Sensor de pH mediante onda evanescente

Sensor de pH mediante onda evanescente Capítulo 3 Sensor de pH mediante onda evanescente 38 Sensor de pH mediante onda evanescente 3.1 Introducción En el capítulo anterior se ha fijado la línea de investigación a seguir, apuntándose a los sensores de pH mediante fibra óptica como los más apropiados para la problemática del presente estudio. A continuación se describe el fenómeno gracias al que se puede utilizar la fibra óptica como un sensor de pH. Primero se introducirá el fenómeno físico de las ondas evanescentes y después se describirán algunos trabajos previos que utilizan esta técnica. 3.2 Fundamento teórico 3.2.1 Breve introducción a las ondas electromagnéticas La luz es una onda electromagnética y por tanto está formada por un campo eléctrico y un campo magnético ortogonales entre sí y ortogonales también a la dirección de propagación. La descripción formal del comportamiento de las ondas electromagnéticas en el interior de una fibra se deduce a partir de las ecuaciones de Maxwell y es bastante compleja, sin embargo para este proyecto basta la comprensión de ciertos conceptos básicos y simplificados ya que el fenómeno en el que se basa la medida de pH es bastante intuitivo. Para un análisis detallado se recomienda leer [Janer]. Puede simplificarse el estudio de las ondas electromagnéticas mediante las ondas monocromáticas o armónicas, ya que es posible analizar las propiedades físicas generales de las ondas electromagnéticas usando una combinación lineal de ondas de una sola frecuencia u ondas monocromáticas. Esto es debido a que cualquier función de cuadrado integrable es representable mediante una integral de Fourier tal que: ,
39 Sensor de pH mediante onda evanescente o una serie de Fourier si la función es periódica. Como se observa, esta representación es una superposición de funciones armónicas. De este modo una onda que viaja en dirección puede escribirse de la siguiente forma: cos
, sin
donde es la amplitud y frecuencia un ángulo de fase. Estas son funciones de una única /2 . Se define el número de onda en función de la longitud de onda . Estas son funciones de onda periódicas, con periodo . La expresión anterior representa una onda monocromática propagándose en dirección (signo negativo de la fórmula) o – (signo positivo). Es común utilizar la representación fasorial de las ondas armónicas: |
cos
|
donde se ha usado el complejo . Vector de onda La expresión fasorial de la onda monocromática: ,
representa una onda plana monocromática progresiva que se propaga según . Sin embargo, en muchas ocasiones es necesario describir la propagación de una onda plana en una dirección cualquiera del espacio . Para ello se usa el vector de onda o vector de propagación : ,
, con 40 Sensor de pH mediante onda evanescente donde el empleo de letra negrita se usa para representar una magnitud vectorial. La dirección y sentido del vector son los de la propagación y su módulo es . Una onda monocromática plana que se propaga según el vector de onda tiene campos eléctrico y magnético transversales a la dirección de [UBA]. Para más detalles sobre la formulación matemática de las ondas monocromáticas puede consultarse [Page]. 3.2.2 Estructura de una fibra óptica La fibra óptica permite guiar longitudinalmente los pulsos luminosos, evitando que su energía se disperse. El guiado de la luz se consigue gracias a que en las cercanías del eje de la fibra hay una región cilíndrica, donde el índice de refracción (
) es más elevado: esta zona de la fibra se denomina núcleo (core). El resto recibe el nombre de recubrimiento o corteza (clad), donde el índice de refracción menor que el del núcleo ( es ). Para proteger el conjunto se envuelve con un material plástico llamado revestimiento (jacket). Figura 3: Guiado de rayos [Baldini, 1997] Figura 4: Óptica ondulatoria [Baldini, 1997] Los rayos que viajan a través de la fibra e inciden en la interfaz núcleo‐corteza con un ángulo determinado son guiados por el interior del núcleo gracias a la reflexión total interna (figura 3). En términos de onda ondulatoria, el campo 41 Sensor de pH mediante onda evanescente electromagnético que se propaga forma una onda estacionaria en la zona del núcleo y decae exponencialmente (campo evanescente) en la corteza. En la figura 4 se representa el campo evanescente, la magnitud es la distancia desde la interfaz en la que la amplitud del campo se reduce en un factor 1 con respecto al valor en la interfaz núcleo‐corteza [Baldini, 1997]. Las fibras ópticas se pueden clasificar en dos grandes familias en función del número de modos de propagación que pueden existir en su interior. Un modo es una distribución transversalmente estacionaria y longitudinalmente progresiva del campo electromagnético, además la densidad de energía debe tender a cero a medida que nos alejamos del eje de la fibra. Se pueden clasificar por tanto en fibras multimodo (las que permiten la propagación de varios modos) o fibras monomodo (sólo permiten la existencia de un modo de propagación). Existen tres estructuras de fibra básicas: la fibra multimodo a salto de índice (MM: Multi­Mode), la fibra multimodo a gradiente de índice (GI: Graded­Index) y la fibra monomodo estándar (SM: Single­Mode). Las fibras multimodo tienen un núcleo de diámetro grande y una diferencia relativamente importante entre los índices de núcleo y corteza. Por el contrario, la fibra monomodo estándar tiene un núcleo de diámetro pequeño y la diferencia entre los índices de núcleo y corteza es mucho menor que en las multimodo. De esta manera se consigue que, a la longitud de onda de trabajo, exista un único modo guiado2. En fibras de gradiente de índice el índice de refracción va disminuyendo gradualmente (en lugar de con un salto brusco) desde el valor del núcleo hasta el de la corteza [Janer]. La estructura de fibra en la que se basa la técnica de medida que se describirá en un apartado posterior es la de salto de índice. Se utiliza preferentemente fibra monomodo para evitar la dispersión intermodal. 2 El hecho de que la fibra se comporte como monomodo o multimodo en función de la longitud de onda de trabajo será analizado en el apartado de simulación. 42 Sensor de pH mediante onda evanescente 3.2.3 Ondas evanescentes Las ondas evanescentes se forman cuando una onda sinusoidal es reflejada al incidir en una interfaz con un ángulo mayor que el ángulo crítico (medido respecto de la normal), de manera que se produce reflexión total interna. La onda evanescente es la que, aún así, se propaga al otro lado de la interfaz, es decir, se trata de energía trasmitida. Figura 5: Generación de la onda evanescente [Olympus] Haciendo la aproximación de óptica geométrica, que solo es válida si las dimensiones transversales de la fibra son mucho mayores que la longitud de onda de la luz3, la expresión del ángulo crítico es: sin
ú
donde ú
es el ángulo crítico, es el índice de refracción de la corteza y es el índice de refracción del núcleo. 3 El diámetro de núcleo de una fibra multimodo a salto de índice es del orden de 50 µm y una longitud de onda de trabajo típica sería del orden de 1,3 µm. En estas condiciones la aproximación de la óptica geométrica estaría justificada. 43 Sensor de pH mediante onda evanescente En el marco del electromagnetismo, la explicación física de la existencia de la onda o campo evanescente es que los campos eléctrico y magnético no pueden ser discontinuos en la frontera de separación entre dos medios, como sería el caso si no hubiese campo evanescente. En mecánica cuántica, la explicación física es análoga, la función de onda ;
que representa el movimiento de una partícula perpendicular a la frontera no puede ser discontinua en dicha frontera. Cuando el ángulo que forma la onda incidente con la normal a la superficie de separación es menor que el ángulo crítico, no se produce reflexión y la onda pasará al otro lado de la interfaz. Esta onda se pierde puesto que no es guiada por el interior de la fibra y no es la llamada onda evanescente. La onda evanescente es, por tanto, la que se pierde en la corteza cuando la onda de señal es guiada por el interior de la fibra. Cambios en la onda evanescente debidos al valor de pH del medio (como se explicará en un apartado posterior) tienen una influencia en las propiedades ópticas de la onda guiada, que es la que podemos medir. Esta onda será tanto más intensa cuanto más perpendicular4 sea el ángulo de incidencia en la interfaz, siempre y cuando sea superior al ángulo crítico (para poder hablar de onda evanescente). «Evanescente» quiere decir que «tiende a desaparecer», lleva este nombre porque su amplitud decae exponencialmente con la distancia a la interfaz en la que se ha formado; este decaimiento se observa matemáticamente en que al menos una componente del vector de onda k se hace imaginaria o compleja cuando la onda se propaga al otro lado de la interfaz. En el caso de una fibra óptica, el índice de refracción de la corteza es inferior al del núcleo. Cuando la luz experimenta reflexión total interna en la interfaz núcleo‐
corteza, parte de la energía penetra en la corteza hasta cierta profundidad. El flujo 4 Un rayo que incide perpendicularmente en la interfaz equivale a un ángulo de incidencia de 0° respecto a la normal 44 Sensor de pH mediante onda evanescente de energía de una onda evanescente es paralelo a la superficie del núcleo y en la misma dirección que la energía que viaja por el interior del núcleo [ISP] [Olympus]. 3.3 Medida del pH por absorción de onda evanescente (in vitro) En los últimos años varios autores [Gupta, 1997] [Gupta, 1998] [Beltrán‐Pérez] han descrito un procedimiento para medir el valor de pH de un líquido valiéndose de las ondas evanescentes. La técnica consiste en modificar una fibra convencional, desprendiendo la corteza y dejando así el núcleo al descubierto, sobre este se deposita una pasta vítrea dopada con un material (colorante o indicador) cuyas características de absorción varían en función del valor de pH del medio en el que se encuentra inmersa la fibra. Cuando la luz viaja por la fibra y atraviesa el segmento modificado, el campo evanescente no se atenúa de la misma forma que lo haría en una fibra sin modificar y de este modo, en el extremo final se pueden medir caídas relativas de potencia que permiten discernir el nivel de pH del líquido de interés. Por tanto, con esta técnica, la fibra es la guía de luz pero también es, al mismo tiempo, el propio sensor (esto es lo que se conoce como sensor intrínseco, en contraposición a los sensores extrínsecos en los que la fibra hace de guía de luz únicamente, valiéndose de un transductor acoplado para medir el parámetro de interés [Martin]). La fibra a la que se le ha desprendido parte de la corteza se denomina fibra tipo D. También se podría trabajar con una fibra sin modificar, simplemente depositando el colorante alrededor de la corteza. Figura 6: Fibra tipo D 45 Sensor de pH mediante onda evanescente El siguiente esquema muestra la sencillez de este procedimiento de medida. La fibra atraviesa la cubeta quedando la parte modificada bañada por el líquido cuyo pH se desea medir. Figura 7: Montaje para la medida del nivel de pH del líquido Es de remarcar que esa masa vítrea, que alberga el colorante en su seno, deberá hacer la función de corteza y por tanto su índice de refracción final debe ser menor que el del núcleo. Para inmovilizar el colorante se emplean diferentes técnicas como el empleo de vidrios de poro controlado (CPGs: Controlled Pore Glasses) o la técnica Sol‐Gel. Se describen estas técnicas de deposición en un apartado posterior. Existen diferentes indicadores bien estudiados, cada uno de los cuales tiene un rango dinámico de pH distinto, es decir el rango para el que se pueden detectar variaciones de absorbancia en el indicador, analizando la onda de salida en el fotodetector. En el trabajo de B. D. Gupta et al. [Gupta, 1997] se apunta que estos rangos dinámicos se han visto incrementados al inmovilizar los indicadores en la solución vítrea fabricada mediante el procedimiento Sol‐Gel, respecto a los valores teóricos (indicador disuelto en agua). La siguiente tabla muestra estos valores hallados experimentalmente en las condiciones descritas en su trabajo. 46 Sensor de pH mediante onda evanescente Indicador Phenol red
Cresol red Bromophenol blue Rango de pH 7,5 – 11,5 6,5 – 11 4 – 7,5 Tabla 2: Indicadores usados en el trabajo de Gupta et al. [Gupta, 1997] Por otra parte, en el trabajo de G. Beltrán‐Pérez et al. [Beltrán‐Pérez] se utilizan otros indicadores menos conocidos pero de un coste inferior. Además la forma de preparar la pasta vítrea difiere de la anterior (básicamente en la utilización de TiO2 como precursor en lugar de SiO2). La siguiente tabla muestra los diferentes rangos de pH hallados experimentalmente en las condiciones descritas en su trabajo. Indicador Brilliant green
Rhodamine 6G Rhodamine B Coumarin Rango de pH 5,5 – 6,5 6,5 – 11 10 – 12 2 – 5,5 Tabla 3: Indicadores usados en el trabajo de Beltrán­Pérez et al. [Beltrán­Pérez] La potencia recibida en el fotodetector depende del pH del líquido en el que se sumerge la fibra puesto que modifica la absorbancia del colorante, pero también depende de la longitud de onda de la luz que viaja por la fibra. La figura 8, que ha sido extraída del trabajo de Beltrán‐Pérez et al. [Beltrán‐Pérez], muestra como las variaciones de absorbancia en función del pH son más acusadas para una longitud de onda determinada. Esto equivale a una mayor o menor sensibilidad del sensor en función de la frecuencia de trabajo. Evidentemente se debe trabajar en la frecuencia que coincide con el pico de la gráfica. 47 Sensor de pH mediante onda evanescente Figura 8: Espectro de absorción para el indicador coumarin [Beltrán­Pérez] El indicador ha sido fijado mediante la técnica Sol­Gel y utilizando TiO2 como precursor. Resultado de la experimentación de Beltrán­Pérez et al. En los dos trabajos citados se describen varios sensores diferentes, uno por colorante, cada uno puede medir variaciones de pH en un rango determinado. Ante la limitación que esto supone, B. D. Gupta et al. [Gupta, 1998] describe un sensor de pH de gran rango utilizando una mezcla de tres colorantes e inmovilizándola también mediante la técnica Sol‐Gel. Gracias a esta mejora se consigue un rango dinámico de pH de 4,5 a 13. Se muestra en la siguiente figura la relación, obtenida experimentalmente en este trabajo, entre potencia recibida en el fotodetector y valor de pH del líquido en el que se sumerge la fibra. 48 Sensor de pH mediante onda evanescente Figura 9: Potencia recibida frente a pH [Gupta, 1998] Resultado del trabajo de Gupta et al. Este último método que consiste en mezclar varios indicadores, conlleva algunos inconvenientes que se describen en el apartado 4.3.1. 3.4 Construcción del terminal sensible Nota: Este apartado (con sus subapartados) se basa casi exclusivamente en la tesis doctoral de Nelia Bustamante Álvarez [Bustamante], en concreto en el apartado: “2.5 Construcción del terminal sensible”. 3.4.1 Indicadores ópticos La elección de un reactivo adecuado para la construcción de un optodo depende, fundamentalmente, del analito y del método óptico de medida. En la actualidad, existe un gran número de compuestos químicos comerciales cuyas propiedades ópticas se ven modificadas en función del medio o especie al que se ven expuestos. Sin embargo, no siempre se encuentran disponibles las moléculas apropiadas para la sustancia que se pretende determinar, por lo que se recurre al diseño y síntesis 49 Sensor de pH mediante onda evanescente de nuevas estructuras. Esta opción, aun siendo más compleja, permite desarrollar indicadores a la medida del sensor que se va a fabricar. Los requisitos que debe reunir un indicador que forme parte de un optodo basado en absorción son: Propiedades ópticas (espectro de absorción) sensible a la presencia del analito y compatibles tanto con la fuente de excitación como con el detector. Estabilidad química y fotoquímica, que evite su degradación tras largos tiempos de exposición del sensor a fuentes de luz intensas, aumentando la vida operativa útil del optodo. Biocompatibilidad. Debe cumplir todos los estándares y normas internacionales que se imponen a los materiales destinados al uso médico como la norma ISO 10993 [Medisil] o la norma IEC 60601 [MedEco] entre otras. Sencillo de obtener. Debe ser comercial o, en su defecto, fácilmente obtenible a través de sencillos pasos de síntesis y purificación, a precios asequibles. Un elevado coste del indicador exigiría una mayor durabilidad para poder competir con el resto de sistemas de medida, mientras que la construcción de terminales sensibles económicos permitiría su uso desechable. Facilidad de fijación. Debe poseer en su estructura química algún grupo funcional que permita el anclado del compuesto a un soporte adecuado, o bien ser fácilmente modificable para estos fines, sin que ello conlleve una pérdida de sensibilidad hacia el analito. 50 Sensor de pH mediante onda evanescente 3.4.2 Técnicas de deposición del indicador Una vez seleccionado el indicador óptico más adecuado para la fabricación del optodo, es necesario inmovilizarlo en torno al núcleo de la fibra para que la onda evanescente interactúe con él, constituyendo así la denominada fase sensible. El material debe encontrarse inmerso en una pasta ópticamente transparente que permita el fácil acceso de la especie objetivo hasta el indicador. Esta pasta debe, idealmente, ser permeable al analito e impermeables al resto de sustancias que puedan actuar como interferentes, siendo responsables, en la mayoría de los casos, de la selectividad del sensor y de su tiempo de respuesta. Asimismo, el material utilizado para fijar el indicador es el encargado de evitar el lavado o arrastre del mismo cuando la fase sensible se sumerge en la muestra. Existen técnicas de inmovilización covalente o por deposición de una fina capa de polímero inmovilizador (spin o dip coating), en cualquier caso hay que tener en cuenta la biocompatibilidad de los materiales. El proceso de inmovilización del indicador en una matriz sólida conlleva, en ocasiones, algún cambio en las propiedades ópticas del compuesto. De forma general, los métodos de inmovilización se clasifican en dos grandes grupos: Físicos: Son, en principio, reversibles. Mantienen unido el soporte al indicador a través de fuerzas electrostáticas, de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas, etc. Químicos: Este tipo de unión soporte‐indicador es la más idónea para la construcción de optodos, ya que evita el lavado de la sonda al sumergir el terminal sensible en la muestra. Sin embargo, los reactivos y las matrices poliméricas no siempre poseen en su estructura grupos funcionales que faciliten este tipo de enlace. En la bibliografía sobre el tema pueden encontrarse numerosas opciones para la inmovilización del indicador, como son: 51 Sensor de pH mediante onda evanescente 
Polímeros de condensación derivados del ácido silícico 
Siliconas 
Polímeros orgánicos lineales 
Intercambiadores iónicos 
Matrices poliméricas hidrofílicas Sin embargo, en este documento sólo se va a describir la primera opción (polímeros de condensación derivados del ácido silícico) puesto que a este grupo pertenecen las técnicas basadas en Sol‐Gel y en vidrios de poro controlado, que han sido ya nombradas en apartados anteriores, y que se han utilizado ampliamente para la construcción de sensores de pH mediante fibra óptica. En concreto es la técnica Sol‐Gel la que parece tener, a priori, mejores prestaciones para el sensor por campo evanescente por su relativa facilidad de implementación. Para más información sobre las otras técnicas de inmovilización puede consultarse [Bustamante]. 3.4.2.1 Vidrios de poro controlado (CPG) El empleo de vidrio de poro controlado (CPG: Controlled Pore Glass), comercializado en forma de fino polvo, aumenta considerablemente la superficie de contacto con el indicador, proporcionando al mismo tiempo un control sobre la selectividad del sensor derivado de la elección del tamaño de poro. El carácter inerte y la gran estabilidad mecánica de este tipo de soportes son dos factores muy apreciados. La naturaleza particulada del CPG, sin embargo, impide la exposición directa del indicador soportado al analito cuando éste se encuentra en disolución, siendo necesario el empleo de membranas permeables que envuelvan al soporte facilitando el acceso del analito hasta el indicador, pero evitando que la muestra arrastre las partículas de CPG. En algunos casos, la presencia de estas membranas en el terminal sensible aumenta el tiempo de respuesta del sensor, por lo que se recurre a la utilización de vidrio laminado, cuyo mayor inconveniente es su fragilidad. 52 Sensor de pH mediante onda evanescente 3.4.2.2 Técnica Sol­Gel Uno de los soportes más populares para la construcción de optodos de los últimos años es el denominado Sol‐Gel. Estos vidrios porosos de sílice, obtenidos a partir de la hidrólisis y posterior condensación de tetraalcoxisilanos (Si(OR)4) en disoluciones hidroalcohólicas, permiten el atrapamiento en su interior de moléculas indicadoras. De modo esquemático, el proceso de formación de un material Sol‐Gel es el siguiente: ‐ ‐
La primera reacción representa la hidrólisis y la segunda la condensación. Tanto el proceso de hidrólisis como el de condensación pueden llevarse a cabo a través de sustituciones nucleófilas bimoleculares catalizadas por un medio ácido o básico. En medio ácido la hidrólisis es más lenta, originando cadenas lineales ocasionalmente entrecruzadas mientras que, mediante catálisis básica donde la hidrólisis es rápida, se forman entramados de sílice. En ambos casos, la interconexión de enlaces Si‐O‐Si forma partículas coloidales (sol), que con el tiempo dan lugar a redes tridimensionales, aumentando la viscosidad de la disolución (gel). Cuando el proceso Sol‐Gel acaba, se produce la eliminación del disolvente por evaporación (xerogeles) o evacuación supercrítica (aerogeles). Los materiales Sol‐Gel tienen tendencia a romperse durante las primeras etapas de formación, debido a las tensiones originadas en la interfase sólido‐líquido. Esto puede evitarse, en cierta medida, añadiendo agentes químicos que modifiquen la tensión superficial del líquido. Por otro lado, el tamaño final de poro depende de la temperatura durante el proceso de formación del Sol‐Gel. Así, si esta es muy elevada se obtienen vidrios no porosos, mientras que si se realiza a temperatura ambiente el tamaño de poro aumenta. 53 Sensor de pH mediante onda evanescente El gran inconveniente que presentan estos sistemas es que la formación del Sol‐Gel es un proceso dinámico en continua evolución. Esto se traduce, en su aplicación como soporte de optodos, en una baja reproducibilidad, tanto en las medidas como en la construcción del terminal sensible, así como una deriva de la señal y un acortamiento de la vida útil del sensor, dado que con el tiempo estos soportes van cerrando sus poros impidiendo el acceso del analito hasta el indicador. 3.5 Conclusión del capítulo: técnica elegida En el capítulo anterior se escogió la tecnología a utilizar para la construcción del sensor de pH: la fibra óptica. En este capítulo se ha descrito el procedimiento gracias al que se va a obtener información sobre el pH del medio: absorción de campo evanescente. Como ya se ha explicado el campo evanescente es el que se propaga por la corteza de la fibra cuando la luz es guiada por el núcleo. La técnica de medida consiste en desprender la corteza en una parte de la fibra y colocar en su lugar una pasta con un indicador cuyas características ópticas varían en función del pH del líquido que baña la fibra. De esta manera se puede obtener información sobre la acidez del medio analizando la señal recibida en el fotodetector. La razón fundamental de la elección de esta técnica es que permite la utilización de una sola fibra para efectuar la medida, lo que da lugar a un montaje sencillo y a la mínima incomodidad para el paciente. 54