Prevención de HLB (Huang Long Bing) en Uruguay y Argentina.
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Informe Ejecutivo de Consultoría LA CITRICULTURA DE ARGENTINA Y URUGUAY PUEDE ESCAPAR A LA AMENAZA DEL HLB Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable IIBCE Departamento de Biología Molecular Héctor Mara‐ Mercedes Peyrou Oct ‐ 2010 Los autores desean agradecer a colegas de Uruguay y Argentina que les han hecho llegar importante bibliografía y en particular a los ingenieros Elena Pérez, Alvaro Otero, José Buenahora y Roberto Bernal. También desean expresar su agradecimiento a especialistas extranjeros que visitaron nuestra región y aportaron valiosísima información, destacando en especial a los Dres.J.Bové y T.Gottwald. 1 TABLA DE CONTENIDO Introducción 3 1. Velocidad de difusión del HLB a nivel mundial y magnitud del problema 3 2. Daños previstos bajo el supuesto de ingreso del HLB a Uruguay y Argentina 4 3. Las causas de la rápida difusión mundial 5 3.1. Hipótesis actual 5 3.2 Análisis de la hipótesis actual 6 3.3 Una nueva hipótesis para interpretar la dispersión del HLB 11 3.3.1 Escenario de difusión de la enfermedad a nivel predial partiendo de material enfermo en montes nuevos. 12 3.3.2 Escenario de difusión de la enfermedad a nivel predial en un monte adulto donde se reponen plantas faltantes con material planta proveniente de viveros infectados. 13 3.3.3 Escenario de difusión de la enfermedad a nivel regional, partiendo de material planta infectado en vivero 14 3.3.4 Características del material planta infectado e hipótesis final 15 3.4 Eficiencia de dispersión de la bacteria y los programas de certificación 16 3.4.1 Eficiencia de dispersión de la bacteria 16 3.4.2 Métodos de saneamiento y programas de certificación 17 4. Recomendaciones para evitar el ingreso del HLB 21 5. Bibliografía citada 25 FIGURAS Fig. 1 Incidencia de HLB en tablones (lotes de 2000 plantas) en la provincia de San Pablo entre los años 2004 y 2009 6 Fig. 2 Avance de la enfermedad en los municipios del estado de San Pablo desde el año 2004 hasta el año 2008 10 Fig. 3 Evolución de la incidencia de la enfermedad en dos predios en China 12 Fig. 4 Distribución de plantas con HLB en distintos cuadros a los 3 años de plantadas 13 Fig. 5 Dispersión secundaria de la enfermedad a partir de focos aleatorios en montes adultos 14 2 Introducción La citricultura de casi todo el mundo está siendo amenazada por la expansión de la enfermedad conocida como Huang Long Bing (HLB) o también Greening, cuyo organismo causal es la bacteria Candidatus Liberibacter sp. Esta enfermedad esta descripta como la más destructiva de los citrus y está presente hoy en las principales citriculturas del mundo (Bové, 2006a; Gottwald et al. 2007). Los países afectados están realizando una fuerte inversión en investigación científica para generar medidas eficientes para su control. Por su parte las regiones que se encuentran aún libres de HLB, centran sus esfuerzos en conocer las razones de tal dispersión, en identificar las formas más probables de su ingreso en las distintas áreas y en tomar medidas eficaces para evitar su introducción. Estas acciones se generan frente al hecho constatado de que vastas áreas citrícolas del mundo no han podido evitar el ingreso de esta enfermedad en los últimos años, como es el caso de San Pablo en Brasil, de Florida en EEUU y en general en la citricultura centroamericana. El presente Informe Ejecutivo es el resultado de la Consultoría “Evaluación de riesgo de introducción de Huang Long Bing en la Mesopotamia Argentina y el Litoral Uruguayo” (Julio 2008‐Nov 2009) realizada por los investigadores del Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), Héctor Mara y Mercedes Peyrou a solicitud de la empresa citrícola argentina FAMA. La publicación de este trabajo es patrocinada por la Cámara de Exportadores de Citrus del Noreste Argentino (CECNEA). A los efectos de realizar este estudio se reunió toda la información histórica disponible sobre la dispersión de la enfermedad en distintas regiones del mundo y publicaciones científicas que pudieran ilustrar los diversos aspectos de la epidemiología del HLB. La información reunida, fue analizada para la generación de hipótesis que posteriormente fueron contrastadas con las evidencias de campo. Elaborada la hipótesis epidemiológica sobre la rápida distribución de HLB en el continente americano, se evaluaron los factores de riesgo de su introducción a la Mesopotamia Argentina y Litoral Uruguayo. En base a esta evaluación se aportan elementos para la toma de decisiones que permitan evitar su introducción. La forma resumida de este informe, atiende a los interesados directos: citricultores, gobernantes, legisladores y dependencias de gobierno involucradas. 1. Velocidad de difusión del HLB a nivel mundial y magnitud del problema El HLB es una enfermedad destructiva que afecta a los citrus y representa una gran amenaza a la industria citrícola en el mundo pues está invadiendo rápidamente nuevas áreas de producción. Fue descrita por Reinking en 1919 (Bové, 2006a) en el sur de China, como “enfermedad del brote amarillo”, aunque en ese momento se desconocía su etiología. Investigaciones posteriores en ese país, mostraron que ya en 1936 se había dispersado y constituía un serio problema. Si bien la enfermedad HLB existe desde hace mucho tiempo en Asia, luego de su largo confinamiento en esa región, ha superado océanos y miles de kilómetros de tierra firme, llegando a nuestro continente. Lo que no había sucedido en más de un siglo ahora ocurre de una manera extraordinariamente rápida pues, en menos de una década el HLB ya se extiende por el continente americano. Podemos considerar que estamos frente a una pandemia que afecta hoy a más de 40 países (Bové, 2006b). 3 La reciente velocidad de expansión del HLB alarma a los citricultores de todo el mundo. En el año 2004 se detecta la enfermedad en San Pablo, Brasil (Teixeira et al. 2005) en 2005 en Florida, EEUU (Gottwald et al. 2007); en 2007 en Cuba (Martínez et al. 2008) y en los estados de Minas Gerais y Paraná en Brasil (Belasque et al. 2009); en 2008 en Santo Domingo (Matos et al. 2009) y en Louisiana, EE. UU.; en 2009 en Belice, en los estados de Georgia y Carolina del Sur, EEUU. En 2009 se identifica también en México, en Jamaica, Guatemala y Puerto Rico y en 2010 se detectó en Honduras y Nicaragua (Irey, 2010). En Brasil, los ingentes esfuerzos aplicados en la erradicación de plantas y en disminuir las poblaciones del insecto vector del HLB, (Diaphorina citri, Kuwayama, familia Psyllidae, Orden Homóptera) no han tenido la respuesta esperada, y continúa el acelerado progreso de la enfermedad (Ayres, 2010). (Fig.1) En Florida, EEUU, la situación es considerada de suma gravedad. Para algunos productores los costos aumentaron 50% debido al intento de evitar la expansión del HLB, mientras que otros productores no adoptan ninguna medida de control, o lo hacen puntualmente lo que lleva, en muchos casos, al abandono de los predios por su baja rentabilidad (Muraro y Morris, 2008). En los últimos años el estado de Florida ha destinado fuertes recursos financieros en investigación para afrontar el problema. 2. Daños previstos bajo el supuesto de ingreso del HLB a Uruguay y Argentina Uruguay registró en el año 2009, 16.2 mil hectáreas cultivadas con cítricos y 5.9 millones de plantas en producción, habiéndose logrado una cosecha de 269 mil toneladas (DIEA‐ MGAP, 2009a). El sector ocupa a 19.400 trabajadores de los cuales 4.400 son permanentes y 15.000 son zafrales, con una relación de 1,2 trabajadores por Há. (DIEA‐MGAP, 2000). En el año 2008 se exportó el 48% de la producción de fruta cítrica con un valor de 75.5 millones de dólares, a los que se suman 7.3 millones de dólares correspondientes a la exportación de productos cítricos industrializados. (DIEA‐MGAP, 2009b). En el caso de Argentina la superficie ocupada por especies cítricas es de 140.000 hás, 77.000 de las cuales corresponden al Noreste Argentino (NEA), que comprende las provincias de Misiones, Corrientes, Entre Ríos y Buenos Aires. La producción de citrus en Argentina en 2008 fue de 3:000.000 de tons, correspondiendo 1:000.000 al NEA (INTA, 2008). Del total de fruta producida se exportan 654.000 tons ‐un 22% del total‐ mientras que el 28% se destina a mercado interno y un 43% a industria. El valor FOB de exportación de naranja, mandarina y pomelo de Argentina ascendió en 2008 a 167millones de dólares mientras que la exportación de limón ascendió a 361 millones de dólares (SENASA – DNFA/DTI, 2008). Estas son cifras ilustrativas sobre el patrimonio que está en juego ante el peligro del HLB. Hasta el momento ambos países están libres de HLB y para estimar los daños o pérdidas que produciría el ingreso de la enfermedad en la región, si se manifestara con igual intensidad que en las regiones subtropicales de nuestro continente, hay que tener en cuenta varios factores. De acuerdo a lo descripto en las áreas donde se ha instalado la enfermedad, las plantas afectadas sufren un rápido decaimiento perdiendo la capacidad de producción comercial por reducción del cuajado, caída de fruta y disminución del tamaño de la misma, volviéndose improductiva a los pocos años de observarse los primeros síntomas (Gottwald et al. 2007). En nuestras condiciones y en términos generales, se asume que la improductividad o muerte de un 20% de las plantas de un predio pueden inviabilizar la continuidad económica del mismo. Los métodos recomendados para intentar disminuir las pérdidas conllevan un incremento de costos que va de los U$ 500 por hectárea en Brasil a U$ 400 por acre en Florida (Muraro y 4 Morris, 2008) sin lograr la solución al problema, sino un paliativo para reducir la velocidad de expansión dentro de un predio citrícola. Por otra parte, Uruguay y Argentina son productores de fruta fresca para la exportación, lo que hace inviable la aplicación de las recomendaciones actuales de control del insecto vector en base a múltiples aplicaciones de insecticidas, debido a los bajos niveles de residuos en fruta admitidos por los mercados compradores. En resumen, podemos decir que el ingreso del HLB en nuestra zona produciría un fuerte impacto debido a la no producción o muerte de plantas ocasionadas por la enfermedad, al aumento de costos para su control, a la disminución de la rentabilidad que surge de los factores anteriores y el impacto ambiental que originaría la continua aplicación de fiticidas. 3. Las causas de la rápida difusión mundial Las consecuencias que acarrearía el ingreso del HLB a la subregión reclaman identificar las posibles acciones para prevenirlo y fundamentan el presente trabajo. Se requiere, por lo tanto, conocer las causas de la expansión de la enfermedad, las características epidemiológicas del patógeno y las formas de transmisión. El conocimiento que actualmente existe sobre la bacteria causante de la enfermedad, no permite hasta la fecha, determinar con precisión la forma en que la misma ha ingresado, casi simultáneamente, a distintos países de América, en algunos casos separados entre sí por cientos o miles de kilómetros, así como su rápida dispersión dentro de los mismos. En este trabajo se hace una revisión de las hipótesis más difundidas sobre las causas de su distribución y en base a una extensa revisión bibliográfica se plantean nuevas hipótesis. 3.1 Hipótesis actual Las únicas formas de trasmisión de la enfermedad comprobadas hasta el presente son el material planta infectado y el insecto vector (Bové, 2006a). Los especialistas en el tema asignan la causa principal de la actual dispersión mundial y regional del HLB al insecto vector. Este hecho se debe a que el material planta utilizado para la multiplicación de los citrus y la reposición de plantas, proviene en la mayoría de los países que han adquirido recientemente la enfermedad, de viveros que comercializan plantas certificadas por programas que garantizan su sanidad. Esta afirmación se basa en tres supuestos: 1. La infalibilidad del procedimiento de limpieza. Este consiste en la multiplicación de plantas mediante microinjerto de meristemos apicales. Se trata de tejidos no diferenciados, en activa multiplicación, sin tejidos conductores ni sus precursores, exentos de microorganismos como la bacteria que produce el HLB, que coloniza el floema. Se cree además que la semilla sería un filtro que impediría la propagación de la bacteria. 2. La infalibilidad de los métodos de detección que permitirían certificar una planta surgida de este procedimiento de limpieza como libre de HLB. 5 3. La garantía de poseer plantas libres de la enfermedad utilizando germoplasma certificado como libre de HLB, y su posterior multiplicación en ambientes cerrados lo que evitaría la entrada del insecto vector y aseguraría la no transmisión por material planta. Tal interpretación de la expansión del HLB conduce a las siguientes recomendaciones para evitar el ingreso a un área libre: • Utilizar material cítrico certificado para propagación proveniente de viveros cerrados • Controlar o mantener bajas las poblaciones del insecto vector en los huertos cítricos • Eliminar rápidamente las plantas infectadas que eventualmente sean detectadas y eliminar huéspedes alternativos (caso de Murraya paniculata, especie utilizada como ornamental) (Belasque et al. 2010) Los países afectados por HLB siguen este esquema de manejo: utilizan material de propagación certificado, generado en viveros techados y con malla antiáfido, realizan control químico del vector, monitoreo continuo de los montes cítricos a los efectos de detectar los primeros síntomas de la enfermedad y una rápida erradicación de toda fuente de inóculo detectable. Debido a la complejidad y el costo que implica la aplicación de todas estas medidas en forma conjunta, las mismas no son adoptadas por todos los productores dentro de una región (Muraro y Morris, 2008). En muchos predios donde estas medidas se aplican, los resultados son variables y, a nivel de regiones citrícolas, la enfermedad sigue expandiéndose en las distintas zonas en forma sostenida, previéndose una incidencia muy alta en un corto tiempo. Figura 1.‐ Incidencia de HLB en tablones (lotes de 2000 plantas) en la provincia de San Pablo entre los años 2004 y 2009 Fuente: Ayres J., 2010 3.2 Análisis de la hipótesis actual Hasta el momento, los resultados de la investigación científica sobre la epidemiología del HLB, son escasos. Para tratar de entender su forma de dispersión y poder analizar sus causas, 6 debemos basarnos en los hechos observados En la revisión bibliográfica realizada no se encontraron datos indicadores de la existencia de proyectos de investigación que analicen la forma de ingreso en las zonas afectadas y posterior distribución de la enfermedad. Por lo tanto, hoy solamente es posible un análisis epidemiológico considerando que una enfermedad tiene causas y efectos. Se considera que se pueden inferir las causas que ocasionan determinados fenómenos observando sus efectos. El conocimiento de esta relación causa‐ efecto es la clave para actuar contra la enfermedad. Las dos formas de trasmisión de HLB –material de propagación infectado e insecto vector‐ tienen características específicas en su expresión según variables epidemiológicas tales como: a. patrón de distribución, b. velocidad de dispersión, c. edad de las plantas afectadas. Si bien en el pasado se reconoció el papel cumplido por los viveros en la expansión de la enfermedad en distintas regiones del mundo, fundamentalmente en el Sudeste Asiático, la hipótesis prevalente arriba indicada sostiene que actualmente la expansión de HLB se debe al insecto vector. A los efectos de profundizar en esta hipótesis veremos las características del insecto vector, las conclusiones que podemos sacar sobre su capacidad de transmisión de la enfermedad, las características con las que la misma se expresaría si fuera este el principal vector, y posteriormente los hechos observados. Del mismo modo analizaremos las características que debería tener una distribución a través del material planta. Capacidad de desplazamiento del insecto vector La descripción que realizan diversos autores sobre las características de Diaphorina citri ‐vector de las dos variantes de la bacteria Candidatus Liberibacter sp. presentes en América: asiático y americano‐, refieren a un insecto mal volador, “saltador”, sedentario. Catling en 1968 y Bindra en 1970, lo definen como un “ineficiente volador” (citados por Altamirano et al. 1977) Diferentes ensayos realizados a partir de 2005 por Ichinose (Ichinose et al. 2005) y Nakata (Nakata, 2005) confirmaron estas apreciaciones. Ichinose relata que en un experimento donde coloca plantines de citrus como plantas “trampa” a distintas distancias de plantas colonizadas por el vector, luego de 5 meses, las poblaciones de D.citri no habían superado los 20 m de distancia a partir de la plantas donde se encontraba inicialmente. Nakata describe un ensayo donde se liberan 20.000 individuos criados en laboratorio y marcados con una sustancia fluorescente. En este caso la liberación se realiza en un medio diferente del que fueron criados (obligándolos a buscar nuevos huéspedes) y determina que la distancia promedio a la que se mueve el insecto en un día, es de 70 a 80 m, detectando en un caso un individuo a los 200 m y en otro ensayo un individuo a los 350 m. Huang en Taiwan (Huang et al 1990) comprueba que, al liberar adultos de D. citri en un cuadro de citrus de 30 m x 15 m, los mismos tardaron dos meses en dispersarse sobre todo el lote. Observaciones realizadas por entomólogos y productores tanto en Argentina como en Uruguay confirman este carácter sedentario del insecto ya que el mismo suele encontrarse en un determinado lote y no en los vecinos durante meses y aún años. 7 Capacidad de transmisión de la enfermedad por el insecto vector Zhao Xueyuan (Xueyuan, 2010) afirma que bajo condiciones experimentales la capacidad de transmisión del HLB por el psílido es relativamente baja. Ensayos llevados adelante en Liuzhou en 1973‐1978 donde expusieron plantines sanos a la inoculación con 50 a 200 insectos adultos recogidos en plantas enfermas en el campo, mostraron una baja capacidad de transmisión de la enfermedad (8%). Otros ensayos realizados en Fuzhou entre 1978 y 1984 mostraron una capacidad de transmisión de un 12%. En otros tests realizados en Raoping, Guandong el nivel de infección fue mayor, alcanzando el 47% (en ninguno de estos casos se especifica el tiempo durante el que se monitorearon estos ensayos). Martinez y Wallace en 1968, demostraron que se requiere un alto número de vectores para lograr una buena transmisión de la enfermedad. Huang et al. en 1984 determinan una eficiencia en la transmisión de la bacteria menor al 1%. Shi‐cheng Hung afirma que solo el 5% de los adultos de D. citri adquieren HLB al alimentarse en plantas infectadas durante 28 días aunque en estadios ninfales son muy eficientes en adquirir la enfermedad (citado por Hall, 2008). Todos estos factores sumados muestran que se necesita un elevado número de insectos para lograr una mediana a baja transmisión (en un período de tiempo corto similar al observado en estos ensayos). Si además consideramos que esta transmisión se produce a partir de un vector poco móvil y de hábitos sedentarios, estos datos llevarían a suponer un patrón de dispersión sumamente agregado y lento en su dispersión en el tiempo, donde la máxima probabilidad de infección quedaría reducida a las plantas próximas a la planta infectada. Los datos de los primeros ensayos en HLB llevados adelante por Lin Khung Hsiang entre 1951 y 1954 (Lin, 1956) confirman este razonamiento. Lin observó que a los 3 años de inocular 94 plantas de mandarina Ponkan, la enfermedad había sido transmitida por el vector a un 18% de plantas que oficiaban de bordura del ensayo (plantas con una proximidad inmediata a las inoculadas), pero la enfermedad no había alcanzado en ese período de tiempo (3 años) a otro lote de 160 plantas que se encontraban cruzando el camino. Durante el primer período de infección de HLB en Filipinas, Gonzales en 1969 observó que el insecto es incapaz de infectar un predio que se encuentre a 2 km de distancia del predio afectado (Altamirano et al. 1977). Estudios recientes realizados en Brasil concuerdan en que una distancia de 4 km aseguraría la baja probabilidad de infección de un predio a partir de un predio vecino (Belasque et al. 2010). A partir de la información anterior deducimos que la enfermedad transmitida por el insecto vector debería expresarse con un patrón agregado (es decir, concentrado geográficamente a nivel de región y/o predio), de lenta expansión, y afectando plantas con distintas edades y grados de desarrollo. Se analizará brevemente cada una de las características expresadas. a) Patrón agregado de expansión de dispersión de la enfermedad Un patrón de distribución de la enfermedad esperable a nivel regional debido a transmisión por insecto vector debería tomar en cuenta que la colonia es sumamente sedentaria y que el insecto es saltador y mal volador, de manera que la probabilidad de infección quedaría reducida a las plantas próximas a la planta infectada. 8 b) Patrón de lenta expansión La especificidad que tiene la D. citri de alimentarse de citrus u otras rutáceas y sus características de vuelo, vuelven improbable la transmisión de la enfermedad entre predios distantes entre sí varios kilómetros. Ya hemos visto afirmaciones en tal sentido provenientes de observaciones en Filipinas en la década del 60 y en San Pablo actualmente. Se debe sumar a este hecho que se requerirían un número importante de individuos para transmitir la enfermedad, de manera que la velocidad de dispersión a nivel de región por su intermedio sería muy lenta, reduciéndose al propio predio con plantas infectadas y a vecinos muy próximos. c) Patrón de plantas infectadas con diversas edades y desarrollo A pesar de la conocida preferencia por tejidos jóvenes que presentan los insectos chupadores, las características de escasa movilidad y sedentarismo de D. citri determinarían la selectividad de brotes tiernos próximos para alimentarse. Es de esperar que desde una planta infectada, D. citri colonice las plantas más cercanas, independientemente de su edad y de su preferencia por brotes tiernos, (presentes tanto en plantas adultas como jóvenes, aunque en distinta proporción). Observaciones realizadas por técnicos de SENASA que colectan psílidos en distintos predios de la Mesopotamia Argentina a los efectos de su análisis, confirman que no observaron una preferencia del insecto por plantas más jóvenes (comunicación personal). Contraste de los sucesos observados con los sucesos esperados si el insecto fuera el principal vector de la enfermedad. Una visión holística de la pandemia debería dar explicaciones sobre varios sucesos que ocurren simultáneamente. Las primeras descripciones del HLB provienen de 1919 en China. Un siglo después en el 2004 se detecta en Brasil, en 2005 en Florida y en 2008 en Cuba. Estamos frente a tres regiones separadas en algunos casos por miles de kilómetros y en otros por mares. Se debe sumar a lo anterior su aparición en Méjico y en Centroamérica. Frente a este hecho nos hacemos una pregunta: ¿Es posible considerar este hecho una casualidad o debemos buscar una explicación que de alguna forma englobe estos tres sucesos? ¿Podemos afirmar que el insecto vector infectado, luego de 100 años pudo en un breve plazo de tiempo (3 a 5 años) trasladarse desde el Sudeste Asiático o la India para colonizar tres zonas tan distantes y tan diversas entre sí? Un segundo hecho que hemos observado es que en las zonas mencionadas la dispersión de la enfermedad ha sido explosiva con un patrón muy similar. Este patrón se caracteriza por: 1‐ Presentar inicialmente un bajo número de plantas infectadas, distribuidas en una amplia región (patrón sumamente disperso) en un corto período de tiempo. Así en Brasil la enfermedad es detectada en 2004 en dos municipios infectados en San Pablo. En julio de 2010 existían 253 municipios infectados en San Pablo, cuatro en Minas Gerais y 54 en Paraná, lo que muestra la vertiginosa difusión de la enfermedad a distancias que pueden estar separadas entre sí entre 300 y 500 kms, en un período muy corto de tiempo. No existe en este caso un área citrícola continua que pueda explicar el pasaje del insecto vector de una planta a otra, sino que los predios citrícolas están separados por extensas áreas no citrícolas en muchos casos ocupados por el cultivo de la caña de azúcar. 9 En el 2009 con el 0,9% de las plantas del parque citrícola de San Pablo se habían infectado los principales municipios citrícolas (242) y el 24% de los lotes (Figura 1). Es decir que la enfermedad se había desplazado a 300 km de distancia sin afectar aparentemente predios o lotes que estaban más próximos (Ayres, et al. 2010) (Figura 2). En Paraná en el 2007, se erradicaron 531 plantas afectadas por HLB, pero las mismas se encontraban distribuidas en 26 propiedades en 3 municipios distintos. Figura 2.‐ Avance de la enfermedad en los municipios del estado de San Pablo desde el año 2004 hasta el año 2008 Fuente: Ayres J. et al., 2010. En Florida, EEUU, sucede algo muy similar: se detecta la enfermedad en el 2005 y en el 2009 se encuentra presente en los 32 municipios de Florida. En Cuba en el 2008 cuando se identifica la enfermedad, la misma ya está presente en las principales regiones citrícolas. Algo similar sucede en Belice ya que cuando se detecta Ca. Liberibacter en el psílido (previo a la aparición de síntomas) ya se sabía que la enfermedad estaba distribuida en todo el país. Para explicar esta dispersión primaria a partir del vector deberíamos aceptar que de alguna forma no propia de la naturaleza del insecto, el mismo es transportado en un número adecuado para producir la infección y depositado sobre la planta que luego va a mostrar síntomas, pasando por encima de zonas citrícolas próximas o zonas sin citrus. También deberíamos aceptar que esos pocos insectos tienen una mayor capacidad infectiva que el 99% restante que en 5 meses no va a desplazarse más allá de 20 ms de la planta de origen. Estamos frente a un patrón de dispersión totalmente opuesto al que debería presentar el insecto vector como principal fuente de dispersión de la enfermedad ya que estamos frente a un patrón sumamente disperso y de rápida expansión. 2‐ En el primer período de dispersión del HLB en nuevas zonas citrícolas la mayoría de las plantas con síntomas son plantas jóvenes menores de siete u ocho años. 10 En 2008, el Dr. Bové, en oportunidad de su visita a Cuba, pudo apreciar que la enfermedad se veía preferentemente en plantas jóvenes, no habiéndose observado durante su visita, plantas adultas con síntomas. (Bové, comunicación personal). Existen múltiples referencias de cómo se manifiestan los síntomas de la enfermedad en montes nuevos con edades de 3, 4 o 5 años tanto en Brasil como en Florida. En muchos de estos ejemplos hemos visto empresas con plantaciones realizadas en un mismo año en distintas zonas y encontrarse al cabo de 3 o 4 años con la manifestación de la enfermedad en las diferentes zonas y en todos los lotes de cada zona, presentando a la vez una distribución esencialmente al azar en cada lote. (Figura 4) Nuevamente los patrones de dispersión de la enfermedad tanto entre países como en regiones dentro de un país y dentro de los propios predios, no parecen responder al patrón esperado de distribución a través del insecto vector. La hipótesis que atribuye esta infección primaria a D. citri debe aceptar que la misma debe “volar” (recordemos que es un insecto “saltador”) salteándose enormes distancias para infectar a veces una sola planta de cada lote y a su vez tener la capacidad de llegar a todos los lotes a la vez. La hipótesis hoy hegemónica de interpretación de la distribución del HLB no puede explicar la realidad pues existe un agudo contraste entre el modelo de dispersión – esperado – concentrado, de lenta difusión y afectando sin discriminar entre plantas de diferentes edades, y el patrón real – observado ‐ de distribución sumamente dispersa, con alta velocidad de avance, distribución a grandes distancias y selectivo a plantas jóvenes (menores de 7 años en un primer momento de la difusión). El contraste entre la realidad y el modelo teórico de dispersión correspondiente a la hipótesis actual aconseja cuestionarla. 3.3 Una nueva hipótesis para interpretar la dispersión del HLB La causa principal de la gran velocidad de expansión y del patrón general de distribución mundial y regional del HLB es el material de propagación y no el insecto vector. Manteniendo la coherencia de confrontar cada hipótesis con la realidad veremos el comportamiento “esperado” de las variables epidemiológicas si la principal transmisión se realiza a través del material de propagación. Supongamos tres escenarios posibles: dos escenarios de difusión de la enfermedad a nivel predial y un escenario de difusión de la enfermedad a nivel regional. Esta hipótesis se apoya en dos principios: 1. que la dispersión a larga distancia se debe al material de propagación 2. que la dispersión a corta distancia se debe a la acción del insecto vector. 11 3.3.1 Escenario de difusión de la enfermedad a nivel predial partiendo de material enfermo en montes nuevos. De acuerdo a la combinación variedad‐portainjerto, a las prácticas de manejo del predio, y a otros factores ambientales, la enfermedad podrá comenzar a expresarse en forma notoria a partir del tercer año en algunos casos, alcanzando su máxima expresión entre el quinto y séptimo año. (también pueden observarse plantas enfermas a los pocos meses de su plantación). (Figura 3) Este escenario fue claramente descrito en distintas regiones del mundo partiendo de material planta infectado. Así en las plantaciones citrícolas de Vietnam del Sur, Le Thi Tu Hong afirma que en la década del 90 los síntomas aparecían en las plantaciones nuevas cuando las plantas tenían entre 4 y 5 años (Le Thi Thu Hong, 1998). Suchat Vichitrananda en Tailandia describe, en esa misma época, que plantas de 4 a 5 años de edad repentinamente morían y que el período de vida de los citrus en estas áreas era de 8 a 10 años (Vichitranandra, 1998). En la década del 60, reportes de Altamirano en Filipinas relatan que las plantas infectadas mostraban síntomas a los 3 a 5 años entrando precozmente en producción. Todos estos autores sostienen que la infección en sus respectivos países provenía de viveros infectados (Altamirano et al, 1977). Los datos provenientes de China a partir de la Liuzhou Citrus Farm (LCF) en 1953 o del Liuzhou Agriculture Research Institute (LARI) en 1968, partiendo de material enfermo, también muestran con claridad este comportamiento (Gottwald et al 2007). Figura 3.‐ Evolución de la incidencia de la enfermedad en dos predios en China (Fuente: Gottwald et al 2007) En el gráfico de LARI vemos que las plantas, que provienen de material infectado con HLB, comienzan a manifestar síntomas a partir del cuarto o quinto año de su instalación, mientras que en LCF la enfermedad muestra una pendiente uniforme creciente hasta el décimo año de la plantación. De lo anteriormente visto, concluimos que si se plantaran varios cuadros al mismo tiempo a partir de material enfermo los síntomas de la enfermedad aparecerían más o menos simultáneamente en todos ellos, en un patrón inicial aleatorio con pocas plantas muertas 12 entre el tercer y cuarto año y un incremento del nivel de mortalidad entre esos años y el octavo año de vida del monte. Figura 4.‐ Distribución de plantas con HLB en distintos cuadros a los 3 años de plantadas (Fuente: Bassanezi, 2010) 3.3.2 Escenario de difusión de la enfermedad a nivel predial en un monte adulto donde se reponen plantas faltantes con material planta proveniente de viveros infectados. Partiendo de un monte adulto, debemos tener en cuenta la pérdida natural de plantas (antes de la aparición del HLB) y posterior reposición por parte del productor. (En Florida, EEUU, en montes adultos se reportaban pérdidas anuales de plantas de 1 a 3%, previo a la aparición de HLB) (Muraro y Morris, 2008). Si suponemos que predios sin HLB son replantados con plantas enfermas podríamos presuponer el patrón de distribución de la enfermedad en los mismos. Al tercer año, estos replantes comenzarían a mostrar síntomas y esa enfermedad se iría incrementando en el conjunto de los replantes en los años subsiguientes. La enfermedad se manifestaría nuevamente en los montes adultos al azar y al mismo tiempo, si el vector se encuentra presente, se comenzaría a observar la enfermedad en plantas adultas próximas a las plantas infectadas. Tendríamos por lo tanto un patrón de distribución en el predio en principio al azar y posteriormente este patrón se iría agregando debido a la acción secundaria de D. citri. La edad de las plantas afectadas sería, en principio, el de plantas jóvenes entre 3 y 7 años y en una segunda etapa se observarían plantas adultas afectadas. Distintos trabajos epidemiológicos muestran un escenario similar al de la figura 5. 13 Figura 5.‐Dispersión secundaria de la enfermedad a partir de focos aleatorios en montes adultos. (Fuente: Bassanezi, 2010) 3.3.3 Escenario de difusión de la enfermedad a nivel regional, partiendo de material planta infectado en vivero. Si presuponemos que un volumen muy importante de las plantas de vivero va a oficiar como replantes en montes adultos (Escenario 2 a nivel predial), la velocidad de dispersión de la enfermedad a nivel regional va a ser enormemente rápida. Sus características se expresarán con un bajo número de plantas sintomáticas que constituyen la fuente primaria de inóculo para grandes regiones (comienzan a aparecer al tercer año de ser plantadas). A medida que avanza la edad de estos replantes hasta llegar al 5º y 6º año se va acentuando el porcentaje de plantas enfermas sintomáticas y comienza a observarse la difusión secundaria dentro del predio o entre predios vecinos por el insecto vector. La bacteria ‐que no tiene vida libre‐ es, en este caso, transportada dentro de la planta huésped a lugares muy distantes en un breve período de tiempo y colocada entre otras plantas a las cuales tendrá acceso a través del insecto vector (Figuras 1 y 2). De esta forma un bajo número de plantas estará en condiciones de generar una alta incidencia de la enfermedad en un gran número de lotes, separados entre sí por decenas o cientos de kilómetros. La nueva hipótesis apoyada en las propiedades que tienen cada uno de los distintos vectores y en sus “patrones esperados” de manifestación de la enfermedad, actuando en conjunto, explican con facilidad los “hechos observados” en las distintas regiones citrícolas de nuestra América. Así se explica con facilidad que la enfermedad pueda entrar en forma casi simultánea en regiones distantes entre sí cientos y miles de kilómetros como son Florida y San Pablo o entre 14 zonas separadas por mares como son Florida y Cuba, o Cuba y Méjico. También esta hipótesis explica la rápida difusión dentro de una región, donde en lugar de concentrarse la enfermedad tiene una primera etapa de alta y rápida dispersión, con una posterior agregación en las distintas zonas a las que ha llegado. También esta hipótesis explicaría la distribución dentro de un mismo predio donde la expresión en sus comienzos es totalmente aleatoria, tanto en montes nuevos como en montes viejos, con una tendencia a la agregación en los años siguientes. En efecto, el modelo predial esperable de manifestación de la enfermedad sería el de un bajo número de plantas manifestando síntomas en los primeros años de realizada la plantación, en el caso de montes nuevos, o en los replantes en el caso de montes en producción. En los años siguientes 3º, 4º o 5º, se observaría un rápido crecimiento, con diferencias en la tasa de expresión de la enfermedad, dependiendo si la misma está constituida por montes nuevos con material originalmente infectado o por montes adultos donde los replantes ‐un 10 o 15% del total de plantas‐ van a comenzar a expresar los síntomas en ese volumen reducido de plantas al 3er o 4º año. En este último caso, D.citri llevará posteriormente la enfermedad a las plantas adultas vecinas, generando el patrón agregado de la enfermedad (Fig. 5). En todos estos escenarios descriptos, los “hechos esperados” son muy similares o idénticos a los hechos observados ya que en un principio la enfermedad se manifiesta fundamentalmente en plantas nuevas, menores a 6 u 8 años, sin afectar en las primeras etapas a las plantas adultas. 3.3.4 Características del material planta infectado e hipótesis final Si aceptamos que la principal vía de diseminación de la enfermedad en un cortísimo tiempo histórico, entre países, entre regiones dentro de un mismo país, entre predios dentro de esas regiones y por último dentro de los mismos predios se debe en primera instancia al material planta infectado y recién en segunda instancia al insecto vector, surge una nueva: ¿Cuáles son las características que debe tener ese material planta? En este punto definiremos la hipótesis final, que de ser cierta permitiría instrumentar las medidas adecuadas para prevenir la introducción de la enfermedad. La causa principal de la gran velocidad de expansión y del patrón general de distribución mundial, regional y predial del HLB es el material de propagación y no el insecto vector. Este material planta de propagación provendría de viveros centrales. Definiremos como viveros centrales aquellos que se encuentran bajo un programa global de certificación y que por su tamaño e importancia, comercializan sus plantas en grandes zonas citrícolas a diferencia de pequeños viveros que lo hacen en forma local, en predios cercanos al lugar donde se encuentran instalados. De acuerdo a las características de la producción altamente tecnificada de las regiones afectadas (Florida, EEUU y San Pablo, Brasil) estos son los viveros que abastecen principalmente la producción. Veamos ahora la segunda parte de la nueva hipótesis que sostiene que el principal factor de dispersión es el material planta infectado proveniente de viveros centrales que garantizarían la calidad sanitaria de sus plantas. Si bien sólo el material planta puede cumplir con las 15 características de la dispersión de la enfermedad observadas en la realidad, no cualquier material planta infectada puede hacerlo. Un material planta infectado introducido a un país por un particular para uso propio, concentraría la enfermedad en su propio monte pero no globalizaría el efecto. Tampoco un vivero menor infectado podría explicar la magnitud de la expansión. En cambio, un material planta infectado proveniente de viveros centrales cumple con las “características observadas” de expansión de la enfermedad en las distintas regiones de nuestro continente, tanto en magnitud, rapidez y distancias alcanzadas. La enfermedad se expresaría, en una primera etapa, fundamentalmente en montes jóvenes o en la reposición de plantas en montes adultos. Si nuestra hipótesis de que la enfermedad se está transmitiendo a partir de viveros centrales es correcta, este hecho implicaría que la bacteria ha logrado traspasar los sofisticados programas de limpieza y certificación de material planta ya indicados, los que son esencialmente similares en distintas regiones del mundo. Por lo tanto, la hipótesis de una distribución de la enfermedad mediante material planta proveniente de viveros centrales coloca bajo “sospecha” el o los programas de “certificación de plantas libres de HLB”. Recordemos que estos programas son la piedra fundamental en la que se apoya todo el manejo de la enfermedad, es decir la producción de plantas libres de HLB. Algunos hechos observados en América dan un ulterior soporte a esta teoría como ser: 1. La detección de la enfermedad en etapas tempranas de su dispersión en Bancos de Germoplasma activos tanto en Brasil como en EEUU (Sanicitrus, 2007; Florida Department of Agriculture of Consumer Services, 2007) 2. La temprana detección de la enfermedad en viveros en Miami (Gottwald et al. 2007) y en Nueva Orleans, en viveros certificados en Colima (Méjico) (Asoc.Tucum.de Cítricos, 2010) y en Belice (Williams et al. 2009) 3. Podemos sumar a este hecho la temprana detección de la enfermedad en la Universidad de West Indias en Jamaica (ProMED post 2009) o la temprana detección de la enfermedad en el Wangdue Research Center en Bhutan (Doe et al, 2003). 3.4 Eficiencia de dispersión de la bacteria y los programas de certificación. 3.4.1 Eficiencia de dispersión de la bacteria Como se dijo anteriormente, el agente causal del HLB no tiene la habilidad para vivir fuera de sus huéspedes, ni la capacidad de alcanzar por sí mismo los nuevos huéspedes que va a colonizar. También hemos visto la baja eficiencia del insecto vector, tanto por su baja movilidad como por el elevado número de individuos que se requieren para trasmitir la enfermedad en un corto período de tiempo. Estas características, unidas a los hechos observados en cuanto a su altísima eficiencia en la diseminación, están hablando de una excelente adaptación de este patógeno, a la “transmisión pasiva”, mediada por un organismo vector, planta o insecto. Comprender los mecanismos que determinan esta “transmisión pasiva”, permitirán entender los mecanismos de transmisión de la enfermedad. Algunos datos históricos permitirían entender el fenómeno. En Filipinas la enfermedad se disemina en todo el país a partir de viveros producidos en la provincia de Batangas en la década de 1960. Previo a este hecho, Altamirano afirma que se introduce en esta región material planta proveniente de China, China Nacionalista y la India. (Altamirano et al. 1977). Se debe suponer que este material introducido ya sea a través de yemas o plantas no mostraba 16 síntomas de la enfermedad. Algo similar podemos atribuir a la rápida dispersión de la enfermedad por todo el Sudeste Asiático a partir de 1940. La necesidad de nuevo germoplasma llevó a la colección de material promisorio “aparentemente sano” en algunas zonas productoras y su transporte a nuevas áreas. Este hecho observado en el pasado es el que explicaría la rápida difusión de la enfermedad por el Sudeste Asiático y la adaptación a la transmisión pasiva del agente causal. Ya Altamirano en Filipinas suponía que la capacidad de una planta de no expresar la enfermedad podría deberse a la baja concentración del patógeno en la planta (Altamirano et al. 1977). Es conocido, entre bacterias fitopatógenas, que luego de la infección existe un período de latencia durante el cual no se observan síntomas. En el proceso de establecimiento de la enfermedad se describe que, la conjunción de varios factores no totalmente conocidos aún, determinan la expresión de genes que inducen la manifestación de síntomas por parte del huésped. Dentro de estos factores se encuentra el título del patógeno en los tejidos, que es sensado por las células microbianas (fenómeno conocido como “quorum sensing”) que luego de superado un determinado umbral de su población, dispara los factores de patogenicidad que darán lugar a la manifestación de los síntomas característicos de la enfermedad (González y Keshavan, 2006). En el caso del HLB, el tiempo entre la trasmisión del patógeno por el vector y la aparición de los síntomas visuales depende de la época de infección, condiciones climáticas para la multiplicación de la bacteria, expresión de los síntomas, variedad y edad de la planta (Bassanezi, 2010). Esta multiplicación silenciosa de la bacteria explicaría la rápida difusión de la enfermedad a partir de material vegetal ocurrida en el pasado y, probablemente, también en el presente. El tiempo que la bacteria puede permanecer “silenciosa” es desconocido hasta el momento, pero datos de la Liuzhou Citrus Farm (LCF), en China, donde se realizó un seguimiento de la evolución de la enfermedad a partir, de material planta aparentemente infectado y con la presencia del insecto vector, señalan que un 80%, de las plantas estudiadas no mostraba síntomas de la enfermedad luego de 10 años de su instalación a pesar de que al segundo año la enfermedad ya estaba presente. (Figura 3)(Gottwald et al. 2007). En Brasil se estima que por cada planta sintomática, existen 2 a 5 plantas asintomáticas infectadas con HLB (Bassanezi, 2010). 3.4.2 Métodos de saneamiento y programas de certificación Los programas de saneamiento de material de propagación vegetal son aquellos en los que se aplican tratamientos terapéuticos que conducen a la producción de germoplasma libre de patógenos para su uso comercial a partir de fuentes nacionales o materiales provenientes de un programa de cuarentena Este último garantiza sanitariamente la introducción de germoplasma de áreas exóticas. Los programas de saneamiento aplican un conjunto de procedimientos basados en conocimientos biológicos que permiten suponer que el material que se recupera luego de realizar determinados procedimientos, está limpio de los patógenos que pudieran haber estado presentes en el material original. Las plantas evaluadas en los programas de cuarentena y en los programas de saneamiento brindan el material necesario para el programa de certificación. (Lee, 2009) En la década del ’70 se describió un método de multiplicación y saneamiento de plantas de cítricos que revolucionaría la producción de plantas y permitiría acelerar los procesos de 17 intercambio de germoplasma a nivel mundial (Navarro et al.1975). Se trata del microinjerto de ápices caulinares o “shoot tip grafting” (STG) y se desarrolló para la eliminación de virus, viroides y fitoplasmas patógenos de los tejidos cítricos. Esta técnica se basa conocimientos anatómicos y fisiológicos que determinan que en los meristemos apicales (tejidos no diferenciados en activa multiplicación) aún no se han formado los tejidos conductores ni sus precursores, lo que determina que los patógenos se encuentren ausentes en estos tejidos en rápido crecimiento. El tamaño de esta área presumiblemente libre de microorganismos y virus depende de la especie vegetal de que se trate, pero en citrus se habla de 0.1 a 0.2 mm. La técnica utilizada en citrus combina la micropropagación de plantas y la termoterapia ‐ sometiendo previamente los tejidos vegetales a temperaturas no permisivas al desarrollo de patógenos, lo que mejora las posibilidades de su eliminación del material infectado‐ y el injerto de pequeños trozos de meristemas de dichas plantas en plantines de portainjertos crecidos in vitro, provenientes de semillas de plantas libre de virosis. Esta metodología fue difundida por los científicos y patrocinada por organismos internacionales encargados de potenciar la producción de cítricos en distintas partes del mundo. Este conjunto de técnicas, unido a la aplicación de sofisticados métodos de detección y diagnóstico, fue y es aplicado en el marco de Programas de Certificación de plantas en las regiones de producción de cítricos más importantes a nivel mundial. Los programas de certificación aseguran la eliminación de patógenos del material de propagación producido. Los procedimientos utilizados para su obtención, basados en técnicas de micropropagación ‐como es el caso del microinjerto‐ y termoterapia, así como las técnicas de “indexaje” o análisis realizados para la detección de patógenos permiten certificar la calidad sanitaria de dicho material. Las autoridades sanitarias responsables, certifican que los “test” de detección no constataron la presencia de microorganismos responsables de enfermedades trasmitidas por el material vegetal. La base para evaluar la efectividad de un sistema de saneamiento reside en contar con métodos de detección sensibles y específicos para determinar el éxito de la limpieza realizada ya sea por el método de microinjerto, termoterapia o ambas juntas. Hoy se acepta que el microinjerto mediante la separación de tejido meristemático de brotes, e injertación sobre plantines de semilla crecidos “in vitro”, permite eliminar virus, viroides y fitoplasmas patógenos de los tejidos cítricos y que también se logra limpieza completa de cancro cítrico y HLB en plantas obtenidas por microinjerto (STG ‐ shoot tip grafting) de plantas infectadas. (Navarro et al 1989a; Jiang et al. 1987; Chen et al 1987) Por lo tanto cuando se habla de material planta certificado libre de HLB y se utiliza este concepto como cimiento de un programa de control de la enfermedad en material introducido a partir de otras regiones citrícolas, se está implícitamente hablando de un material que ha sido seleccionado en su lugar de origen y luego introducido sometiéndolo previamente a las técnicas de saneamiento e indexaje utilizando las más avanzadas técnicas de detección. La confianza en el programa de saneamiento es la base para sostener que un material de propagación certificado no acarreará problemas de introducción ni propagación de enfermedades. 18 ¿El microinjerto es un método verificado para la eliminación de HLB? La efectividad de la metodología descripta para la obtención de plantas libres de HLB, no ha sido– a la luz de los conocimientos actuales‐ debidamente verificada. La revisión realizada señala el trabajo realizado por Navarro et al 1989a como la única demostración publicada de la eliminación de Ca. Liberibacter de tejidos vegetales, por microinjerto. En este trabajo, la demostración está basada en la observación de las plantas obtenidas por microinjerto a partir de material infectado con HLB, y mantenidas en invernadero, por un período de 8 meses, como única forma de verificación (Navarro et al. 1989a). El solo hecho de obtener una planta por microinjerto no garantiza su saneamiento. En los últimos años se han publicado diversos trabajos que describen la detección de bacterias endófitas en tejidos meristemáticos de distintas especies vegetales. Estas bacterias frecuentemente se encuentran en estado de “no culturabilidad” y fue posible su detección gracias a técnicas moleculares que prescinden del cultivo “in vitro” de estos microorganismos y demuestran que los meristemas no son “ascépticos” y que pueden ser portadores de bacterias más allá de la formación o no de los tejidos vasculares. Estos hechos muestran que no es posible asegurar la ausencia de bacterias de los tejidos meristemáticos por una característica propia de los mismos. (Thomas et al. 2008; Norman y Alvarez, 1994). También se sabe que existen factores que afectan la eficiencia de la eliminación de los patógenos mediante el microinjerto, tales como el tamaño de meristema utilizado para realizar el microinjerto, el tipo de patógeno que se trata de eliminar y el estado de la planta, entre otros (Navarro, 1989b). Como todo hecho biológico, la eliminación de patógenos nunca tiene eficiencia total pues depende de muchos factores. Por lo tanto el resultado de un método de saneamiento no tiene valor si no es analizado posteriormente por la posible presencia de los patógenos que pudieran estar presentes aún. De ahí que todo programa de limpieza de material de propagación tiene un extenso y cuidadoso proceso de “indexing”, por métodos biológicos, serológicos, moleculares, bioquímicos, etc. La utilidad de estas técnicas va a depender de la sensibilidad y especificidad que posean, que a su vez están determinadas por las características del patógeno a detectar. En el caso de Candidatus Liberibacter la información existente hasta la fecha constata que se trata de una bacteria vascular con baja concentración en los tejidos vegetales, sensible a la temperatura que afecta su concentración en planta, con una distribución irregular en la planta y con un período de latencia (con presencia pero sin manifestación de síntomas), que resulta largo y variable. Análisis de tejidos vegetales realizados en San Pablo en plantas con síntomas detectaron la presencia del patógeno en muestras provenientes de ramas sintomáticas, mientras que ramas asintomáticas de la misma planta, arrojaron resultados negativos (Bové, 2006a). Tales características limitan la efectividad de los métodos de detección de HLB disponibles y dificultan comprobar si la planta obtenida por microinjerto está libre de Ca. Liberibacter. La técnica más sensible utilizada actualmente es el PCR (Polymerase Chain Reaction) en tiempo real o RT‐qPCR. La PCR posee alta sensibilidad y especificidad, permite la detección e identificación del patógeno tanto en plantas cítricas como también en los insectos infectados y es capaz de discriminar entre las distintas variantes de Ca. Liberibacter conocidas (africano, asiático y americano). Un aporte importante de esta técnica ha sido la posibilidad de detectar Ca. Liberibacter en insectos vectores. Sin embargo, la interpretación de los resultados de PCR es compleja (Manjunath et al. 2008). La aplicación de esta técnica en tejidos infectados ha 19 arrojado resultados contradictorios: en material sintomático, los resultados positivos tienen alta correlación con la presencia de síntomas, sin embargo tejidos que han desarrollado algunos síntomas extremos (como el amarillamiento de todo el brote) no siempre han arrojado resultados positivos por PCR. Por otra parte tejido asintomático extraído de plantas sintomáticas da, con alta frecuencia, resultados negativos. Por lo tanto un resultado negativo por PCR no garantiza la ausencia del patógeno en el tejido analizado. Al contrario, un resultado positivo confirma la presencia del patógeno en ese tejido. Así, el PCR es mejor para confirmar el diagnóstico visual que para diagnosticar (Manjunath et al. 2008). Otro factor que atenta contra la seguridad que nos brindan los materiales certificados respecto al HLB, es que la posibilidad de trasmisión del patógeno a través de la semilla no ha sido descartada (Shokrollah et al. 2009) Conclusión: los métodos disponibles actualmente para la detección confiable de la bacteria responsable del HLB requieren de la manifestación de síntomas en los tejidos analizados. Y no permiten verificar el saneamiento obtenido a través del mircroinjerto. De manera que, más allá de la confianza en las técnicas de eliminación de patógenos de los tejidos, hoy no existe un procedimiento que asegure que una planta joven está libre de HLB. Es de señalar que la duda sobre la eficacia del microinjerto en la eliminación del HLB ya está fuertemente planteada, en algunos centros de investigación de los EEUU, como es el caso del Agricultural Research Service del USDA en Riverside, California. En ese centro, se encuentra en desarrollo un proyecto de investigación dirigido por el Dr. Richard Lee, cuyo objetivo es “determinar si la termoterapia y el microinjerto eliminan el HLB de las yemas”, entre otros. (Research Project: Huanglongbing: Development of Information Needed for Avoidance/ management, ‐Project Number: 5310‐21000‐009‐03 5310‐21000‐009‐03‐, Dr Richard Lee) El primer reporte de resultados parciales conocido, afirma que, en experimentos en cooperación con Fundecitrus, Brasil, se determinó que “El porcentaje de yemas obtenidos por estos métodos, que son aparentemente libres de HLB varía con la variedad que se evalúe” (2009 Annual Report) Si se acepta que el saneamiento y la certificación correspondiente no garantizan que el material planta esté saneado, se debería: Modificar completamente la forma de encarar el riesgo de ingreso de HLB a Uruguay y Argentina, centrando el principal riesgo de introducción de la enfermedad no en el insecto vector sino en el material de propagación Si la nueva hipótesis planteada es correcta, las medidas de prevención que hasta ahora vienen tomando los países que intentan evitar la infección del HLB a su citricultura son erróneas pues se han centrado en evitar la dispersión del insecto vector. Y si es así, que la principal diseminación en el pasado reciente habría sido a partir de germoplasma de viveros centrales, ese material se estaría actualmente distribuyendo en las principales áreas citrícolas del mundo como EE. UU. y Brasil, impidiendo detener el avance de la enfermedad en estas regiones. Pero la aceptación de una hipótesis diferente, permitiría identificar medidas preventivas que no se han manejado hasta el momento. El eje de este Informe sostiene que el ingreso de la enfermedad HLB a Uruguay y Argentina no es un hecho inevitable. Las ventajas económicas que resultarían de evitar el ingreso del HLB a la subregión son el fundamento de las recomendaciones que siguen. 20 4. Recomendaciones para evitar el ingreso del HLB Se considera un enorme capital para la citricultura regional mantenerse libre de la presencia de HLB en un momento de fuerte expansión de la enfermedad en todo el mundo y fundamentalmente en América. Estaríamos por lo tanto frente a una fuerte amenaza de ingreso de la enfermedad a la región y frente a una enorme oportunidad si evitamos su presencia. De acuerdo a nuestro análisis, si ingresa la enfermedad en la región, de la misma forma en que lo está haciendo en otros países de América, lo va a hacer a través de material vegetal introducido a partir de viveros centrales. Serían pues, en estos puntos a los que deben ir destinados los mayores esfuerzos en un trabajo de prevención. Debido a lo anterior, la estrategia que se propone, se centra en la vigilancia y manejo del material de propagación. Si bien hay muchos aspectos de la biología y epidemiología de la enfermedad que desconocemos, existen elementos suficientes para instrumentar un adecuado programa de prevención. Este programa debería de basarse en las siguientes afirmaciones: i. Podemos asegurar que está libre de HLB un banco de germoplasma que: a) está difundiendo plantas al medio donde existe Diaphorina citri, por lo menos desde hace 5 o 6 años atrás, sin que se hayan observado síntomas de la enfermedad b) que no ha introducido nuevo germoplasma en los últimos 8 años (ésta es la situación, por ejemplo, de dos importantes bancos de germoplasma existentes tanto en el Litoral Argentino como en Uruguay). ii. Si la reposición de plantas se hace a partir de este tipo de bancos de germoplasma y solamente de ellos, la enfermedad no entraría en la región a través del material vegetal. iii. Difícilmente la enfermedad sería introducida por un insecto aislado debido a su poca movilidad. iv. Sin embargo, sí es probable que ingrese el HLB en germoplasma nuevo producido con las mismas técnicas de saneamiento que, según nuestra hipótesis, han fallado en otras regiones del mundo. v. Aunque no existen técnicas que aseguren la no presencia de Ca. Liberibacter en un plazo menor de un año, sí existirían procedimientos que permitirían determinarlo en material introducido en un período de 3 a 4 años. Con los elementos expuestos es posible identificar medidas básicas de prevención de entrada de la enfermedad. 21 Estas medidas son válidas y tendrán éxito si participan en su discusión e implementación todos los involucrados en la cadena productiva: viveristas, productores, técnicos, organismos de sanidad oficiales y centros de investigación. MEDIDAS DE PREVENCIÓN RECOMENDADAS 1º Mantener el “blindaje” de los bancos de germoplasma actuales Podemos citar a estos efectos el Banco de Germoplasma del Alambrado en Concordia, Entre Ríos y el Banco de Germoplasma creado por la Dirección General de Servicios Agrícolas del Ministerio de Agricultura y Pesca de Uruguay, en este momento bajo la órbita del Instituto Nacional de Semillas. Estos bancos contienen un valiosísimo material que podríamos asegurar que no tiene HLB ya que, material proveniente de ellos, fue distribuido en ambas zonas en los últimos 8 años sin mostrar evidencias de la enfermedad. Estos bancos podrían cubrir todas las necesidades de reposición de material planta de los montes en producción que abarcan 77 mil hectáreas en el NEA y 16 mil hectáreas en Uruguay. La preservación del germoplasma actual se puede hacer a través de los organismos oficiales ‐si los mismos están de acuerdo en no introducir nuevos materiales en ese banco de germoplasma‐ o preservarlo a partir de agrupaciones de productores privados. 2º Crear viveros con material exclusivo de los citados bancos de germoplasma Estos viveros deben crearse, o mantenerse, sin incorporar ningún material recientemente introducido. Para ello se deberían cumplir varios pasos: a) Para asegurar el abastecimiento con este material, relevar las necesidades de plantas que en los próximos 5 o 6 años, requerirá la producción para reposiciones y nuevas plantaciones. b) Acordar convenios con el sector viverista para producir ese número de plantas en viveros que no introduzcan otros materiales y tengan las condiciones de aislamiento que exige esta enfermedad. 3º Introducción de nuevo germoplasma La introducción de nuevo germoplasma, es una necesidad de la industria citrícola para adaptarse a la cambiante demanda de los mercados, pero también es la vía más factible de introducción de la enfermedad. Tratando de conjugar estos dos principios opuestos, como son la necesidad de introducción de material y el peligro de contaminación asociado a la misma, se sugiere el uso de un paquete de medidas que minimicen el riesgo de introducir la enfermedad. a) Reducir al mínimo el número de materiales a introducir y el lugar de origen de esos materiales, requiriéndolos siempre y en toda situación, desde regiones donde no exista la enfermedad. b) Someter el material introducido a un adecuado programa de cuarentena instrumentado especialmente para HLB, que comprendería: I. Realizar sobre estos materiales todas las pruebas posibles de detección temprana. Sabemos que la enfermedad se detecta antes en el insecto transmisor que en la propia 22 planta, actuando el mismo como un “PCR biológico” (Manjunath et al., 2008). Por lo tanto se debería extraer un número importante de plantas de esos viveros y llevarlas a una zona aislada bajo malla, liberando sobre estas plantas una alta población de D. citri, evaluando periódicamente la presencia o ausencia del Ca. Liberibacter en los insectos. Simultáneamente se deberían testar directamente las plantas por PCR. II. Someter a las plantas a condiciones que permitan la multiplicación de la bacteria dentro del tejido vegetal, tales como temperatura, humedad, etc. de forma de multiplicar su título y permitir su detección por las técnicas disponibles. III. Aplicar las técnicas de detección, de mayor sensibilidad, sobre la planta y el insecto. IV. Mantener las plantas en estas condiciones de cuarentena por un período de 3 a 4 años. c) Los viveros instalados para la multiplicación y posterior producción comercial de estos materiales deberán estar aislados de la zona de producción y de los materiales de propagación “blindados”. d) Las nuevas plantaciones realizadas con este material deberían, de la misma forma, realizarse en zonas aisladas de las zonas productivas actuales, a una distancia prudencial, de por lo menos 10 km. e) En ningún caso realizar con estos materiales cambios de copa o plantaciones nuevas en montes en producción. No aplicar insecticidas en estas plantaciones y testar periódicamente adultos y ninfas de D. citri para detectar la presencia de Ca. Liberibacter. Se debe además, realizar test en plantas y observaciones visuales permanentes por el posible desarrollo de síntomas en la plantación. f) Al cuarto año de no observar síntomas en plantas de campo aisladas, y con todos los tests anteriormente mencionados, se podrán liberar variedades para su utilización con menores restricciones. g) Se deberían concentrar y privilegiar la mayor cantidad de medidas de vigilancia sobre este material a través de un monitoreo continuo con las más eficientes técnicas de detección. 4º Implementar un estricto sistema de trazabilidad Se debería llevar un estricto registro de viveros y del origen del material planta que los mismos utilizan, así como de su distribución en los diversos lugares de plantación. De esta forma, si se detecta HLB en los montes de producción, se podría recurrir a los registros de los 3 o 4 años anteriores e identificar el vivero a partir del cual se introdujo el material planta, como forma de eliminar el foco. 5º Implementar un sistema de monitoreo sensible a HLB Se debe implementar un sistema de monitoreo sobre toda el área citrícola, aplicando las técnicas de detección más sensibles. Esta estrategia debe ser precedida de un análisis de puntos de riesgo de introducción de la enfermedad dando prioridad a: viveros en general, a viveros próximos a zonas de frontera en particular, plantaciones próximas a zonas de frontera y plantaciones donde se haya introducido material proveniente del exterior, en los últimos años. La información recabada a partir de este monitoreo debería ser georeferenciada y dada a conocer periódicamente por las autoridades fitosanitarias. 23 Se debe sumar a este hecho la formación de productores y operarios de campo en la correcta detección de síntomas a los efectos de universalizar el monitoreo por sintomatología. 6º Promover la investigación en los temas de detección precoz Ello implicaría la realización de convenios con países donde se encuentra presente la enfermedad y trabajar con los mismos en tres ejes temáticos. 1. Desarrollo de técnicas de detección con mayor sensibilidad 2. Estudiar las condiciones que promuevan el título de la bacteria en los tejidos. 3. Desarrollo de marcadores de la enfermedad expresados por la planta. 7º Promover la capacitación de personal nacional para la realización de este programa El trabajo de monitoreo en las distintas etapas requerirá el entrenamiento de personal, público y privado en la identificación de síntomas. A nivel de laboratorio, será necesario capacitar personal tanto en las técnicas de laboratorio para la detección del patógeno en distintos tejidos, así como en la cría artificial de D. citri. Disponiendo de estos conocimientos se podría acelerar la introducción de nuevo material sin correr gravísimos riesgos. 8º Monitoreo de Diaphorina citri a nivel regional Se debe de continuar con el relevamiento de Diaphorina citri, a nivel de ambas regiones, determinando poblaciones de insecto en las distintas zonas, variación de poblaciones entre predios y dentro de predios, variedades más susceptibles al ataque del insecto, nivel de parasitismo encontrado, etc. 9º Acciones que NO se deben realizar. RESUMEN 1. NO Introducir nuevo material vegetal de diferentes áreas (aún libres de la enfermedad) sin pasar por los pasos descriptos anteriormente, confiando que la región de origen está libre de HLB y que los métodos de saneamiento garantizan su eliminación. 2. NO Mezclar este material con material de viveros comerciales que distribuyen material “blindado”. 3. NO Utilizar el nuevo material introducido para replantar montes ya instalados o realizar cambios de copa con ellos. 24 BIBLIOGRFÍA CITADA Altamirano, D.M., Gonzales, C.I., Viñas, R.C. 1977 Analysis of the Devastation of Leaf‐Mottling (Greening) Disease of Citrus and Its Control Program in the Philippines. Proc. 7th IOCV Conference, www.ivia.es/iocv/archivos/proceedingsVII/7th022_026.pdf Asociación Tucumana del Citrus. 2010. Méjico los viveristas sufren el HLB www.atcitrus.com/noticia.asp?seccion=noticias&id=2078 Ayres, J., 2010. Situación actual del HLB en la provincia de San Pablo. 2do Seminario Internacional sobre HLB, Mérida, Méjico Bassanezi R. B. 2010. Epidemiología del HLB y sus implicaciones para el manejo de la enfermedad. 2do Seminario Internacional sobre HLB, Mérida, Méjico Belasque, Jr, J., Bergamin Fh, A., Bassanezi R. 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