INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DEL NIÑO DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR β-LACTAMASAS DE EXPECTRO EXTENDIDO EN E. coli y K. pneumoniae AISLADAS EN EL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DEL NIÑO LIMA-PERU 2015 RESUMEN El objetivo del estudio fue detectar y caracterizar molecularmente las β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y K. pneumoniae aisladas en el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Se incluyeron un total de 1198 enterobacterias de muestras de pacientes hospitalizados y comunitarios. Finalmente se consideraron para el análisis 724 Escherichia coli y 181 Klebsiella pneumoniae de aislamientos consecutivos no repetidos; recuperados entre los meses de agosto de 2012 a enero del 2013. Las pruebas de sensibilidad se realizaron mediante la técnica de disco difusión, de acuerdo a los criterios del "Clinical and Laboratory Standards Institute" (CLSI) (2013). El ensayo fenotípico para la detección de BLEE se realizó utilizando el método de Jarlier. Detección de genes BLEE se realizó mediante PCR, para las familias más ampliamente diseminadas. El 31% (281/905) de los aislamientos de ambas enterobacterias fueron productoras de BLEE. Del total de E. coli el 28,6% (207/724) fueron productores de BLEE y de las K. pneumoniae el 40,9% (74/181) fueron productores de BLEE. A través del método genotípico se analizaron tres familias de genes productores de BLEE, Los genes involucrados fueron el gen blaCTX-M (91,1%: 256/281), el gen blaSHV (45,5%: 128/281) y el gen blaTEM (44,4%: 125/281). En conclusión de los 905 aislamientos de E. coli y K. pneumoniae recuperadas en el INSN que ingresaron al estudio, el 28,6 % de E. coli y el 40,9% de K. pneumoniae presentan producción de BLEE indicando que este es el principal mecanismo de resistencia a los betalactamicos presentado por E. coli y K. pneumoniae en el INSN, y refuerzan la necesidad de revisar las medidas de control de la infección en la institución. Palabras clave: β-lactamasas de espectro extendido, E. coli y K. pneumoniae. 6 INTRODUCCIÓN Uno de los grupos de antibióticos más importantes, tanto histórica como clínicamente, es el grupo de los ß-lactámicos. Este incluye a las penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas , carbapenemas y monobactámicos, entre otros antibióticos 1. La resistencia bioquímica a los antibióticos β-lactámicos se puede atribuir a cuatro mecanismos diferentes: ya sea inactivación enzimática de la droga, alteración del sitio blanco, incapacidad de la droga de alcanzar su sitio blanco debido a modificación de las porinas a nivel de la pared celular y eflujo de la droga una vez que ingresa. El mecanismo más utilizado por los bacilos Gram negativos para adquirir resistencia a penicilinas y β-lactámicos en general, ya sea que esto ocurra de manera natural o adquirida, es la inactivación de las drogas por las enzimas βlactamasas, que abren el anillo de las penicilinas y demás β-lactámicos entre los átomos de C y N para formar compuestos inactivos 2. Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) son derivadas a partir de mutaciones puntuales de las β-lactamasas de espectro ampliado (BLEA) TEM-1, TEM-2 y SHV-117, aunque existen otras familias de BLEE, como las tipos CTX-M y PER que tienen orígenes diferentes y una escasa relación estructural con las TEM y SHV3. La movilización y estabilización de genes de resistencia a antibióticos ha sido conducida por los mecanismos de transferencia horizontal de la información genética, principalmente a través de la conjugación. La transferencia de ADN mediante conjugación, esta mediada por plásmidos conjugativos, que contienen toda la información genética necesaria para promover su propia transferencia4,5. La aparición de bacterias productoras de BLEE tiene importantes repercusiones clínicas y terapéuticas: a) la mayoría de los aislamientos tienen codificada la resistencia en plásmidos que pueden ser transferidos a otros microorganismos, b) son causantes de brotes en instituciones de salud, c) aumentan la morbimortalidad nosocomial y d) limitan las opciones terapéuticas, incrementándose el uso de antibióticos costosos como el imipenem 6. Los microorganismos que más comúnmente sintetizan BLEE son: Klebsiella spp. y E. coli, pero también se han detectado 7 en: Salmonella spp., Proteus spp., Citrobacter spp., Morganella morganni, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginos y, Burkholderia cepacia 7. En el caso de Perú, muy pocos estudios han reportado el problema de las BLEE. Una excepción son los estudios de Morales et al, quienes reportaron la presencia de BLEE tipo TEM-10 y SHV-5 en aislamientos de K. pneumoniae y E. coli en dos hospitales generales de Lima8 y el trabajo de Calderon et al., quienes identificaron cepas BLEE SHV-5 en K. pneumoniae y E. cloacae en una UCI neonatal9. Otro problema adicional relacionado con la detección de BLEE en el laboratorio es la presencia de cepas de BGN que producen betalactamasas de tipo Amp C. Estas son enzimas de carácter de Cefalosporinasas, clasificadas en el grupo 1 (Clase molecular C), estas no son inhibidas por los inhibidores de betalactamasas (Ac. Clavulanico, sulbactan y tazobactan) originalmente descritas como de origen cromosomal y con síntesis inducible, pero ahora parecen codificadas por genes plasmidiales 3. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) publicó unas directrices para detectar y confirmar la producción de BLEE en K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli. La gran diversidad de BLEE obliga a los laboratorios a estar preparados para detectar los diferentes tipos de resistencia, lo que permitiría que se adopten rápidamente las medidas de control. Los estudios epidemiológicos pueden comenzar a determinar las relaciones de los aislamientos bacterianos con técnicas basadas en el fenotipo, como biotipificación y patrones de resistencia a los antibióticos, pero estos métodos han sido reemplazados por técnicas moleculares. Actualmente existen técnicas para la tipificación molecular de bacterias, como son electroforesis en gel con campo pulsado (PFGE), PCR-RFLP y PCR-RT; estas técnicas son utilizadas en epidemiología molecular y actualmente son consideradas como técnicas para la tipificación molecular de microorganismos 1. Se desconoce la prevalencia real de la BLEE sobre todo en poblaciones pediátricas. Por eso los efectos de no identificar la producción de BLEE por bacilos gran negativos pueden resultar en un fracaso del tratamiento, debido a una dosificación inapropiada de los antibióticos de espectro 8 extendido seguido de un incremento de la tasa de morbimortalidad y de los costos que implica el tratamiento y la estancia hospitalaria. Por este motivo se desarrolla esta investigación en el Instituto de Salud del Niño para poder determinar los tipos de genes prevalentes a fin de dirigir más conscientemente el arsenal terapéutico utilizado y prevenir la diseminación de los microorganismos multirresistentes en la población pediátrica de nuestro hospital. 9 OBJETIVOS General Detectar y caracterizar molecularmente las β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y K. pneumoniae aisladas en el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Específicos 1. Caracterizar los genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y K. pneumoniae provenientes de pacientes hospitalizados en el Instituto Nacional de Salud del Niño. 2. Caracterizar los genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y K. pneumoniae provenientes de pacientes de la comunidad en el Instituto Nacional de Salud del Niño. 3. Evaluar el perfil de susceptibilidad antimicrobiana de los aislamientos considerados probables productores de β-lactamasas de espectro extendido. 10 I. MARCO TEÓRICO IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS ENTEROBACTERIAS Esta familia incluye especies que son patógenas y otras comensales, estables o transitorias que pueden producir infecciones oportunistas. Estas infecciones pueden darse siempre que existan factores predisponentes locales: lesiones sobre las barreras físicas constituidas por la piel y las mucosas como heridas, quemaduras, catéteres o las fisiológicas del árbol respiratorio (intubación), vía urinaria (sondas), vía genital (dispositivos intrauterinos); así como factores generales inespecíficas principalmente fagocitosis y la respuesta inmune del huésped que puede estar disminuida por una enfermedad de base.10 Las enterobacterias son el grupo de microorganismos que frecuentemente se aísla en los laboratorios clínicos de microbiología, produciendo infecciones tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunodeprimidos y pueden ser adquiridos en la comunidad como en ambientes hospitalarios. Producen una gran variedad de enfermedades en el ser humano, como el 30% de las septicemias, más del 70% de las infecciones del tracto urinario (ITU) y las infecciones intestinales. Algunas enterobacterias son parte de la flora intestinal normal, pueden producir infecciones oportunistas, entre los más frecuentes figuran: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Serratia marcescens. Mientras que otros géneros siempre se asocian a enfermedades, por presentar factores moleculares de patogenicidad, pudiendo causar infecciones en personas previamente sanas sin factores predisponentes, estas bacterias son: Shigella, Samonella, Yersinia y Escherichia coli (especies patógenas). 11 La E. coli es el principal microorganismo anaerobio facultativo que reside en el intestino grueso y forma parte de la flora normal, asimismo es aislado con mayor frecuencia como agente causal de infecciones de las vías urinarias, heridas, neumonías, meningitis y septicemia tanto en las infecciones comunitarias como las adquiridas en el ambiente hospitalario. Las mujeres son más propensas a sufrir infecciones del tracto urinario a una edad más temprana debido a diferencias en la estructura anatómica, la madurac ión sexual, las alteraciones que se producen durante el embarazo y el parto. 12 El género Klebsiella recibió ese nombre en honor a Edwin Klebs y la especie que se aísla con mayor frecuencia es la Klebsiella pneumoniae. Se encuentra en las heces de los individuos sanos (5 a 10%) y es con frecuencia un invasor secundario del aparato 11 respiratorio de personas con enfermedad pulmonar crónica. Como otras enterobacterias oportunistas, K. pneumoniae puede ocasionar infecciones en aproximadamente el 3% de todas las neumonías bacterianas agudas y es el segundo patógeno más común del tracto urinario. También puede causar infecciones de heridas. Es la segunda especie después de E. coli causante de bacteriemia por gram negativos. Forman una cápsula y por esta razón producen colonias grandes y húmedas, frecuentemente muy mucosas. 12 ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS Los β-lactámicos son un grupo de antibióticos de origen natural o semisintético que se caracterizan por poseer en su estructura un anillo β-lactámico tetragonal, esencial para su actividad antibacteriana. Actúan inhibiendo la última etapa de la síntesis de la pared celular bacteriana, impidiendo la transpeptidación y el entrecruzamiento de las cadenas de peptidoglicano. Constituyen la familia más numerosa de antimicrobianos y la más utilizada en la práctica clínica. Son compuestos de acción bactericida lenta, relativamente independiente de la concentración plasmática, que presentan escasa toxicidad y poseen un amplio margen terapéutico. Su espectro se ha ido ampliando a lo largo de los años por la incorporación de nuevas moléculas con mayor actividad frente a los gram negativos; pero la progresiva aparición de resistencias adquiridas ha limitado su uso empírico y su eficacia en algunas situaciones. 13 CLASIFICACIÓN El espectro de los β-lactámicos incluye bacterias gram positivas, gram negativas. No son activos sobre el Micoplasma porque estos carecen de pared celular. 13,14 Se pueden clasificar en los siguientes grupos: Penicilinas: penicilina, amoxicilina, ticarcilina y piperacilina Cefalosporinas: 1ra generación: cefalotina, cefazolina, cefalexina, cefradina 2da generación: cefaclor, cefuroxima 3ra generación: cefpodoxima, cefoperazona, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima 4ta generación: cefepime 12 5ta generación: ceftobiprol, ceftarolina Monobactámicos: aztreonam Carbapenémicos: imipenem y meropenem PENICILINAS El primer miembro de los β-lactámicos, la penicilina se obtuvo en 1928 de una cepa del género Penicillium notatum. Están formadas por un núcleo químico común, denominado ácido 6-aminopenicilánico (6-APA o núcleo penam), constituido por 3 partes: Un anillo betalactámico, un anillo tiazolidínico y una cadena lateral unida en posición 6. Las penicilinas constituyen el grupo de antibióticos más usados y mejor tolerados. Se caracterizan por tener una buena distribución en el organismo, baja toxicidad y actividad bactericida. La utilidad de esta penicilina natural, bencilpenicilina (penicilina G), está en función de su espectro antibacteriano relativamente reducido; cocos gram positivos, espiroquetas y algunos organismos gram negativos (Neisseria).13,15 6 1 CEFALOSPORINAS En 1945 se aisló el primer antimicrobiano cefalosporínico de cultivos del hongo Cephalosporium acremoniumal que se le denominó cefalosporina C. Las cefalosporinas son fármacos estructuralmente similares a las penicilinas, cuya estructura básica está constituida 13 por un núcleo central llamado ácido 7-aminocefalosporínico (7-ACA o núcleo cefem) constituido por la fusión de dos anillos: un anillo betalactámico y un anillo dihidrotiazínico. La introducción de modificaciones en las cadenas laterales origina las diversas cefalosporinas. Son antibióticos de amplio espectro, muy eficaces y poco tóxicos, pero que deben ser cuidadosamente seleccionados para prevenir el desarrollo de resistencia bacteriana. 13,16 1 7 7-ACA Dentro de este grupo también se incluye las cefamicinas (cefoxitin, cefotetan) que derivan de especies de Streptomyces, la cefamicina resulta de la adición de un grupo metoxi a C7, lo cual aumenta su actividad contra bacterias anaerobias. La más conocida es la cefoxitina que deriva de la cefamicina C. CARBAPENÉMICOS Los carbapenémicos son los de mayor relevancia clínica. Difieren de las penicilinas por presentar una sustitución de un átomo de carbono por uno de azufre en posición C1, y por la adición de un doble enlace entre los átomos 2 y 3 del anillo pentagonal de la penicilina. Esto les confiere mayor afinidad por las proteínas ligadoras de penicilina (PLP), mayor potencia y un espectro antibacteriano más amplio. Los carbapenémicos derivan del antibiótico natural tienamicina producido por el Streptomyces catleya descubierto en 1976, a partir del cual se ha desarrollado el imipenem, meropenem, ertapenem y doripenem. El primer derivado que se utilizó, el imipenem, tiene un espectro bacteriano excepcionalmente amplio; se une con extraordinaria afinidad a la PBP2, por ello su acción 14 antimicrobiana conduce a la producción de células bacterianas esféricas que se lisan con rapidez y facilidad. 14,15-17 MONOBACTÁMICOS Los monobactámicos fueron descubiertos el año 1981, éstos son antibióticos estructuralmente relacionados con los β-lactámicos, pero con una configuración monocíclica. El término deriva de Monocyclic Bacterially produced Betalactam, lo que indica que los primeros fueron de origen natural, obtenidos a partir de bacterias procedentes del suelo tanto gram positivas (Nocardia), como gram negativas (Acetobacter, Chromobacterium y Gluconobacter). Aunque estos compuestos tienen una débil actividad antibacteriana, la simplicidad de su estructura permitió sintetizar su núcleo estructural, adicionándole diversos radicales, lo que permitió obtener más de un millar de derivados semisintéticos y sintéticos con disímiles propiedades farmacológicas. El primer monobactámico introducido en la clínica fue el aztreonam, obtenido por síntesis. El espectro de este antibiótico (bacterias gram negativas aerobias y anaerobias facultativas, incluyendo enterobacterias, P. aeruginosa, Haemophilus y Neisseria) es similar a los 15 aminoglucósidos; pero, a diferencia de ellos, no es nefrotóxico ni ortotóxico es débilmente inmunogénico y no se ha asociado a coagulopatías, por lo cual representa una alternativa a los aminoglucósidos. El aztreonam es muy estable a la hidrólisis de la β-lactamasa bacteriana y además presenta una cierta especificidad por las PBP-3, proteína que interviene en la división bacteriana.15 INHIBIDORES DE LAS β-LACTAMASAS (IBL) Los IBL deben atravesar los canales porínicos de la pared celular bacteriana y alcanzar concentraciones adecuadas en el espacio periplásmico de los bacilos gram negativos, donde se encuentra la β-lactamasa. Según su mecanismo de acción se distinguen dos tipos de IBL: Inhibidores reversibles: Se unen a las β-lactamasas, pero no la destruyen y pueden disociarse de ella, perdiendo eficacia a medida que su concentración disminuye. Inhibidores irreversibles: Se unen a la β-lactamasa, alterándola y destruyendo su actividad en forma permanente, la enzima queda modificada químicamente de forma definitiva, mientras que el IBL sufre un proceso de autodegradación. El inhibidor se une a la β-lactamasa impidiendo que el β-lactámico sea destruido, dejando al antibiótico activo y libre para que ejerza su efecto. Los IBL disponibles son ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam. 17 16 MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS β-LACTÁMICOS Los antibióticos β-lactámicos son agentes bactericidas que inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana e inducen un efecto autolítico. La destrucción de la pared celular bacteriana se produce como consecuencia de la inhibición de la última etapa de la síntesis del peptidoglicano. El peptidoglicano está constituido por largas cadenas de glúcidos, formadas por la repetición de moléculas de ácido N-acetil murámico y N-acetilglucosamina. El ácido murámico fija cadenas de péptidos que se unen entre sí para formar una malla. Los β-lactámicos inhiben precisamente esta unión o transpeptidación, última etapa de la síntesis de la pared celular. De este modo, la pared queda debilitada y puede romperse por la presión osmótica intracelular. Para que actúe los betalactámicos es necesario que la bacteria se halle en fase de multiplicación, donde se sintetiza la pared celular. Los βlactámicos también actúan activando una autolisina bacteriana endógena que destruye el peptidoglicano.18,19 RESISTENCIA BACTERIANA Las enterobacterias pueden generar resistencia bacteriana, capacidad que tienen los microorganismos para evadir la acción de los antimicrobianos. Esta resistencia ha aumentado en los últimos años, representando un problema de salud pública cada vez más importante. La era antibiótica moderna se inició hace más de 80 años con el descubrimiento de la penicilina y otras sustancias similares, capaces de eliminar las bacterias. Tras los primeros y extraordinarios resultados la humanidad concibió la idea de eliminar las enfermedades infecciosas; pero la frecuente prescripción inadecuada, automedicación y expendio de antimicrobianos sin receta médica ha generado la selección de mutantes resistentes en el ambiente hospitalario y en la comunidad, ocasionando fracaso terapéutico en el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas, siendo uno de los principales problemas en todo el mundo, en particular en países de África, Asia y América Latina. 20,21 17 TIPOS DE RESISTENCIA A. Resistencia Natural También conocida como resistencia intrínseca, característica natural de determinados grupos de bacterias, siendo especie o género específica, demuestra el espectro natural del antibiótico. Esto puede ayudar a la identificación del microorganismo según el fenotipo presentado en la prueba de sensibilidad. Ejemplo: Enterococcus resistente a cefalosporinas y Klebsiella resistente a la ampicilina.19,20 B. Resistencia Adquirida Las bacterias adquieren resistencia por diferentes mecanismos genéticos: Por mutación durante el proceso de replicación donde puede ocurrir errores que modifican la secuencia de la codificación del ADN, consecuentemente, la alteración de la información contenida en el ADN original. Por transferencia de ADN mediante la conjugación, transducción y transformación. 20 (Figura 1) Figura 1. Principales mecanismos de intercambio genético bacteriano: Transformación, Conjugación y Transducción. Fuente: (Adaptado de Moreno C, et al.2009) 18 MECANISMOS DE RESISTENCIA Las bacterias pueden desarrollar mecanismos de resistencia que impiden al antibiótico ejercer su mecanismo de acción, esto le permite gran capacidad de adaptación. Los mecanismos de resistencia de las bacterias son fundamentalmente tres: Modificaciones en el sitio blanco Los antibióticos se ligan a sitios específicos en la bacteria. Si este sitio fuera alterado, el antibiótico no puede ligarse y se torna ineficiente contra la bacteria. Esta alteración es físicoquímica, disminuye la afinidad de la droga por el lugar y hace que haya pérdida de la actividad antimicrobiana. Existen diversas estrategias para alcanzar este objetivo como las modificaciones en el gen que codifica el blanco del antibiótico, ejemplo alteraciones de las PBP (proteína ligadora de penicilina) de Streptococcus pneumoniae que confiere resistencia a penicilina e incluso a ceftriaxona; la adquisición de genes que codifiquen para sustitutos de los blancos originales, como PBP2 en Staphylococcusspp. meticilinorresistentes o la dihidrofolato reductasa alternativa en las cepas resistentes a trimetoprim. Trastornos de la permeabilidad A. Alteraciones de las membranas bacterianas La alteración en la expresión de los canales de porinas modifica la penetración y la consecuente acción de diferentes antibióticos. Se considera que los niveles de resistencia alcanzados no suelen ser suficientes como para conferir resistencia absoluta a un antibiótico. La ocurrencia simultánea de este mecanismo unido a otro, por ejemplo a la hidrólisis enzimática, sí puede conferir altos niveles de resistencia y ocasionar fallos terapéuticos. B. Eflujo activo de antibióticos Propiedad deexpulsar activamente los antibióticos fuera de la célula, contribuyendo a una disminución de la concentración inadecuada de la droga y consecuentementesu acción noefectiva (bomba de eflujo), éste es un mecanismo inespecífico, que afecta a diferentes grupos de antibióticos como β-lactámicos, quinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol. 19 Inactivación enzimática Mecanismo bastante frecuente relacionado con la producción de diferentes enzimas. Ciertas bacterias producen enzimas que neutralizan el antibiótico o sus efectos antimicrobianos. Principal mecanismo de inactivación es la hidrólisis, como sucede con las β-lactamasas y los β-lactámicos, pero también pueden ocurrir modificaciones no hidrolíticas tales como las acetilaciones, adenilaciones o fosforilaciones inactivantes de aminoglucósidos. 21 β-LACTAMASAS Las β-lactamasas son enzimas que inactivan los antibióticos β-lactámicos al hidrolizar el anillo β-lactámico de los mismos. La mayoría de β-lactamasas inactivan ya sea penicilinas o cefalosporinas; pero algunas son capaces de inactivar ambos tipos de antibióticos. La mayoría de bacterias gram positivas secretan sus β-lactamasas, que inactivan los agentes antimicrobianos β-lactámicos extracelularmente, en el medio que las rodea. En contraste, las β-lactamasas de las bacterias gram negativas permanecen dentro de la célula e inactivan los β-lactámicos en el espacio periplásmico, esto es, en el espacio entre la membrana externa y la membrana citoplasmática.18 El número de β-lactamasas actualmente descrito es sumamente elevado, incrementándose de manera continua, se han caracterizado más de 1000 β-lactamasas (http://www.lahey.org/studies/webt.htm), las familias de los genes más comunes dentro de las enterobacterias son: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M.22 CLASIFICACIÓN DE LAS β-LACTAMASAS Actualmente se encuentran en uso dos esquemas de clasificación: la clasificación de Ambler basada en la estructura molecular, distingue cuatro clases de β-lactamasas en función de sus secuencias aminoacídicas. Las clases A, C y Dson serina β -lactamasas y la clase B metalo-β-lactamasas dependientes de zinc. Por su parte, la clasificación de Bush-Jacoby, modelo funcional, separa las β-lactamasas en función de los sustratos que hidroliza y de sus perfiles de inhibición, distingue tres categorías y múltiples subgrupos: grupo 1 (clase C de Ambler) cefalosporinasas, grupo 2 (clases A y D de Ambler) representan el mayor grupo de β-lactamasas y el grupo 3 (clase B de Ambler) corresponden a las metalo-β-lactamasas. 20 La case A de Ambler y el grupo 2 de Bush comprenden a las BLEE, siendo descritas las enzimas tipo TEM, SHV y CTX. La clase B de Ambler y el grupo 3 de Bush incluyen a las metalo- β-lactamasas, que requieren del metal zinc como cofactor, los genes codificantes están localizados en cromosomas o plásmidos. La clase C de Ambler y el grupo 1 de Bush, incluye un grupo de β-lactamasas tipo AmpC encontradas en algunos negativos. La case D de Ambler y grupo 2d de Bush, incluye bacilos gram BLEE tipo OXA, el comportamiento de estas enzimas es variable y son difíciles de detectar por los métodos de rutina en el laboratorio, estas enzimas resultan frecuentemente en gram negativos como Acinetobacter spp.23 La clasificación de las β-lactamasas se resume en la Tabla 1. 21 Tabla 1. Clasificación de β -lactamasas de Bush, Jacoby BushJacoby Grupo 2009 Clase molecular Ambler Sustrato 1 C Cefalosporinas 1e C Cefalosporinas 2ª A Penicilinas Si 2b A Penicilinas, cefalosporinas Si TEM-1,TEM-2,SHV-1 2be* A Cefalosporinas de espectro extendido, monobactámicos Si TEM-3,SHV-2,CTX-M15,PER-1,VEB-1 2br A Penicilinas 2ber A Cefalosporinas de espectro extendido, monobactámicos 2c A Carbenicilina Si 2ce A Carbenicilina Si 2d D Cloxacilina 2de D Cefalosporinas de espectro extendido, 2df D Carbapenémicos 2e A Cefalosporinas de espectro extendido 2f A Carbapenémicos 3ª B Carbapenémicos Si 3b B Carbapenémicos Si Inhibidor Enzima representativa AC Fuente: (Bush, Jacoby et al.2010) EDTA ACT-1,CMY-2,FOX-1,MIR-1 GC1, CMY-37 PC1 TEM-30,SHV-10 TEM-50 PSE-1,CARB-3 RTG-4 OXA-1,OXA-10 OXA-11,OXA-15 OXA-23,OXA-48 Si CepA KPC-2,IMI-1,SME-1 IMP-1,VIM-1,SME-1 L1,CAU-1,GOB-1,FEZ-1 23 AC: Acido Clavulánico (Inhibidor de β-lactamasas), * β-lactamasas de espectro extendido 22 β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO La presencia de mutaciones en los genes que codifican las β-lactamasas clásicas (blaTEM,blaTEM-2, blaSHV-1), dieron lugar a las llamadas β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) 1 que pertenecen al subgrupo 2be de la clasificación de Bush y Jacoby.23 Las BLEE son enzimas codificadas por plásmidos, capaces de hidrolizar las penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda, tercera, cuarta generación y los monobactámicos, pero no las cefamicinas (cefoxitina) ni carbapenémicos (imipenem, meropenem y ertapenem). Pueden ser inhibidas por el ácido clavulánico u otros inhibidores de β-lactamasas como el tazobactam y el sulbactam. Las cepas productoras de BLEE, en su mayoría son enterobacterias, con mayor frecuencia Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli, pero también se ha identificado en otras especies de bacilos gram negativos como Pseudomonas aeruginosa. 24,25 A las BLEE tipo TEM y SHV se les ha unido las enzimas BLEE tipo CTX-M, detectado por primera vez a finales de 1980 en los aislados clínicos de la familia Enterobacteriaceae en Europa y Argentina. Desde mediados de la década de 1990 la aparición de enzimas CTX-M se ha observado en varias partes del mundo, incluyendo Europa, América del Norte, América del sur, Asia y África, estas enzimas actúan hidrolizando las oximino-cefalosporinas preferentemente cefotaxima.9 Actualmente se han identificado al menos 223 β-lactamasas tipo TEM, 191 enzimas tipo SHV y 166 enzimas tipo CTX-M (http://www.lahey.org/studies/webt.htm). Junto con las variantes de BLEE tipo TEM y SHV las β-lactamasas tipo CTX-M son reconocidos como uno de los más importantes BLEE adquiridos en la propagación de enterobacterias en todo el mundo. La mayoría de las cepas productoras de enzimas tipo CTX-M han sido implicadas en las infecciones nosocomiales y en infecciones adquiridas en la comunidad. 22,26 La aparición de las BLEE ha dificultado enormemente el tratamiento antibiótico de numerosas infecciones bacterianas porque presentan resistencia a la gran mayoría de los β-lactámicos y altas tasas de resistencias a los antimicrobianos de otras familias. Estas bacterias resistentes pueden transmitir los genes de resistencia por transferencia horizontal, intercambio de plásmidos, generando así un problema terapéutico. 2, 27-29 23 ELEMENTOS GÉNÉTICOS INVOLUCRADOS EN LA DISEMINACIÓN DE RESISTENCIA Es importante tener un mejor conocimiento de los elementos génicos móviles que facilitan la difusión de los genes bla y otros genes de resistencia asociados, porque el problema se complica cuando ocurre la transmisión de genes que codifican estas enzimas a otras enterobacterias.30 La resistencia se transmite entre bacterias de la misma especie y entre especies y géneros diferentes, esta transferencia puede ser vertical (ocurre cuando un organismo recibe material genético de sus ancestros, es decir de células madre a células hijas) y horizontal (proceso en el que un organismo transfiere material genético a otra célula que no es descendiente mediante bacteriófagos, plásmidos o transposones). PLÁSMIDOS Los plásmidos son moléculas extra-cromosomales de ADN de doble cadena que presentan la capacidad de replicación. Pueden ser transferidos por conjugación mediante el pili que asocia la bacteria donadora y receptora. La transferencia puede darse entre bacterias de la misma especie o entre distintas especies y géneros. Esto los convierte en excelentes herramientas para la diseminación de resistencias. En general los plásmidos, codifican para más de un mecanismo de resistencia. Esto determina que en un evento de transferencia, la bacteria receptora adquiera todos los mecanismos de resistencia que se presenta en dicho plásmido.30,31 TRANSPOSONES Los transposones conocidos como genes saltarines son fragmentos de ADN capaces de movilizarse de un lugar a otro en el ADN, por transposición. A diferencia de los plásmidos los transposones no son autoreplicantes, deben mantenerse dentro de una estructura para replicarse. Existen diversos tipos de transposones, pero las dos principales características que los diferencian de otros elementos génicos móviles son la presencia de secuencias repetidas e invertidas en sus extremos y la presencia de repeticiones directas que flanquean el transposon. Por ejemplo un transposón puede desprenderse de un plásmido e integrarse al cromosoma bacteriano y viceversa. Este mecanismo da la posibilidad, por ejemplo, que mecanismos de resistencia cromosómica que no son transferibles pasen a un plásmido y a través de este a otra bacteria. 30,32 24 INTEGRONES Los integrones fueron descritos por primera vez por Stokes y Hall en 1989, son estructuras genéticas capaces de capturar y movilizar genes de resistencia a los antibióticos. No presentan autonomía de movimiento, se encuentran frecuentemente como parte de transposones que pueden localizarse en el cromosoma o plásmidos conjugativos, que sirven como vehículos para su transmisión. Estas estructuras son responsables de la diseminación horizontal de la resistencia bacteriana. Constan de tres regiones, dos invariables y una central variable, que porta el cassette. Existen clases de integrones según la secuencia de la integrasa (int), los más estudiados son las clases 1,2 y 3. Por la diversidad de integrasas se ha realizado una nueva clasificación: Integrones de resistencia a antibióticos e integrones presentes en el cromosoma bacteriano.30, 32-34 CASSETTES Los cassettes constituyen un grupo diverso de pequeños elementos móviles que incluyen un gen que puede codificar resistencia a los antimicrobianos. Los cassettes génicos pueden existir tanto en su forma libre circular o integrada a un sitio. Solamente cuando están integrados los cassettes génicos son considerados formalmente parte de un integrón. Codifican genes de resistencia a múltiples antibióticos como los -lactámicos y los aminoglucósidos también genes relacionados a la resistencia a trimetoprima y 32,34 cloranfenicol. 25 DETECCIÓN FENOTÍPICA DE β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO Método de screening para detección de BLEE según CLSI*2013 En esta prueba se busca la disminución de los halos de inhibición en los discos de screening: cefpodoxima (10 µg), ceftazidima (30 µg), aztreonam (30 µg), cefotaxima (30 µg) y ceftriaxona (30 µg) que permitan sospechar la presencia de BLEE en E. coli y K. pneumoniae, K. oxytoca y P. mirabilis. Se considera sospechoso de BLEE, cuando la cepa presenta halos de inhibición iguales o inferiores a los diámetros referidos en la Tabla 2, para al menos uno de los antibióticos.35 Tabla 2. Diámetros críticos de screening para la detección de β-lactamasas de espectro extendido CLSI* 2013 E. coli, K.oxytoca y K. pneumoniae Cefpodoxima 10 mg <=17 mm Ceftazidima 30 mg <=22 mm Aztreonam 30 mg <=27 mm Cefotaxima 30 mg <=27 mm Ceftriaxona 30 mg <=25 mm P. mirabilis Cefpodoxima 10 mg <=22 mm Ceftazidima 30 mg <=22 mm Cefotaxima 30 mg <=27 mm *Clinical and Laboratory Standards Institute Prueba confirmatoria BLEE-CLSI (Método Americano) Este método confirmatorio emplea discos de ceftazidima (30 µg) y cefotaxima (30 µg) con y sin ácido clavulánico (10 µg), este último es un inhibidor de las BLEE. Una diferencia mayor o igual a 5 mm de los diámetros de los halos de inhibición entre los discos de ceftazidimaácido clavulánico (30/10 µg) y ceftazidima solo o cefotaxima-ácido clavulánico (30/10 µg) y cefotaxima es interpretada como resultado positivo.35 26 Prueba confirmatoria BLEE – Método de Jarlier (Comité de la Sociedad Francesa de Microbiología) Conocido como prueba de sinergia del doble disco porque está basado en la sinergia entre las cefalosporinas de espectro extendido o los monobactámicos y el disco de amoxicilina/ácido clavulánico (20/10 µg). Los discos de ceftazidima (30 µg), cefotaxima (30 µg) ycefepime (30 µg) se disponen a 20 mm del disco de amoxicilina/ácido clavulánico (distancia de centro a centro de los discos). Si una imagen de sinergia aparece entre el disco amoxicilina/clavulánico y cualquiera de los cuatro antibióticos probados se toma como evidencia de la producción de BLEE, de lo contrario se le considera prueba negativa.36,37 DETECCIÓN GENOTÍPICA DE β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO Para ello se puede emplear la amplificación del gen codificante por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El método de amplificación de DNA a través de la técnica de PCR, consiste en el diseño de indicadores (primers) que son secuencias de oligonucleótidos. Los “primers” pueden ser desarrollados para hibridizar en regiones especificas de DNA molde, siendo estas amplificadas por la enzima Taq polimerasa, generando un producto denominado amplicón. Este producto es visualizado en gel de agarosa después de ser sometido a electroforesis. La técnica de PCR permite la detección de genes específicos responsables de la producción de las BLEE conforme lo descrito en diversos estudios.38,39 27 MATERIALES Y MÉTODOS DISEÑO DE ESTUDIO Se realizó un estudio observacional sobre la presencia de enterobacterias productoras de BLEE en muestras de pacientes del Instituto Nacional de Salud del Niño (Lima, Perú) entre los meses de agosto de 2012 a enero del 2013. TIPO DE INVESTIGACIÓN Se realizó un estudio descriptivo, prospectivo, de corte transversal. POBLACIÓN Fueron consideradas las muestras con solicitud de cultivos que llegaron al laboratorio de microbiología del Instituto Nacional de Salud del Niño durante el periodo de estudio. MUESTRA Se incluyeron un total de 1198 enterobacterias de muestras de pacientes hospitalizados y comunitarios. Finalmente se consideraron para el análisis 724 Escherichia coli y 181 Klebsiella pneumoniae de aislamientos consecutivos no repetidos. PLAN DE PROCEDIMIENTOS Estudio Microbiológico Aislamiento primario Los aislamientos E. coli y K. pneumoniae fueron obtenidas según procedimiento estándar de cultivos, procedentes de los diferentes servicios que llegaron al laboratorio de microbiología del INSN. El personal calificado realizó el aislamiento primario, la diferenciación bioquímica para la identificación bacteriana y la susceptibilidad antibiótica como parte de la rutina de diagnóstico. Identificación bacteriana Para la reactivación de los aislados, se sembraron por dispersión y agotamiento en el medio MacConkey, incubándolos a 35 °C por 18 a 24 horas, luego se procedió a la identificación con las pruebas bioquímicas convencionales Triple Sugar Iron (TSI), Lisina Hierro Agar 28 (LIA), Sulfuro Indol Movilidad (SIM) y Citrato de Simons. Fueron conservadas en caldo tripticasa de soya (TSB) con glicerol al 20%y almacenadas en criobox a – 20ºC hasta su procesamiento. Detección de fenotipo BLEE La determinación de la producción de BLEE se realizó mediante el método de Jarlier (método de sinergia del doble disco), se utilizó una placa de Agar MuellerHinton (MH) y se inoculó con una suspensión bacteriana de 0,5McFarland, sobre ella se colocaron discos de susceptibilidad antimicrobiana (Oxoid): ceftazidima (30 µg), cefotaxima (30 µg) y cefepime (30 µg) a 20 mm de centro a centro de un disco central de amoxicilina/ácido clavulánico (20/10 µg) (Figura 2), esta placa se incubó a 35°C por 18-24h, posteriormente se realizó la lectura. La presencia de BLEE se manifestó por el efecto sinérgico entre el inhibidor y los discos de antimicrobianos. 37 Adicionalmente se realizó pruebas de susceptibilidad mediante el método de Kirby Bauer, siguiendo los lineamientos del CLSI 2013, para ello se utilizaron discos de ciprofloxacina (5 µg), nitrofurantoina (300 µg), gentamicina (10 µg), amikacina (30 µg), cefoxitina (30 µg), sulfametoxazol/trimetoprim (23,75/1,25 µg), cloranfenicol (30 µg), imipenem (10 µg) y meropenem (10 µg).35 Control de calidad de discos Antes de realizar la prueba de susceptibilidad de disco difusión se realizó el control de los discos utilizando una cepa de E. coli ATCC 25922, presentando halos de inhibición cuyos valores ingresaban en el rango establecido por el CLSI 2013. También se realizó un control del método para la detección de BLEE utilizando una cepa de K. pneumoniae ATCC 700603 productora de BLEE. 29 Figura 2.Representación esquemática de las distancias entre discos por el método de Jarlier (20 mm de centro a centro), sustratos y el inhibidor para la detección fenotípica de aislamientos productores de -lactamasas. CAZ: ceftazidima; CTX: cefotaxima; FEP: cefepime; AMC: amoxicilina/ácido clavulánico. FEP 30mg 20 mm 20 mm AMC 20/10mg CAZ 30mg 20 mm CTX 30mg Detección genotípica de las β-lactamasas de espectro extendido Se realizó en el Laboratorio de Epidemiologia Molecular y Genética del Instituto de Medicina Tropical “Daniel A. Carrión” de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Obtención de DNA total A partir de cultivos de 24 horas de los microorganismos en estudio, se resuspendió de 3 a 4 colonias en 200 μL de agua Milli-Q estéril. Se sometieron a ebullición durante 15 minutos y se centrifugó durante 2 minutos a una velocidad de 12 000 r.p.m. para descartar los restos celulares. Se conservó el sobrenadante a -20C. 30 Detección de la presencia de genes codificantes de BLEE tipo CTX-M Primer utilizados en la amplificación por PCR del gen blaCTX-M Secuencia de Primer (5’ 3’) Target Primer blaCTX-M CTX-M-F TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA CTX-M-R CGATATCGTTGGTGGTGCCAT Tamaño de producto 593pb Primers utilizados en la amplificación por PCR de los genes blaSHV y blaTEM Target blaSHV blaTEM Primer Secuencia de Primer (5’ 3’) Tamaño de producto SHV-F CGCCTGTGTATTATCTCCCT SHV-R CGAGTAGTCCACCAGATCCT TEM-F CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC TEM-R CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC 294bp 800bp 31 Amplificación por PCR del gen blaCTX-M Mezcla de reacción: REACTIVO CONCENTRACIÓN Buffer 10x (libre de MgCl2) VOLUMEN 2,50mL MgCl2 50 mM 1,00mL dNTPs 10 mM 0,75mL CTX-M-F 10mM 0,50mL CTX-M-R 10 mM 0,50mL DNA* 2,50mL Agua milliQ estéril 16,80mL Taq 5U/mL 0,20mL El ADN bacteriano se agrega en el área de extracción Parámetros de amplificación Protocolo PCR Tº C Tiempo Denaturación inicial 94º C 7 minutos Denaturación 94º C 50 segundos Hibridación 52º C 50 segundos Extensión 72º C 1 minuto Extensión final 72º C 5 minuto 35 ciclos 32 Amplificación por PCR genes blaSHV y blaTEM Mezcla de reacción: REACTIVO CONCENTRACIÓN Buffer 10x (libre de MgCl2) VOLUMEN 2,50mL MgCl2 50 mM 1,00mL dNTPs 10 mM 0,75mL SHV-F 10mM 1,00mL SHV-R 10 mM 1,00mL TEM-F 10mM 1,00mL TEM-R 10 mM 1,00mL DNA* 2,00mL Agua milliQ estéril 14,55mL Taq 5U/mL 0,20mL El ADN bacteriano se agrega en el área de extracción Parámetros de amplificación Protocolo PCR Tº C Tiempo Denaturación inicial 94º C 5 minutos Denaturación 94º C 40 segundos Hibridación 62º C 40 segundos Extensión 72º C 1 minuto Extensión final 72º C 5 minuto 35 ciclos 33 Electroforesis Los productos de amplificación fueron resueltos por electroforesis en agarosa al 1,5% en buffer TAE 1X, por calor. Para cargar en cada pocillo se mezcló 9 μL de cada producto con 1 μL de buffer de muestra y se sembró todo el volumen en el gel. El Ladder se agrega en una canaleta para compararlo a la migración de los productos obtenidos. Las condiciones de corrida: tiempo: 45 minutos, voltaje: 100V, buffer de corrida: TAE 1X Coloración Terminada la corrida los geles son teñidos con bromuro de etidio (0,5μg/mL) por 10 minutos, luego se decolora en agua PCR y posteriormente son colocadas al transiluminador para su lectura e interpretación. ANÁLISIS DE DATOS Se realizó un estudio descriptivo univariado de cada una de las muestras en estudio, clasificándolas en productoras o no productoras de β-lactamasas de acuerdo a la familia de genes involucrados. Para la determinación de los porcentajes de resistencia y sensibilidad antimicrobiana de las distintas especies de enterobacterias en estudio, los datos obtenidos fueron introducidos en Microsoft Excel 2010 y en el programa WHONET (World Health Organization Net Versión 5.6), programa estadístico utilizado por la Organización Panamericana de la Salud para la vigilancia de la resistencia bacteriana, que permitió analizar datos epidemiológicos y las características del germen en estudio. 34 RESULTADOS Descripción general de la muestra estudiada Se identificaron un total de 1198 enterobacterias provenientes de las diferentes muestras con solicitud de cultivos. El 63,5% (761/1198) de las muestras provenían de pacientes de comunidad y el 36,5% (437/1198) de muestras provenientes de pacientes hospitalizados. De los comunitarios el 64,9% (494/761) fueron E. coli y el 8,8% (66/761) fueron K. pneumoniae. De los hospitalizados el 52,6% (230/437) fueron E. coli y el 26,3% (115/437) fueron K. pneumoniae. Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productoras de BLEE El 31% (281/905) de los aislamientos de ambas enterobacterias fueron productoras de BLEE. Del total de E. coli el 28,6% (207/724) fueron productores de BLEE y de las K. pneumoniae el 40,9% (74/181) fueron productores de BLEE. BLEE en los aislamientos comunitarios De los aislamientos recuperados de muestras comunitarias; el 27,3% (135/494) fueron E. coli productoras de BLEE y el 28,7% (19/66) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el 3,7% (5/135) de las E. coli productoras de BLEE también producían β– lactamasa tipo AmpC y el 5,2% (1/19) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC. De los aislamientos comunitarios, estos provenían de Consultorio Externo 77,2% (E. coli 104/154; K. pneumoniae 15/154); Emergencia 12,4% (E. coli 19/154); Servicio bajo tarifario diferenciado 10,4% (E. coli 12/154; K. pneumoniae 4/154). Todos los aislamientos comunitarios fueron recuperados de muestras de orina. Las Enterobacterias productoras de BLEE aisladas de muestras comunitarias, categorizadas de acuerdo al grupo etario y género, se observó lo siguiente: 50,6% (78/154) lactantes; 14,3% (22/154) prescolares; 29,9% (46/154) escolares y 5,2% (7/154) adolescente. En cuanto al género, en las enterobacterias productoras de BLEE en el sexo femenino (63%: 97/154) fue superior al del sexo masculino (37%: 57/154). 35 Lactantes: 1mes -2años; Pre-escolares: 3 - 5años; Escolares: 6 -12 años; Adolescentes: 13 - 18años BLEE en los aislamientos hospitalizados De los aislamientos de muestras hospitalarias; el 31,3% (72/230) fueron E. coli productores de BLEE y el 47,8% (55/115) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el 4,1% (3/72) de las E. coli productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC y el 7,2% (4/55) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC De los aislamientos hospitalarios, estos provenían de los servicios de: Cardiología 7,8% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 6/127); Cirugía 5,5% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 3/127); Gastroenterología 3,1% (E. coli 1/127; K. pneumoniae 3/127); Ginecología 1,6% (E. coli 2/127); Hematología 0,8% (K. pneumoniae 1/127); Infectología 1,6% (E. coli 1/127; K. pneumoniae 1/127); Medicina A 3,9% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 3/127); Medicina B 7,0% (E. coli 7/127; K. pneumoniae 2/127); Medicina C 6,3% (E. coli 6/127; K. pneumoniae 2/127); Medicina D 3,1% (E. coli 1/127; K. pneumoniae 3/127); Neurocirugía 8,6% (E. coli 7/127; K. pneumoniae 4/127); Nefrología 8,6% (E. coli 5/127; K. pneumoniae 6/127); Neonatología 3,1% (K. pneumoniae 4/127); Neumología 0,8% (E. coli 1/127); Neurología 36 5,5% (E. coli 5/127; K. pneumoniae 2/127); Quemados 3,9% (E. coli 3/127; K. pneumoniae 2/127); Traumatología 5,5% (E. coli 7/127); UCI 11,0% (E. coli 7/127; K. pneumoniae 7/127); UPO 2,3% (K. pneumoniae 3/127); Urología 8,6% (E. coli 8/127; K. pneumoniae 3/127). De los aislamientos hospitalarios fueron recuperados de muestras de: Absceso 1,6% (E. coli 1/127; K. pneumoniae 1/127); Catéter 6,3% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 6/127); LCR 0,8% (K. pneumoniae 1/127); Herida 3,9% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 1/127); Lavado Broncoalbeolar 0,8% (K. pneumoniae 1/127); Orina 66,1% (E. coli 57/127; K. pneumoniae 27/127); Ótica1,6% (K. pneumoniae 2/127); piel de quemado 3,1% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 2/127); Sangre 6,3% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 6/127); Aspirado traqueal 9,4% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 8/127). Las Enterobacterias productoras de BLEE aisladas de muestras hospitalarias, categorizadas de acuerdo al grupo etario y género, se observó lo siguiente: 64,6% (82/127) lactantes; 37 11,8% (15/127) prescolares; 14,2% (18/127) escolares y 9,4% (12/127) adolescente. En cuanto al género, en las enterobacterias productoras de BLEE en el sexo femenino (48%: 61/127) y en el sexo masculino (52%: 66/127) fueron prácticamente iguales. Lactantes: 1mes -2años; Pre-escolares: 3 - 5años; Escolares: 6 -12 años; Adolescentes: 13 - 18años Análisis de la susceptibilidad antimicrobiana E. coli productores de BLEE en los aislamientos comunitarios En el grupo de las quinolonas, la ciprofloxacina presento una resistencia de 77,8%, la más alta de todas, además 9,6% de los aislamientos presentaron una sensibilidad límite pudiendo mutar a resistentes durante el tratamiento antibiótico. La evaluación del grupo de los aminoglucósidos se realizó con gentamicina y amikacina, donde se mostró una alta tasa de resistencia con el 57,8% para gentamicina y por el contrario se mostró una baja tasa de resistencia para amikacina de 6,7%, presentando una alta sensibilidad con 80,0%. La resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol fue alta con el 71,1%. La resistencia al cloranfenicol fue de 23,7% con una buena sensibilidad de 74,1%. Nitrofurantoina presento un bajo nivel de resistencia con 10,4% y una muy alta sensibilidad con 85,9%. La resistencia cefoxitina fue de solo el 5,9%. Todos los aislados eran sensibles a los carbapenémicos. 38 Dentro de las cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como resistentes, el 38,5% y 2,2% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima y cefepime respectivamente, según los puntos de corte CLSI 2013. E. coli productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios La resistencia más alta se presentó frente a ciprofloxacina con 81,9%, además 6,9% presentaron una sensibilidad límite. Trimetoprim-sulfametoxazol también presento una resistencia alta con el 66,7%. La evaluación del grupo de los aminoglucósidos se realizó con gentamicina y amikacina, donde se mostró una resistencia de 58,3% para gentamicina y una resistencia de 4,2% para amikacina, pero con una sensibilidad de 87,5%. La resistencia al cloranfenicol fue de 16,7% con una buena sensibilidad de 80,6%. La Nitrofurantoina presento una resistencia muy baja con 8,3% y una alta sensibilidad con 83.3%. La resistencia frente a cefoxitina fue de 8,3%. Todos los aislados eran sensibles a los carbapenémicos. Entre el grupo de cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como resistentes, el 29,2%, 4,2% y 2,8% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima, cefepime y cefotexima respectivamente, según los puntos de corte CLSI 2013. 39 K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos comunitarios Trimetoprim-sulfametoxazol presento la más alta resistencia con 89,5%. Ciprofloxacina presento una resistencia de 63,2%; además 15,8% presentaron una sensibilidad límite. En cuanto a los aminoglucósidos, la gentamicina mostró una resistencia de 63,2%, amikacina no presento resistencia alguna, pero una sensibilidad del 100,0%. La resistencia al cloranfenicol fue de 26,3%, a nitrofurantoina una resistencia de 42,1%. La resistencia frente a cefoxitina fue de 10,5%. Todos los aislados eran sensibles a los carbapenémicos. Entre el grupo de cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como resistentes, el 5,3% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima y también el 5,3% a cefepime, según los puntos de corte CLSI 2013. K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios La mayor resistencia se observo en trimetoprim-sulfametoxazol con 92,7%. En quinolonas , ciprofloxacina presento una resistencia de 50,9%, una sensibilidad límite de 14,5% y una sensibilidad de solo 5,5%. En cuanto a los aminoglucósidos, la gentamicina mostró una resistencia de 74,5% y amikacina una resistencia de solo el 9,1%. La resistencia a nitrofurantoina fue de 41,8%, a cloranfenicol una resistencia de 14,5%. La resistencia frente a cefoxitina fue de 9,1%. Todos los aislados eran sensibles a los carbapenémicos. Entre el grupo de cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como resistentes, el 10,9% y 1,8% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima y cefepime respectivamente, según los puntos de corte CLSI 2013. 40 Análisis genotípico mediante el PCR Se analizaron tres familias de genes productores de BLEE, estas fueron: SHV (45,5%: 128/281), CTX (91,1%: 256/281) y TEM (44,4%: 125/281). E. coli productores de BLEE en los aislamientos comunitarios En las E. coli comunitarias se observo que el 22,2% (30/135) eran productores de BLEE tipo SHV, el 91,9% (124/135) fueron productores de BLEE tipo CTX y el 40,7% (55/135) presentaron BLEE tipo TEM. Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo genes BLEE: el 5,9% (8/135) presentaron solo SHV, el 50,4% (68/135) CTX y el 2,2% (3/135) TEM. También se pudo observar combinaciones de genes BLEE, el 3,0% (4/135) presentaron SHV y CTX, el 25,2% (34/135) presentaron CTX y TEM; y en el 13,3% (18/135) se observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM. 41 E. coli productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios En las E. coli hospitalarias se observo que el 33,3% (24/72) eran productores de BLEE tipo SHV, el 94,4% (68/72) fueron productores de BLEE tipo CTX y el 56,9% (41/72) presentaron BLEE tipo TEM. Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo genes BLEE: el 1,4% (1/72) presentaron solo SHV, el 33,3% (24/72) CTX y el 1,4% (1/72) TEM. También se pudo observar combinaciones de genes BLEE, el 8,3% (6/72) presentaron SHV y CTX, el 2,8% (2/72) presentaron SHV y TEM, el 31,9% (23/72) presentaron CTX y TEM; y en el 20,8% (15/72) se observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM. 42 K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos comunitarios En las K. pneumoniae comunitarios se observo que todas eran productoras de BLEE tipo SHV es decir el 100,0% (19/19), el 84,2% (16/19) fueron productores de BLEE tipo CTX y el 63,2% (12/19) presentaron BLEE tipo TEM. Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo gen BLEE: el 5,3% (1/19) presentaron solo SHV. También se observó combinaciones de genes BLEE, el 31,6% (6/19) presentaron SHV y CTX, el 10,5% (2/19) presentaron SHV y TEM y en el 52,6% (10/19) se observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM. K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios En las K. pneumoniae hospitalarios se observo que todas eran productoras de BLEE tipo SHV es decir el 100,0% (55/55), el 87,2% (48/55) fueron productores de BLEE tipo CTX y el 30,9% (17/55) presentaron BLEE tipo TEM. Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo gen BLEE: el 10,9% (6/55) presentaron solo SHV. También se observó combinaciones de genes BLEE, el 58,2% (32/55) presentaron SHV y CTX, el 1,8% (1/55) presentaron SHV y TEM y en el 29,1% (16/55) se observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM. 43 44 DISCUSIÓN De acuerdo con los resultados encontrados en la presente investigación se evidencia la presencia de enterobacterias productoras de BLEE en muestras recuperadas de pacientes hospitalizados y comunitarios, siendo un motivo de preocupación, la presencia de cepas resistentes de enterobacterias en estos aislamientos indicaría la presencia de genes de resistencia que se encuentran localizados en plásmidos altamente transmis ibles, la propagación de estos genes entre bacterias de igual o diferentes especies es preocupante ya que hay pocas alternativas terapéuticas; además se asocia con casi el doble de la mortalidad en comparación con las no productoras de BLEE. 40,41 El resultado del presente estudio indicó una frecuencia de el 31% de los aislamientos de E. coli y K. pneumoniae fueron productoras de BLEE. De las E. coli el 28,6% fueron productores de BLEE y de las K. pneumoniae el 40,9% fueron productores de BLEE. De los aislamientos de muestras hospitalarias, el 31,3% de las E. coli y el 47,8% de K. pneumoniae fueron productoras de BLEE, estudios anteriores en Perú mostraron una frecuencia de 2,9% y 44,4% para E. coli y K. pneumoniae, respectivamente.8 En el Instituto de Enfermedades Neoplásicas en 2005 se reporto una frecuencia de 40,78% en aislamientos de E. coli y K. pneumoniae.42 En 2012 la publicación de Garcia et al. muestra que el 75,1% y el 76,8% de E. coli y K. pneumoniae respectivamente, eran productores de BLEE.43 La mayoría de estudios de prevalencia de BLEE en el Perú están realizados en aislamientos hospitalarios, no existen datos referidos a aislamientos comunitarios y su resistencia a los antibióticos. En nuestro estudio observamos que para E. coli el 27,3% y el 28,7% de K. pneumoniae eran productores de BLEE, todos estos a partir de aislamientos recuperados de cultivos de orina. El estudio de Colquechagua et al, en muestras fecales en el Instituto de Salud del Niño, mostro que el 64,2% eran portadores de enterobacterias productoras de BLEE y de estas el 86% eran E. coli.44 En otro estudio de portadores se observa con el avance del tiempo un incremento de la resistencia según lo reportado por: Pallechi et al. en Perú-Bolivia donde detectaron enterobacterias productoras de BLEE en 0,1% (4/3208) de las muestras fecales 45 de niños sanos de cuatro centros urbanos de América Latina, la caracterización molecular reveló la presencia del gen -lactamasa tipo blaCTX-M en los cuatro aislados. El año 2005 en la misma población de niños sanos de Perú-Bolivia reveló el incremento de portadores fecales de Escherichia coli, en comparación al 2002 (0,1% el año 2002 y 1,7% en el 2005).45,46 Estos estudios son realizados a partir de portadores sanos, sin haber datos de la frecuenc ia de productores de BLEE como causante de infecciones en la comunidad en el Perú. En una publicación de 2013 de Salles et al muestra que en América latina se observa que más de un cuarto de aislamientos de E. coli (27%) y más de un tercio de K. pneumoniae (38%) fueron BLEE positivo. La prevalencia de Productores de BLEE en E. coli y Klebsiella spp. asociado con infecciones adquiridas en la comunidad, en particular, fue 29%.47 En el presente estudio la frecuencia de enterobacterias productoras de BLEE fue alta en el grupo de los lactantes, este dato indicaría que la colonización con bacterias productoras de BLEE ocurre a temprana edad, por ende las infecciones que presenten serán por bacterias productoras de BLEE, esto puede deberse al uso cada vez mayor de los antibióticos en la comunidad o en previas hospitalizaciones, dando lugar a una presión selectiva a favor de las bacterias que han adquirido resistencia. En un estudio realizado en Guinea-Bissau muestra que los niños que compartían la cama tenían un mayor riesgo de ser colonizados con cepas productores de BLEE, lo que indica que el contacto directo y el hacinamiento pueden ser importantes en la propagación de las BLEE.48 Los genes BLEE se encuentra predominantemente en Klebsiella spp. y E. coli, pero también se han descrito en otros géneros de Enterobacteriaceae incluyendo especies de Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, y Enterobacter.49,50 Hasta fines del siglo pasado, las enterobacterias albergaban variables de BLEE tipo TEM (Temoneira) y SHV (sulfhidrilo variable) eran frecuentes e los aislamientos nosocomiales, y CTX-M (cefotaximasa) era rara vez aislado.50-52 Sin embargo, en los primeros años de este siglo, América Latina se convirtió en el primer continente donde variantes CTX-M comenzaron a desplazar TEM y SHV variantes como el tipo más común de BLEE, principalmente en E. coli.51 Las BLEE de tipo CTX-M comparten sólo el 40% de homología con TEM o SHV enzimas y se consideran no relacionada.50 Es importante mencionar que en los últimos años se ha descrito el incremento 46 de enterobacterias productoras de BLEE de la familia CTX-M, La BLEE tipo CTX-M tiene principalmente actividad sobre la cefotaxima y no sobre la ceftazidima; aunque en los últimos años la emergencia de variantes de CTX-M (CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-27 y CTX-M-19) están mejorando su actividad frente a ceftazidima. 53 Un dato importante de nuestro estudio, que puede ser considerado una limitación del mismo, es que no se estudiaron las variantes alélicas de los genes de BLEE tipo SHV y TEM, ya que de estos las variantes alélicas SHV-1, TEM-1 y TEM-2 son consideradas betalactamsas de espectro ampliado y no de espectro extendido (BLEE), esto podría hacer que sobredimensionemos la frecuencia de estos genes como productores de BLEE. En el caso de CTX-M, todas sus variantes son productoras de BLEE. Dentro de los genotipos aislados en el presente estudio, las BLEE de tipo CTX-M (91,1%) fueron las más frecuentes seguido por SHV (45,5%) y TEM (44,4%), resultados que difieren de los publicado por Arce et al, en un estudio realizado en 2011 en dos Hospitales de Chiclayo-Perú, donde se evaluó la presencia de genes tipo TEM y SHV encontrándose 60,61% y 12,12% respectivamente y con ambos genes 27,27%, analizando un total de 66 aislamientos de E. coli.54 Luego, el mismo Arce en un estudio publicado en 2014 en un Hospital de Chiclayo, donde se analizaron 50 aislamientos de E. coli, los resultaron mostraron que el gen mayormente encontrado fue SHV con 44%, seguido de CTX-M con 20% y TEM con 16%, cabe mencionar que esta investigación se realizó en aislamientos hospitalarios, dentro de este mismo grupo bacteriano, E. coli hospitalarios, nuestros resultados indican a CTX-M (94,4%) como el más frecuente, seguido de TEM (56,9%) y SHV (33,3%). Además mencionan que el 4% de los aislamientos presentaron los tres tipos de genes BLEE, en nuestra investigación el 21% presentaron los tres tipos de genes, el 43% presentaron dos tipos de genes, siendo la combinación más frecuente la de CTX-M + TEM con 32%.55 En cuanto a los resultados genotípicos de K. pneumniae hospitalarios, como se esperaba todos estos presentaron genes tipo SHV (100%), que es una característica de resistencia natural de este género que presentan el gen SHV-1 que las hace resistentes a ampicilina, en cuanto a los otros genes se evidencio CTX-M en 87% y TEM en 30% de los aislamientos. 47 Referente a los resultados de los aislamientos comunitarios, las mayoría de estudios realizados muestran un predominio de genes tipo CTX-M presente en E. coli, en nuestra investigación las E. coli comunitarias el gen CTX-M en 91% de los casos, seguido de TEM en el 40% y SHV en el 22% de los aislamientos, sobre K. pneumoniae el 84% fueron CTXM, el 63% TEM y nuevamente al igual que en los aislamientos hospitalarios SHV en 100% por la razón que ya se detallo anteriormente. Otros estudios realizados en Perú han evidenciado la presencia de genes SHV, TEM y CTXM, pero como reportes aislados sin determinar la frecuencia de estos genes.9,56,57 La resistencia acompañante no tuvo diferencias significativas entre los aislamientos hospitalarios y comunitarios, en cuanto a E. coli se observa alta resistencia acompañante a las fluoroquinolonas, sulfametoxazol/trimetoprim, gentamicina y una resistencia menor a cloranfenicol, nitrofurantoina, una resitencia minima para amikacina, siendo sensibles a los carbapenémicos. En K. pneuminiae se evidenció también alta resistencia acompañante a sulfametoxazol/trimetoprim, Gentamicina, fluoroquinolonas y una resistencia menor a nitrofurantoina, Cloranfenicol, una resistencia minina frente amikacina, siendo sensibles a los carbapenémicos. Llama la atención la resistencia de más del 40% a nitrofurantoina en K. pnemoniae, ya que este era una buena alternativa frente a las infecciones urinarias. Esto es alarmante, porque no se dispone de muchas alternativas terapéuticas, en caso de infección por alguno de estos microorganismos se puede administrar como tratamiento amikacina y en infecciones complicadas los carbapenémicos. Cabe destacar que en ocho E. coli y en cinco K. pneumoniae productoras de BLEE al interpretar el antibiograma se observó la disminución del halo del disco de cefoxitina (≤18mm) lo que sugirió la presencia de -lactamasa tipo AmpC, comprobándose mediante el método de Hodge y utilizando el disco de ácido fenil borónico (AFB), inhibidor de las lactamasas tipo AmpC. También queremos mencionar que las infecciones por E. coli con BLEE han experimentado importantes cambios epidemiológicos en los últimos tiempos y actualmente la atención se centra en el aumento de infecciones y colonizaciones en pacientes procedentes de la 48 comunidad y la mayor incidencia de las CTX-M. En cuanto a las medidas de control de la diseminación de las BLEE y la actuación frente a pacientes colonizados por E. coli con BLEE no es muy claro, pero es incuestionable la necesidad de implementar un uso correcto y responsable de los antibióticos para evitar la expansión de cepas resistentes.3 Según las recomendaciones del CLSI desde el año 2010 no se debería buscar enterobacterias productoras de BLEE, solo se debe informar los puntos de corte 35 obtenidos, pero con los resultados obtenidos en el presente trabajo se demuestra que esto representaría una falla en el tratamiento, debido a que las bacterias productoras de BLEE pueden presentar halos de inhibición sensibles para ceftazidima según el punto de corte del CLSI 2013, pero ser productoras de BLEE. Por lo tanto se debe continuar con la búsqueda, reporte e informe de BLEE en las pruebas de rutina, si es BLEE positivo informar resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactámicos independientemente de las zonas de inhibición obtenidas, si es BLEE negativo informar según el punto de corte CLSI 2013. Las infecciones causadas por bacterias productoras de β-lactamasas de espectro extendido representan un reto para el equipo de salud por la limitada disponibilidad de opciones de tratamiento, esto obliga a la prevención de estas infecciones mediante la restricción del uso de agentes antimicrobianos, junto con la aplicación de medidas inmediatas de control de infecciones. Para controlar o reducir la elevada tasa de portadores de estos organismos, se deben tomar medidas efectivas como prohibir la venta de antibióticos sin receta médica y concientizar en la población los peligros de tomar antibióticos sin consulta médica. 49 CONCLUSIONES En el presente estudio se demostró la presencia de bacterias productoras de BLEE en 31% (281/905) de los aislamientos de ambas enterobacterias. Del total de E. coli el 28,6% (207/724) fueron productores de BLEE y de las K. pneumoniae el 40,9% (74/181) fueron productores de BLEE. De los aislamientos comunitarias; el 27,3% (135/494) fueron E. coli productoras de BLEE y el 28,7% (19/66) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el 3,7% (5/135) de las E. coli productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC y el 5,2% (1/19) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC. De los aislamientos hospitalarios; el 31,3% (72/230) fueron E. coli productores de BLEE y el 47,8% (55/115) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el 4,1% (3/72) de las E. coli productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC y el 7,2% (4/55) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC En la mayoría de las enterobacterias productoras de BLEE, se observó la resistencia a las fluoroquinolonas, gentamicina y sulfametoxazol/trimetoprim. Todos los aislados resultaron ser resistentes a los carbapenémicos. La mayoría de las muestras correspondían a los lactantes, de los aislamientos comunitarios el 50,6% (78/154) eran productores de BLEE y de los aislamientos hospitalarios el 64,6% (82/127) fueron productores de BLEE. En cuanto al género, masculino o femenino, no hubo diferencias significativas. De las enterobacterias productoras de BLEE aisladas los genes productores de BLEE fueron: SHV (45,5%: 128/281), CTX (91,1%: 256/281) y TEM (44,4%: 125/281). 50 RECOMENDACIONES Es necesario el secuenciamiento de los genes productores de BLEE. Evaluar los otros mecanismos de resistencia a betalactamicos diferentes a las BLEE: o Otras betalactamasas (AmpC) o Perdida de porinas Evaluación de la clonalidad mediante el método estandarizado “Electroforesis de Campo Pulsado” (P.F.G.E.). Implementar un sistema de vigilancia de la resistencia a antibióticos, que permita detectar la aparición de enterobacterias productoras de BLEE. Continuar con la búsqueda de mecanismos de resistencia en el laboratorio de microbiología. 51 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Organización Mundial de la Salud. Movilizar la voluntad política para contener la resistencia a los antimicrobianos. Bulletin of theWorldHealth Organization.2011; 89:168–169. 2. Muzaheed Y, Adams J, Shivannavar C, Paterson D, Gaddad S. 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