATTTTGGATTGACCACACCTCCCTCAGGTTCTTTAGAGGATACCTATAGGTTGGT
AACCTCACAGGCCATTACAGGTCAAAAACTGGCCCCCCAAAAGCCCANGGACGATCCNTTTTAAAGATTAT
GTTTTTTGGGGAGGGTAANTTTAAAAANAAAAAGGTTTTCCCGGCCAAATTTAAAANCNNGTTC
CASO 14
CCNATTCCCNTTGGNCGNAGCATGGGGNNTTCCTCACTNGGNCNNCGTGCANCGGGGNTTCCCANGNGG
ACGAAGCNNTTTNTGNANTNNGNGACTAGGNNCGTTGAGCCTAATGTNTGATGGCAGCCTCTACAAAGCT
GGAANAGATCAGTANAATGGTTCTCACCTACGGTCTCCANAAAGGAACACCGNCTGGCCAACACCTTGATC
TTAGCCCAGTGAGACTCATTTCTACCTTCTGACTTCCNGAAGNTGAAGGNAATCNACTTTTTGCTGCTTTNA
GCCACTGAAGGTTAANGGCAATTTGCCTACAACAACCCATATCAGGNTANTTATACNGNAGCCNCAATNCN
TTACCCCTNCTNNGGACTTTCCCCAATTTNCAAACCCCGTTCCNAACCCNNCCCANNNAAAGGTCNTTCCG
GNCTTGGGGNNAAAAACNAATNTTTCCCCNNNGGGGANGNGAAANANNTTTTTTNTTTTTTNGGNNNNN
ATNNTAGNGGGNNGNNNNCNANNNNNAANAANCCCCNNGGNNNNNGNNGNGTNNNNNNN
CASO 15
62
CAGTTGCNATCAGTATTTCGTTACTGTNGTGGATCNACCCGGANTACCAACTTGACACTNTCTGCCTCCACA
CAGTCTTCNNNNCCTTCTACTTNTGATCCTTCTAANTNTATGGAATAGCCCGCGCACGNGGAGGANTACGA
TTTGNGTTTCTANTATCGNCTGTGTNCCNGNCAGCAGNNGCTGAGGNCANGTCNNATACTCNNACTNCGA
NCTCNNCGNTATAGTNNAATNGGAGTTTNNCTGCACCTNCTNCNNCNNCTGCAGTNAGGTANACACNTA
CGNATACTTGCAGTCTGCANCNGTCCATGGCACANGNCCGCTCCCGGAACCGGAGACCAAGATCCTANTG
ACNGNNTTAGGGTTGGNAATGTNNACTAAGGNTANAGCTGANTTNGGAACTGTNCCCNTGCCCNGGGGN
GGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 16
GCCANNGTGGTCCATATGTCTGTGTGTGCTGCANTTNNCNAACAGTGCATACTACATTTAATAGTAGTAATT
TTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAANATGATTTACAGTTTATTTTTCAACGGGGGGGGGGNNNGNN
NNNGNGGNGGGGNNNGCNCCCCCCCCCNCCCCCCCNNCCCCNNGNNNNNGNNNNGGNNNNGNNNGN
GNNNNNNNNNNCNNNNGNCGGNNNNNNNCNNNNGGNCNNGNNNCNNNGNGNNGNNGNNNTNNN
NNNNNNCCCNNCNNCCNNNNNNCNTGNCGGGGAGGGCCNNNNNCGGGGNNNNNNGGGNGGCNNNG
GGGNGGGGGGGNNCNNNNNNCNNNNCNGNGCNNGNGGGGGGGGGGGNNNGNNGNGGNNTNGCNT
NNNNCNTTNCNCGTNTCNCNCGCGNCCTNNNNGNGCNGNNGCGCGNNNNNNNNNNNNNNCNCCGCG
NNGCGG
CASO 17
CTTGGGANGGAGANAGGAGTTGTTTCAATACTCTGCCAGNAAGTCCTCCGNTGGNCCCTNAGCACTGCTG
CTACTCCATCAGTTGCACAGACATTCACTCCAACAAACTTTAAGCAGTATATTAGGCACGGGGAAGAATATG
AATTACAATTTATTTTTCAATTGTGTAAAATTACTCTAACNACTGAGGTAATGGCTTACCTGCACACCATGGA
TTCTACAATACTAGAGCAGTGGAATTTTGGATTAACATTGCCTCCTTCAGCTAGTTTGGAGGATGCCTATCG
CTTTGTGAAAAATGCAGCAACCTCTTGTCAACGGGACAGCCCTCCCCAGGCTAACAGGACCCTTTGGCAAAA
TANANGTTTTGGNACNGGGNACCTTAAGGAACNCTTTCCTTTAATTTAAACNAATNGNCTTGGGGCCNAA
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CASO 18
CAGTCCTNTNGAGGAGTNGTANTGTTGCGGATCCACCAGGAACNCAAACATGACACTTTCTGCAACCACAC
AGTCTATGTCCACATATAATTCAAAGCAAATTAAACAGTATGTTAGGCATGCAGAGGAATATGAATTACAAT
TTGTGTTTCAACTATGTAAAATATCCCTGTCTGCTGAGGTTATGGCCTATTTACATACTATGAATTCTACCTTA
CTGGAAGACTGGAATATAGGTTTGTCGCCTCCTGTTGCCACTAGCTTAGAGGACAAATACAGATATGTAAA
AGTGCAGCTATAACCTGTCCAAAAGGATCAGCCCCCCNCCTGAAAAGCAGGACCCNCTATCTAATTATAAA
NTTTGGGGAGGNCAATTTACAAACAANTTTT
CASO 19
NCACCAAANNGGCCNNACGTCTAATTGNNTTTATGCAACAGGTCCCTAGTGACAGTACATATAAAAATGAG
AATTTTAAGGAATATATAAGACATGTTGAAGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCACNATGTNNNATATATTC
CCNAGCTTCCCATTTGTNATGTGTACNGTGACNAGTTACCTGTGNGCATAAAGTCNTATTAGTACTGCGAG
TNGTTCNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
63
NNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNCNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNCNNNC
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CASO 20
GGAAAAGGGGNNNNNNNCNGAANAGGTGGGNNGGGGNNTGNNANGTTTTCCCCATNCANAAGAAAAA
AAACGNTTTTTCCCCATGGGGGNGNNAAAANAACTCNTGNGACCNGGGNAATATGATGCTTTTTNANCCC
CCGCAGNATAGGAGAAANGNTGAGGAATATGANTTGNAGGTGATNNTTCAGNTGNGNACNANTACNTN
AACTGCAGANGTGATGTCCTAGATNCANAGGAAGGAANAGGAGNANGGNAGAGGAANGGGAANGNGG
GGGNNCCCCCCCCGNCNAGNANNGNNAGGGGGGGANAAANAAAGGNGNGGGAAAAATNTGGGGGGA
ANAGANGGGGNAAANGGGAAGGNGGGNACNGGGNGGAAAAAAAAGGGAACCCNAAAGNAANAAGGA
GAAAGGGGGGGGGGAAGGGGGGGNNNNAANGGGGAAANNGGGNNNANNNAAAAAAAAAAAANAAG
GGAAGGNCGGGGGGGGGGGGGGGGNNGNGNNGNGGNNNGGGGANNANGGNANAAGGNNGGGGAN
NAAAAGNNAANNNNNNNNNANNNANNANAGGGNGGGGGGNGNGGGGNGGGGNANGAAGGAANAA
AAAAAAAAAAAAANA
CAS0 21
GCACACACGACAATATGTCGNNNTGNTGCCTGCCATANCCTACTTCAGNAACCTACATATNNATAGCCNNA
CTTTNAAGAGTACCTNACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGNTTATTTTTCAAGGTGCCGNCNTGACN
NTGNTGATCNGTGTTNNATGTATGTGGGCCCTNNNNAATCTCACTGANAGCAGTGACATTCGNCCNCAGA
CCCTCAGCTCTGNCCGNTGTGGCNGTCCANAGCATACTATGNCCAGTACAGCGGGTTNATGCNNCAAGGG
CNTNNCCNGGTANCNGGGAATTTTTNTTGTNTTGGCCTAANGNCNNTTAANGGCCCNAAAAANGGATTTG
GGGGCCCTGNCCCTTTTGNAAACCCCGGGCTTTCCCCCNNAAANTGGAAAAAAAAAAATNTCCCCCCNCN
GGGNTTTTTNCCCCAANAANAANNTCCCCCGNTTTTNNNNNNAAAANTTTTTNNGGGCCCCNCCCCGGGG
GGNNAGGNNNANCNCGGGGNGNGGNCCCCNNGGGGGGGG
CASO 22
GCAACCACTNNNGTCTATNTCCACATATAATTCAAAGCCAATTAAACAGTATGTTAGGCATGCAGAGGAAT
ATGATTTACAGTTTATTTTTCCNACANNNNNGGGGGGGGNNNNNNGNNCCNNNGCCCCNCCTGNCNGA
NCCCCCCNCGNNNCCCCCCNTGCNCCCCNNCCCCCCCCNCCCCCCCCCCACCCCCCACNCCCCNNCNCNNN
CCCTNNCCNCCCNCTCCGNCNCNNGANNAAGNGCCCCCCCTCCCCCNCTCCCNCCCCCCCCCCTCNCCNCC
NANNNCANGNCCNNGNCACCCNCCTCCNCNCCCCNCCCCCCCNTCCCCCNCGGCCCNCCCGCNCNCCNAC
NGGGCNGNNGNGNTNTGCNCNNCNCNGCCNCGCGCCGGCNNCNCNCCCCCNCNCANCCCCCCCCACCC
GCCCNCCNNNGNCCCTCGCCGCNNCCCCCCNTCCCNCCCCCNCGCNCNTNNANAANTTCANNACCNCCTC
CCCCCCCCCCTCCCCCCNNATTCNTTCNGNGCNCCTNTNTCTCCNNNCCNGNACCNCCCTAACNCGAN
CASO 23
CNAATCCNTNGGAGNAGTTGTCATNCTTCCCACCCCTCCNCCTGCTCACNTNCCCCTGGGNNGTGCTACAG
AACAGTTAAGTAAATATGATGCACGAAAAATTAATCAGTACCTTAGACATGTGGAGGAATATGAATTACAA
TTTGTTTTTCAATTATGCAAAATTACTTTGTCTGCAGAGGTTATGGCATATTTACATAATATGAATGCTAACCT
ACTGGAGGACTGGAATATTGGGTTATCCCCGCCAGTGGCCACTAGCCTAGAAGATAAATATAGATATGTTA
64
GAAGCCCAGCTATAACATGTCCACGAGAACAGCCACCACAGAAAAACAGGACCCNTTANCTAAATNATAAA
ATTTTGGGGANGTTANCTTANNGGAAAAGTTTTCNTNCNAACCNGGNNCCATTTTCCCCCNGGGANGGGG
GGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 24
GTGCTGCTACTGCAACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGA
ATATGATTTACAGTTTATTTTTCCACCCGGGNCGNGACTNCTCGGNNAGNGCCCCNNNTTNGGCGCCCCNC
CCNCCCCCCCACNNNGNCNNGNGGGNNNGNNNGGGTNCNGTCCGGNNGGCGCCNNCNGNCCGGCNGC
CCNNCNCCCCCNCNCCCCNCCCCNCCCNCCCNCACNCNNCNCTANGCGGGNNCCGGGNNGGCNCCCCCC
CCCCCNCCNCCNNCGNCCCNCCCTCCTTCGCNNNNNTGNNGNNCNCGNCTCCCNNCCCCNCNNCNCNGC
CNCNNNNAGNCCCCTCNNCCACCNCCCNGCGCGGTGCNGNGGNGCGGGGNNANNGNCGCGGNGNNCC
GCGCCCNCCCCCCCCCCCCCCNCGCCCNTGTNNTGCTGCNGGNGCCNCCNGGNGTCCNCCCGGNG
CASO 25
GATCTCTTGGAGNAGATGCATGTTCCANATCTACNCGAAGTGCTCACATGACTGTGNTGTGCTTCCACAAC
ATCGTCACCTTCTGCCACATATACAGCTTCAGAATATAAACAGTACATGCGACATGTAGAGGAATTTGATTT
GCAATTCATTTTCCAGTTATGCACTATTAAGTTAACTGCAGAGGTTATGGCATATATTCATACTATGAATCCT
ACAGTTTTAGAAGACTGGAACTTTGGATTATCACCCCCTCCTAATGGAACATTAGAAGACACATATAGATAT
GTTCAGTCACAGGCCATAACGTGTCAAAANCCTACACCTGATANGGAAAACCAGGATCCTTATGCGGGTCT
NAGTTTTGGGGANGTNATCCTAAAGAAANGTTTCCAGGGGAGCTAAACNGT
CASO 26
CNGGCCAATATGTCATTATGTGCTGCCNTATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAG
TACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAANGNNGGNNCNGNNGNNGNNNGGNN
GCNCNNNNGNNNNNGNNGNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNCGNNNNNGNNNNCNNGNNNGNNGNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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NNGNNNNNNNNCNNNGNNGGGGGNGNCNNCNNCNNNNGGNNNNGNNNNNNNNNNNNGNCCCCCC
GCCCTCCCCCGGGCNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNGGGNNGNNNGNCNCNCGTGCNNCGNGN
NTNGNN
CASO 27
ATTTGGCCNCNTCAATTGTCATTATGTGCTGCCATNTCTACTTCAGAACCTACATATAAAAATACTAACTTTA
AAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCACANNGGNGGNNNNGGNGNNG
NNNGGGNGCNNNNNNGNCNNNNNGNNGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNTCTNCNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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65
CASO 28
CAATTCCCTNGGNGGAGNTGCAACTGCNCCTGATNCCTCCGCCTGCCCATGTGNCCGGGGACGCTGCCATT
GCTACCTNTGATCCTACATTTAAAAGTACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATTTGATTTA
CAGTTTATNTTTCAGCTGTGCAAAATAACCTTATCTGCAGACGTTATGACATACATTCACTCTATGAATCCCG
CTATTTTGGANGACTGGAATTTTGGATTGACCACTCCTCCCTNAGGCTCTCTGGANGATACCTATAGGTTTG
TCACCTCNCAGGCNATTGCTTGTCNAAAAACTGCCCCCCNANCCCCNAAGNAGATCCCTTTAAANATTATG
CTTTTNGGGAGGTNAATTNAAAAAAAANGTTTTCCGCNNANCNAANACCANNTTCCCCCTGGGNNGGGG
GGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 29
CAATTCCCTNGGNGGAGNTGCAACTGCNCCTGATNCCTCCGCCTGCCCATGTGNCCGGGGACGCTGCCATT
GCTACCTNTGATCCTACATTTAAAAGTACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATTTGATTTA
CAGTTTATNTTTCAGCTGTGCAAAATAACCTTATCTGCAGACGTTATGACATACATTCACTCTATGAATCCCG
CTATTTTGGANGACTGGAATTTTGGATTGACCACTCCTCCCTNAGGCTCTCTGGANGATACCTATAGGTTTG
TCACCTCNCAGGCNATTGCTTGTCNAAAAACTGCCCCCCNANCCCCNAAGNAGATCCCTTTAAANATTATG
CTTTTNGGGAGGTNAATTNAAAAAAAANGTTTTCCGCNNANCNAANACCANNTTCCCCCTGGGNNGGGG
GGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 30
GGAGATGTACTGTTGCGGATCCACCAGGAATACAAACATGACACTTTCTGCAACCACACAGTCTATGTCCAC
ATATAATTCAAAGCAAATTAAACAGTATGTTAGGCATGCAGAGGAATATGAATTACAATTTGTGTTTCAACT
ATGTAAAATATCCCTGTCTGCTGAGGTTATGGCCTATTTACATACTATGAATTCTACCTTACTGGAAGACTGG
AATATAGGTTTGTCGCCTCCTGTTGCCACTAGCTTAGAGGACAATACAGATATGTAAAAGTGCAGCTATAAC
CTGTCAAANGNATCAGCCCCCCCNGGAAAGCAGGACCCCTATCTAANTTNAANTTTGGGGAGGGCAATTT
ACNA
CASO 31
GCCNNCGCCAATATGTCATTATGTGCTGCCATNTCTACTTCAGGAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAG
GAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAAANGNNGAGGNNNGNNGNNGNN
NGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNGNNNNNGN
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NNNNNNNNNNNNGNNNNGNNNNNNNNNNNNNCNNNCNCNNNCNCNNNNCNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 32
TAGNTGGNGTACACTGTTTGTTCTGTGGCAGATCCACACGCAGTACCAACATGACNTTATGTGCATCCGTAA
CTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATT
66
TATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTT
TGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGT
CACAGGCCATTACNTGTCAAAAGCCCCTCCTGAAAAGAAAAGCCAGATCCCTATAAAACCCTANNTTTTGG
GGAGGTTATTTAAAANAAAAGTTTCCANGGGATTGGAACANTTCCCCTGGGGANGGGNNGGNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNANAAAAAAAAAAAAAAA
CASO 33
CACNGCGTCAATTTGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGGAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG
AGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAANGNNGNNNNNGNNGNNGNNNNN
AGNNNNNNNNNNNNNNNNGGGNNNNNNNCNCCGNNCGNNNNGCGCNNNNCNCNNNTNCNNNCNN
CNNNNNNNCCNNNNNNNNNGNNCCTNNNNNCNNCNNCNGGCNCCNCGNGNTNNTCCNNNNNNNNN
GNNNNNNNNNNTNNCTCCCTCCNNCCCCCNTNCCTCNCCCCNGNCNCNCNGGNNGCNCCCCCNCCNNN
GNNNNNGNNNCNNCNCNCGCGNCNNCNNNGCCCNCNGCNACNNNGGNCNNNNNNNNNNNGNCNNC
GNGNNNNNANNNCCCCCCCNNGNNCNCNCNTNNNGGNCNNNNCGGNCCNGNGCNNNNNCNCCGGCN
GNCGNTNNCNCCNNGCNNG
CASO 34
TGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAACCTACATATAAAAATACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACA
TGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCACANGGGGGNNGNGGNGNNGNNGNGGCCGCCNNNNN
GNCNNNNCNNNNNGNNNNNNCCCCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNCCCCCCCCNCNNCNCNCCN
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NNNNNNNCNNNNNNNCNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNCNCCCCCCCCNCCCCCCCNNNN
NNNNNNNNNCCNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNCNNNCCCNNCNCNNCNCNNNNNNCNNNC
CASO 35
CTCGGGAGGNGTTGTTATGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACT
TCAGAACCTACATATAAAAATACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTT
ATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGTCATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTT
GGAGGACTGGAATTTTGGTTTACAACCTCCTCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATC
CCAGGCAATTGCTTGTCAAAACATACACCTCCNGCACCTAAGAAGANCCCCTTAAAAAAAATACTTTTGGGG
ANGTAANTTTAAANNAAAGTTTTCCGNAAACCNAANCNNNTTCCCCTGGGGNGGGGGGNNNNNNN
CASO 36
CTTCCATACCTTCTACATATGCATCCCTTCCTAAGTTTAAGGAATATACCCAGGCACGTGGGAGGGAATATG
GATTTACAGTTTATTTTTCCAAAGGGGGGGGGGGGGGGAGGGTCCGCTNNTTNCCCTNCCCNCNNGTACC
CNGGANNGCGGTNGGGNCGNTGGGGTTTGGTNGNCNGGNCCNNCNCTCTTNCCTCTNCCNTNCNNNGC
NNNNNNACCCNNCCNCNNNCNTCTGTCNNNGCNNTNNCNNCCNNNCTNCCNNCCCNCCCCTNNCNCTN
CCCNCTCAACACGNGGNGTNGGNNNGTNTCNNNNTGCCTCCACCNNTNGCCCNCGTCNNCTTNCNTTCC
NCNTGCNNNNCTCNNNNNNNGCGNNNGGNGNCGCTTNNTNGCTNNGNCTNGNTAGGGTNTCNCNNCC
67
GGCNCCTTGTNNCCCNCGCCCCNCCCCCATTGCCNGTNAATCNNGCCTGCCCGNTNTNGCTCGNNNNNGG
GANTNANGGGTGGNGGAAGGCGNGNNTTTTACCCCCCCCNCCCTCCNTNCCCCTTNNNCACTTTTTTCTN
GNTNGNCCNNAGTCTTCGNGGNCNGTNNNTGGCNCNNCNNNCNNGNNNCCC
CASO 37
CNTTGGCGGAGAGCGTAGNGTCGCAGATCTACACGCAGTACNNATATGTCNTTATGTGCTGCCATATCTAC
TTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTT
TATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTT
TGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGGTAAC
ATCCCAGGCAATTGCTGGCCAAAACATNCCCTCCGGCACCTAAGAAGATCCCCTNAAAAATACNCTTTTNG
GGAAGGTAATTTTAAGGGAAAGGTTTCNGNNNACCCTA
CASO 38
TNNTCGCCNCNTCCAATTTACATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAAT
TTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAANNGNNNNNNNNNNNNNN
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NNNNNNCNNGNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNANNNNN
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CASO 39
TTNTAANNGCCNGNANTCAATATGTCATTATGTGCTGCCATNTCTACTTCAGGAAACTACATATAAAAATAC
TAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCACANNNNNNNNNNN
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CASO 40
ATCCCGGGCGGAGATGTACTGTGTCCGATCCACTCGCAGTACTAATATGACTTTATGCACACAGGTAACTAG
TGACAGTACATATAAAAATGAGAATTTTAAGGAATATATAAGACATGTTGAAGAATATGATCTACAGTTTGT
TTTTCAACTATGCAAAGTTACCTTAACTGCAGAAGTTATGACATATATTCATGCTATGAATCCAGATATTTTA
GAAGATTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCATCTGCTAGTTTACAGGATACCTATAGGNTTGGTTACCTCT
CAGGCTATTACGTGNCCAAAAACAGTACCTCCCAAGGGAAANGNAAAACCCCTGGGGNAAATNANNTTTT
68
GGGGANGGGNATTTAAAGGAAAATTTTCCCCCCAATTTAANCNANTNCCCCCTGGGGNGGGGGGGGNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 41
CAAAANGGGCNNNAATCTACATGCTGTTTGTGCTTCCTCNACATCGTCACCTTCTGCCACATATACAGCTTC
AGAATATAAACAGTACATGCGACATGTAGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAANGGNNNNTCANNN
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GNNNNNNNNNNGNNNNCNNNNNNNGNGGNNNGNNNGNGGNNNGGNNNGCNGNNNNNNNNNNN
NNNNNNGGNGANNNNN
CASO 42
GTGNCCTGTTCCNCCGATACCGNGGAGCAGTCACNTNATATGTNNCCTATGNGCTGCGGGACACTGCTCCT
GNANCTGNGCAAAATGATAGCTTACCNNNTTTTAANCACGCTATCAGCGGANATGAGGAGGAATANGAG
NTGCTGNTTNTTCTTCNGTTGTGTACACACCTACNCTGNCNGCAGNAGTTATGTCCTANATTCGTAGTNNG
NNANGCTGNAGGANAGAGGATTGGAACTTTNTACNTCCTCCCCCCGCCGNCTACCAGGNNGNNGGTTAC
ATANCNNNNTCCACNNTCNGTNGTTNTTACNNNANAGAAGCCCCTTGNGCCGGGGAGAANTACGNATCC
NAAATGACAANTTGGGNNGTGGAATGTGAGAATNAAAGNTCTTGCTNNTCTAGAGCATNAGNTCAGTNT
CCGGATGGNGNCNGAATNNTCNNATTTTTNTTTTCTNNNGGGCCNGNGGAGNGGAANTGGNGCCNCGN
NGGGNCCNCNNTCNGTGGGNGNGCNTGTCCNNNGGGNGGTNTNNCNTGACNTGNCATNCTGCCGTNN
GTTGANATNNAGNGTTGTNGGNGNGNNGNTGGNNNTGNGGNTGGGNCGGNNGNGNAGGNNNNNNG
TGGGNCTNCNGNTNTGNNTCGGTNNGGNGGCGGGNNGCGGCNNCTGNGNNNGNNGGCAGCNGGGNC
NGTNNTNGCCNTGNNNAGNCGGNGGNCGGNGCGN
CASO 43
TGTCTTTACTGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGAC
ATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACAT
ACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACT
AGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAGGA
AGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGANGTAAATTTAAAGGAAAGNTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTC
CCCTTNGGACGAAANNNNNNNNNNGNNGGNGNNNNNNGGNGGNNNGNNNNNGNGGGNGNGNNNG
GNGGNNGNGNNNNGGNNGNNTGGNNGNNGNNNNNNGGNNGGGGGGGGGGNGNGGGGNNGGNGN
NNNGNGNGTNGGGTGNNGNGNNNTNNNGGNGNGNGGTNNNTNGTNGTGGGNNNNNNNNTNTNGG
GGNGNGNGGTGGGGGNGNGGNGNGGCNNCTGTCN
CASO 44
CNCTNGNGNANNTTGCCNAGNNACTATTTNCCATACNCGNNGGGNTNGTTACCAAGGCTGTTCCCTATGT
GCTGCCGNTAACTNCATTCTCTCGNACNNCCACCGNTNCTGGNTGNCCNNTGAGGACACAGCNTCTNTNT
GGTGGGAGGNTGNTTCACAANTAGATNATTCNATCNATNNCAGCGANACANCCTCGTGCTGCAGAAGTA
69
ATTCTATATNATNACAGTGANGGCCCTCTNATTTTNNTGAGAATGNCGACNTTGGGNAATCGCCTCCNCCA
TNAGGGGACANGNGNNNGCNTCCCAGNTAGGAGNTGATGCTNGANCACANCGACGATGTNTCTGTTGN
NAANCACCANTCNNNNTANAGGAANNTGCCTGTATNNTCTTTTAGAACCTTANCNCTGNTGGGGAGGNG
AAAATNANAAGGAAAGANTTCTNGNNNANCGGNATATGNNTCCCCTGGNNNCGAGNCCNGTGNGNACA
CCNGTNNGGTATGCGNTCNTNNNCGCNGTNCNTGTGNCCCGGGGACANNCCCNANGGGGNAANGNGG
GGNGGGTGNGGGTGNGNGNNTGTTNGANGNGCCCNNGGGNGNNNNNNTANNCGCGNNCGGCGGAG
NGGNGANGGTNGNGNNCGAGGTGNNTGCTGTGGNGGGGTCTGNNGGTTGGGGGGCGGGGTNNNGCG
TNGCGTCNNGGGTANNGGTGGANGGNTNNNGGGNNGNGAGNGTCGGGTGNGNTCNCGGNGNNTANG
AGTGNANNNTNTGAGGGNTNGGGTTNGNGGGTN
CASO 45
CAACTATTTGTTNTGTTGTTGTNNCTACACGCAGGAACNAATATGTCNTTATGTGCTGCCATATCTACTTCA
GAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATT
TTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGG
AGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCC
AGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAGGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGG
AAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCCNTNGGACGAAANNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 46
CAACTATTTGTTCTGTTCTTGATCTACACGCAGACCAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAA
ACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTT
CAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGG
ACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAGG
CAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGAAG
TAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCTTTGGGACGAANNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNN
CASO 47
CCAGNTATTTGTTCTGTTGTTGATCTACACGCAGAACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA
AACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTT
TCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAG
GACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAG
GCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGACGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGAN
70
GTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTCCCCCNTNGGACGAAANNNNNNNNNNNNN
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CASO 48
CCACTATTTGTTCTGTTNTTGATCTACACGCAGNCAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAA
CTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGTTTACAGTTTATTTTTCA
ACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTNGGAGGA
CTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAGGC
AATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGAAGT
AAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCCTGGGGACGAANNNNNNNNTNNNNN
GGNNNANTATANNGTCATGTTCNCNCNNTNNTNNNCCCNNGGNANANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 49
CAACTATTTGTTCTGTTGTTTTCCTACACGCAGGNNNNAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA
AACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTT
TCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAG
GACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAG
GCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGGA
AGTAAATTTAAAGGNAAAGNTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCTTTGGGACGAANNNNNNNNNNN
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CASO 50
NTGTGGGGTACAACTGTTTGTTNTGTTCTAGATCCNACGCAGTACCAACATGNCATTATGTGCATCCGTAAC
TACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTT
ATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTT
GGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGT
CACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTT
GGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTTCCCCCNTTGGGACGGAANNNNNNN
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71
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CASO 51
GGGGGNCAGTTNTTGTTNCGTGGTTNTTCCACTCGTAGCACTAATATGACTTTANGCACTGAAGTAACTAA
GGAAGGTACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGAATATGACTTACAGTTTGT
TTTTCAGCTTTGCAAAATTACACTAACTGCAGAGATAATGACATATATACATACTATGGATTCAAATATTTTG
GAGGACTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCGTCTGCCAGTTTACAGGACACATATAGATTTGTTACCTCCC
AGGCTATTACTTGCCAAAAAACAGCACCCCCTAAAGAAAAGGAAGATCCATTAAATAAATATACTTTTTGGG
AGGTTAACTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGATCTAGATCAGTTCCCCCCCTNGGACGGAAANNNNNNNNN
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CASO 52
CTGTGGGNCACAGTTATTTGTTNCGTAGTTGCTCCACTCGTAGCACTAATATGACATTATGCACTGAAGTAA
CTAAGGAAGGTACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGAATATGACTTACAGT
TTGTTTTTCAGCTTTGCAAAATTACACTAACTGCAGAGATAATGACATATATACATACTATGGATTCCAATAT
TTTGGAGGACTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCGTCTGCCAGTTTACAGGACACATATAGATTTGTTACC
TCCCAGGCTATTACTTGCCAAAAAACAGCACCCCCTAAAGAAAAGGAAGATCCATTAAATAAATATACTTTT
TGGGAGGTTAACTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGATCTAGATCAGTTCCCCCCTNGGGACGAANGANNNN
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CASO 53
CGGTNCNGGCCNGTATTTGTTNTGTTGTTGATCTNCACGCAGTACAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCT
ACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAG
TTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTAT
TTTGGAGGACTGGAATTTTGGTTTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAAC
ATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATATACTTTT
TGGGAAGTAAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCTTNGGACGANNNNNNNNN
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CASO 54
72
CAGTTATTTGTTCCGTGGTTGACCCACTCGTAGCACTAATATGACATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGG
TACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGAATATGACTTACAGTTTGTTTTTCAG
CTTTGCAAAATTACACTAACTGCAGAGATAATGACATATATACATACTATGGATTCAAATATTTTGGAGGAC
TGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCGTCTGCCAGTTTACAGGACACATATAGATTTGTTACCTCCCAGGCTA
TTACTTGCCAAAAAACAGCACCCCCTAAAGAAAAGGAAGATCCATTAAATAAATATACTTTTTGGGAGGTTA
ACTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGATCTAGATCAGTTCCCCCCCTNGGGACGAANNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 55
CTTGTGGGGTCCACTATTTGTTCTGTTNNTGATCTACACGCAGTACAAATATGTCNTTATGTGCTGCCATATC
TACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACA
GTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACT
ATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTA
ACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACT
TTTTGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCTTNGGACGAGANNNNN
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CASO 56
AATGCANGATGGAATATNTNTNACAATNNGTGTCNCATCNATGCNNNANATCNCTGTCTGCTGAGGGCTA
TGGCNTGNTNNCATACTATGNAGACTACCTTACTGNNNGCACGAGNTNNTATANGTTTGTCGCNTCCTGN
TGNCGCTGGCTTAGGNNACTNATACAGNGATGNTTTGTGTGCAGCNNTANCCNGTNNTAAGNATACNGC
CCCCTCNTGAAAAGCAGGANNNGNTCATCNCAAATATTNCNTCNGGGAGGNCCANNNAGNAAATGAGCT
TCTGCTGNTGATCNGATNACAGTCCCCCTTNGACGAGAANAACTTNTTTTTTGNGGGGGNATCNGAANGG
NAGGNCNCCCGGCNNNNTTTGNTNNTGGNGNNATNNGGGNNANNNGAGANACCCAAATNTTGGCNCC
CCCCATAGGGGGGNNANCNNAANGNGGNCCNGGNNCCCCGCNNCCGCCNNTNTTGNNAAANNTGGNG
NNGNGNNCCCNAATTTAAAANNNGTGTNGGGGGGNNNNNNAANGGGGGGCCTCCCCCCTNCNTTTTTG
CCCCNNNGGNTTTTTTNAANANTTTNTCCCCCGGGGGGGNNTCNNGNTNNNNCCCGGGNGNNNTNCNN
NANAAGGGTTTT
CASO 57
ACTGCCTANCCATTATTTGTTCTGTGNTCCATCCCTCGGAGTACCAATTTAACTACATGTGCTTCTACACAGT
CTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAAGAATATGATTTGC
AGCTTATTTTTCAGTTATGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGCATGAATAGCAGT
ATTTTAGGAGNNATTGGAACTTTGGGGGTNCCCCCCCCCGCNAACCACAAAGTTTGGGGGGGAAACAAAA
NCGTTTTTNAAAAANCNGGGGGGGCNATTAACCNGGNNAANNNGGGGNNGNNCGNCCCCCCCCCCNNA
73
AAAAAAAAGGGGNNCCCCCCCAATNTNAAAANAANAAAANTTTTTNGGGGGNANGGGGGGGGGGTTTTT
TNAAAAAAANAAAAAAGNTTTTTTTTTTTAANAATNNAAAAAAAAGGGNNCCCCCCCNGGGGGGGGGGG
GNGGGGGGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 58
GGGGTCCACTATTTGTTNTGTTGTTGNTCCACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTT
CAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTA
TTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTG
GAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCC
CAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGG
GAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCNNTTGGGACGAANANNNNNNNN
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CASO 59
CNGTGCTGNCCANNATTTGTTCTGTTGTCGATCTACACGCAGACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCT
ACTTCAGAACCTACATATAAAAATACTAACTTTAAAGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAG
TTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGTCATACATACATTCTATGAATTCCACTAT
TTTGGAGGACTGGAATTTTGGTTTACAACCTCCTCCAGGGGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAAC
ATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATATACTTTT
TGGGAAGTAAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGNTCCCCCCTTNGGACGGAANNNNNN
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CASO 60
NCCCTTGGCGGAANTTGTTATGTGGTNCNATTNCCCGGCGTGANGATNNGTCANTNATCCNCTGCNNTCT
CTNNNTCTGNAATAGGNTNGNGAGCCTAGNCNTTAGGGCGNACTCTCATACANGTGGAGGAAATNTGAC
AANGNGTNTNNCNTNCAGCCGCNNGANAGNANCTCCGCNGGGGNCNNNNCNTGATCTAAGCCTNNTNN
GACTTCCTTCTGCNTGCAGGNTTGNAGATGTGTGNCGGCAACCTCCTTCTGGTGNCTTACGNNACTAAGCT
TATGGNGTTNTGACTACCCCAGNCANTTGNTNGTNGTATACNNAGNCCTCCTGCTNANCNNNGANGANC
CCNTCCAANAATTACATNNNGTGGGACCCNCCCTNTAAAGNGCTTCTGCTGCGGGAGANATANATATNCC
CCNTGGANGGANGAANNNNTTANTCCTTGGNGGGGGNAGGNGGGTCCCTTTGGNNNCCCNTNGGNTGG
GGNTTGCGGGANCNCNNNNNGGCCNAGCCCNCCTTGNCCCCNGGGGAAANCGGTTTGGACCAANATCCT
GNNTNCCCCNTTNNNAANNCCCGGGNCTCNNNNNNCCCNNATTANANGGGNAANNGNTTNNANGNNN
NNAAANGGGNNGNNTNAAAANGNANNTTTGCCCCTTNNNGNTNTTNNANANCCNCNACCNCCNNGGG
GGCNNCNNNGGNNGGNANTGGNNGANNNTNCNCCANN
74
CASO 61
CNGTNNCTGGCAANNATNTGTTCTGTTGTCGATCTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATAT
CTACTTCAGAACCTACATATAAAAATACTAACTTTAAAGAGNACCTACGACATGGGGNGGAATATGATTTAC
AGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCAC
TATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTTTACAACCCCCTCCAGGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTG
TAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATATA
CTTTTTGGGAAGTAAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCCTTNGGACGAAANN
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CASO 62
TGTNNNGGNCCNGTGTNTGTTNTGTGGTANATCCACACGCAGNACCAACATGACATTATGTGCATCCGTA
ACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAAT
TTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTT
TTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAG
TCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGGAAAAGGAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTT
TTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTTCCCCCCTNGGGACGAANNANNN
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CASO 63
CNNGTNGGGGGTNCACGTATTTGTTNTGTTGTNGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGC
CATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGA
TTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATT
CCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGT
TTGTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAAT
ACACTTTTTGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCCTTTGGGACGAA
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CASO 64
CGATCCTTGGGCGGAATNTGNATGTTGTGCCNTTCCCCAGGAATACAAACATGACACTTTCTGCAACCACAC
AGTCTATGTCCACATATAATTCANAGCAAATTAAACAGTATGTTAGGCATGCAGAGGAATATGAATTACAAT
TTGTGTTTCAACTATGTAAAATATCCCTGTCTGCTGAGGTTATGGCCTATTTACATACTATGAATTCTACCTTA
75
CTGGAAGACTGGAATATAGGTTTGTCGCCTCCTGTTGCCACTAGCTTAGAGGACAAATACAGATATGTAAA
AAGTGCAGCTATAACCTGTCAAAAGGATCAGCCCCCTCCTGAAAAGCAGGACCCACTATCTAAATATAAATT
TTGGGAGGTCAATTTACAAAACAGTTTTTCTGCTGATTTGGATCAGTNTCCCCCTTGGACGAANGNNNNNN
NNNNTGNNNNNNNNGGNGNNCCNNNTNNNTANCNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNGN
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NGTGNNNCNNNNTCNNNCNNANNTNNCNNNNGNGNTNNCNNNNGNNGNAGNGNNNNNNNGNNAN
NNNN
CASO 65
CTAGTGGGCACAGTTATTTGTTCTGTGGTNCTCCACACGTAGNACCAATATGTCTGNTTGTGCTGCAATTGC
NAACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTACA
ATTTATATTTCAGTTATGCAAAATAACATTATCTGCAGACATAATGACATATATTCACAGTATGAATCCTGCT
ATTTTGGAAGATTGGAATTTTGGATTAACCACACCTCCCTCAGGTTCTTTAGAGGATACCTATAGGTTTGTAA
CCTCACAGGCCATTACATGTCAAAAAACTGCCCCCCAAAAGCCCAAGGAAGATCCATTTAAAGATTATGTAT
TTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGATTTAGATCAGTTCCCCCCTNGGGACGAANNANNN
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CASO 66
TGTNGGNACAGTNTTGTTNTGTGGTAATCCCACGCAGNACCAATATGTCTGTTTGCGCTGCAATTGCAAAC
AGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTACAATTT
ATATTTCAGTTATGCAAAATAACATTATCTGCAGACATAATGACATATATTCACAGTATGGAATCCTGCTATT
TTGGNAAGATTGGAATTTTGGATTAACCACCCCTCCCTCAGGGTTCTTTTAGANGGAAAACCTATAGGGTTG
NTAACCCCCCCAGGGCCANTTACANGNGCCAAAAAAAAAGGGCCCCCCCCAAAAAGNCCCNAAGGGGGG
NAACCCCCCTTTTNNAAAANTNTTTNNNTNTTTTTTNTGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTNAAAAAA
AAAAAAAAANNTTTNTNTNCCNNCCCCCCNCCCNNNTTTTTTTTNNAAANNNNNNNNNNTTTTTNCCCCC
CCCCNCGGNGGGGGGGNGGGGGNGGGGGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNTNTNNNNNNNNNNNNN
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CASO 67
TGTGGCNACAANTGTTTTNTACAGGTGTAGATACNACTCGCAGCANCAATCTTTCTGTGTGTGCTTCTNCNA
CTGCTTCTNNTCCTAANGNATACNCACCTACCAGNTTTAANGANCATGCCNGACATGTGGAGGATTTGANT
TGCAGTTTATATTNCNACTGTGTACAATANCATTAACTACNGAGGTANTGTCANACANTCAGAATNCGANT
ACCACTATNTTGGAGGATTGGNATTTTGNTGCTNCACCACCTCCTACTGCNAGATTAGCTGACACATACCGT
NTTGCTCANNCNGCTGCTGNAACTTGTCCCANGGACGCCGCACCGNCAGTTAANCNGGACCCTTATGACA
NACTANAGTTTTGNACTGTAGATCNNAAGGTAAGNGGTNCTGCAGATCTTGTCCANTTGCCCCGGGGGAC
GAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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76
CASO 68
CGANAGGGNGGGNGGAGCGTCTGAGAGTNTCCTTAGNATNGGANCNTGCCATGAGTTNCCGGCNCGTGC
NANTTCNGTNNCTGGTGCCACGACCTGAGAGCGGCAGTCNTNATGGAGGNCTCTCTNNATGCNGNNGAG
TGNTNCNATNAAGANNCNNANGNCNAGTCTCNATAAAGCTCCACCCTNTGTGCNGACNNCTTNNTCTNT
GACNNTTGAGAANCATNTCTNCCTNNCTGNNTCCGNTAAGNTTATGGCANCCCANCTTTGGANGCCGCAC
GCCTCNCAAAGTTGNTGGGATNTTNACTNCAGNTGCCATTGCCTGCTAACANGCGGAGTCTCNGTCTNAC
NCTCNTNATGATCTTNGGACGAGTTCATCCGGTTGNACACACNNAGCAGTGTCTTCTGCTGGGNACCGNCC
AGTTTCCCNCTTNGGAGGAANATCATGNTANTGCACACGTGAACANTATACACGTCATGTTTCNCCTTGTTA
TGTGCCCCNGTGGCAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 69
CAGTTATTTGTTCCGTGGTTGATCCACTCGTAGCACTAATATGACATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGG
TACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGAATATGACTTACAGTTTGTTTTTCAG
CTTTGCAAAATTACACTAACTGCAGAGATAATGACATATATACATACTATGGATTCAAATATTTTGGAGGAC
TGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCGTCTGCCAGTTTACAGGACACATATAGATTTGTTACCTCCCAGGCTA
TTACTTGCCAAAAAACAGCACCCCCTAAAGAAAAGGAAGATCCATTAAATAAATATACTTTTTGGGAGGTTA
ACTTAAAGGGAAAAGTTTTCTGCAGATCTAGATCAGTTCCCCCNTNGGACGAANNANNNNNNNNNNNNN
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CASO 70
CAATCCGTTGNCGANGNTTGTTAAGTNGTTCATACTACCGCAGTGATAANCTGTCNTTGTGTGCTGCNGTA
TCTANNNTCNGAGACCANGNANNAGNCTANACNTCTATTAGAGGNNGCCCNCNCANGATGGTGGGAAA
AANATGNAACANGNGTNTTNTNCTNCANTCNNCCNAAANNNTCTACAGCCGGTGNTATGNCNTGATANT
CANNCTNANNNAGACTCCTNTNCTCNTGNAGNGTTNCNNTNNTGTANCNCNNCCNCCTTCNGGTGGTTT
NCGNNACNNAGCTTANNGNGGNTNTGTCACAGCAGNCNGNTGGTGGTANNATACNTNNCCCTCCTCAGC
ATNTNGANGATCCCTTNCACNAATTCATCTTTTTNGGACCGTCGNCNTNAGGGNATNGTGNTTCGGCCTGA
CCTAGATCAGCNTNCCCNCCTNGNGACGAANNNNNNNNTNNNNNGNGGNNNGNNANNNNGNNNNNN
NNNNNGNNNNNGNNTTNNNNCCNGGGGGCAAANNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGGG
77
CASO 71
NGGNATGNCNTTNTCCCCTGCCGTATNTGGGTNCAGNTACTACTTATNATGATACTNTCTTTNNGNAGGN
CCCCCNNGNTGAGGAGGANGANNNACAGCNGGTTNTTCNNCTTCGGTGCATNACACNCNNTGCTGCGGT
CNTGANGTACTTACCTACATNCGATGACTTCCACTATGNNGGAGTGCTGGANTGNTGNACTACNNCCTCCN
NCNGCCNGCTTACTAGANGATNCTTNTNGNGTTGCCNCCNCNNCNNTTACTNGTNGTNAAANACCTNCCC
CTCCAGCACNNGANGANGCACNCNNTAAANANTNCTCTTGNGNGGATGNNNATATAGNAGGAGATNTCT
GCTGCANACCTAGAGATCCNCCCTGGGNNGANGAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNTNNGNNGNNNNNNGNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNGNNNNNGNNNN
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NNGNNNNNGNNNNNNNNNGNNGNNNNGNGNGGNNGNNNNGNNNNNNCNNGNNNNGNNNNNNN
NNNNNNGNGGNCCGNNNNGNNNNGGGNGNGNG
CASO 72
GGGGTACNACTATTTGTTCTGTTGTTGCCCTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACT
TCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTT
ATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTT
GGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACAT
CCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTG
GGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCTTNGGACGAANNANNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 73
NGNCTGNNCANNGTATGTTNTGTGNGTCGCNTCCCCCCGCAGTACCAATATGGACACTATGTGCATCTGTG
TCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGGGGGGGGGAGTTTGGATTA
CAGTTTATTTTTCATTGTGGAGCNTACTTTTCTGCGGAGNCATGGCNNTATACNCNNANGGAACCCTCNNG
TTTNGGGAGACTGGGAANTTNGGNTTNCCNCCCCCCCCCCAAAGGGNNCCCTGGGGGGNGAANCTTTTA
NGNTTNTGGGGNGGGCCCCCNGGGGNNTTNNTCTTGNNGGNAAAAACCCCCCCCCCCGNGAAAAAAAA
AAAAAANNGGGCNCCCCCCNTAAAAAAAAANTNNGGTTTTTTTNNGGGGGGGGTNTTTTTTNNAAAAAA
AAAANTTTTTTTCCGGGGGGNAAAAAAAAAAAAANAANNCCCCCCCNGGNGGGGGGGGGNT
CASO 74
TGGGGACACTTGTTTGTTNTGTGGTANCTCCACACGCAGGNACAAATATGACACTNTGTGCATCTGTGTCTA
AATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTA
TTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTG
GAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCA
CAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAGTTTTTG
GGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTCCCCCCTTNGGACGAANANNNNNNNN
78
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CASO 75
CGNGTCTGGANNNGGTNCGTNGGNGNGNNGGGTGCGNGNNGGNGNGGTTGGNNAGATGTTGTTCGCC
CCGGGGCAAAATAGGGANGNGGGTCGCTTTTGCCCGCANTACCGNGGGTAACNATATGNNCNTCTACNC
AGTCTCCTGTACCTGGGCNATANGATGCTACCAAATTTAAGCAGNATAGCAGCACATGTTGAGGAATATGA
TTTGCAGTTTATTTTTCAGCNTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGCNATGAA
TAGCAGTATTTTAGAAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGGGGGATACATAT
CGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGAT
AAGTTAAAGNTTTGGAAGCGGATTTTAAAGGGAAAAGNTTTCTTTAGACTTAGATCAGGNTCCCCTTGGGA
CGAAGGTNNTNGNTTNNGNNCGCCCTNGNNGNAGGGGNGNNNCCNTNNTCCGGGNCNCATGNNNNN
NTCGCGTCTCNGNCNNNNTGGGNGGGNGGGNGNGGCNGNNGCNGAGNNTGNATNCCCNCNTTNGANT
ANTNCCGTTNGAGTGANNNGNTACNCNNGTCCNGCNGNNNGGAGGNNGGGNNGGCTNNTGCNNCNTT
CGGCNNGTGGNGNGTCNGNNGNNGGCTNTGGTNNGTANGGAGTTGNCANNNTCCAGNNNGACGNNTC
GTNGTGNTGTTTGNTAANTCGTGGGTCTTNGTTATGNGG
CASO 76
GTGGGGTCAACTATTTGTTNTGTTGTTGATCTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTAC
TTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTT
TATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTT
TGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACAT
CCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTG
GGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTCCCCCCTTGGGACGAAGANNNNNNNN
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CASO 77
NGGNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNGNNNNNNNNGNNNGNNNNNGGGNNNNNNNNNGGNCGGG
GCNNANNTGGGNANGGGGTGCCTTTNGCCCGNAGCCTAATATGACATTATGCACTGAAGTACTAAGGAA
GGTACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGAATATGACTTACAGTTTGTTTTTC
AGCTTTGCAAAATTACACTAACTGCAGAGGATAATGACATATATACATACTATGGATTCCAATATTTTGGAG
GACTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCGTCTGCCAGTTTACAGGACACATATAGATTTGTTACCTCCCAGG
CTATTACTTGCCAAAAAACAGCACCCCCTAAAGAAAAGGAAGATCCATTAAATAAATATACTTTTTGGGAGG
NTAACTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGATCTAGATCAGTTCCCCTTGGACGAAACNTNGNNCGGTNNNNN
CTGGGGAGGGGNNNGGGGNGGGNGGGGNNGNGGCNGCNCNGGNCNNCNNNNNGGNNGNNNGGNG
GGGNGGGNGGGGNNNGGNGGGGNNNGGGCGGGGNGNGNGNCNGTGACNGNGNGGGGGGGGGNNG
TCGGNGNTGGNNNGNGNNGNGGNGGNGCGCGGNNTGNNCGGNCGNGNNGNNGGNGNNGNNGCTTT
79
NCGNNNNGNGTCNGGTNGTCGCGGNGGGGNGNNTTNCTTCNGTGTNNNGACGNGGNGGGGGGTTNTG
GGGNCGNGNNNGG
CASO 78
GCGGTACAGGTTTTGTTNTGTTGTGNCATCTACCAGAAGTACCAACATGACTATTAATGCAGCTAAAAGCAC
ATTAACTAAATATGATGCACGTGAAATCAATCAATACCTTCGCCATGTGGAGGAATATGAACTACAGTTTGT
GTTTCAACTTTGTAAAATAACCTTAACTGCAGAAGTTATGGCATATTTGCATAATATGAATAATACTTTATTA
GACGATTGGAACATTGGATTGTCCCCACCAGTTGCAACTAGCTTAGAGGATAAATATAGGTATATTAAAAG
CACAGCTATTACATGTCAAAGGGAACAGCCCCCTGCAGAAAAGCAGGATCCCCTGGCTAAATATAAGTTTT
GGGAGGTTAATTTACAGGACAGCTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTCCCCCNTTNGGACGAAGANNNNNN
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CASO 79
NNNTNTTNNTNNCTNNNNNACGGNNNNANNCANTNTATGANTTTCNCNCANNCNGTNNNNNGTTTGN
ANTCNGTNNGNNANCNANANCNCCNNCNCCCGGATATTNTANTNCATNAGNNTNTNTTCNNCCATNNCG
TCGTANGGGNGATNNGNNNNNNCACTGNNNTNCNCANNTAACANNNTANNANCGNANAAAANNTNTA
CAAAAATCNNCTNATTTNNTTNCNTTCNTNCACNNGCTNTNGTCCTCGCANNGGGATTGNNNGGTCANAG
NATTNCTGNANTANNNTNTANNANNNGNAAGNCANGNACNNGACNTGATNTNCGNNNNNNCNTATTN
CTNTNTNNTTNGNNTTATATNANCTANCTNCNCACANANTNGNNNTCACTGNNNTCNGNGTCNNNNATT
NNNNNNAGTANAACNNNNTNNNATNNCANTNNCNGCNCCCNNCANNATGCGNANNNNNNGNGCNNG
GCCNCNGNTNCNGGCNGGNGNNGTNTCNNANATGGANACNTTACCNATGTNANTGNNGCGANNGGTG
AANNNATNNNCTATCTCNTTNNNACTNATNNTNNNTNTTTCTNNNANTACNNNGGTNNTTNCNCNTNNT
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GGCTTNCNNCCANANCNAATATCNNAGNNNNATANGTACAGNNTNGTNNATNNGNNGTNATNGTGNN
ANTTNNACGNNGTNNNCNANNTCCNGNNCNGNTNATNNANNAGNCGNGNNCNNNCTNCANAAGNNN
TNAGNNGGGNNNNCNNCTGNAANNNTTANAGNCATNCCAGCCACGTNCNCNNTGANCCNCCANCGAN
NNGNACGNNCNNCGANATTGNCACNNTNNACCGNCTNNGTCTTACAANTCCTATNCGAAGCCCNANNAC
TNCTANCAGANGNNGCANAANTGNTCTNNTGNACGNAGGNCNNNNGNNAGNCNACNNNANNNAGGT
NCNANGTTGNAGNNNCGNNGGCGTANTCATAAGANAGNNNCNCNGCCN
CASO 80
CTGTGGTGNCCNNTATTTGTTNTGTTGTTGATCTACACGCAGTACAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTA
CTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAAGAATATGATTTACAGT
TTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATT
TTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACANCCTCCCCCAGGNGGCNCCCTAGAAGAAACNTTATNGGNTTGTAA
CATCCCAGNCAATTGCTTGNCAAAAANCATACNCCNCCGNCCCCTAAGGAGAACCCCCTTNAAAAAAAACC
NTTTTTGGGGAGGGAAATTTTAAGGNAAAAGTTTTTNCNGGGAAANAAANAAAAAGGTTCCCCCNTNGGG
80
GNGGNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CASO 81
CGNGTNGGGGTACAGGNGTTTGNTNTGTTTNTGATCCACGGGGCNGCACCCACATGTNATTATGTGCTGC
CGTNTCTACTTCTGCCACNTCCCCCANTTCTGCTTACTTTGAGNAGNANCTNCNAGNGGAAAGAGGAAGAT
TNNCAACNGATTATTCATCGANNGNGCANGAACATCNTCNGCTGAAGNNGTGNNNTATNTTCTCACAACG
ANGCCCTCTGNTTTGNAAGANNGNCANTTTNNGNGANGNCCTCCTCCCNNNGGGACANTAGCAGATNNC
CATGGGAGTGTGNTNACNCAGCNNGATTTCCNGTGNNAAGCANCAGTCCTGCTCNAGGAACCNNCCAGA
AGATCNATTAGAAACCTTACANTTTGGGAGGNGAAANTNNAAGNGAAAANTTCTNGGCAGACNNATCAG
NTCNCCCCTGGGNAGAGAANTTTTNNTNCCCCNNGGANANTATNCNGTCATNTNCCCCCTNTTNTNTNCC
CNNGGGCANANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 82
ANCNCTNNGNGNTTCTCTNNACTGTTNGANNTGATCAGCNANGANAGCCTCCNACAGGCNNNNCNACNA
NACTAAAATTNCNGCCGANGNNGNNNGNNCCCCTANGNNATNNTANNTTTNNNTTNCTTTCCTACANTN
GTNNNNTNAGGGGNGTNNNNNNTNNATNTCACGGCGTNGNNAATCATGNTCGTANNNGNATACNNGN
TGTNAANGCCNNCTCNACCAGTNATNNGGNGTTNGNCNTAGCNTGCCTCNNNANTANTANNNNNGTNG
CNNNNTGGCNNANANCGGCNCNTNNNGAGTNANATGANCNNNGTGNNAGNNNNCGTNANNANNNNN
CNGCANNTNGAGNATTANCTGCNNCGTANNTANTNNCTNNNNATNACANCCTNNCCCCATGNNNTANT
NATTNCTCNNNAGNNANNTNNANANCCANGCCCGCGCNCNANNNTNTCANCNNCNNNAGNTNTCAAG
NGAGNNNCTANTNNGNTTTNANGNTGCTNNNTNGCTCCNCTGANNNAATANNTTNTTNCNNNNTTAGN
NNNTANANNANANGTGTNCNTNTANTANCNTAAAGGATNNNTATANNANNANNAGNTGNAANNCGNA
TNTGACATNAATNNNNTACTNNCTNNAGCTCCGGTNCGNGGNTGNNNGTTNTNGNCNCCCTCNNNNGA
GGNGGCNGTGCNANCGGTCTNNNTCGNTTNNNNAACNAANNACNNNTANTTNGGTNNGNGNCNGNNG
NGCACGNGGNGNGNGTGAGANNNANGNNGATCCNGTGACAAGANTGAGGNGNTGNTNGCNTNGTTNA
NNTNNGTAGGNNGANGNAANAANNTTTANTNAGATNCCNNGTNNNNNANGNNAANTCNAAGTNANTG
TNNNAANNNNNCNANGNNGGGGCGATGTNGGNGCANNGAAGCNNGTCTNNTNANNNNNNANNTNAT
NCNNNNNNNTNNTNAGTCNNTNANTTCATNTNTCTNGNNAGNANATNTNATATNNGNCNTNCNNAANN
TNNNNTNNTATNNANTANGAANTNANNNTNTACTANGTGNTCGCNTNNNNNNNGTGTCNNACNGTNNT
NAGNCNNNACNTNNNNNATCATNNCAGANTNTNTTGNTNGNGGNNCCCGCGCN
CASO 83
CGNNTNCNNGGCNGGTATTTGTTNNGTGGTTTCCTCCNCTCGNANAAACTAATNTGTNTTCCNGCGCTGCT
NNAACTACTNCNGGAACTGGGCAAAATGATAGTTACCANTTTGTAGCCCNTCGNGGAGANGANGAGGAC
81
TANNAGNTGGTNTTTNTTCTTCGGTGGTGTACACNCTACTGCTGANTGCATGACNTATGTCCTACNTTCGG
AGTNNGANACTNTGNAGGAAGAGNGATTGTGAANNTNNGCNTTCCTCCCCCTGCCANGCTACACAGGAG
NAGGNTTAATNTGTTNCCTCCCAGGCCTGTTACTTGTTATCTGACACNANCACCTNGCAGCNGANGNAGAA
CCAACNACCCAAATAACCNNTTGNGGGGTGGANTNTNGAGAGNAAGTNTCTGCTGNCCTNNAACATAATC
CNCNTGCCCGAGGACGANNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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CASO 84
CGTCCGGNCCGNNGTTTGCCAGTTGTGGCTCCNCTCGTAGCACTAACATGACTTTATGNGCTGAAGTTAAA
AAGGAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAAGGAATACCTTCGTCATGGCGAGGAATTTGATTTACAATTT
ATTTTTCAATTGTGCAAAATTACATTAACAGCTGATGTTATGACATACATTCATAAGATGGATGCCACTATTT
TAGAGGACTGGCAATTTGGCCTTACCCCACCACCGTCTGCATCTTTGGAGGACACATACAGATTTGTAACTT
CTACTGCTATAACTTGTCAAAAAAACACACCACCTAAAGGAAAGGAAGATCCTTTAAAGGACTATATGTTTT
GGGAGGTGGATTTAAAAGAAAAGGNTTCGGCTNCTGCAGATCAGATCCCCCTTNCCNCGGGGGACGANN
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CASO 85
CNGTGGCATCAGTTATTGTACTGTTGTGTTCCCACCAGGGAATACAAACATGACACTTTCTGCAACCACACA
GTCTATGTCCACATATAATTCAAAGCAAATTAAACAGTATGTTAGGCATGCAGAGGAATATGAATTACAATT
TGTGTTTCAACTATGTAAAATATCCCTGTCTGCTGAGGTTATGGCCTATTTACATACTATGAATTCTACCTTAC
TGGAAGACTGGAATATAGGTTTGTCGCCTCCTGTTGCCACTAGCTTAGAGGACAAATACAGATATGTAAAA
AGTGCAGCTATAACCTGTCAAAAGGATCAGCCCCCTCCTGAAAAGCAGGACCCACTATCTAAATATAAATTT
TGGGAGGTCAATTTACAAAACAGTTTTTCTGCTGATTTGGATCAGTTCCCCCCTTGGGACGAANANNNNNN
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82
ANEXO 12
FOLLETO DE INFORMACIÒN A LAS PACIENTES
Marco teórico
Durante los últimos 25 años, la Medicina ha evolucionado, conociendo las probables causas
del cáncer del cuello de la matriz .
La muestra de la paciente para estudio, se obtiene de un frote en el cuello de la matriz;
utilizando instrumentos descartables y seguros que no dañan el cuello de la matriz, parecido
a un papanicolaou. Detectan si hay un problema a nivel de las células del cuello de la
matriz, específicamente se identifica la presencia de un virus conocido como papiloma.
Dentro de los casos positivos, se podrá llevar un mejor manejo en las decisiones para el
tratamiento.
El estudio está aprobado por La Facultad de Medicina de la Universidad de San Carlos de
Guatemala y por las instituciones donde están siendo tratadas actualmente.
Propósito
Encontrar la presencia del Virus del Papiloma Humano en las células afectadas del cuello
de la matriz. En este estudio:
1.-El análisis de las biopsias cervicales será utilizado únicamente para la investigación
llamada: Detección y Tipificación de los virus del Papiloma Humano de alto riesgo , en
pacientes con diagnóstico de lesiones preinvasivas_e Invasivas del cérvix por medio de
PCR
2.-El investigador dará los resultados al ó los médicos a cargo de su caso y si
usted lo
solicita será notificado a través de ellos.
3.-No serán entregadas los resultados a terceras personas, incluyendo a su compañía de
seguro médico, si usted no lo autoriza en forma escrita.
4.- La muestra y su procesamiento podrá conservarse hasta que sea de utilidad en el
estudio. La investigación dura 12 meses a partir de _________.
5.-Los científicos investigadores no entregarán las muestras a ninguna tercera parte,
cumpliendo con esto privacidad y confidencialidad.
6.-La muestra de obtenida no estará disponible para ningún otro tipo de estudio no
relacionado con esta investigación.
Procedimiento
La investigación estudiará la presencia de virus del papiloma Humano en las muestras
obtenidas por medio de un instrumento llamado citobrush, el cual frota el cérvix ó cuello de
la matriz; en cada paciente se utilizará uno, estéril y descartable, así como un espéculo
descartable para cada paciente. La muestra se puede tomar a partir de una semana después
de la biopsia realizada por colposcopía.
Esta muestra será enviada al laboratorio del Centro Universitario Metropolitano,
Facultad de Medicina, Universidad de San Carlos de Guatemala, zona 11 Ciudad Capital.
El procesamiento de la muestra dura 10 días hábiles y el resultado por escrito se enviará en
3 semanas.
83
Riesgos e incomodidades
Los riesgos del estudio son casi nulos en la paciente, ya que solamente se obtendrá una
muestra con un cepillo de plástico sin dañar ni cortar el cuello de la matriz. La técnica es
similar a la toma de un papanicolaou, utilizando un espéculo descartable para cada
paciente. En el caso de las pacientes con cáncer invasivo del cuello podría existir la
posibilidad de un leve sangrado vaginal.
Quienes pueden participar
Pacientes con lesiones del cuello del útero con lesiones preinvasivas ó de cáncer invasivo.
CONTRAINDICACIONES: No se le efectuará la prueba a embarazadas, si hay retrasos de
regla ó dudas de embarazo, favor indicarlo para realizar una prueba de embarazo
previamente. Tampoco las pacientes con tratamientos de radioterapia previa por cáncer del
cuello del útero.
Recomendaciones previas a obtener de la muestra:
No tener relaciones sexuales, duchas vaginales ni óvulos vaginales 3 días antes.
Estar sin regla ó menstruación, el día de la obtención de la muestra
Beneficios potenciales
Los beneficios por participar en este estudio pueden ser:
Un mejor conocimiento de la enfermedad
Aportar información para el médico tratante en la institución donde está siendo tratada
Recibir información del estudio si así lo desean
Alternativas
La única alternativa es no participar en el estudio. Al negarse a colaborar con el estudio no
afecta la atención médica en las instituciones donde son tratadas
Costos financieros
No hay gastos para usted por participar en este estudio.
Dudas pueden realizarla con los investigadores Dr. Alberto García González. Tel. 53 12
7874
84
ANEXO 13
Si está interesado en participar favor leer y llenar la boleta que se le presenta a continuación.
Consentimiento informado
Nombre de la paciente____________________________________________
Fecha ________________
No de registro Médico___________
Institución a que pertenece________________
Con
la
firma
de
este
documento,
dejo
constancia,
yo____________________
_____________________, que he sido informada acerca del estudio que se realizará en la muestra que
me tomaron previamente. He recibido además una copia de la información al paciente, sobre la
investigación. El médico ha resuelto personalmente las dudas que he planteado con respecto a la
investigación.
Además he sido informado del derecho que tengo de retirarme de este estudio, sin que afecte la
atención médica dada por esta institución.
Autorizo al médico y equipo de investigación a recabar la información que requiere la ficha del estudio,
manteniendo la confidencialidad de los datos. Acepto voluntaria y libremente participar en esta
investigación.
Al firmar el consentimiento informado se deberá llenar la boleta de Datos del paciente que
a continuación se presentan, dichos datos se obtendrán de los registros médicos, bajo en
consentimiento. Ver siguiente cuadro.
85
ANEXO 14
Boleta de Datos de la paciente
Fecha: _______________ Registro clínico____________________
Institución_____________________
Nombre de la paciente_____________________________ Edad: __________
procedencia__________________________
Diagnóstico histopatológico ó por Biopsia LEIBG
LEIAG
Cáncer Invasivo de tipo
Epidermoide
Adenocarcinoma
Mixto
Estudios realizados previamente en su respectiva institución
Resultado de papanicolaou_____________________________________
____________________________________________________________
86
V INFORME FINANCIERO
AD-R-0013
TRECEAVA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
Nombre del Proyecto:
Detección y tipificación de los virus del papilona humano de alto riesgo, en
pacientes con diagnóstico de lesiones preinvasivas del Cérvix por medio de PCR
Numero del Proyecto:
006-2007
Investigador Principal:
Dr. Alberto García González
Monto Autorizado:
Q260,354.50
Fecha de Inicio y Finalización:
01/06/2007 al
31/08/2008
15 meses
TRANSFERENCIA
Grupo Renglón
Nombre del Gasto
Asignación
Presupuestaria
Menos (-)
En Ejecución
Mas (+)
Ejecutado
1
Pendiente de
Ejecutar
Servicios No Personales
122
Impresión, encuadernación y
reproducción
Q 2,000.00
Q
2,000.00
Q
131
Viáticos en el exterior
Q 7,000.00
Q
3,755.00
Q
3,245.00
181
Estudios,investigacionesy
proyectos de factibilidad
Q 80,000.00
Q
72,000.00
Q
8,000.00
Q
74,700.87
Q 10,019.13
2
-
Materiales y Suministros
261
Elementos y compuestos
químicos
Q 84,720.00
268
Productos plásticos, nylon, vinil y
pvc
Q 17,575.00
269
Otros productos químicos y
conexos
Q
295
Útiles
menores,
médicoquirúrgicos y de laboratorio
Q 17,575.00
Q
400.00
Q
17,575.00
Q
15,991.00
-
Q
400.00
Q
1,584.00
87
3
Propiedad, planta y equipo
323
Equipo médico-sanitario y de
laboratorio
329
Otras maquinarias y equipos
9
Q 45,000.00
Q
5,459.00
Q
5,459.00
Q
33,806.50
Q
5,734.50
Q
5,459.00
Q
-
Q
23,669.50
Q
-
Asignaciones Globales
(-)
Gastos Administrativos (10%)
Q 23,669.50
TOTAL
Q260,364.50
Monto Autorizado
Q260,364.50
( -) Ejecutado
Sub-total
Q 23,034.00
Q 23,034.00
Q231,381.87
Disponibilidad:
Q28,982.63
Q 28,982.63
Q231,381.87
Q 28,982.63
( -) Apertura de Caja Chica
Total por Ejecutar
Q 28,982.63
88