CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA Y DINAMICA DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE ECOSISTEMAS ACUATICOS ASOCIADOS A SISTEMAS PRODUCTIVOS EN LA CUENCA DEL RÌO LA VIEJA AYDEE SOFIA MUÑOZ NUÑEZ BIOLÓGA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MAESTRÌA EN CIENCIAS BIOLÒGICAS BOGOTÁ, D.C. 2008 CARACTERIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE ECOSISTEMAS ACUÁTICOS ASOCIADOS A SISTEMAS PRODUCTIVOS EN LA CUENCA DEL RÌO LA VIEJA AYDEE SOFIA MUÑOZ NUÑEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÒGICAS SANDRA BAENA Ph.D. Directora PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MAESTRÌA EN CIENCIAS BIOLÒGICAS BOGOTÁ, D.C. 2008 Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. CARACTERIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE ECOSISTEMAS ACUÁTICOS ASOCIADOS A SISTEMAS PRODUCTIVOS EN LA CUENCA DEL RÌO LA VIEJA AYDEE SOFIA MUÑOZ NUÑEZ APROBADO ________________________ Angela Umaña _______________________ Ivon Venegas Biólogo Ph.D. Biólogo-Limnólogo Jurado Jurado ________________________ Dr. Rodulfo Ospina Biólogo Jurado CARACTERIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE ECOSISTEMAS ACUÁTICOS ASOCIADOS A SISTEMAS PRODUCTIVOS EN LA CUENCA DEL RÌO LA VIEJA AYDEE SOFIA MUÑOZ NUÑEZ APROBADO _______________________ Ingrid Schuler Ph.D. Decana Académica Facultad de ciencias Pontificia Universidad Javeriana __________________________ Carlos Corredor Ph.D Director Postgrado Pontificia Universidad Javeriana A Dios por darme la sabiduría y fortaleza en los momentos más difíciles de mí vida. A mi madre a quien le debo todo lo que soy, que con su amor y comprensión me inspiró para alcanzar mis sueños. AGRADECIMIENTOS Deseo mis sinceros agradecimientos a: La profesora Sandra Baena Garzón, por su profesionalismo, paciencia y afecto especial. Ella es una verdadera huella a seguir. Al Doctor Carlos Rivera por su valiosa asesorìa en la parte estadística de la tesis. Al Centro de Investigación en Estudios de Biodiversidad y Recursos Genéticos CIEBREG por la oportunidad de permitirme realizar este proyecto de investigación. A Carolina Díaz por su valiosa asesoría en la parte molecular. A mi hermanita Tania y a mis hermanos Freddy y Marcos por su apoyo incondicional, aun en la distancia. A mis amigas de maestría en especial María Magdalena Gómez Coronel, Marcela Gómez y Yamile Díaz por su valiosa amistad y apoyo incondicional. A mis compañeros de laboratorio por hacer amenos los momentos difíciles. Y en general a todas las personas que de alguna manera contribuyeron para que este estudio pudiera ser realizado. CONTENIDO 1. INTRODUCCION Pág. 1 2. MARCO CONCEPTUAL 4 2.1 BIENES Y SERVICIOS AMBIENTALES 4 2.2 SISTEMAS PRODUCTIVOS 7 2.3 ECOSISTEMAS ACUÁTICOS LÒTICOS 9 2.1.2 Bienes y servicios ambientales derivados de los ecosistemas acuáticos. 2.2.1 Sistemas productivos en la ecorregión cafetera. 2.3.1 Factores ambientales que influyen en los ecosistemas lòticos 6 8 11 2.4 COMUNIDADES MICROBIANAS EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS 14 ecosistemas acuáticos 16 3. METODOLOGÍA 23 2.4.1 Factores que determinan la distribución de comunidades bacterianas en los 2.4.2 Herramientas para el estudio de estructura de comunidades bacterianas 3.1 ÁREA DE ESTUDIO 3.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS Y ELECCIÓN 19 23 DE LOS SITIOS DE MUESTREO 24 3.4 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN MEDIANTE ENCUESTAS 27 3.3 FASE DE CAMPO 3.5 FASE DE LABORATORIO 3.5.1 Procesamiento de las muestras de sedimentos recolectadas a partir de los 26 28 ríos de estudio 28 microorganismos 28 3.5.2 Fijación de las células de las muestras de sedimento para el conteo total de i 3.5.3 Separación de las células del sedimento 3.5.4 Recuento total de células por tinción con DAPI 3.5.5 Extracción del ADN de las muestras de sedimento para los análisis de estructura y dinámica de las comunidades microbianas 3.5.6 Amplificación del gen 16S rRNA 3.5.7 Análisis de la estructura y dinámica de las comunidades microbianas 3.5.8 Relaciones entre la diversidad de las comunidades microbianas y los 28 29 29 29 31 sistemas productivos 32 el DGGE 32 SELECCIONADOS EN EL DGGE 32 3.5.9 Análisis de agrupamiento y similitud de los perfiles de OTUs generados en 3.6 SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS OTUS 4. ANÁLISIS DE LOS DATOS 4.1 VARIABLES FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS EN LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS DE LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA 4.2 ÍNDICE DE CALIDAD DE AGUA 4.3 ANÁLISIS DE ORDENACIÓN DE LOS DATOS DE LA COMPOSICIÓN DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS 4.4 RELACIÓN ENTRE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS, E HIDROLÓGICOS CON LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EN CADA SISTEMA PRODUCTIVO 5. RESULTADOS 5.1 CALIDAD DEL AGUA Y VARIABILIDAD FÍSICA, QUÍMICA E HIDROLÓGICA 34 34 34 35 35 37 37 5.2 RECUENTO TOTAL DE CÉLULAS POR TINCIÓN CON DAPI 46 MICROBIANAS 46 5.3 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES ii 5.4 ÍNDICES DE DIVERSIDAD DE LAS MUESTRAS DE LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS 52 SELECCIONADOS EN EL DGGE 53 SISTEMAS PRODUCTIVOS 57 COMUNIDADES MICROBIANAS 59 5.5 SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS OTUS 6. RELACIONES ENTRE LA ESTRUCTURA MICROBIANA Y LOS 6.1 RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES AMBIENTALES Y LAS 7. DISCUSIÓN 7.1 CALIDAD DEL AGUA Y CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIABLES FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS EN LOS DIFERENTES SISTEMAS 62 PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA 62 MICROBIANAS 63 7.2 ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE LAS COMUNIDADES 7.3 RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES AMBIENTALES Y LAS COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LOS RÍOS ASOCIADOS A LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA 68 9. RECOMENDACIONES 72 8. CONCLUSIONES 70 BIBLIOGRAFIA 73 ANEXOS 88 iii LISTA DE TABLAS Tabla 1. Servicios ambientales proporcionados por diversos bienes ambientales Tabla 2. Ubicación geográfica de las fincas muestreadas y sus respectivos sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja. Ganadería semiextensiva para carne (GC), Pág. 5 Ganadería semiextensiva para leche (GL) y Cultivos Mixtos (CM) 25 Amplificación del gen 16S rRNA en las muestras de sedimento 31 Tabla 3. Secuencias y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la Tabla 4. Características morfométricas de los ríos de la Cuenca La Vieja 38 cada tramo de los ríos en estudio en la cuenca del río La Vieja 39 Tabla 5. Resumen de las variables físicas, químicas e hidrológicas registrados en Tabla 6. Valor promedio del índice de calidad del agua NSFI (Brown et al., 1970) en los ríos de los diferentes sistemas productivos estudiados en la cuenca del río La Vieja 42 obtenidos durante el estudio 46 Tabla 7. Conteo de los microorganismos presentes en las muestras de sedimentos Tabla 8. Valores de diversidad de Shannon (H`), dominancia de Simpson (1/D), Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en los diferentes sistemas productivos estudiados. Dominio. Bacteria Tabla 9. Valores de diversidad de Shannon (H`), dominancia de Simpson (1/D), Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en algunas muestras para el 52 Domino Archaea, de los diferentes sistemas productivos estudiados 53 Bacteria 55 Archaea 56 significativos 59 variables ambientales. (r>0.5) 59 Tabla 10. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio Tabla 11. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio Tabla 12. Test de Monte Carlo. Correlación especies-ambiente. P<0,05 Tabla 13. Correlación de Pearson con los ejes de ordenación entre los OTUS y las iv LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ubicación geográfica de la ecorregión eje cafetero y la cuenca del río La Vieja Figura 2. Representación esquemática del muestreo (EPA 2000) Figura 3. Relación de las variables ambientales de los sistemas productivos con los dos primeros ejes del análisis de componentes principales (ACP) Figura 4. Ordenación de las variables ambientales mediante el análisis de Pág. 24 26 44 componentes principales (ACP): a) Ordenación de los ríos respecto al sistema de producción b) Ordenación de los ríos según la época de muestreo c) ordenación de los ríos respecto al sistema de producción Figura 5. Patrón de diversidad bacteriana de cada sistema productivo durante las 45 épocas de muestreo. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivo mixto; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche Figura 6. Agrupamiento de las muestras microbianas de los ríos en la cuenca del 47 río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de Jaccard. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; Tes: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo época de lluvias v 48 Figura 7. Perfil de bandas generadas en el DGGE de muestras amplificadas del dominio Archaea sistema productivo durante las épocas de muestreo. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche Figura 8. Agrupamiento de las muestras del dominio Archaea pertenecientes a 49 los ríos de la cuenca del río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de Jaccard. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; sistema productivo cultivo mixto; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo época de lluvias Figura 9. (a) Agrupación de los OTUs de acuerdo al sistema de producción. (b) Agrupación de los datos de acuerdo al periodo. (C) agrupación de las fincas de 50 acuerdo al sistema productivo 58 el ACC realizado a todas las muestras 60 Figura 10. Bioplot que describe la ordenación de los OTUs (banda) obtenida con Figura 11. Ordenación obtenida con el ACC realizado para las comunidades microbianas. (a) Ordenación de los OTUs según las variables para cada sistema de producción. (b) Ordenación de los OTUs según las variables para cada periodo. c) Ordenación de los ríos según las variables ambientales vi 61 LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Valores medios mensuales obtenidos de series históricas en la estación Maracay, Departamento Quindío, Municipio Quimbaya perteneciente a la cuenca del río La Vieja. Cenicafe 88 sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja 89 análisis de Componentes principales (ACP) 90 Anexo 2. Encuesta a dueños y/o administradores de las fincas asociadas a los Anexo 3. Correlación entre las variables ambientales y los ejes explicativos en el vii RESUMEN En la cuenca del río La Vieja, perteneciente a la ecorregión cafetera de Colombia, se buscó determinar la relación entre los sistemas productivos característicos de la región: ganadería de carne, ganadería de leche y cultivos mixtos, sobre la calidad del agua, estructura y composición de las comunidades microbianas. Se muestreó un total de 9 ríos durante la época de sequía y lluvia respectivamente. Los resultados obtenidos indican que los sistemas de producción de ganadería de carne y cultivos mixtos tienen un mayor impacto sobre los ríos al presentar una baja concentración de oxígeno, mayor concentración de nutrientes y sólidos en suspensión. Por el contrario, el sistema productivo ganadería de leche presentó la mejor calidad del agua, debido a las buenas técnicas de manejo como el mantenimiento de la cobertura vegetal y la utilización de sistemas para el tratamiento del agua residual. La mayor similitud en la composición microbiana se presentó en cultivos mixtos debida posiblemente a que los ríos bajo esta influencia tienen condiciones ambientales favorables como concentración de nutrientes que permiten el establecimiento de ciertas comunidades. Las variables que se encontraron significativamente relacionadas con las comunidades microbianas fueron nitrógeno total, sólidos totales, fósforo total y temperatura. Los ríos bajo la influencia de los diferentes sistemas productivos se caracterizaron por presentar principalmente comunidades microbianas pertenecientes a la subclase B-Proteobacteria, representantes importantes en ecosistemas de aguas dulces. Palabras claves: Calidad del agua, estructura, composición de comunidades microbianas, sistemas productivos, variables ambientales, B-Proteobacteria. ABSTRACT In the basins of rivers La Vieja belong to the ecorregion the coffee of Colombia, we studied the relationship between the productive systems characteristic of the region: Meat cattle raising, milk cattle raising, mixed cultivation, on water quality and structure and composition of the microbial community. A total of 9 rivers were sampled during the dry and rainy season. Results show that productive systems based on meat cattle raising and mixed cultivation have the highest impact on water quality on the rivers due to the lowest of oxygen concentrations, the high concentrations of nutrients and suspended solids. By the contrary, productive systems milk cattle raising most the quality of the water, because to the techniques of handling like the maintenance of the plant cover and the utilization of waste water treatments. The highest similarity in the microbial composition occurs in mixed cultivation probably due to the rivers that are influenced by this type of productive system have favourable environmental conditions like concentrations of nutrients that allow the establishment of certain communities. The variables that were significantly related with the microbial communities were total nitrogen, total solids, total phosphorus and temperature. The rivers that are influenced by the different productive systems were composed mainly of the subclass B-Proteobacteria important representatives in the freshwater ecosystems. Key words: Water quality, structure, composition of microbial community, productive systems, environmental variables, B-Proteobacteria. 1. INTRODUCCION La ecorregión cafetera se encuentra localizada en la región andina de Colombia, entre la vertiente oriental de la cordillera occidental y el valle del río Magdalena (CARDER, 2004). Está conformada por los Departamentos de Risaralda, Caldas y Quindío, y por la región nor-oriental de los departamentos del Valle del Cauca y Tolima (Chará, 2003). La región se caracteriza por presentar suelos fértiles y una buena disponibilidad hídrica durante la mayor parte del año. Estas condiciones favorecen la sostenibilidad de bienes y servicios ecológicos de la región (Ministerio del Medio Ambiente, 2004). Uno de los componentes claves de la biodiversidad en los paisajes rurales naturales y transformados en la ecorregión cafetera, lo constituyen los ecosistemas acuáticos. Sin embargo, esta zona es una de las regiones de Colombia con mayor presión sobre estos ecosistemas, debido a la vulnerabilidad de sus cuencas, la alta densidad de población (IDEAM, 2001), y la intensa transformación que han sufrido sus paisajes naturales como consecuencia de los cambios en el uso del suelo y del impacto de los diferentes sistemas productivos (CARDER, 2004). Estas modificaciones sumadas a la baja capacidad para garantizar una oferta constante de agua, constituyen uno de los problemas más grandes de la región. La ecorregión, depende críticamente del mantenimiento de la calidad y la regulación de la disponibilidad de agua. El desarrollo sostenible de los paisajes rurales de la región implica un suministro suficiente de agua, e implica agua de la calidad apropiada para los diferentes usos que tiene en la región (Rivera-Rondón et al., 2007). Según el Plan de Ordenamiento Territorial de la Cuenca del Río La Vieja (Amaya et al., 2005), la calidad del agua de la cuenca se ve afectada por el vertimiento de desechos domésticos y del beneficio del café, por las conexiones de 1 alcantarillado a antiguos aljibes y por el poco mantenimiento de los pozos sépticos. Así mismo, las diferentes actividades y el impacto de los sistemas productivos han deteriorado la cuenca afectando la calidad del recurso hídrico, y en algunos casos, la estructura y composición de los organismos acuáticos (Chará 2003, CARDER, 2004). Reconociendo la dependencia que tiene la ecorregión cafetera por los bienes y servicios provenientes de los ecosistemas acuáticos, es necesario evaluar los impactos de los sistemas productivos en la calidad de sus aguas y en la diversidad de sus comunidades bióticas, las cuales son importantes para el buen funcionamiento de estos ecosistemas. Las comunidades microbianas constituyen un componente imprescindible en los sistemas acuáticos, en los cuales contribuyen a muchos servicios ambientales esenciales. Su presencia y relevancia se manifiesta en múltiples formas, siendo su papel imprescindible en los ciclos biogeoquímicos de diversos elementos (carbono, nitrógeno, azufre y hierro, entre otros), controlan los flujos de nutrientes a través de la transformación y mineralización de la materia orgánica, participan en procesos de degradación de sustancias alóctonas y eliminación de contaminantes derivados de actividades humanas (Azam, 1998; Spring et al., 2000; Araya et al., 2003). La diversidad de las especies microbianas que existen en un determinado ecosistema es una consecuencia de la relación entre los organismos y su ambiente, por esto, desde un punto de vista ecológico es importante conocer como está organizada esa comunidad microbiana y que valor tiene para la estructura y función del ecosistema. Teniendo en cuenta lo anterior, la pregunta de investigación está dirigida a estudiar cuál es el efecto de los sistemas productivos sobre la calidad del agua y sobre las comunidades microbianas presentes en los ríos asociados a la cuenca del río la Vieja. Para responder lo anterior, las hipótesis planteadas fueron: 1) Cada sistema productivo causa un impacto particular sobra la calidad del agua, y 2) Las comunidades de microorganismos pueden verse afectados por las actividades que se realizan en estos ecosistemas. El presente trabajo estudia las variables ambientales 2 Fisicoquímicas, microbiológicas e hidrológicas, el uso y el manejo del recurso hídrico y la composición, la estructura y la distribución de las comunidades microbianas en ríos de bajo orden bajo la influencia de sistemas productivos agrícolas ganaderos y forestales en la Ecorregión Cafetera en dos épocas climáticas. Este estudio hace parte del proyecto: “Efecto de los sistemas productivos sobre la calidad, disponibilidad del agua y funcionalidad de los ecosistemas acuáticos de la Ecorregión Eje Cafetero”, propuesto por el Grupo Aguas dentro del marco del proyecto general “Valoración de bienes y servicios de biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales colombianos complejo Ecorregion Andes del Norte (CEAN)” del Centro de Investigación en estudios en Biodiversidad y Recursos Genéticos CIEBREG. 3 2. MARCO CONCEPTUAL 2.1 BIENES Y SERVICIOS AMBIENTALES Los recursos naturales de un país son un elemento clave para su desarrollo, especialmente dentro del contexto de manejo y aprovechamiento sostenible de dichos recursos, que permiten alcanzar el desarrollo económico y social, además, una mejor calidad de vida de las presentes y futuras generaciones. Los recursos naturales fundamentales constituyen los bienes ambientales y corresponden a los recursos que proveen los ecosistemas para beneficio de los seres vivos. De estos bienes ambientales, se derivan los servicios ambientales que se definen como el conjunto de condiciones y procesos naturales que ofrecen los ecosistemas por su simple existencia y que la sociedad puede utilizar para su beneficio, reconociendo a su vez que la obtención de dichos beneficios implica costos ambientales (Barzev, 2002). Los recursos naturales son importantes, no sólo para la obtención de alimento (agua para consumo, agricultura, ganadería, pesca), transporte, refugio de diferentes especies, industria, sino también por los servicios ambientales, procesos y funciones que permiten el mantenimiento de la biosfera: Ciclado de nutrientes, ciclos biogeoquímicos, regulación del clima y la eliminación de contaminantes, entre otros. Para facilitar el análisis, los bienes y servicios ambientales de un ecosistema específico pueden ser separados así: los servicios ambientales son las funciones ecosistémicas y los bienes ambientales son las materias primas que utiliza el hombre en sus actividades económicas. La siguiente tabla presenta de manera resumida, algunos de los servicios ambientales proporcionados por diversos bienes ambientales (Barzev, 2002). 4 Tabla 1. Servicios ambientales proporcionados por diversos bienes ambientales Servicios Ambientales Regulación de Gases Regulación del clima Funciones Regulación de composición Química atmosférica Regul. de temperatura global; precipitación y otros procesos climáticos Regulación hídrica Regulación de los flujos hidrológicos Oferta de agua Almacenamiento y retención de agua Retención de sedimentos y control de erosión Detención del suelo dentro del ecosistema Formación suelos Proceso de formación de Suelos Reciclado de nutrientes Almacenamiento, reciclado interno, procesamiento de nutrientes Tratamiento de residuos Movimiento de gametos florales Refugio de especie Hábitat para población residentes y migratorias Producción de Alimento Producción primaria Cultural Balance CO/O2 Regulación de gases de efectos invernaderos Provisión de agua (riego, agroindustria, transporte acuático Provisión de agua mediante cuencas reservorios y acuíferos Prevención de la pérdida de suelo por viento, etc., almacenamiento de agua lagos y humedales Meteorización de rocas y acumulación de materia orgánica Fijación de nitrógeno, fósforo, potasio, etc. Remoción y descomposición Tratamiento de residuos, de exceso de nutrientes y control de contaminación y compuestos desintoxificacion Polinización Recreación Ejemplos Proveer oportunidades para actividades recreacionales Proveer oportunidades para usos no comerciales 5 Provisión de polinizadores para reproducción de poblaciones de plantas Semilleros, hábitat de especies migratorias, locales Agricultura, cultivos, frutas etc. Ecoturismo etc Estética, artística, educacional, espiritual etc. Sin embargo, a pesar del incalculable valor que generan los bienes y servicios ambientales, la actividad humana compromete seriamente la conservación de los recursos biológicos, provocando la degradación del ambiente y acarreando consecuencias como la alteración de los ecosistemas y el medio ambiente en general (Iza & Rovere, 2006). 2.1.2 Bienes y servicios ambientales derivados de los ecosistemas acuáticos. Entre los ecosistemas más afectados por la actividad humana se encuentran los cuerpos de agua dulce (ríos, arroyos, lagos, lagunas) y cuencas hidrográficas; paradójicamente sistemas imprescindibles para el mantenimiento de la vida. Estos ecosistemas son generadores de servicios ambientales que incluyen los asociados a los usos directos del agua (agricultura, industria, consumo humano, acuicultura, etc.), eliminación de contaminantes, generación de hidroelectricidad, regulación de flujos y control de inundaciones, transporte de sedimentos, mantenimiento de la capacidad productiva del suelo, control de erosión hídrica. Los asociados a los ciclos biogeoquímicos tales como almacenaje y reciclaje de nutrientes y materia orgánica, almacenamiento y fijación del carbono, liberación de oxígeno, y los asociados a la protección biológica, protección de ecosistemas, creación y mantenimiento de hábitat y de la vida silvestre, y los asociados a la belleza escénica natural o intervenida para fines recreativos y turísticos. La mayoría de los servicios ambientales esenciales (ciclos biogeoquímicos, ciclado de nutrientes, eliminación de contaminantes), derivados de los ecosistemas acuáticos dependen de procesos claves que son llevados a cabo por los microorganismos. Dentro de estos procesos cabe destacar la eliminación de contaminantes por procesos de autodepuración. El concepto de autodepuración ayuda a entender cómo se autorregula un medio acuático frente a un caso de contaminación. Se define como un proceso biológico normal de estabilización progresiva de compuestos complejos y bioquímicamente inestables que se da en los medios acuáticos y en el que interviene un número elevado de microorganismos que se encargan de la degradación de 6 contaminantes. En este proceso, las bacterias heterotróficas, desempeñan un importante papel en la degradación de la materia orgánica, restableciendo el sistema y permitiendo que aparezcan los organismos autotróficos (Kirchman et al., 2004). La descomposición de la materia orgánica (MO) es uno de los procesos claves en el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos, donde los procariotas juegan un papel importante en el reciclado de la materia orgánica e inorgánica. (Azam, 1998; Sekiguchi et al., 2002; Winter et al., 2006). Los estudios en ecología microbiana en las últimas décadas han llevado a la idea del llamado “loop microbiano”, que presupone que una gran cantidad de la producción primaria no es consumida directamente por herbívoros sino que es aprovechada por los microorganismos heterotróficos convirtiéndose en biomasa microbiana (Lowell & Konopka, 1985). De esta forma, los microorganismos propician la reintroducción de compuestos inorgánicos en el sistema y producen biomasa microbiana susceptible de servir como alimento a otros organismos. Con esta nueva concepción, el proceso de descomposición deja de tener un carácter terminal para adquirir uno central en el control y la dinámica de nutrientes del sistema, y actuando de vía de redistribución de la energía. Todo esto hace que tenga también importantes efectos en la estabilidad de los ecosistemas. A su vez, las comunidades bacterianas participan en los ciclos biogeoquímicos de la mayoría de los elementos. De esta forma, las tasas de reciclado de nutrientes (C, N, P) son controladas a una escala global por los microorganismos (Alvarez, 2005). 2.2 SISTEMAS PRODUCTIVOS Los sistemas productivos corresponden a todas las formas antrópicas de intervenir en la naturaleza de forma pasiva o activa y que generan algún tipo de impacto o alteración dependiendo del tipo, intensidad y duración de la actividad humana (manejo de agroecosistemas o aplicación de tecnologías de mayor o menor complejidad) (Murgueitio, 2003). El uso del suelo para actividades como la 7 agricultura y pastoreo ha generado alteraciones en los ecosistemas, donde los principales efectos se relacionan con el uso de fertilizantes en la agricultura, aumento de plagas, compactación del suelo y erosión, desecación y contaminación de diferentes cuerpos de aguas (CIEBREG, 2004). Estos procesos de trasformación y degradación de los paisajes naturales se ven reflejados en sus componentes bióticos y abióticos en su estructura y en el funcionamiento de los flujos de energía (Etter, 1994), Así mismo, estas actividades generan impactos negativos sobre los ecosistemas que resultan en la pérdida de biodiversidad y de los servicios ambientales que proporcionan a la sociedad. El sistema productivo ganadería, genera impactos ambientales negativos como la erosión y compactación del suelo, además de esto, genera uniformidad genética del territorio al privilegiarse el monocultivo de gramíneas mediante quemas estacionales y eliminación de la sucesión vegetal por la utilización de herbicidas o medios físicos; así mismo, causa la desecación de humedales, construcción de vías de penetración, contaminación del agua y el suelo por fertilizantes sintéticos y plaguicidas (Murgueitio, 2003). Por otro lado, la falta de cobertura vegetal nativa y el libre acceso de los animales a los cursos de agua corriente, generan mayores sedimentos (sólidos disueltos en el agua), y el aporte de excretas incrementa los coliformes fecales, afectando la calidad del recurso hídrico (Chará, 2003). 2.2.1 Sistemas productivos en la ecorregión cafetera. Sistema productivo Ganadería: en la región cafetera afectada por la crisis de la broca del café (Hypothenemus hampei) y los bajos precios internacionales, varios miles de hectáreas de suelos fértiles, se transformaron en pastizales intensivos con sistemas ganaderos basados en altas cargas animales (10 a 15 animales/ha) y elevada fertilización química. Estas actividades causaron serios deterioros en el medio ambiente, como contaminación de los recursos hídricos, daño en la estabilidad de los agregados del suelo y pérdida de la diversidad biológica (Sadeghian et al., 1998). Los sistemas ganaderos de pastoreo están ampliamente dominados por la especie bovina, seguida 8 por la ovina y equina. La Ganadería de leche se encuentra ubicada en altiplanos en altitudes entre 2000 y 3000 m; mientras la ganadería de doble propósito (carne y leche) en climas medios entre 1000 y 200 m. Y la ganadería para producción de carne se presenta en zonas bajas entre los 500 y 100 m (Chará, 2003). La ganadería de pastoreo sin árboles causa un impacto negativo de mayor magnitud que la caficultura, principalmente por sedimentación de los cauces y aportes de materia orgánica, nutrientes y patógenos que deterioran las corrientes de agua (Murgueitio, 2003), genera mayor impacto en los ecosistemas naturales, debido a su alta capacidad de expansión y transformación del paisaje (CIEBREG, 2004). Sistema productivo Agricultura: El sistema productivo agricultura, ha generado de igual forma efectos negativos sobre los ecosistemas en la ecorregión cafetera. La producción agrícola se encuentra representada básicamente por los cultivos de café (tradicional y tecnificado), plátano (solo o en asocio), cítricos, yuca y caña de azúcar (Amaya et al., 2005). La mecanización del suelo y el uso excesivo de agroquímicos han causado efectos perjudiciales a los ecosistemas tales como proliferación de plagas, homogenización del paisaje, erosión del suelo, contaminación edáfica y acuática por vertimientos puntales y escorrentía superficial, lo cual ha producido cambios en la calidad y cantidad del recurso hídrico (CIEBREG, 2004; Chará, 2003). 2.3 ECOSISTEMAS ACUÁTICOS LÒTICOS Los hábitats de las corrientes de agua o lóticos, incluyen todas las partes del curso de los ríos: los arroyos y manantiales de su cabecera, la zona central del valle, con sus pozetas o zonas de deposición y sus rápidos, la zona de la llanura aluvial, y los estuarios en los que vierten sus aguas al mar. Estos sistemas llevan a cabo múltiples funciones que dependen del clima, área de la cuenca, estructura del hábitat y diversidad (Ward, 1998; Tockner et al., 2002). Se caracterizan por su flujo 9 unidireccional, forma lineal, morfología del canal, una alta heterogeneidad espacial y temporal. Los ríos llevan muchas sustancias disueltas en solución. Estos constituyentes disueltos incluyen materiales orgánicos e inorgánicos y gases. La materia orgánica y la energía son producidas dentro del río (al menos o totalmente por procesos fotosintéticos), o es importada de la zona terrestre o de la interfase agua-tierra y es usada por los consumidores o almacenada en el ecosistema (Wetzel, 2001). La materia orgánica, es, en gran parte materia orgánica particulada (MOP) y materia orgánica disuelta (MOD). Sin embargo dependiendo de la vegetación riparia, tamaño de la corriente, y la descarga, la producción microbiana autóctona puede también contribuir con una porción significativa de materia orgánica (Vannote et al., 1980; Finlay, 2001). La afluencia y presencia de estas diferentes fuentes varían a lo largo del transporte longitudinal y también con la estación, debido principalmente a las variaciones espacio temporales en las características químicas. Por tanto los ríos no solo transportan materia orgánica e inorgánica, sino que participan en la transformación de estos compuestos, a través de procesos físicos y biológicos. Las características de los sistemas fluviales, están estrechamente relacionadas con el tipo de vegetación o de paisaje (Allan, 1995), y su composición química es controlada directa o indirectamente por diversos factores como la litología y el relieve de la cuenca de drenaje, las condiciones climáticas, los procesos biológicos y la actividad antrópica. En este sentido, las vertientes, arroyos y ríos de montaña en contacto con suelos muy poco desarrollados, están influenciados por las características químicas de las precipitaciones que los alimentan a diferencia de lo que ocurre en otras cuencas, con mayor extensión y espesor de suelos (Pasquini et al., 2002). El estado trófico de un sistema acuático depende del equilibrio de sus características intrínsecas (morfología del río, geología, tipo de suelo, ciclo de nutrientes, materia orgánica y sedimentos), que recibe de sus áreas circundantes. Este equilibrio puede 10 verse afectado por el estado de conservación de la vegetación y del suelo de la cuenca, que son las características extrínsecas mas importantes que pueden provocar el desequilibrio de los cuerpos de agua dulce. Un factor de importancia en la dinámica de estos sistemas, lo constituye el componente ripario, el cual puede influir en el régimen microclimático y en la estructura trofica de los ríos. Así mismo, puede influir en la penetración de luz y en las fluctuaciones de temperatura del agua, en la morfología del canal, en la diversidad de hábitats de los ríos y constituye una fuente de energía alóctona para el ecosistema (Murgueitio, 2003; Chará, 2003). La eliminación de la vegetación riparia altera el régimen de flujo y los intercambios de materia y energía con la cuenca de drenaje. En zonas agrícolas y ganaderas, la eliminación de la vegetación riparia aumenta la entrada de nutrientes y contaminantes al curso de agua. 2.3.1 Factores ambientales que influyen en los ecosistemas lòticos. Existen diversos factores que determinan las condiciones ecológicas de los ecosistemas dulce acuícolas: Temperatura: Las propiedades lumínicas y calóricas de un cuerpo de agua están influidas por el clima y la topografía tanto como por las características del propio cuerpo de agua: su composición química, sedimentos en suspensión y su productividad algal. La temperatura del agua regula en forma directa la concentración de oxígeno, la tasa metabólica de los organismos acuáticos y los procesos vitales asociados como tasa de crecimiento, reproducción y productividad de las especies (Margalef, 1983). En lagos, la absorción de energía solar y su disipación como calor son procesos críticos en el desarrollo de gradientes de temperatura entre la superficie y las capas más profundas de agua, así como en los patrones de circulación del agua (Baron et al., 2003). En los ríos, la estratificación vertical de temperatura no se da, no existen gradientes debido a la acción de mezcla del agua de la corriente. Solamente los ríos profundos de movimiento lento muestran o exhiben diferencias apreciables de 11 temperatura entre la superficie y el agua de la parte inferior dentro del canal principal. En estos sistemas usualmente la temperatura varía estacionalmente y a escalas de tiempo diarias, y entre localizaciones, debido al clima, pero puede ser bastante constante bajo ciertas circunstancias. La corriente: Constituye un factor de importancia que caracteriza a los sistemas lóticos, determinando la distribución ecológica y las adaptaciones de los organismos del sistema. La velocidad del agua y las fuerzas físicas, colectivamente representan tal vez, los factores ambientales más importantes que afectan los organismos en estos sistemas acuáticos. La velocidad de la corriente influye en el tamaño de las partículas del sustrato, afecta las fuentes alimenticias a través de la entrega y remoción de nutrientes y alimento (Allan, 1995). La velocidad se ve afectada por la forma, la pendiente, la anchura, la profundidad y la rugosidad del lecho, además de la intensidad de las precipitaciones. La corriente permite el transporte de recursos, alimento y remoción de residuos (Wetzel, 2001). A medida que la pendiente decrece, y la anchura, la profundidad y el caudal aumentan, el limo y la materia orgánica en descomposición se acumulan en el fondo. El carácter del sistema cambia notablemente de las aguas rápidas a las lentas, con un cambio en las especies que van asociadas. El oxígeno: Constituye una variable de importancia en los ecosistemas acuáticos. Su presencia y concentración definen el tipo de especies presentes, de acuerdo con sus tolerancias y rangos de adaptación, que permiten establecer toda la estructura y funcionamiento biótico de estos sistemas. El oxigeno disuelto en aguas no contaminadas esta usualmente cerca de la saturación, y bajo estas circunstancias su concentración es de poca significancia biológica (Allan, 1995). En los ecosistemas lóticos, esta variable no se considera un factor limitante, 12 debido a que el agua al estar en continuo movimiento, favorece la difusión de oxígeno y el intercambio de gases entre la atmósfera y el agua (Margalef, 1983). Sustrato: Una gran variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos de diversos orígenes se encuentran en el sustrato de aguas de corrientes. La composición y distribución de estos materiales dentro del canal son determinadas por el lavado de rocas, factores climáticos, y vegetación riparía interactuando con la geomorfología del canal y variables hidráulicas. Especialmente en ríos pequeños y arroyos, el aporte de materia orgánica desde la superficie terrestre es una fuente particularmente importante de energía y nutrientes, y los troncos de árboles y otros materiales leñosos que caen al agua proporcionan sustratos y hábitats importantes para los organismos acuáticos, además de proporcionar alimento y protección contra depredadores. El componente orgánico del sustrato está compuesto primariamente de desechos de plantas, derivados de plantas acuáticas, o aportes de detritus de plantas terrestres. La materia orgánica particulada gruesa (MOPG) incluye partículas, como desechos de hojas y restos de maderas caídas de la vegetación de ribera dentro del canal. Estos desechos, tienen un importante papel en la estructuración de los patrones de drenaje y en la determinación de la morfología del canal. La materia orgánica particulada fina (MOPF), son partículas producidas por floculación y liberación microbiana de materia orgánica disuelta y por partículas pequeñas de MOPG, que resultan de la fragmentación física del detritus grueso y las actividades alimenticias de los detritívoros. La materia orgánica disuelta (MOD) es ubicua en aguas dulces y es mucho más abundante que MOPG o MOPF (Allan, 1995). 13 2.4 COMUNIDADES MICROBIANAS EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS Los ecosistemas acuáticos albergan diversos organismos importantes que aportan servicios ambientales imprescindibles para su mantenimiento y equilibrio. En estos ecosistemas las comunidades microbianas realizan diferentes procesos ecológicos; constituyen una pieza funcional básica a través del cual circula una importante fracción del flujo de energía, exhiben una gran variedad de capacidades metabólicas, desempeñan un importante papel en la transformación de compuestos orgánicos complejos y minerales (Tamaki et al., 2004), son necesarios en la transformación biótica del carbón y de los nutrientes (Winter et al., 2006); son capaces de utilizar la materia orgánica disuelta (MOD) que deriva de los organismos autótrofos y de la actividad metabólica de otros organismos heterótrofos y presentan un aporte esencial en los ciclos biogeoquímicos (Azam, 1998; Sekiguchi et al., 2002). Estas comunidades, también son responsables de los procesos claves que regulan la función y productividad de los ecosistemas a través del “microbial loop” (Lindstrom, 2001), que corresponde a la producción de materia orgánica disuelta (MOD) en las redes alimenticias acuáticas durante el flujo de materia orgánica particulada hacia organismos superiores y la reincorporación de esta MOD por las bacterias heterotróficas (Pernthaler, 2005). El “loop microbial” es regulado por nutrientes y por la acción depredadora de metazoos, de protozoos, microcrustáceos, que resulta en el equilibrio dinámico del sistema. Las bacterias constituyen un grupo heterogéneo y ampliamente distribuido en los ecosistemas acuáticos. La mayoría se encuentran como células planctónicas libres constituyendo el bacterioplancton, creciendo en superficies sólidas formando biopelículas o depositadas en el sedimento (Brümmer et al., 2003). En el bacterioplanton las comunidades microbianas tienen un importante papel en el flujo de energía y nutrientes a través de la redes alimenticias del planton, esto es una consecuencia de su alta abundancia, eficiente toma de nutrientes y un gran crecimiento potencial (Simek et al., 2006). Las bacterias son una importante parte de la microflora en el sedimento, por su abundancia, diversidad y la multiplicidad de sus 14 actividades metabólicas (Miskin et al., 1998). El sedimento como hábitat favorece la acumulación de nutrientes, materia orgánica y altas concentraciones de constituyentes químicos que proporcionan un ambiente más heterogéneo y estable a los microorganismos. Allí, las comunidades microbianas participan en procesos de degradación y transformación de la materia orgánica disuelta y en los ciclos biogeoquímicos de los principales elementos (carbón, nitrógeno, fósforo, etc), y están por tanto implicadas en el intercambio de energía y nutrientes (Jurgens et al., 2000; Tamaki et al., 2004; Schwarz et al., 2006). La materia orgánica, en el sedimento llega en forma de partículas y está compuesta principalmente por macromoléculas tales como proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos (Gomes & Mendoça, 2004). La degradación microbiana y transformación de partículas y materia orgánica disuelta en este hábitat, son procesos claves con respecto al ciclaje del carbono. Wobus et al. (2003), sugieren que existe una fuerte conexión entre la deposición de materia orgánica y la actividad bacteriana en sedimentos de sistemas marinos y de aguas dulces. Recientes investigaciones han reportado que las comunidades microbianas en aguas dulces están siendo dominadas por bacterias que están filogenéticamente afiliadas con la subclase α y β Proteobacteria y miembros de Cytophaga-Flavobacterium (Pernthaler et al., 1998; Araya et al., 2003; Brummer et al., 2000; Fazi et al., 2005). Sekiguchi et al. (2002), reportaron que las subclases α, β proteobacteria y Cytophaga -Flavobacterium, representaron la mayor proporción de la comunidad microbiana. Así mismo, dominancia del mismo grupo bacteriano ha sido encontrado en estudios de comunidades bacterianas en lagos (Van der Gucht et al., 2005). Generalmente, β-Proteobacteria ha sido descrito como el grupo más abundante en sistemas de aguas dulces. Este grupo de bacterias pueden adherirse más fácilmente a las superficies durante el desarrollo inicial de una biopelícula que miembros de otros grupos (Araya et al., 2003). Brummer et al. (2003), sugirieron, que la dominancia de 15 β-Proteobacteria en el río Spittelwasser (Alemania), puede ser explicado por su toleracia a altas concentraciones de contaminantes y metales presentes. Así mismo, Brummer et al. (2000), atribuyeron la presencia de una gran fracción de βProteobacteria, por su habilidad de oxidar amonio y participar en la degradación de contaminantes. La incidencia de miembros del grupo de Cytophaga-Flavobacterium en sistemas acuáticos ha sido asociada a compuestos de carbón de alto peso molecular (Crump et al., 1999). Cottrell & Kirchman (2000), demostraron que la abundancia de Citofaga- Flavobacterium, estaba asociada con quitina y concentraciones de proteínas en sistemas marinos. 2.4.1 Factores que determinan la distribución de comunidades bacterianas en los ecosistemas acuáticos. Las comunidades microbianas en los ecosistemas lóticos pueden presentar profundos cambios estaciónales y cambios longitudinales que influyen en la ecología de poblaciones específicas y que pueden producir impactos en la abundancia, estructura, composición y función de estas comunidades (Liu & Leff, 2002). Estos cambios pueden estar influenciados por numerosos mecanismos o factores bióticos y abióticos entre los cuales se encuentran: condiciones físicas (radiación y temperatura), disponibilidad de recursos nutritivos (control bottom-up) y mecanismos bióticos como la depredación o la infección viral (control top down) (Manz et al., 1999; Araya et al., 2003; Hullar et al., 2005). Los ríos y los lagos dentro de una región geográfica comparten ciertas características climáticas, como temperatura y precipitaciones, que de forma directa o indirecta influyen en la actividad y la diversidad del bacterioplancton y otros organismos acuáticos (Crump, 2005). Entre las condiciones físicas, numerosos estudios han demostrado que la temperatura controla la abundancia, producción y tasas de crecimiento del bacterioplancton (Shiah 16 & Ducklow, 1994; Simon & Wünsch, 1998; Hullar et al., 2005). Así mismo, investigaciones recientes muestran una fuerte relación de la temperatura con la abundancia de ciertos grupos bacterianos (Rubin & Leff, 2007). Sin embargo otros estudios relacionan la composición bacteriana con otras variables tales como turbiedad, velocidad del agua, fuente de materia orgánica, tipo de vegetación riparia, impacto antropogénico y precipitación (Leff et al., 1999; Liu & Leff, 2002; Crump, et al., 2005; Olapade et al., 2005). Existen otros factores intrínsecos tales como la concentración de nutrientes y producción fitoplanctonica que parecen determinar la composición de comunidades microbianas en ecosistemas acuáticos (Winter et al., 2006). En ecosistemas marinos y de aguas dulces por ejemplo, se ha encontrado que la abundancia y producción del bacterioplancton esta positivamente correlacionada con la producción de biomasa del fitoplancton. Esta relación de acoplamiento se presume que se produce porque las bacterias heterótrofas obtienen su energía a partir del metabolismo de fuentes externas de carbono orgánico disuelto liberado por parte del fitoplancton (Fuhrman et al., 1980; Azam et al., 1983; Brett et al., 1999). Winter, et al., 2006, reportaron que altos niveles de actividad fotosintética estimularon el crecimiento de algunos miembros de la comunidad bacteriana en el río Danubio, que fueron capaces de utilizar el aumento repentino del carbono de manera más eficiente. El fitoplancton libera hasta un 25% del carbón orgánico total fijado por la fotosíntesis. La materia orgánica disuelta es entonces rápidamente consumida y remineralizada por la comunidad bacterial. Por lo tanto, los cambios en la composición de comunidades fitoplanctonicas pueden influir en la composición de las comunidades bacterianas que funcionan como parte del “loop microbial”. Sin embargo, diferentes investigaciones han evidenciado un acoplamiento débil o inexistente entre el crecimiento bacterial y el crecimiento del fitoplancton, en donde no se encontraron relaciones positivas entre las dos comunidades (Canosa & Pinilla, 2001). No obstante, es también posible que el bacterioplancton y el fitoplancton, estén directamente estimulados por la adición de nutrientes, nitrógeno inorgánico y fosforo (Toolan et al., 1991; Morris & Lewis, 17 1992; Vrede et al., 1999). Así mismo, otros estudios encontraron que el crecimiento de bacterias heterotróficas es a menudo limitado por nutrientes inorgánicos (especialmente fósforo) en muchos ecosistemas (Brett et al., 1999; Simek et al., 2006). De igual forma, en biopelículas acuáticas, se ha encontrado que la abundancia de ciertos grupos bacterianos varía en respuesta a alteraciones en nutrientes orgánicos e inorgánicos y a la materia orgánica disuelta (MOD), (Rubin & Leff, 2007). Algunos experimentos en mesocosmos han demostrado que las comunidades bacterianas son altamente dinámicas y pueden diferir marcadamente en su respuesta a la disponibilidad del recursos (carbón orgánico y nutrientes inorgánicos tales como el nitrógeno y el fósforo), y a la estructura de las redes alimenticias (Kent et al., 2004). Otros aspectos o funciones de las comunidades microbianas tales como respiración, biomasa y actividad enzimática extracelular pueden ser limitados por nutrientes inorgánicos y materia orgánica en las corrientes. Los cambios en la riqueza y abundancia de las comunidades, pueden resultar en la pérdida de ciertos grupos responsables para los procesos específicos y por consiguiente el ecosistema puede experimentar cambios en la utilización del recurso que pueden afectar las comunidades de los niveles tróficos más altos (Kent et al., 2004). Otros factores que pueden estar modificando las comunidades bacterianas en los ecosistemas acuáticos, corresponden a las interacciones con otras comunidades bióticas. En estos sistemas, las redes alimenticias tienen muchas interacciones con las comunidades del bacteriplancton. Estas interacciones pueden incluir ataque por protozoos, metazoa y poblaciones de flagelados que proveen un control “top-down de la abundancia de las comunidades del bacterioplanton (Simek et al., 1999). Algunos estudios han revelado el ataque por protistos, como el factor dominante que controla la mortalidad bacteriana y puede ser un mecanismo que influye en la dinámica y estructura de la composición de comunidades microbianas. Protistos, especialmente nanoflagelados han sido 18 reportados, como los principales consumidores de bacterias en muchos ecosistemas acuáticos (Van der Gucht et al., 2005). Sin embargo, las comunidades microbianas, han desarrollan morfotipos resistentes a las altas presiones de los protistos (Hahn & Hofle, 2001). Ciertas características bacterianas, como motilidad y la forma, pueden influenciar la selectividad del ataque protista. Los cambios en la morfología celular han sido sugeridos como un mecanismo de las poblaciones del bacterioplanton contra grandes fluctuaciones en la abundancia (Hahn & Hofle, 2001; Kent, 2004). Por tanto, la depredación es un mecanismo que estructura la organización de redes alimenticias acuáticas, y determina la composición de especies de los diferentes niveles tróficos. 2.4.2 Herramientas para el estudio de estructura de comunidades bacterianas. El conocimiento actual de la estructura y de la dinámica de comunidades microbianas naturales ha sido limitado, y la mayoría de los estudios se han basado en los métodos dependientes de cultivo (Pernthaler & Amann, 2005), aunque hoy sabemos que las bacterias cultivables son sólo una pequeña parte de las bacterias que existen en la naturaleza. Varios acercamientos han sido usados para identificar microorganismos en ambientes naturales sin los requerimientos de métodos de cultivo. En la actualidad, es el uso de técnicas moleculares han permitido el estudio de la biodiversidad microbiana. Estas técnicas se basan, en general, en el análisis de las secuencias que codifican la subunidad pequeña de los ribosomas 16S RNA, moléculas con regiones altamente conservadas, es decir, que pueden ser encontradas en todos los organismos vivos; y regiones más variables, que se encontrarían sólo en organismos relacionados filogenéticamente (Moyer, 2001). Así es como, aplicado a muestras ambientales, el estudio de genes que codifican el rRNA permite tener una aproximación a la biodiversidad. Las técnicas de “fingerprinting” son consideradas como herramientas adecuadas para un rápido y comparativo análisis de comunidades naturales desconocidas (Ranjard et al., 2000), permitiendo obtener una visión general de la estructura genética de la 19 comunidad. La estrategia general de estas técnicas de comunidades microbianas, consiste primero, en la extracción de los ácidos nucleicos, seguido de la amplificación de genes que codifican el 16S ARNr y el análisis de los productos obtenidos en la PCR por las técnicas. Estas técnicas son usadas para distinguir entre especies utilizando solo muestras de su ADN basados en la separación electroforètica que generan un patrón o perfil de bandas de la diversidad genética en una comunidad microbiana (Muyzer & Smalla, 1998). La electroforesis en gel de gradiente denaturante por sus siglas en inglés Denaturing gradient gel eletroforesis (DGGE), es usada para separar fragmentos de ADN de la misma longitud pero con diferente secuencia nucleotidíca. La separación es basada en el decrecimiento de la movilidad electroforética del fragmento de ADN a través del incremento de un gradiente lineal denaturante (una mezcla de urea y formamida). El fragmento permanece de doble hebra hasta que alcanza la concentración de denaturante equivalente a la temperatura correspondiente. Los patrones de bandas generados en el gel son considerados como una imagen de toda la comunidad bacteriana y cada banda constituye un tipo de secuencia única, que representa un OTUs (Unidad taxonomica operacional), o filotipo (Fromin et al., 2002; Hughes & Bohannan, 2004). Los perfiles se caracterizan por el numero, posición (ausencia o presencia de bandas particulares) e intensidad relativa de la banda y pueden ser utilizados en métodos estadísticos para determinar dominancia, frecuencia de aparición, entre otros indicadores de diversidad bacteriana en estudios de dinámica poblacional y relacionarlos con varios parámetros biológicos y fisicoquímicos (Brummer et al., 2003). La técnica DGGE fue originalmente desarrollada para detectar mutaciones puntuales en las secuencias del ADN (Muyzer, et al., 1993). Actualmente es utilizada en estudios de ecología microbiana, permitiendo el análisis simultáneo de múltiples muestras y la comparación de comunidades basadas en diferencias temporales y geográficas (Sekiguchi, 2001). Permite el estudio de la estructura de comunidades 20 microbianas y medidas de la diversidad de filotipos y monitorea cambios en la comunidad. Uno de los puntos mas fuertes de la aplicación del DGGE en ecología microbiana es la de realizar simultáneos análisis de múltiples muestras, que permiten monitorear la dinámica compleja de las comunidades microbianas, frente a fluctuaciones estacionales o perturbaciones ambientales. Esta técnica, se caracteriza por ser confiable, reproducible, rápida y económica. Además, se puede combinar con otros métodos diferentes como amplificación de grupos específicos y corte de bandas para análisis de secuenciación. Sin embargo, hay que enfatizar que al igual que cualquier otro método, la técnica no es libre de presentar errores y sesgos, especialmente cuando se aplica a muestras ambientales. La técnica de DGGE ha sido adaptada como una herramienta para determinar la diversidad microbiana en muestras ambientales. Los estudios de diversidad se realizan utilizando diferentes índices de diversidad (Shauer et al., 2000; Fromin et al., 2002), los cuales pueden ser calculados para describir posibles diferencias entre la estructura de las respectivas comunidades microbianas. Las medidas de diversidad tiene en cuenta tanto el numero de especies presentes en una muestra (riqueza) como su abundancia relativa. Entre estos índices se encuentran: Riqueza de especies (S): Se define como el número de diferentes organismos presentes en una muestra (número de bandas presentes en el DGGE). No toma en cuenta la proporción y distribución de cada especie en la comunidad. Se calcula con la siguiente ecuación: S= # de bandas detectadas. Indice de Shannon–Weaver (H´): Se calcula con base en las bandas de los perfiles obtenidos del DGGE, toma en consideración el número y la intensidad relativa de las bandas en una línea individual. Se calcula con la siguiente ecuación: H`= - Σ Pi. Ln Pi, 21 Donde: Pi es la intensidad relativa de las bandas en un perfil. Índice de Equidad de Pielou: mide la proporción de la diversidad observada en relación con la máxima diversidad esperada. Su valor va de 0 a 1, de forma que 1 corresponde a situaciones donde todas las especies son igualmente abundantes (Magurran, 1989). Se calcula con la siguiente ecuación: J´=∑ pi * ln pi/ln s Donde: s = Número de especies pi = Proporción de individuos de cada especie i o de abundancia de cada especie expresada como una proporción de la cantidad total ln = log natural Índice de Dominancia de Simpson: Considera la probabilidad de que dos individuos tomados al azar de una muestra sean de la misma especie. Se calcula con la siguiente ecuación: S= Σ pi2 Donde: pi = abundancia proporcional de la especie i, número de individuos de la especie i dividido entre el número total de individuos de la muestra. 22 3. METODOLOGÍA 3.1 ÁREA DE ESTUDIO La ecorregion eje cafetero se encuentra localizada en la región andina de Colombia. Se caracteriza por ser un territorio con sistemas naturales prioritarios para la retención y regulación del agua como son los sistemas de páramo y subparamo de las cordilleras Central y occidental, y las cuencas altas de los ríos Otún, Consota, Chinchinà y La Vieja, entre otros (CARDER, 2002). En la actualidad es la región más poblada del país, tanto en la parte urbana como en la rural, con una gran explotación agrícola y ganadera. Se ha estimado que un 70% de la cobertura boscosa de la región ha sido transformada, mientras que el 80% de la tierra deforestada es ocupada por pasturas (Murgueitio et al., 2003). Este estudio se llevó a cabo en 9 ríos de la cuenca del río La Vieja, ubicada en el centro-occidente de Colombia en jurisdicción territorial de los departamentos de Quindío, Risaralda y Valle del Cauca con un área de aproximadamente 2.925 km2., Geográficamente, se encuentra ubicada entre 4º 04` y 49º 49`de latitud norte y 75º 24` y 75º 57`de longitud oeste. La cuenca presenta una gran heterogeneidad ambiental evidenciada en sus diferencias climáticas y topográficas (Figura 1). Con el desarrollo económico y agropecuario, la cuenca se ha posicionado como uno de los lugares más densamente poblados del país, ocasionando con ello grandes cambios y presión sobre los recursos naturales de la zona. Además, el vertimiento de desechos domésticos, agrícolas y pecuarios y la carencia de infraestructuras para el tratamiento de aguas residuales constituyen uno de los principales problemas que sufre el recurso hídrico de la cuenca (Amaya et al., 2005). 23 Figura 1. Ubicación geográfica de la ecorregión eje cafetero y la cuenca del río La Vieja. 3.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS Y ELECCIÓN DE LOS SITIOS DE MUESTREO Los sistemas productivos seleccionados en la cuenca fueron establecidos por el Centro de Investigaciones y estudios en Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG), con base en información biofísica y geográfica del SIG sobre sistemas productivos en paisajes naturales y transformados en la ecorregión del eje Cafetero (CIEBREG, 2004). A partir de la información anterior, se seleccionaron tres sistemas productivos predominantes en la cuenca del río La Vieja: (1) Sistema productivo ganadería semiextensiva con potreros y pastos mejorados para carne (Ganadería de carne). Corresponde al sistema de mayor predominio en la región, se ubica en bajas altitudes, algunas de las riberas del sistema no presentan cobertura arbórea y los pastos de forraje suelen invadir el cauce de los ríos. (2) el sistema productivo ganadería semiextensiva para producción de leche (Ganadería de leche), el cual se caracteriza 24 por la presencia de pastos mejorados en las fincas y riberas protegidas con vegetación arbórea nativa y (3) el sistema productivo cultivos Mixtos, dominado por cultivos de café y cítricos principalmente. La selección de los ríos y puntos de muestreo en los diferentes sistemas productivos se realizó en conjunto con los miembros del Grupo de aguas del CIEBREG. En el grupo de investigación se estudiaron diferentes comunidades acuáticas (peces, macroinvertebrados, diatomeas y microorganismos), en los sistemas productivos de la ecorregion cafetera. En cada sistema productivo se seleccionaron fincas que tuvieran cuerpos de agua con influencia directa de las actividades características de cada sistema. Se muestreó un río por cada finca, con un total de 9 fincas (Tabla 2). La selección de los ríos y puntos muestreados fueron escogidos considerando ciertas características tales como orden de los ríos (bajo orden), el caudal, la influencia antrópica, tipos de cobertura vegetal, uso del suelo y accesibilidad. Tabla 2. Ubicación geográfica de las fincas muestreadas y sus respectivos sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja. Ganadería semiextensiva para carne (GC), Ganadería semiextensiva para leche (GL) y Cultivos Mixtos (CM). Dpto Quindío Valle Sistema productivo Quindío Ganadería de Carne Quindío Quindío Ganadería de Leche Quindío Valle Quindío Valle Cultivos Mixtos (Cafetales, naranjos) Finca Porvenir Tierra Labrantía La Floresta Coord Coord (W) (N) 4º41’18.7” 75º48’46.8” Altitud (msnm) 1203 4º35’11.2” 75º49’43.1” 1195 4º39’10.1” 75º48’48.1” 1145 Villa Ximena 4º35’23.0” 75º40’11.1” Tesalia Baja 4º35’54.8” 75º39’58.1” 1602 1628 La Comarca La Sonora Santa Bárbara El Descanso 4º41’44.4” 75º46’23.2” 4º41´54.5” 75º45´36.1” 1226 1285 4º40’51.3” 75º44’51.5” 1346 25 4º35’43.0” 75º46’54.2” 1261 Los muestreos se realizaron durante el inicio de la estación de sequía del 17 al 24 de julio y durante la estación de lluvias del 3 al 10 de noviembre de 2006 (Anexo1). 3.3 FASE DE CAMPO Para el estudio de las comunidades microbianas, en cada uno de los ríos seleccionados en las diferentes fincas, se eligió aleatoriamente un solo tramo de 100 a 500 metros de longitud, para realizar en el mismo lugar todos los muestreos y de esta manera, tener información específica de cada lugar. A partir de este punto se seleccionó un transecto de 50 metros, donde se tomaron muestras de sedimentos cada diez metros a lo ancho del río con seis replicas cada uno, obteniéndose una submuestra por cada transecto. En total se obtuvieron seis submuestras, las cuales se mezclaron y transfirieron a una botella estéril de 500 ml conformando una muestra integrada por sitio de muestreo (Figura 2). Figura 2. Representación esquemática del muestreo. 26 Las muestras fueron conservadas a 4ºC y transportadas al laboratorio de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), de la Universidad Javeriana en Bogotá, para su posterior procesamiento. Además, en cada uno de los ríos se midió in situ, pH, oxigeno disuelto (YSI 52), conductividad (sonda OAKTON), temperatura del agua (YSI 52). Así mismo, se recolectó una muestra de 2 litros de agua para los análisis fisicoquímicos y de calidad de aguas que se realizaron a nivel de laboratorio, donde se determinó la alcalinidad (titulométrico H2SO4), DBO5 (incubación 5 días, electrométrico), turbiedad (Nefelométrico), coliformes totales (fijación por membrana), E. coli, silicatos (Colorimétrico –Molibdosilicato), fósforo total (PT, colorimétrico – cloruro estañoso), fósforo reactivo soluble (PRS, colorimétrico – cloruro estañoso), nitrógeno total (NT, titulométrico H2SO4), nitrógeno amoniacal (NH4, colorimétrco - Nesslerización), nitratos (NO3, colorimétrico), nitritos (NO2, colorimétrico-NEDA), sólidos suspendidos totales (SS, titulométrico DPD-FAS), sólidos totales (ST, Gravimétrico -105°C) y color (comparación visual con patrón) según métodos normalizados (APHA-AWWA_WEF, 2006). Adicionalmente, se tomaron datos morfomètricos e hidrológicos, como ancho del canal, profundidad y velocidad de la corriente, con lo cual se calculó el caudal de cada río. Se determinó el porcentaje de cobertura riparia (0% ausente, 0-25% escasa, 25-50% parcial, 50-100% completa) y el tipo de sustrato, que varió entre fino (limo y arenoso), rocoso y mixto (sedimento fino, grava particulada y roca). 3.4 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN MEDIANTE ENCUESTAS Para caracterizar el manejo del recurso hídrico en los sistemas productivos de estudio, se realizó una encuesta a los dueños y/o administradores de las fincas sobre el uso del agua, fuentes de abastecimiento, disposición de aguas residuales y posibles fuentes de contaminación del recurso hídrico (Anexo 2). 27 3.5 FASE DE LABORATORIO 3.5.1 Procesamiento de las muestras de sedimentos recolectadas a partir de los ríos de estudio. Para el análisis de la estructura de las comunidades microbianas, se utilizaron técnicas independientes de cultivo como electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE) y recuento total de células por tinción con solución 4,6diamidino-2-fenilindol diclorohidrato (DAPI). Para la obtención de la biomasa microbiana, las muestras de sedimento recolectadas de los diferentes ríos se centrifugaron a 5000 rpm por 20 minutos obteniéndose un precipitado homogéneo, el cual se dividió para los posteriores análisis. 3.5.2 Fijación de las células de las muestras de sedimento para el conteo total de microorganismos. Las muestras de sedimento fueron fijadas para su conservación en paraformaldehído 4% y procesadas siguiendo el protocolo de Pernthaler et al., 2004. Posteriormente se realizaron lavados con solución buffer fosfato salino 1X (PBS), y finalmente las muestras fueron almacenadas en etanol al 96% a -20ºC hasta su uso. 3.5.3 Separación de las células del sedimento. El paso inicial para el conteo directo es la separación de los microorganismos presentes en el suelo, que se llevó a cabo, siguiendo el protocolo propuesto por Battin, (2001), a 0.05 g de sedimento se le adicionó pirofosfato de sodio 0.1 M (PPS); La mezcla fue macerada y homogenizada en un agitador orbital (12100; New Science) a 160 rpm por 30 minutos. Posteriormente la mezcla se sonicó por 5 minutos y se centrifugò por 6 segundos. Pasado este tiempo se recuperó el sobrenadante en un tubo eppendorf y se lavó con buffer fosfato salino (PBS) por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se centrifugó por 20 minutos, se descartó el precipitado y al sobrenadante se le adicionó nuevamente PBS, se homogenizó la mezcla y con la ayuda de una jeringa se adicionó en el fondo del tubo una cantidad igual de Percoll (1:1), se centrifugó a 2800 rpm por 28 15 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo eppendorf. Se filtraron 100 µl del sobrenadante a través de una membrana de policarbonato de 0.2µm de tamaño del poro (GTTPO4700, Millipore), con ayuda de una bomba de vacio y finalmente el filtro se secó a temperatura ambiente. 3.5.4 Recuento total de células por tinción con DAPI. Para el recuento total de microorganismos, una porción de filtro previamente cortado se incubó en una solución de 4,6-diamidino-2-fenilindol diclorohidrato (DAPI), según el protocolo de Schallenberg et al. (1989). El recuento total se llevó a cabo en un microscopio epifluorescencia (Nikon – Eclipse 50i), donde se leyeron 50 campos visuales por muestra, si se observaba un número menor de 30 células por campo, y 20 campos visuales si se observaba un número mayor de células, hasta llegar, como mínimo a contar 300 células por filtro (Kirchmanm, et al., 1982). 3.5.5 Extracción del ADN de las muestras de sedimento para los análisis de estructura y dinámica de las comunidades microbianas. Para la extracción del ADN total, 0.5 g del precipitado homogenizado fue procesado utilizando un kit de extracción rápida de ADN en suelos (MOBIO), siguiendo las especificaciones del fabricante. Las extracciones se realizaron por duplicado y el ADN extraído se resuspendió en 50 µl de agua desionizada estéril y se verificó en gel de agarosa (1.5 %), teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron preservadas a -20°C. 3.5.6 Amplificación del gen 16S rRNA. A partir del ADN extraído de cada una de las muestras, se amplificó por PCR la región variable V3 a V5 del gen 16S rRNA, usando los iniciadores universales del dominio Bacteria F1 GC (Connolly & Patel, 2002) y R4 (Dwivedi et al., 1996), para obtener un producto PCR de aproximadamente 400 pb (Tabla 3). Antes de la PCR, el ADN fue diluido a diferentes concentraciones (1:50, 1:100). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 µl que contenía 10 µl de buffer 10X (Promega), 4mM de MgCl2, 0.2mM de cada iniciador, 29 0.2mM de dNTP, 2.5 U de Taq DNA polymerase (Promega) y 2 µl de ADN. Las muestras fueron amplificadas usando un Termociclador MyCyclerTM (BioRad) con un programa modificado de “Touch down” (James et al., 2006), bajo las siguientes condiciones: Una denaturación inicial de 94ºC por 1 min, seguido por 10 ciclos de denaturación a 94º C por 1 minuto, anillamiento a 65-55 ºC (disminuyendo 1º/ciclo) y elongación por 1 minuto 30 ciclos. Luego 20 ciclos con una denaturación de 94 ºC por 1 minuto, anillado a 55 ºC por 1 minuto, extensión a 72 ºC por 1 minuto y un paso de extensión final a 72 ºC por 5 minutos. La amplificación del ADN se verificó en electroforesis en gel de agarosa (1.5%), teñido con bromuro de etidio, y se visualizó por transiluminacion UV en un analizador de imágenes GEL-DOC (Biorad). Los tamaños de los productos amplificados se cuantificaron con el marcador de peso molecular Hyperlader IV (Bioline), y el análisis del perfil de bandas se hizo en el software Quantity One (Biorad). De igual forma, se amplificó por PCR el fragmento V1 a V3 del gen 16S rRNA, usando los iniciadores universales para el dominio Archaea, A109 (T) f (Grosskopf et al., 1998) y GC 515R (Lane et al., 1991), (Tabla 3). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 µl que contenía 10 µl buffer 10X (Promega), 4mM de MgCl2, 0.2-0.5 mM de cada iniciador, 0.2mM de dNTP, 2.5 U de Taq polymerase (Promega) y 1 µl de ADN. Las muestras fueron amplificadas bajo las siguientes condiciones: Una denaturación inicial a 95 ºC por 2 minutos, seguido por 35 ciclos de denaturación a 95 ºC por 30 segundos, anillamiento a 56 ºC por 40 segundos, extensión a 72 ºC por 1 minuto y un paso de extensión final a 72 ºC por 5 minutos. Los productos de la PCR fueron verificados en electroforesis en gel de agarosa (1.5%), y cuantificados con el marcador de peso molecular Hyperlader IV (Bioline). 30 Tabla 3. Secuencias y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la Amplificación del gen 16S rRNA en las muestras de sedimento. Dominios Iniciadores Bacteria Archaea Secuencia F1-GC Forward 5’CGCCCCCCGCGCCCCGCGCCCGTCCC3’ R4 Reverse 5’CCGTCAATTCCTTTGAGTTT3´ A109 (T) f 5’ ACTGCTCAGTAACACGT3’ GC 515R 5' CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAT CGT ATT ACC GCG GCT GCT GGC AC -3' Posición (pb) respecto E. coli 339-357 907 -926 109 515 3.5.7 Análisis de la estructura y dinámica de las comunidades microbianas. El análisis de los fragmentos del gen 16S rRNA amplificados por PCR, correspondientes a las muestras de los dominios Bacteria y Archaea fueron analizados utilizando la técnica de huella genética DGGE. El análisis se realizó en un sistema DCodeTM Universal Mutation Detection System (BioRad) según Muyzer et al., 1998. Todos los productos de PCR, se ajustaron a una misma concentración y aproximadamente entre 400 a 600 ng de producto PCR fue depositado en un gel de urea –formamida, con gradiente denaturante 40 a 60% (solución 100% denaturante que contenia 7M de urea y 40% de formamida) para Bacteria y 45-55% para Archaea. La electroforesis se realizó a 160 voltios por 13 horas en buffer TAE 0.5X (20 mM Tris, 20 mM de ácido acético, 1mM EDTA pH: 8.3). Después de la electroforesis, los geles fueron teñidos con nitrato de plata (AgNO3). Una vez terminado el procedimiento de tinción, los geles fueron escaneados (escáner Hppsc 1500) y la digitalización de la imagen fue procesada con el sofware de imagen HP image zone express. 31 Las imágenes de los perfiles de bandas generados por el DGGE de las comunidades procariotas presentes en muestras de sedimentos fueron analizadas usando el Software Quantity One (Bio-Rad). Con el fin de determinar la posición e intensidad de las bandas individuales se establecieron valores equivalentes a la abundancia por OTUs, utilizando como estimativo el número de píxeles por banda (el número de OTUs es equivalente al número de especies y el número de píxeles es equivalente al número de individuos o abundancia), siguiendo la metodología de Boon et al. (2002). 3.5.8 Relaciones entre la diversidad de las comunidades microbianas y los sistemas productivos. Se utilizaron índices de diversidad para caracterizar la estructura de las comunidades de procariotas presentes en las muestras de los diferentes sistemas de producción estudiados. Se calcularon la riqueza de especies (S), el índice de dominancia de Simpsom (1/D), el índice de diversidad de Shannon (H´ en base e) la Equitatividad de Pielou (EH), siguiendo las recomendaciones de Magurran (1989). Estos análisis se hicieron utilizando el programa Diversity tool. 3.5.9 Análisis de agrupamiento y similitud de los perfiles de OTUs generados en el DGGE. Los perfiles de OTUs generados por los geles, fueron analizados para estudiar el grado de similitud de la composición de las muestras microbianas, mediante análisis de agrupamiento, utilizando el índice de similitud de Jaccard (Diez et al., 2001), que se basa en presencia o ausencia. Para este análisis se utilizó el programa PAST (Paleontological software, 2005). 3.6 Secuenciación e identificación de los OTUs seleccionados en el DGGE Para los análisis de secuenciación, los geles de DGGE fueron procesados bajo las mismas condiciones anteriormente mencionadas, con la diferencia que estos fueron teñidos con un colorante diferente al de plata. Se utilizó SYBR Gold (SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain, 1:10000), en Tampon TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA). De todas las bandas generadas en el DGGE, se tuvieron en cuenta ciertos criterios de 32 selección para los respectivos cortes, como intensidad de la banda, bandas que aparecieran en todas o en la mayoría de las muestras y bandas que aparecieran una sola vez en el gel. Cada banda seleccionada fue cortada cuidadosamente con un bisturí estéril mientras era visualizada en un transilumidador con luz ultravioleta (UV). La banda extraída era depositada en tubos eppendorf que contenían 50µl de agua desionizada estéril; luego las muestras fueron incubados a 80 ºC por 1 hora para eluir el ADN del gel (Burgmann et al., 2005). Posteriormente, el ADN fue concentrado para eliminar toda traza de SYBR (SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain). 2 a 5 µl de sobrenadante ADN fue usado para la reamplificación, la cual se hizo bajo las mismas condiciones anteriormente descritas y se utilizaron el mismo conjunto de iniciadores. Posteriormente se realizó un nuevo gel de DGGE con tinción con plata para verificar que la banda cortada apareciera como una única banda, al igual que la posición correspondiera con la banda presente en la muestra original. Subsecuentemente, estos nuevos productos de PCR reamplificados fueron enviados para ser purificados y secuenciados respectivamente, en el laboratorio Macrogen, Corea. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizaron contra las secuencias de nucleotidos de la base de datos del NCBI (National Centre for Biotechnology Informati- on) utilizando el algoritmo BLAST. 33 4. ANÁLISIS DE LOS DATOS 4.1 VARIABLES FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS SISTEMAS PRODUCTIVOS DE LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA EN LOS Para determinar las variaciones entre las condiciones físicas, químicas e hidrológicas que se presentaron entre los diferentes ríos estudiados, se empleó el Análisis de Componentes Principales (ACP), que corresponde a una técnica estadística lineal de simplificación y reducción de la dimensionalidad de un conjunto de datos. Permite evaluar grandes matrices de registros fisicoquímicos (múltiples estaciones y variables) y su principal ventaja consiste en conjugar en unas pocas variables llamadas componentes, alta cantidad de información con base en las correlaciones existentes (Ramirez & Viña, 1998). Previo al análisis, los datos fueron transformados con Log (X+1) y ajustados a desviación estándar. El análisis de ACP se realizó mediante el programa Statistic 6.0 (StarSoft, 1995). 4.2 ÍNDICE DE CALIDAD DE AGUA La calidad del agua de cada río en los diferentes sistemas productivos estudiados se determinó mediante el índice de calidad de aguas de la “National Sanitation Foundation Water Quality Index” NFSI (Brown et al., 1970) el cual utiliza los parámetros: DBO (mg/l), temperatura (ºC), turbidez (NTU), pH, oxígeno disuelto (% saturación), coliformes fecales, fosfatos (mg/l), nitratos (mg/l), sólidos disueltos totales. La escala de valores del índice está entre 0 y 100, con las calificaciones de: Excelente: 91-100; Buena: 71-90; Regular: 51-70; Deficiente: 26-50; Mala: 0-25. El procedimiento realizado para determinar la calificación de calidad de agua de cada río en cada sistema productivo fue el siguiente: a) se determina para cada variable un valor ponderado según una curva específica y se obtiene el valor Q. b) Este valor se multiplica por el peso respectivo según la importancia relativa de cada variable (W). 34 c) La suma de los productos (Q*W) d) El resultado obtenido es el valor del NSFI (Brown et al., 1970). 4.3 ANÁLISIS DE ORDENACIÓN DE LOS DATOS DE LA COMPOSICIÓN DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS Para determinar los patrones de distribución de las comunidades microbianas se realizó un Análisis de correspondencia (ACO), (Hill & Gauch, 1980). El ACO es una técnica jerárquica aglomerativa que analiza las muestras en forma individual para fusionarlas sucesivamente en grupos de tamaño creciente, hasta que todas las muestras son sintetizadas en un sólo grupo. El análisis fue utilizado para observar patrones en la distribución de las comunidades de microorganismos, y se utilizó el programa PC-ORD 4.0 (McCune & Mefford, 1999). 4.4 RELACIÓN ENTRE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS, E HIDROLÓGICOS CON LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EN CADA SISTEMA PRODUCTIVO Para estudiar la relación entre los filogrupos u OTUs y las variables ambientales se realizó un análisis de Correspondencia Canónica (ACC) por medio del programa PC-ORD 4.0 (McCune & Mefford, 1999). El ACC es una técnica de ordenación directa y representa además un caso especial de regresión múltiple donde la composición de especies está directamente relacionada con las variables ambientales, muestra cómo la composición de la comunidad varía en función del ambiente (Kent & Coker, 1992). En el ACC se tuvieron en cuenta variables ambientales fisicoquímicas, microbiológicas e hidrológicas a partir de los análisis del ACP. Se desarrolló el test de Montecarlo (999 permutaciones, α=0,05) con el objeto de establecer si los valores característicos de los primeros ejes de la ordenación y los valores de 35 correlación entre las especies y las variables ambientales obtenidos con el análisis eran estadísticamente significativos (P< 0.05). Para graficar los resultados arrojados por los diferentes análisis multivariados (ACP, ACO y ACC), se utilizó el programa Sigmaplot 6.0 (Brannan, 2000). Los gráficos se representaron teniendo en cuenta los sistemas productivos y la época climática. Los resultados de estos análisis permiten establecer las principales variables que afectan a la comunidad microbiana en la cuenca estudiada. 36 5. RESULTADOS 5.1 CALIDAD DEL AGUA Y VARIABILIDAD FÍSICA, QUÍMICA E HIDROLÓGICA Los ríos estudiados, se caracterizaron por presentar sustratos finos y rocosos de diverso tamaño desde grava particulada hasta roca (Tabla 4). El sistema productivo ganadería de carne en particular, presentó un tipo de sustrato fino y cobertura riparia escasa (menor al 25%), a diferencia del sistema productivo ganadería de leche, en el cual predominó un tipo de sustrato rocoso y cobertura riparia completa (mayor al 70%). En este sistema se protegen las riberas de los ríos con bosques naturales. La vegetación ribereña predominante se encontró conformada en su mayoría por herbáceas, árboles y arbustos, igualmente se encontraron plantaciones de guadua, jengibre, frutales y heliconias. En el sistema productivo cultivos mixtos en algunos casos, se protege las riberas de los ríos con vegetación herbácea (Tabla 4). 37 Tabla 4. Características morfométricas de los ríos de la Cuenca La Vieja Sistemas productivos Ganadería de Carne Ganadería de Leche Río Sustrato TieL Porv Flor Fino y raíces Fino Fino y raíces TesB Roca y fino Roca, grava fina y hojarasca VillaX Son Grava particulada, fina y guijarros Fino SanB Fino y raíces Des Guijarros, grava particulada arena Com Cultivos Mixtos Tipo de vegetación riparia Pastizal Árboles, arbustos, herbáceas Vegetación riparia (%) 25 Herbácea y guadual Gramineas 75 Árboles de naranja Cafetales Cafetales Herbácea y guadual Herbácea Árboles, arbustos, herbáceas Cultivo dominante 25 Cafetales En cuanto a las variables químicas, los ríos presentaron pH con una tendencia neutra y débilmente básica. Los valores de conductividad se encuentran entre los rangos reportados para otros ríos andinos de bajo orden (Diaz & Rivera 2004) y fueron mas altos en los ríos del sistema productivo ganadería de carne. El sistema productivo ganadería de leche, presentó valores altos en la concentración de oxígeno disuelto y obtuvo los valores más bajos en las concentraciones de los nutrientes nitratos y fosfatos (Tabla 5), a diferencia de los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos, los cuales presentaron los mayores valores promedios en turbiedad, sólidos totales, alcalinidad y temperatura. Respecto a las características hidrológicas, los mayores valores de caudal, velocidad de la corriente y ancho del canal se encontraron en el sistema productivo cultivos mixtos (Tabla 5). 38 Tabla 5. Resumen de las variables físicas, químicas e hidrológicas registrados en cada tramo de los ríos en estudio en la cuenca del río La Vieja Ganadería de carne Variables Ganadería de leche TieL Por Flo VillaX TesB SanB Son Des Com Sec lluv Sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv Temperatura ºC 23.5 24.3 24 24.3 24.2 22.1 19.9 19 19.3 19.6 Oxigeno disuelto (mg/l) 4.6 2.7 3.8 2.6 7.1 6.3 6.6 7.1 6.9 Conductividad (µS/Cm) pH 160 210 142 182 118 116 59.6 48.9 7.1 6.1 6.8 6.1 7.3 6.2 7.5 alcalinidad (mg/lCaCo3) 60 Color (UPC) 5 Turbiedad (UNT) 3.5 64 60 58 42 42 10 5 10 5 3.1 6.5 7.4 132 80 104 2.5 2.5 Sólidos Totales (mg/l) Sólidos Suspendidos Totales (mg/l) Cultivos Mixtos 26.9 21.8 24 22 23.9 20.6 21.3 22.9 6.4 6 5.3 6.8 6.4 6.6 7.3 7.8 6.8 65.4 76 72.3 78 75 76.7 58.5 68 78.6 67 7 7.3 7.3 6.9 7.6 7.3 6.1 6.9 6.2 7.7 6.3 22 18 28 22 26 28 28 30 24 26 28 30 10 5 10 5 5 5 15 5 5 5 5 5 5 14 8.3 2.7 2 2.6 2.5 9 8.5 5.4 3.3 3.4 2.7 3.9 5 76 120 72 80 32 24 34 124 44 60 40 44 36 40 52 6 8 25 9 2.5 6 2.5 2.5 26 5 13 2.5 8 2.5 7 13 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 Demanda Biológica de Oxígeno (mg/l) Nitrógeno Total K (mg/l) >2 >2 2.24 1.12 3.92 0.56 1.68 0.56 1.12 0.56 2.8 0.56 1.6 0.56 2.2 0.56 1.1 0.56 0.5 0.56 Fósforo Total (mg/l) 0.04 0.06 0.07 0.05 0.05 0.05 0.01 0.02 0.01 0.06 0.02 0.04 0.01 0.02 0.01 0.01 0.02 0.04 39 Ganadería de carne TieL Por Flo Sec lluv Sec lluv sec lluv Ganadería de leche VillaX TesB sec Lluv sec lluv 0.15 0.07 0.09 0.01 0.13 0.07 0.04 0.15 0.15 0.2 0.3 0.4 0.1 0.75 0.3 0.44 0.05 Fosfatos PO4 0.1 0.14 0.2 0.12 0.14 0.1 0.02 (mg/l) 20 7.5 24 9.3 17.2 13 (m3s) 0.01 0.02 0.01 0.01 0.06 (cm/s) 0.04 0.11 0.03 0.21 4E 6.1E 3.2E +03 80 Variables Amonio NH4 (mg/l) Nitratos NO3 SanB sec lluv Cultivos Mixtos Son Des sec lluv sec lluv Com sec lluv 0.07 0.07 0.07 0.11 0.01 0.09 0.07 0.07 0.04 0.1 0.05 0.6 0.05 0.6 0.3 0.5 0.2 2.2 0.05 0.03 0.03 0.14 0.05 0.07 0.03 0.03 0.03 0.02 0.05 0.07 11.2 28 22 29.2 14 36 22 13 13.2 12 12 7.5 0.05 0.003 0.08 0.006 0.006 0.085 0.074 0.039 0.035 0.057 0.06 0.24 0.515 0.08 0.13 0.01 0.14 0.01 0.12 0.19 0.39 0.21 0.22 0.13 0.35 0.2 0.65 1.12E 3.4E 9.6E 1.7E 1.3E 1.4E 7.2E 4.7E 3.4E 6.3E 6.8E 1.8E 7.3E 3.2E 1.6E +04 +04 +04 +03 +03 +04 +04 +03 +03 +04 +04 +03 +04 +03 +04 +04 90 240 380 160 230 670 270 420 80 1100 160 150 270 340 840 920 Silice (SiO ) Caudal Velocidad Coliformes (UFC/100ml) +04 Ecoli (UFC/100ml) 150 40 El índice de calidad NSFI osciló entre regular y bueno en todos los sistemas productivos (Tabla 6), con valores de coliformes fecales <1000 UFC/100 ml y DBO<2mg/l (Rivera et al., 2007). El sistema productivo con mejor calidad de agua fue ganadería de leche (durante la época de lluvia). La menor calidad (calificación regular) la presentaron los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos respectivamente. Según la información obtenida de las encuestas realizadas a los dueños y/o administradores de las fincas, el sistema productivo ganadería de carne utiliza abonos y fertilizantes en áreas de pastizal y en menor proporción en zonas cultivadas con cítricos y plátano (Anexo 2). En el sistema productivo cultivos mixtos se realizan prácticas de manejo donde utilizan agroquímicos para eliminar plagas y malezas y en algunas fincas se protege de la erosión del suelo (Anexo 2). El 77% de las fincas asociados a los sistemas productivos implementan pozos sépticos para el tratamiento de agua residuales. Sin embargo, no existe la práctica de hacer mantenimiento ni limpieza a los pozos. Las demás fincas, vierten las aguas de desechos directamente al río. 41 Tabla 6. Valor promedio del índice de calidad del agua NSFI (Brown et al., 1970) en los ríos de los diferentes sistemas productivos estudiados en la cuenca del río La Vieja. Sistema productivo Ganadería de Carne Ganadería de Leche Cultivos Mixtos Calificación NSFI Época Época Fincas TieL Por Flo VillaX Tes SanB Son Des Com seca lluvia Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Buena Regular Regular Regular Regular Regular Buena Regular Regular Regular Regular Con relación a la época climática, la calidad del agua de los ríos en la mayoría de los sistemas productivos no varió; sin embargo, en el sistema productivo ganadería de leche, el agua disminuyó de buena en el periodo de sequía a regular en la época de lluvia. Mediante el análisis de componentes principales ACP se resumieron los patrones físicos, químicos e hidrológicos de los ríos estudiados. Para el análisis se tuvieron en cuenta 22 variables ambientales. Los resultados indicaron que la suma de la varianza acumulada para los dos primeros factores, explicaron el 48 % de la variación entre las muestras (Figura 3 y Anexo 3). El primer componente presentó las mayores correlaciones positivas (>0,5) con conductividad, concentraciones de fosfatos (PO4), fósforo total (PT), sólidos totales (ST) y turbiedad. Este componente presentó correlaciones negativas con el oxigeno disuelto y la altitud. (Figura 3). Este comportamiento se encuentra asociado con el tipo de sistema productivo. De esta forma, el sistema productivo ganadería de leche, 42 presentó una correlación positiva con oxígeno disuelto y altitud, en comparación con el sistema productivo ganadería de carne, el cual presentó una correlación con los nutrientes (Figura 3a). El segundo componente presentó correlaciones positivas con la velocidad. Sin embargo separa al sistema productivo cultivo mixto de los demás sistemas productivos. Este sistema, también se caracterizo por presentar mayores valores relacionados con los nutrientes (Figura 3). En cuanto a la estacionalidad climática, se encontró una tendencia al aumento en los valores de variables como velocidad de la corriente, caudal y profundidad en el periodo de lluvias, en todos los sistemas estudiados. Sin embargo, este periodo presentó disminuciones en los valores de ciertos parámetros como amonio, nitratos sólidos totales y sólidos suspendidos totales (Figura 3b). 43 1,0 Veloc E Factor 2 : 16.67% 0,5 Temp Color Q N D S H Cond Alca Turb SST ST PT PO4 Ecoli 0,0 NO3 Ancho Oxi Altitud ColiT -0,5 NTK Prof SiO2 NH4 pH -1,0 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 Factor 1 : 31.12% 4 3 b 3 2 2 1 1 Eje 2 Eje 2 4 a 0 0 -1 -1 -2 -2 Ganaderia Leche Ganaderia Carne Cultivos Mixtos -3 a -3 Època seca Època lluvia b -4 -4 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 -6 -4 -2 0 5 2 4 6 8 Eje 1 Eje 1 c 4 LaCom2 TieLa2 Porve2 3 LaSon2 ElDes2 Factor 2: 16.67% 2 LaFlo2 StaBa2StaBa1 1 ElDes1 0 LaCom1 LaSon1 ViXim1 TesBa2 -1 -2 LaFlo1 TieLa1 ViXim2 TesBa1 Porve1 -3 -4 c -5 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 Factor 1: 31.12% Figura 3. Ordenación de las variables ambientales mediante el análisis de componentes principales (ACP): a) Ordenación de los ríos respecto al sistema de producción b) Ordenación de los ríos según la época de muestreo c) Ordenación de los ríos respecto a las fincas. 44 5.2 RECUENTO TOTAL DE CÉLULAS POR TINCIÓN CON DAPI Las densidades microbianas variaron entre 3.80x108 y 7.04x109 células/ml, en todos los sistemas productivos. El máximo valor se registró en sistema productivo ganadería de carne, en el río Tierra Labrantía con un valor de 7.04x109 células/ml durante la época de lluvia, seguidos por ganadería de leche, en el río Villa Ximena con un valor de 9.11x108 células/ml y cultivos mixtos con un valor de 9.05x108 en la época de sequía. En este sistema, los mayores valores en los recuentos se presentaron durante la época de sequía (Tabla 7). Tabla 7. Conteo de los microorganismos presentes en las muestras de sedimentos obtenidos durante el estudio. Sistemas productivos Ganadería de Carne Ganadería de Leche Cultivos Mixtos Conteo de células/ml Época seca Época lluvia 8 3.95X10 7.04x109 6.43x107 4.37x108 8 4.11x10 4.60x108 7.70x108 9.11x108 8 7.05x107 8.24x10 4.67x108 4.77x108 5.92x108 4.55x108 8 6.99x10 3.88x108 3.80x108 9.05x108 Fincas Tiel Por Flo VillaX Tes SanB Son Des Com 5.3 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES MICROBIANAS Los perfiles de DGGE de los fragmentos del gen16S rRNA bacterial amplificados por PCR son mostrados en la figura (4). Cada banda representa un OTUs o filogrupo y las flechas indican las bandas que fueron seleccionadas para su secuenciación. En el análisis del gel un total de 52 bandas fueron detectadas en las 18 muestras procesadas. El número de bandas por muestras varió entre 19 y 31, de las cuales el 37% se repitieron en todas las muestras, el 49% aparecieron de 4 a 8 veces en algunas muestras y un 14% de bandas se presentaron en una o dos muestras. 45 T ie M Época Seca L (G C) Por v( G C) F lo r( G C) V il l X (G L) Tes (G L ) San B (C M) So n (C M) De s(C M) Co m (M C) T ie L(G C) Po rv( G C) F lo r( G C) V i ll X(G L) Tes (G L ) San B(C M) So n(C M) De s(C M) Co m (C M) Época Lluvia Bv1a1 M Bv1a2 Bv2a1 Bv3b1 Bv4a1 Bv5a1 Bv6b1 Bv7c Bv8c2 Bv9a1 Bv1oa Figura 4. Patrón de diversidad bacteriana de cada sistema productivo durante las épocas de muestreo. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivo mixto; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche. Según el análisis de similitud de Jaccard se observaron dos grupos bien definidos. Las muestras tomadas de los ríos Porvenir, Floresta, Villa Ximena y Tesalia Baja de los 46 sistemas productivos ganadería de carne y ganadería de leche durante la época de sequía, las cuales se agruparon aparte del resto con una similitud de 60%, y el otro grupo integrado por la mayoría de las muestras de los sistemas productivos ganadería de carne, ganadería de leche y cultivos mixtos, en la época de lluvia, con una similitud de 50 %. Dentro de este grupo, se observa un subgrupo aparte, conformado solamente por muestras de los ríos Santa Barbara, Sonora, El Descanso y La Comarca, asociados al sistema productivo cultivos mixtos en la época de sequía, las cuales tienen una similitud de 80% (Figura 5). Figura 5. Agrupamiento de las muestras microbianas de los ríos en la cuenca del río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de Jaccard. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; Tes: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo época de lluvias. 47 Los perfiles de DGGE de los fragmentos del gen16S rRNA para el dominio Archaea amplificados por PCR, son mostrados en la figura (6). Debido a que no todas las muestras amplificaron durante la PCR, en el DGGE solo se cargaron cinco muestras correspondientes a los sistemas productivos ganadería de carne, ganadería de leche y cultivos mixtos de la época de lluvia y tres muestras de los sistemas productivos cultivos mixtos y ganadería de carne de la época de sequía. En el perfil obtenido se observaron un menor número de bandas u OTUs conformados por tres a ocho por muestra. Época seca Co m(C M) Tes (GL ) Vill X(G L) Flo r(G C) Po rv( GC ) So n(C M) Sa nB (CM ) Tie L(G C) Época lluvia AV2b AV1a AV3a1 Figura 6. Perfil de bandas generadas en el DGGE de muestras amplificadas del dominio Archaea sistema productivo durante las épocas de muestreo. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche. 48 En cuanto al índice de similitud de Jaccard para el dominio Archaea, se observaron dos subgrupos (Figura 7). Las muestras de los ríos Floresta, Santa Bárbara, Sonora, Comarca y Tierra Labrantía, asociados a los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos en la época de sequía, con una similitud de 50% y las muestras de los ríos Tesalia Baja y Villa Ximena del sistema productivo ganadería de leche en la época de lluvia, con una similitud de 20%. En estas muestras no se observa un patrón de agrupación con base en la estacionalidad y el sistema productivo. Figura 7. Agrupamiento de las muestras del dominio Archaea pertenecientes a los ríos de la cuenca del río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de Jaccard. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; sistema productivo cultivo mixto; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo época de lluvias. 49 5.4 ÍNDICES DE DIVERSIDAD DE LAS MUESTRAS DE LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS Los índices de diversidad fueron calculados a partir de los análisis del DGGE en cada una de las muestras (Tabla 8) y fueron usados para comparar la estructura de la comunidad microbiana entre las muestras. Los valores de diversidad de de Shannon (H`) estuvieron entre 3.0 a 3.36 y los de y Simpson (1/D), entre 19.93 y 28.93. Respecto a la diversidad microbiana, los índices ecológicos de Shannon (H`), Equidad (EH), Riqueza (S), y Simpson (1/D), presentaron valores similares en las muestras del sistema productivo ganadería de carne, en las dos épocas de muestreo. En el sistema productivo ganadería de leche, las muestras colectadas en el rio Villa Ximena no mostraron diferencias en los valores de los índices, en las dos épocas de muestreo; Sin embargo, en el rio Tesalia Baja, los valores de los índices disminuyeron en la época de lluvia. En cuanto al sistema productivo cultivos mixtos, las muestras tomadas en el rio La Comarca, presentaron una variación notoria en los índices ecológicos, siendo más altos en la época de lluvias que en época de sequía (Tabla 8). En general, el valor máximo de diversidad de Shannon y Riqueza en las muestras de microorganismos se presentó en cultivos mixtos, mientras que el sistema productivo ganadería de carne presento valores bajos en estos índices. También se encontró una alta equidad entre todas las muestras analizadas y no se observó en ninguna muestra dominancia de especies. 50 Tabla 8. Valores de diversidad de Shannon (H`), dominancia de Simpson (1/D), Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en los diferentes sistemas productivos estudiados. Dominio. Bacteria. H’ 1/D EH S Época Época Época Época Época Época Época TieL 3.21 3.25 24.9 26.0 0.99 1.00 25 26 Por 3.0 3.0 19.93 18.98 0.99 1.00 20 19 Flo 3.13 3.0 22.94 20.0 0.99 1.00 23 20 Leche VillaX Tes 3.21 3.33 3.17 3.04 24.97 27.94 24.0 21.0 0.99 0.99 1.00 1.00 25 28 24 21 Cultivos SanB 3.36 3.36 28.93 29.0 0.99 1.00 29 29 Son 3.29 3.36 26.97 29.0 0.99 1.00 27 29 Des 3.29 3.40 26.98 30.0 0.99 1.00 27 30 Com 3.17 3.43 24.0 31.0 0.99 1.00 24 31 Sistema productivo Ganadería de Carne Ganadería de Mixtos Fincas seca lluvia seca lluvia seca lluvia seca Época lluvia Respecto al análisis de diversidad realizados a las muestras para el dominio Archaea, el sistema ganadería de leche presentó los valores mas bajos de diversidad, según los índices de Shannon (H`), Riqueza (S), y Simpson (1/D). A diferencia, de los sistemas productivos carne y cultivos mixtos, los cuales presentaron valores similares (Tabla 9). 51 Tabla 9. Valores de diversidad de Shannon (H`), dominancia de Simpson (1/D), Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en algunas muestras para el Domino Archaea, de los diferentes sistemas productivos estudiados. Sistema productivo H’ Fincas TieL 2.59 Por * Flo * VillaX Ganadería de Carne Ganadería de Leche Cultivos Mixtos Época Seca 1/D Época lluvia Época seca EH Época lluvia 13.29 2.48 Época seca Época lluvia 0.98 * 11.98 * 1.80 * 4.41 * * 1.09 * 2.99 Tes * 1.09 * 2.99 SanB 2.07 * 7.99 Son 2.48 * Des * Com * S Época seca Época Lluvi a 14 0.99 * 12 0.86 * 8 * 0.99 * 3 * 0.99 * 3 0.99 * 8 * 11.97 * * 0.99 * 12 * * * * * * * * 2.39 * 10.97 * 0.99 * 11 *Corresponde a las muestras de ADN que no amplificaron para el dominio Archaea 5.5 SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS OTUS SELECCIONADOS EN EL DGGE Inicialmente, un gran número de bandas fueron cortadas de los geles de DGGE del domino Bacteria, las cuales se chequearon y con base a los criterios de selección (aparición de la banda en el nuevo gel de DGGE realizado con tinción con plata), eran escogidas. 11 bandas prominentes, de diferentes carriles fueron seleccionados con sus respectivas replicas (entre 4 y 6 replicas). 39 OTUs pertenecientes al dominio Bacteria y 9 pertenecientes al dominio Archaea fueron secuenciadas. En total se obtuvieron 48 secuencias de las cuales una vez revisadas, algunas fueron descartadas por mala calidad de la secuencia. 11 secuencias del dominio Bacteria 52 fueron seleccionadas y analizadas utilizando el servidor BLAST del National Centre for Biotechnology Information (NCBI), en la base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). De las secuencias analizadas, 9 pertenecieron a la subclase β-Proteobacteria (BV1a1, BV6b1 BV1a2, BV5a1, BV3b1, BV7c, BV8c2, BV10a, BV4a1) 1 a la subclase αProteobacteria (BV2a1) y 1 perteneció a la subclase γ-Proteobacteria (BV9a1), (Tabla 10). Las bandas u OTUs oseleccionados, se escogieron de la mayoría de los sistemas productivos. A excepción del OTU BV10a, el cual fue obtenido a partir de muestras asociadas a los sistemas productivos ganadería de carne, durante la época de lluvia. En general, el 75% las bandas secuenciadas de las diferentes muestras, pertenecen a la subclase ß-Proteobacteria, representado por el género Variovorax, Rubrivivax y Azoarcus, el 17% de las secuencias perteneció a la subclases α-Proteobacteria y el 8% a γ-Proteobacteria (Tabla 10). Además de las secuencias del dominio Bacteria, se obtuvieron algunas secuencias de Archaea que presentaron similitud con secuencias de organismos no cultivables en muestras ambientales (Tabla 11). 53 Tabla 10. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio Bacteria. Ecosistema donde se aisló el organismo o clon mas cercano a la banda de estudio Banda Grupo Filogenético Relación Filogenética % de Similitud Longitud (pb) GenBank Accesión No BV1a1 ß-Proteobacteria Uncultured bacterium clon:13C-A5 93% 462 AB205697 BV6b1 ß-Proteobacteria 76% 383 DQ110012 BV1a2 ß-Proteobacteria 93% 464 D16213 Suelos BV2a1 α-Proteobacteria Rubrivivax gelatinosus Sedimentos aguas dulces DQ479388 clon 60GS4 92% 201 ß-Proteobacteria Variovorax sp. 76% BV3b1 ß-Proteobacteria Stappia sp. 87% 438 EF203856 BV7c ß-Proteobacteria clon Spb272 94% BV8c2 ß-Proteobacteria Rubrivivax gelatinosus BV9a1 γ-Proteobacteria BV10a ß-Proteobacteria BV4a1 ß-Proteobacteria BV5a1 Uncultured clon 030T7 Osaka et al., 2006 Weber et al., 2006 Gundlapally et al., 2006 No public. DQ432053 Suelos Sherstha et al., 2007 475 AJ422172 Río Brummer et al., 2003 92% 458 D16213 Suelos Hiraishi et al., 1994 Lysobacter sp. 91% 454 AB083480 Miranda et al., 2003 Methylibium aquaticum Aguas Dulces 98% 487 DQ664244 93% 457 AM406670 Suelos Krause et al., 2007 Azoarcus sp. 460 sistema de tratamiento de agua residual Ref. 54 Lago Aguas Dulces Pfannes et al., 2007 Stackebrandt et al., 2008 Tabla 11. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio Archaea Banda AV1a Grupo filogenético Archaea Relación Filogenética Uncultured archaeon Clon: TN-1 BV2b Archaea Uncultured archaeon Clon: SWA05 BV3a1 Archaea; Crenarchaeota Uncultured archaeon Clon: GRU20 % similitud Longitud (pb) GenBank Accesión No 90% 172 AB107814 93% 240 AB294261 96% 173 AY278087 55 Ecosistema donde se aisló Ref. No public. Agua Suelos Shimizu et al., 2007 Ochsenreiter et al., 2003 6. RELACIONES ENTRE LA ESTRUCTURA MICROBIANA Y LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS El Análisis de correspondencia (ACO) se empleó con el fin de analizar los patrones de distribución de las comunidades microbianas respecto a los sistemas productivos. El primer eje del modelo de ordenación explicó un 48% de la variación, mientras que el segundo eje explicó el 18%. Los ríos de los sistemas productivos ganadería de carne y ganadería de leche, presentaron especies compartidas entre sí. Mientras que el sistema productivo cultivos mixtos presentó comunidades microbianas especificas de este sistema, donde se agruparon aparte de los demás sistemas productivos (Figura 8a). La ordenación por estacionalidad mostró un marcado patrón de asociación en función de la época (Figura 8b), en muestras de los ríos Comarca, El Descanso, Sonora y Santa Bárbara, que se encuentran bajo la influencia del sistema productivo cultivos mixtos (Figura 8c). De igual forma, muestras pertenecientes a los sistemas productivos ganadería de carne y ganadería de leche presentaron tendencia a agrupase entre sí. 56 100 100 a b 80 60 60 40 40 20 Eje 2 Eje 2 80 0 -20 20 0 -20 -40 -40 -60 GanaderìadeLeche -60 GanaderìadeCarne Epoca pocaSeca eca Epoca pocade deLluvia Lluvia Cultivosmixtos -80 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Eje1 -80 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Eje1 500 banda 23 banda 24 banda 37 400 300 200 banda 14 banda 16 banda 51 banda 32 banda 27 banda 29 banda 35 banda 7 banda 40 banda 43 banda 12 banda2 banda1 banda 6 banda 38 banda 20 banda 17 banda 34 banda 45 banda4 banda 36 banda 11 banda 39 banda 28 banda3 banda 47 banda 25 banda 49 banda 42 banda 46 Axis 2 100 banda 18 0 banda 50 -100 banda 8 banda 9 banda 10 banda 44 banda 30 banda 21 banda 15 banda 33 banda 26 banda 19 banda 52 -200 banda 31 banda5 banda 13 banda 22 banda 48 -300 banda 41 -400 -400 -300 -200 -100 0 100 200 300 400 500 Axis 1 Figura 8. (a) Agrupación de los OTUs de acuerdo al sistema de producción. (b) Agrupación de los datos de acuerdo al periodo. (C) agrupación de las fincas de acuerdo al sistema productivo. 57 6.1 RELACIÓN ENTRE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS VARIABLES AMBIENTALES Y LAS El análisis de ordenación ACC de las comunidades microbianas es mostrado en las figuras 9 y 10. Las variables que explicaron significativamente la variabilidad de los OTUs fueron fósforo total, nitrógeno total, sólidos totales y temperatura. El primer eje del modelo explicó el 26.5% de la variabilidad, el segundo eje explicó el 14.1%. Sin embargo, el primer eje fue el único que explico significativamente la varianza de los datos, según el test de Monte Carlo con un p<0.05 (Tabla 12). Tabla 12. Test de Monte Carlo. Correlación especies-ambiente. P<0,05 significativos Eje Eigenvalues 1 2 0.17 0.10 % Varianza explicada por cada eje 26.5 14.1 % Varianza acumulada por cada eje 26.5 40.6 p 0.01 0.07 El primer eje se relacionó con sólidos totales (ST) y nitrógeno total (NTK), mientras que el segundo se relacionó con temperatura y fósforo total (PT), (Figura 9). ST y NTK, fueron las variables con una mayor explicación de la variabilidad de los filogrupos (Tabla 13). Tabla 13. Correlación de Pearson con los ejes de ordenación entre los OTUS y las variables ambientales. (r>0.5). Variable Altitud T. Agua NH4 ST NTK PT Eje 1 0.052 -0.236 -0.380 -0.621 -0.784 -0.333 58 Eje 2 -0.166 0.442 0.169 0.186 0.257 -0.423 La ordenación por sistemas productivos indicó que en el sistema productivo ganadería de carne, la mayoría de los OTUs se relacionaron positivamente con las variables fósforo total (PT), nitrógeno total (NTK), sólidos totales (ST) y temperatura. Así mismo, OTUs presentes en el sistema productivo cultivo mixto presentaron una tendencia a agrupares con estas variables. Sin embargo, otros OTUs no presentaron relación alguna con ninguna de las variables ambientales. (Figura 9a). Eje 2: 14.1 banda 24 banda 23 banda 37 banda 45 banda 14 banda 46 banda 36 banda 49 banda 31 banda2 banda 32 banda 51 Temp banda 16 banda 29 banda 40 NTK ST banda 12 banda 43 banda1 banda4 banda 25 banda 34 banda 11 banda 17 banda 42banda 39 banda 35 banda 47 banda 27 PT banda3 banda 13 banda 22 banda 28 banda 18 banda 50 banda 21 banda 52 banda5 banda 19 banda 44 banda 41 banda 33 banda 30 Eje 1: 26.5 Figura 9. Biplot que describe la ordenación de los OTUs (banda) obtenida con el ACC realizado a todas las muestras. 59 2 2 b a 1 Eje 2 Eje 2 1 0 0 -1 -1 EpocaSeca EpocadeLluvia GanaderìadeLeche GanaderìadeCarne CultivosMixtos -2 -2 -2 -1 0 Eje1 1 -2 2 -1 0 Eje1 1 2 StaBa1 c ElDes1 LaSon1 Temp TieLa1 NTK ST ElDes2 TesBa1 LaCom1 LaSon2 LaCom2 ViXim2 Porve2 StaBa2 LaFlo1 TieLa2 PT ViXim1 LaFlo2 Porve1 TesBa2 Figura 10. Ordenación obtenida con el ACC realizado para las comunidades microbianas. (a) Ordenación de los OTUs según las variables para cada sistema de producción. (b) Ordenación de los OTUs según las variables para cada periodo. c) Ordenación de los ríos según las variables ambientales. 60 7. DISCUSIÓN 7.1 CALIDAD DEL AGUA Y CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIABLES FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS EN LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA Las características fisicoquímicas, de los ríos estudiados se encontraron relacionadas con los sistemas productivos predominantes. Sadeghian et al., 1999, en sus estudios encontraron que las características químicas e hidrológicas y la calidad química del agua a lo largo del cauce estaban asociadas al uso del suelo. En general, los sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja, se caracterizaron por presentar calidad del agua entre regular y buena. Los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos, presentaron los mayores valores con respecto a las concentraciones de las variables asociadas con actividades antrópicas como nutrientes, sólidos disueltos y coliformes. De igual forma, presentaron los mayores valores de turbiedad y bajas concentraciones de oxígeno disuelto en el agua, indicando posiblemente mayor carga orgánica. Junto con las modificaciones en la utilización de la tierra, las principales causas que afectan la calidad de las aguas de los ríos estudiados, se relacionan con la contaminación que deriva de los diferentes sistemas productivos. Estas formas de contaminación obedecen al uso de insumos y fertilizantes en los suelos y a los vertimientos de origen doméstico y desechos generados por las actividades agropecuarias. Según Murgueitio (2003), cambios en el uso del suelo (de agrícola a ganadero) en la ecoregión cafetera, prácticas inadecuadas de manejo y bajos niveles de tecnificación generan alteraciones en el ecosistema acuático y en la calidad del agua. Además, la ganadería de pastoreo sin árboles causa un impacto negativo, principalmente por sedimentación de los cauces y aportes de materia orgánica, 61 nutrientes y patógenos que deterioran las corrientes de agua. Así mismo, estudios realizados por Chará (2003), relacionan este estado con la falta de cobertura vegetal y el libre acceso de los animales a los ríos, lo que genera mayores sólidos disueltos en el agua y aumenta la concentración de coliformes fecales. El sistema con mejor calidad del agua fue ganadería de leche, este sistema productivo se caracterizó por presentar cobertura riparia y cercas vivas en los ríos que surten las fincas. Además presentó los valores más altos en concentración de oxigeno, baja turbidez y baja contaminación de los cuerpos de agua. La cobertura riparia genera efectos positivos al regular el exceso de escorrentía (regula caudales), se retienen nutrientes y contaminantes además de otras funciones como la protección del cauce y taludes en zonas pendientes y orillas (Charà, 2003). El nivel de tecnificación presentado por este sistema productivo y la completa cobertura riparia pueden indicar que el tipo de manejo que se le da al sistema influye en la calidad del recurso hídrico. Respecto a la época climática, en el periodo de lluvias se observó una tendencia en la disminución de la concentración de sólidos totales, nitrógeno total y fosfatos en todos los sistemas productivos, lo cual puede estar asociado con los altos caudales y la velocidad de la corriente que favorecen el efecto de dilución y mezcla (Margalef, 1983). 7.2 ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS A partir del análisis multivariado ACO (análisis de correspondencia canónica) y el análisis de similitud de Jaccard, se observó un patrón de distribución definido de la estructura de las comunidades microbianas en el sistema productivo cultivo mixtos. Los ríos de este sistema presentaron una composición microbiana con un similitud del 80%. En este sistema productivo también se observaron los valores más altos de diversidad de Shannon, riqueza y recuentos de abundancia bacteriana en época seca y en época de lluvia. Resultados similares fueron evidenciados en estudios realizados 62 en ríos de los sistemas productivos en la ecorregiòn del eje cafetero donde las diatomeas, peces y macrofitas mostraron una tendencia a presentar valores más altos de diversidad en los sistemas sometidos a una mayor concentración de nutrientes, mayor arrastre de sólidos y escasa cobertura vegetal arbórea o arbustiva (RiveraRondón et al., 2007). Estos resultados se pueden relacionar también con la hipótesis del disturbio medio, donde las comunidades se adaptan a ciertas variaciones. El establecimiento de especies o grupos de especies en el sistema cultivo mixto posiblemente está relacionado con las condiciones morfométricas e hidrológicas que presentaron estos cuerpos de agua. Urbach et al. (2001), plantearon que entre los factores potenciales que influyen en la composición de la comunidad del bacterioplancton en cuerpos de agua dulce se encuentra la ausencia de componente ripario, que permite el transporte de microorganismos terrestres, materia orgánica terrestre y nutrientes al cuerpo de agua. Algunos de estos factores se relacionan con los encontrados en los ríos asociados al sistema cultivo mixtos, donde se presentó una mayor concentración de nutrientes debido en gran medida a la utilización de fertilizantes para los cultivos y a un mayor arrastre de sólidos por la escasa cobertura vegetal favoreciendo la disponibilidad de materia orgánica y nutrientes a los cuerpos de agua. Estas características ambientales posiblemente favorecieron el establecimiento de comunidades microbianas similares que pueden utilizar el mismo recurso y estar adaptadas a estas condiciones. Además, algunos autores sugieren que los nutrientes inorgánicos presentan un impacto en la dinámica de la comunidades bacterianas en ecosistemas acuáticos (Schafer et al., 2000; Rejas et al., 2005; Rubin & Leff, 2007). Backermans & Madsen (2002), afirman que la composición de las comunidades microbianas reflejan las características físicas, químicas, geológicas y biológicas de sus hábitats. Así mismo, Lindstrom et al. (2001), argumentan que las características del medio ambiente en sistemas lóticos influyen en los organismos y por lo tanto seleccionan aquellos taxones que puedan sobrevivir y multiplicarse de manera más 63 eficiente. Sin embargo, pueden existir otros factores ambientales tales como velocidad, temperatura, condiciones de nutrientes, disponibilidad del sustrato, biomasa del fitoplanton entre otros factores (Sekiguchi, et al., 2002; Hahn, 2006; Beier, et al., 2008), los cuales pueden tener influencia en la estructura de las comunidades microbianas que no fueron evaluadas en este estudio. La alta heterogeneidad temporal y espacial que tienen los ecosistemas lóticos pueden potencialmente controlar diferentes aspectos de las comunidades bacterianas las cuales son sensibles a variaciones ambientales, pero estas a su vez, se adaptan y responden a las condiciones naturales. También se observó un patrón definido de las comunidades microbianas de los diferentes sistemas productivos con base a la estacionalidad climática, reflejando la influencia sobre estas comunidades. De igual forma, las variaciones de los índices en algunos sistemas productivos en relación a la época, reflejan la dinámica de las comunidades bacterianas influenciadas probablemente por variaciones ambientales en los sistemas. Se puede sugerir que las condiciones ambientales a las que se encuentran sometidos los diferentes sistemas productivos pueden influir en la diversidad y composición de las comunidades bacterianas, reflejándose en los índices de diversidad calculados. Es así como una amplia gama de factores como los nutrientes, química del agua y la estacionalidad climática puede enmascarar el efecto del uso suelo. Por otro lado, los ríos Porvenir, Floresta y Tierra Labrantía, asociados al sistema productivo ganadería de carne y los ríos Villa Ximena y Tesalia baja, asociados al sistema productivo ganadería de leche, mostraron una asociación de OTUs compartidos. La similitud observada en estas muestras estuvo relacionada con la presencia de OTUs y también ausencia de OTUs en las muestras de estos sistemas productivos. Diferentes investigaciones señalan que existen poblaciones microbianas cosmopolitas en sistemas de aguas dulces, que se pueden adaptar a diferentes condiciones ambientales propias de estos ecosistemas acuáticos (Zwart, et al., 2002; 64 Crump & Hobbie, 2005). Zwart et al., (2002), encontró una marcada relación similitud entre secuencias de rADN recuperadas de lagos diferentes, por lo que es posible encontrar comunidades similares en sistemas de aguas dulces con condiciones ambientales diferentes y que pueden ser relativamente cercanas filogenéticamente (Glockner et al., 2000; Zwart et al., 2002). Las bandas secuenciadas en este estudio, estuvieron relacionadas con grupos filogenéticos típicos de aguas dulces correspondiendo con β- Proteobacteria. La alta detección de filotipos de β- Proteobacteria, sugiere que ellos constituyen un importante componente de la comunidad bacteriana en los ríos de la cuenca del río La Vieja. Similares resultados han sido bien encontrados en muchos estudios de comunidades bacterianas en ambientes de aguas dulces (Araya et al., 2003; Wobus et al., 2003; Kirchman, et al., 2004; Beier et al., 2008). Secuencias afiliadas a la subclase β- Proteobacteria, fueron frecuentemente recuperadas de sedimentos de aguas dulces (Spring et al., 2000) Este grupo de bacterias típicas de aguas dulces tiene una distribución cosmopolita, ellas aparecen incluso en hábitats localizados en diferentes zonas climáticas que consecuentemente difieren en sus condiciones ambientales pudiéndose adaptar a cambios y a nuevas condiciones ambientales (Winter et al., 2006). Así mismo, varios autores han atribuido la presencia de este grupo bacteriano en sistemas acuáticos, por su alta afinidad con los nutrientes y participar en la degradación de contaminantes (Brummer, et al., 2000; Rubin & Leff, 2007). Wobus et al. (2003), indicaron, que el aporte de materia orgánica dendrítica posiblemente favoreció el crecimiento y la actividad de miembros del la subclase βProteobacteria, en muestras de sedimentos de ríos. Por otro lado, la presencia de grupos bacterianos similares a secuencias reportadas en suelos es consistente con lo reportado en otros estudios (Hullar et al., 2005; Beier et al., 2008). Spring et al. (2000), afirman que la composición de las comunidades bacterianas en sedimentos de aguas dulces pueden en gran medida estar influenciadas por interacciones entre el entorno del hábitat acuático y el terrestre. Crump et al. 65 (2005), reportaron la presencia de varios filotipos relacionados con bacterias de suelos, e indicó la potencial importancia de organismos alòctonos en la diversidad del río. De igual forma, estudios de análisis comparativos de secuencias del gen 16S rRNA sugieren que los microorganismos residentes en sistemas lóticos están compuesto de una mezcla de poblaciones provisionalmente atribuibles a ambientes acuáticos y terrestres. En los ríos, el carbón y la energía que entra es derivada de plantas en el ambiente terrestre, por esto seria razonable sugerir que las especies derivadas del suelo tienen capacidades metabólicas necesarias para degradar el carbon orgánico en el río. La incorporación de grupos bacterianos derivados del suelo puede proveer un vínculo biológico entre el ecosistema acuático y el terrestre, que complementado con varios factores físicos y químicos son importantes en la estructura y función de estos ecosistemas acuáticos (Hullar et al., 2005). Además de las secuencias obtenidas del dominio Bacteria, se obtuvieron secuencias representantes del dominio Archaea, las cuales presentaron similitud con secuencias de organismos no cultivables en muestras ambientales. Sin embargo, en las muestras evaluadas para este dominio, se observó una menor riqueza de OTUs comparada con el dominio Bacteria. Es poco lo que se conoce respecto al dominio Archaea en aguas dulces y muy pocos estudios se han realizado sobre diversidad y abundancia de este dominio en estos hábitats acuáticos (Ochsenreiter et al., 2003). En esta investigación, la mayoría de las muestras no amplificaron en la PCR, inconvenientes similares se registraron en estudios por Ochsenreiter et al. (2003). Los problemas en los procesos de amplificación posiblemente estén relacionados con la baja especificidad de los primers utilizados, o debido a la presencia de agentes contaminantes en el extracto de DNA cuya concentración alcanza niveles que inhiben o interfieren con la reacción. 7.3 RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES AMBIENTALES Y LAS COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LOS RÍOS ASOCIADOS A LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA 66 Según el análisis de correspondencia canónica (ACC), las variables que mejor explicaron la distribución de microorganismos en los ríos de los sistemas productivos estudiados, fueron NTK, ST, PT y temperatura. Los nutrientes se asocian con el uso del suelo y el manejo del recurso hídrico en cada sistema productivo. La importancia de los nutrientes en las comunidades microbianas está relacionada con el papel que cumplen en la transformación y mineralización de los nutrientes, así como también para mantener el flujo de energía en las redes alimenticias de los ecosistemas acuáticos. Relaciones entre los nutrientes y los microorganismos han sido reconocidas en diferentes ecosistemas acuáticos. Estos resultados concuerdan con los reportados por otros estudios que indican que las fuentes abióticas como los nutrientes son los principales factores que determinan la estructura de las comunidades en sistemas lòticos (Lavrentyev, et al., 1998; Kent, et al, 2004; Rubin & Leff, 2007; Beier, et al., 2008). Van der Gucht et al. (2005), reportaron, que la composición taxonómica del bacterioplanton, en el lago Blakaart puede estar influenciada con altos valores de materia suspendida y altas concentraciones de nitrógeno disuelto. De igual forma, Rubin & Leff, 2007, reportaron que ciertos grupos bacterianos (Cytophaga-Flavobacterium) y el recuento total bacteriano tuvieron un positiva correlación con concentraciones de nitratos y nitritos. Así mismo, ha sido reportado, Simek y colaboradores (2006), encontraron una relación significativa, entre la disponibilidad de fósforo (P), y el crecimiento de diferentes grupos taxonómicos de bacterias en aguas dulces. Otros estudios han mostrado que el crecimiento bacterial puede ser estimulado por adición de fósforo inorgánico, o nitrógeno (N) inorgánico, ya sea por si solos, o en combinación con fósforo inorgánico y carbón orgánico (Vrede et al., 1999; Castillo, et al., 2003). Los nutrientes inorgánicos como nitrato, amonio o fosfatos son fuente importante para el crecimiento bacteriano (Castillo et al., 2003; Rejas et al., 2005; Freese et al., 2007). La disponibilidad de nutrientes inorgánicos en ríos de la cuenca La Vieja, están asociados, en su mayoría a los efectos generados por el uso agrícola de los suelos. Además, de la eliminación parcial o total de la cobertura riparia que causa el 67 arrastre de nutrientes (nitratos, ortofosfatos, fósforo total y abonos) y sedimentos. Estas características se presentaron principalmente en los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos, en los cuales la distribución de las comunidades microbianas estuvo asociada con los nutrientes. La temperatura es otro factor ambiental considerado por varios autores como importante en la distribución de comunidades bacterianas en ecosistemas acuáticos (Hahn, 2006; Hullar et al., 2005). Lindstrom et al. (2005), reportaron, que la temperatura fue una de las variables ambientales que explicaron la variación en la distribución de grupos bacterianos entre lagos. De igual forma, Hullar y colaboradores (2005), evidenciaron la correlación de la temperatura con cambios en la estructura de la comunidad en sedimentos de ríos. 68 8. CONCLUSIONES Los ríos pertenecientes a los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos presentaron un mayor impacto sobre la calidad del agua en la cuenca del rio la Vieja. Estos sistemas se caracterizan por presentar mayores concentraciones de nutrientes y menores concentraciones de oxígeno. La eliminación parcial o total de la cobertura riparia, el uso de agroquímicos y el vertimiento de aguas residual a los cuerpos de agua, tienen un efecto directo sobre la calidad del recurso hídrico en los ríos de los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos mixtos. A diferencia de sistema productivo ganadería de leche, el cual presentó la mejor calidad del agua, debido en gran medida a las buenas técnicas de manejo como el mantenimiento de la cobertura vegetal en los bordes de los ríos y la utilización de sistemas para el tratamiento del agua residual. Existe un patrón definido de las comunidades microbianas de los diferentes sistemas productivos con base a la estacionalidad climática, reflejando la influencia sobre estas comunidades. Las condiciones ambientales e hidrológicas a las que se encuentran sometidos los diferentes sistemas productivos de estudio, pueden influir en la estructura y composición de las comunidades bacterianas. De esta manera, una amplia gama de factores como los nutrientes, química del agua y la estacionalidad climática pudieron enmascarar el efecto del uso suelo. Las comunidades microbianas presentes en los ríos asociados al sistema productivo cultivo mixto, mostraron en general una diversidad mas alta en comparación con los demás sistemas, explicado posiblemente por la concentración de nutrientes incrementado en gran medida por la utilización de fertilizantes para los cultivos y a un mayor arrastre de sólidos por la escasa cobertura vegetal, lo que permite una mayor disponibilidad de materia orgánica y nutrientes a los cuerpos de agua. Lo cual 69 indica que posiblemente las condiciones físicas y ambientales del sistema productivo favorecieron el establecimiento y diversidad de estas comunidades. Las variables que principalmente explicaron la variabilidad de las especies en los ríos estudiados fueron, NTK, ST, PT y temperatura. Estas variables están relacionadas con los impactos de los sistemas productivos. Los ríos pertenecientes a los diferentes sistemas productivos se caracterizaron por presentar comunidades microbianas pertenecientes a la subclase B-Proteobacteria, representantes importantes en los sistemas de aguas dulces. 70 9. RECOMENDACIONES Para estudios posteriores, se recomienda realizar más muestreos con el fin de monitorear las comunidades microbianas a lo largo del tiempo y encontrar un mayor número de correlaciones entre estas comunidades y su ambiente. Se recomienda realizar estudios posteriores en donde se tengan en cuenta otras variables que puedan influir en la composición de las comunidades microbianas. Para estudios posteriores se recomienda el uso de primers específicos, para estudiar la estructura de las comunidades microbianas seria importante para determinar que grupos funcionales prevalecen en los ríos y determinar que procesos ecológicos están llevando a cabo en los hábitats que ocupan. 71 BIBLIOGRAFIA ALLAN, D., 1995. Stream Ecology. Structure and function of running waters. Kluwer Academic Publishers. USA 388 p. ALVAREZ, S. 2005. La descomposición de materia orgánica en humedales: la importancia del componente microbiano. [En línea]. Dirección General para la Biodiversidad. Ministerio de Medio Ambiente. Gran Vía San Francisco 4, E-28005 Madrid. España. http://www.revistaecosistemas.net/articulo.asp?Id=118 [Consulta: 10 ene.2008]. AMAYA, H., Bedoya, L., Herrera, G., Ospina, G., De Salazar, T., Rodríguez, U., Gaviria, C., Montealegre, J., Bernal, M., Valencia, E., Sanchez, R. 2005. Plan de ordenamiento territorial del la Cuenca río La Vieja. Diagnóstico. 223 p. ARAYA, R., Tani, K., Takagi, T., Yamaguchi, N. 2003. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiology. 43: 111-119. AZAM, F. 1998. Microbial control of oceanic carbon flux: The plot thickens. Science. 280:694-696. AZAM, F., Field, JG., Gray, J.S., Meyer, L.A., Thingstad, F. 1983. The ecological role of water-columm microbes in the sea. Mar Ecol progr ser. 10: 257-263. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (APHA), 2006. Standard methods for the examination of water and wastewater. Amer. Pub. Heal. Asoc., Washington. p. 1536. 72 BAKERMANS, C and Madsed, E.L. 2002. Diversity of 16S rDNA and Naphthalene Dioxygenase Genes Coal-Tar-Waste-Contaminated Aquifer Water. Microbiology Ecology. 44: 95-106. BARON, J.S., Poff, L.N., Angermeier, P.L., Dahm, N.C., Gleick, P.H., Hairston, N.G., Jackson, B.R., Johnston, C.A., Richter, B.D., Steinman, A.D. 2003. Ecosistemas de Agua Dulce Sustentables. Sociedad Norteamericana de Ecologia. [en linea] Tópicos en ecología. http://www.esa.org/science_resources/issues/FileSpanish/ issue10.pdf [Consulta: 10 dic. 2007]. BEIER, S., Witzel, K.P and Marxsen, J. 2008. Bacterial Community Composition in Central European Running Waters Examined by Temperature Gradient Gel Electrophoresis and Sequence Analysis of 16S rRNA Genes. Applied and Environmental Microbiology. 74: 188-199. BOON, N., Windt, W.D., Verstraete, E.M. 2002. Evaluation of nested PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) with group-specific 16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different wasterwater treatment plants. FEMS Microbiology Ecology. 39: 101-112. BRANNAN, T. 2000. SigmaPlot 2000 for Windows. Versión 6.0. BRETT, M., Lubnow, F. S., Villar-Argaiz, M., Müller-Solger, A and Goldman, C. 1999. Nutrient control of bacterioplankton and phytoplankton dynamics. Aquatic Ecology. 33: 135-145. BROWN, R., McClelland, N., Deininger, R., Tozer, R. 1970. The Public Health and Safety Company National Sanitation Foundation NFSI. [en linea] Water Quality Index. http://www.nsf.org/consumer/just_for_kids/wqi.asp [Consulta: 20 nov. 2007]. BRÜMMER, H., Felske, A., Do¨bler, W. 2003. Diversity and Seasonal Variability of B-Proteobacteria in Biofilms of Polluted Rivers: Analysis by Temperature Gradient 73 Gel Electrophoresis and Cloning. Applied and Environmental Microbiology. 69: 4463-4473. BRÜMMER, I.H.M., Fehr, W and Doblar-Wagner, J. 2000. Biofilm community structure in polluted rivers: abundance of dominant phylogenetic groups over a complete annual cycle. Applied and Environmental Microbiology. 66: 3078-3082. BATTIN, T., T. J., Wille, A., Sttler, B and Psenner, R. 2001. Phylogenetic and functional heterogeneity of sediment biofilms along environmental gradients in a glacial stream. Applied and environmental microbiology. 67: 609-620. BURGMANN, H., Meier, S., Bunge, M., Widmer, F and Zeyer, J. 2006. Effects of model root exudates on structure and activity of a soil diazothoph community. Environmental Microbiology. /: 1711-1724. CANOSA. A and Pinilla, G. 2006. Relaciones entre las abundancias del bacterioplancton y del fitoplancton en tres ecosistemas lénticos de los Andes Colombianos. Rev. Biol. 55: 135-146. CARDER, COPROCALDAS, CVC, CORTOLIMA, UAESPNN, CRQ, Corporación Alma Mater, Universidad de Caldas, Universidad del Quindío, Universidad del Tolima, Universidad Tecnológica de Pereira, ESAP, Universidad Nacional Sede Manizales 2004. Ecorregión Eje Cafetero: un territorio de oportunidades. Pereira, 34 p.http://www.corpocaldas.gov.co/adminsite/archivos/agenda[Consulta: 17 Oct. 2007]. CASAMAYOR, E. 2006. Recuento de bacterias por epifluorescencia. Centro de estudios avanzados de Blanes (CEAB). España. CASTILLO, M., Kling, G.W., Allan, D.J. 2003. Bottom-up Controls on Bacterial Production in Tropical Lowland Rivers. Limnology and Oceanography. 48: 14661475. 74 CIEBREG, Centro de Investigaciones en Biodiversidad y Recursos Genéticos, 2004. Valoración de bienes y servicios derivados de la biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales colombianos. 5-30 p. CHARÁ, J., 2003. Interactions between biodiversity and land use in low-order stream catchments of the Colombian Andes. Tesis de Doctorado. Institute of Aquaculture University of Stirling Stirling 204 p. CONNOLLY, G.R and Patel, Bharat. 2002. Development of fluorescent adjacent hybridization probes and their application in real-time PCR for the simultaneous detection and identification of Fervidobacterium and Caloramator. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52: 1837–1843. COTTRELL, M.T and Kirchman, D.L. 2000. Natural Assemblages of Marine Proteobacteria and Members of the Cytophaga-Flavobacter Cluster Consuming Lowand High- Molecular-Weight Dissolved Organic Matter. Applied and Environmental Microbiology. 66: 1692-1697. CRUMP, B.C., Armbrust, E.V and Baross, J. 1999. Phylogenetic Analysis of Particle-Attached and Free-Living Bacterial Communities in the Columbia River, Its Estuary, and the Adjacent Coastal Ocean. Applied and Environmental microbiology. 65: 3192-3204. CRUMP, Byron and Hobbie, E. 2005. Syncrony and seasonality in bacterioplankton communities of two temperate rivers. Limnol. Oceanogr. 50:1718-1729. DÍAZ, C., Rivera-Rondón, C. 2004: Diatomeas de pequeños pequeños ríos andinos y su utilización como indicadoras de condiciones ambientales. Caldasia 26, 381-394. DIEZ, B., Pedros-Alio, C., Marsh, T.L., Massana, R. 2001. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the diversity of marine picoeucariotic 75 assemblages and comparision of DGGE with other molecular techniques. Applied and Environmental Microbiology. 67: 2942-2951. DWIVEDI, P.P., Patel, B.K., Rees, GN and Ollivier, B. 1996. A Rapid Method for Sequencing of rRNA Gene(s) Amplified by Polymerase Chain Reaction using an Automated DNA Sequencer. Indian Journal of Microbiology. 36: 9-72. ETTER, A., 1994. Consideraciones acerca de la agricultura sostenible. Instituto de Estudios Ambientales para el desarrollo IDEADE. Ambiente y desarrollo. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias Económicas y Administrativas 2 (2): 3959. FAZI, S., Amafitano, S., Pernthaler, J., Puddu, A. 2005. Bacterial communities associated with benthic organic matter in headwater stream microhabitats. Environmental Microbiology. 10: 1633-1640. FINLAY, J. C., 2001. Stable-Carbon-Isotope ratios of river biota: Implications for energy flow in lotic food webs. Ecology 82: 1052-1064. FREESE, H.M., Gors, S., Karsten, U., Schumann, R. 2007. Dissolved inorganic nutrients and organic substrates in the River Warnow (North-Eastern Germany) – Utilisation by bacterioplankton. Limnologica. 37: 264–277. FROMIN, N., Hamelin, J., Tarnawski, S., Roesti, D., Miserez, J.K., Forestier, N., Cuvelle, T.S., Gillet, F., Aragno, M., Rosi, P. 2002. Statical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGGE) fingerprinting patterns. Environmental Microbiology. 4:634 - 643. FUHRMAN, J.A., Ammerman, J W and Azan, F. 1980. Bacterioplakton in the coastal eutrophic zone: distribution, activity and possible relationships with phytoplankton. Mar Biol. 60: 201-207. 76 GLOCKNER, F.O., Zaichikov, E., Belkova, N., Denissova, L., Pernthaler, J., Pernthaler, A. 2000. Comparative 16S rRNA Analysis of Lake Bacterioplankton Reveals Globally Distributed Phylogenetic Clusters Including an Abundant Group of Actinobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 66: 5053-5065. GOMES, E.A.T & Mendoça H. 2004. Bacterial community structure in two sediments with different organic matter content of a tropical coastal lagoo (Brazil). Acta limnol. Bras., 16 (1): 11-23. GROSSKOPF R., Janssen, P.H and Liesack, w.1998. Diversity and Structure of the Methanogenetic comunity in anoxic rice Paddy Soil microccosmos as examided by cultivation and direct 16s rRNAgene sequence retrieval. App Environ Microbial 64: 960-969. Lane, D.J. 1991 16S/23S rRNA Secuencing-Nucleic acid Tecniques in bacterial systematics: 142-175. GUNDLAPALLY, Reddy Sathyanarayana and Pichel-Garcia Ferran. 2006. The Community and Phylogenetic Diversity of Biological Soil Crusts in the Colorado Plateau Studied by Molecular Fingerprinting and Intensive Cultivation. Microbial Ecology. 52: 345-357. HAHN, Martin, W. 2006. The microbial diversity of inland waters. Environmental biotechnology. 17:256–261. HAHN, Martin. W and Hofle, Manfred. G. 2001. Geazing of protozoa and its effect on populations of aquatic bacteria. FEM Microbiology Ecology. 35: 113-121. HIRAISHI, A., 1994. Phylogenetic affiliations of Rhodoferax fermentans and related species of phototrophic bacteria as determined by automated 16S rDNA sequencing. Curr Microbol. 28: 25-29. 77 HUGHES, J and Bohannan. 2004. Application of ecological diversy statistics in microbial ecology. Kluwer Academia Publishers. Nertherlands. HULLAR, A.J., Kaplan, A and Stahl, A. 2005. Reccuring Seasonal Dynamics of Microbial Communities in Stream Habitats. Environmental Microbiology. 72: 713722. IDEAM., Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales de Colombia. Estudio Nacional del Agua. 2001. Ministerio del Medio Ambiente. Bogotá Colombia. 256 pp. IZA, O.A. & ROVERE, M. B. 2006. Gobernanaza del agua en América del Sur: Dimensión ambiental. UICN- Serie de política y Derecho Ambiental Nº 53. JURGENS, G., Glöcker, F., Amann, R., Saano, A., Montonen, L., Likolammi, M., Munster, U. 2000. Identification of novel archaea in Bacterioplankton of a boreal forest lake by phylogenetic analysis and fluorescen in situ hybridization. FEMS Microbiology Ecology 34: 45-56. KENT, A.D., Jones, S.E., Yannarell, A.C., Graham, J.M., Lauster, G.H., Kratz, T.K. and Triplett, E.W. 2004. annual Patterns in bacterioplankton Community Variability in a Humic Lake. Microbial Ecology. 48: 550-560. KENT, M., Coker, P., 1992. Vegetation description and analysis. A practical approach. Jhon Wiley & Sons Chichester, New York 363 p. KIRCHMANM, D., Sigda, J., Kapuscinski, R, & Mitchell, R. 1982. Statistical analysis of the direct count method for enumerating bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 44: 376 – 382. 78 KIRCHMAN, L.D., Dittel, A.I., Findlay, S.E., Fischer, D. 2004. Changes in bacterial activity and community structure in response to dissolved organic matter in the Hudson River, New York. Aquatic Microbial ecology. 35:243-257. KOIZUMI, Y., Kojima, H., Fukui, M. 2003. Characterization of depth-related microbial community structure in lake sediment by denaturing gradient gel electrophoresis of amplified 16S rDNA and reversely transcribed 16S rRNA fragments. FEMS Microbilogy Ecology. 46: 147-157. KRAUSE, A., Ramakumar, A., Bertels, D., Battistoni, F., Bekel, T., Boch, J., Bohm, M., Friedrich, F., Hurek, T., Krause, L., Linke, B., McHardy, A., Sarkar, A., Schneiker, S., Ali Syed, A., Thauer, R., Vorhölter, F., Weidner, S., Pühler, A. 2007. LAVRENTYEV, P.J., Bootsma, H.A., Johengen, T.H., Cavaletto, J.F., Gardner, W.S. 1998. Microbial plankton response to resource limitation: insights from the community structure and seston stoichiometry in Florida Bay, USA. Mar Ecol Prog Ser. 165: 45- 57. LEFF, L.G., Browm, B.J., Lemke, MJ. 1999. Spatial and temporal changes in bacterial assemblages of the Cuyahoga River Ohio. Journal of science. 94: 44-48. LEMKE, M.J and Leff, L.G. 1999. Bacterial Populations in an Anthropogenically Disturbed Stream: Comparison of Different Seasons. FEM Microbiology Ecology. 8:234–243. LINDSTROM, E.S., Miranda, P., Agterveld, K and Zwart, G. 2005. Distribution of Typical Freshwater Bacterial Groups Is Associated with pH, Temperature, and Lake Water Retention Time. Applied and Environmental Microbiology. 71: 8201-8206. LINSTROM, E. S. 2001. Investigating Influential Factors on Bacterioplankton Community Composition: Results from a Field Study of Five Mesotrophic Lakes. Microbial Ecology. 42: 598-605. 79 LIU. J. & Leff, L.G. 2002. Temporal Changes in the bacterioplankton of a Northeast ohio (USA) River. Hydrobiologia 489: 151-159. LOWELL, C.R. y Konopka, A. 1985. Primary and bacterial production in two dimictic Indiana lakes. Applied and Environmental Microbiology. 49:485-492. En: La descomposición de materia orgánica en humedales: la importancia del componente microbiano. Ecosistemas 14 (2): 17-29. Mayo 2005. MAGURRAN, A. 1989. Diversidad ecológica y su medición. Ed. Vedra España. p 200 MANZ, W., Potthoff, W., Neu, T. R., Szewzyk, U and Lawrence, J.R. 1999. Phylogenetic Composition, Spatial Structure, and Dynamics of Lotic Bacterial Biofilms Investigated by Fluorescent in Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. Microbial Ecology. p 226 – 237. MARGALEF, R. 1983. Limnología. Ed. Omega. S.A. Barcelona. 1010 p. McCUNE, B., Mefford, M. 1999. PC-ORD. Multivariate analysis of ecological data. Version 4.0. MjM Software Design. Gleneden Beach, Oregon. 237 p. MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE, Corporaciones autónomas Regionales del eje Cafetero: CARDER, COPROCALDAS, CRQ, CVC, CORTOLIMA, Gobernaciones de Risaralda, Caldas, Quindío. 2004. Agenda para el desarrollo sostenible de la Ecorregión Eje Cafetero. Caldas, Risaralda, Quindío, occidente de Tolima y norte del valle del Cauca. Documento base para la expresión de acuerdos regionales – en concertación. 1-16 p. MISKIN, I., Rhodes, G., Lawlor, K., Saunder, JR., Pickup, R.W. 1998. Bacterial in post-glacial freshwater sediments. Microbiology. 144: 2427-2439. 80 MORRIS, D. P., and W. M. Lewis, Jr. 1992. Nutrient limitation of bacterioplankton growth in Lake Dillon, Colorado. Limnol. Oceanogr. 6:1179–1192. MOYER, C. L. 2001. Molecular phylogeny: applications and implications for marine microbiology. Océano [en En Diversidad y Ecología de Organismos Picoeucariontes en el línea] http://www.oceanografia.cl/docs/Seminario_bibliografico.pdf. [Consulta: 15 jun. 2007]. MURGUEITIO, E. 2003. Impacto ambiental de la Ganadería de leche en Colombia y alternativas de solución. Livestock Research for Rural Development 15 (10): 98-115. MIRANDA, C., Kehrenberg, C., Ulep, C., Schwarz, S and Roberts, M. 2003. Diversity of Tetracycline Resistance Genes in Bacteria from Chilean Salmon Farms. MUYZER, G and Smalla, K. 1998. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek 73: 127–141. MUYZER, G., Waal, E.C., Uitierlinden, A.G. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase cahin reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology. 59: 695-700. OCHSENREITER, T., Selezi, D., Quasier, A., Osmolovskaya, L., Schleper, C. 2003. Diversity and abundance of Crenarchaeota in terrestrial habitats studied by 16S RNA surveys and real time PCR. Environmental microbiology. 5: 787-797. OLAPADE, O. A and Leff, G. 2005. Seasonal Response of Stream Biofilm Communities to Dissolved Organic matter and Nutrient Enrichments. Applied and Environmental Microbiology. p 2278-2287. 81 OLAPADE, O.A., Gao. X and Leff, L.G. 2005. Abundance of Three Bacterial Populations in Selected Streams. Microbiology Ecology. 49: 461–467. OSAKA, To., Yoshie, S., Tsuneda, S., Hirata A., Iwami, N., Inamori, Y. 2006. Identification of Acetate- or Methanol-Assimilating Bacteria. Microbial Ecology. 52: 253-266. PASQUINI, A., L. Grosso, A. Mangeaud & P. Depetris. 2002. Geoquímica de ríos de montaña en las Sierras Pampeanas: I. Vertientes y arroyos del batolito de Achala, provincia de Córdoba, Argentina. Revista de la Asociación Geológica de Argentina. 57(4): 437- 444. PERNTHALER J. 2005. Predation on Prokaryotes in the Water column And Its Ecological Implications. Nature Review Microbiology. p 537- 546. PERNTHALER, A., Pernthaler, J. & Amman, R. 2004. Sensitive Multi-Color Fluorescence in situ hybridization for the identification of environmental microorganisms. En: Kluwer Academic Publishers. Molecular Microbial Ecology Manual. Segunda Edición. pp.711-726. PERNTHALER, J and Amann, R. 2005. Fate of Heterotrophic Microbes in Pelagic Habitats: focus on populations. Microbiology and Molecular Biology Review. 69: 440-461. PERNTHALER, J., Glockner, O.F., Unterholzner, S., Alfreider, A., Psenner, R., Amann, R. 1998. Seasonal Community and Population Dynamics of Pelagic Bacteria and Archaea in a High Mountain Lake. Applied and Environmental Microbiology. 64: 4299-4306. PFANNES, R., Vogl, K., Overmann, Jorg. 2007. Heterotrophic symbionts of phototrophic consortia: members of a novel diverse cluster of Betaproteobacteria 82 characterized by a tandem rrn operon structure. Environmental Microbiology. 9: 2782-2794. RAMÍREZ, A., Viña. G., 1998. Limnología Colombiana, aportes a su conocimiento estadístico de análisis 293 p. RANJARD, L., Poly, F., Nazaret, S. 2000. Monitoring complex bacterial communities using culture-independent molecular techniques:application to soil environment. Res. Microiolo. 151: 167-177. REJAS, D., Muylaert, K and Meester, L. 2005. Phytoplankton–bacterioplankton interactions in a neotropical Hydrobiologia: 543: 91–99. floodplain lake (Laguna Bufeos, Bolivia). RIVERA-Rondón, C., Baena, S., Prada-Pedreros, S., Chará, J., Valderrama, L.T., Valdés, C. 2007. Determinación de la calidad y disponibilidad del recurso hídrico en la Ecorregión Eje cafetero con base en la diversidad y funcionalidad de sus ecosistemas acuáticos. Documento interno Centro Biodiversidad y Recursos Genéticos CIEBREG 1-5 pp. de Investigaciones en RUBIN, M.A and Leff, L.G. 2007. Nutrients and Other Abiotic Factors Affecting Bacterial Communities in an Ohio River (USA). Microbiology Ecology. 54: 374– 383. SADEGHIAN S, Rivera JM y Gómez M E 1998. Impacto de sistemas de ganadería sobre las características físicas, químicas y biológicas de suelos en los andes de Colombia. En: Conferencia electrónica de la FAO sobre Agroforestería para la producción animal en Latinoamérica. SADEGHIAN, S., Murgueitio, E., Rivera, J., 1999. Características de Suelos en Sistemas Agropecuarios y Forestales para el Ordenamiento Territorial en el Departamento del Quindío (Colombia). 83 [en línea]. Centro Nacional de Investigaciones de Café (CENICAFE), Manizales – Colombia. Centro para la Investigación en Sistemas Sostenibles de Producción Agropecuaria (CIPAV). Cali, Colombia. http://www.cipav.org.co/redagrofor/memorias99/Siavosh.htm [Consulta: 25 Nov. 2007]. SCHAFER, H., Bernard, L., Courties, C., Lebaron, P., Servais, P., Pukall, R., Stackebrandt, E., Troussellier, M., Guindulain, T., Rego-vives, J., Muyzer, G. 2000. Microbial community dynamics in Mediterranean nutrient-enriched seawater mesocosms: changes in the genetic diversity of bacterial populations. FEMS Microbiology Ecology 34: 243-253. SCHALLENBERG, M., Kalff, J and Rasmussen, J. 1989. Solution to problems in enumerating sediment bacteria by direct count. Applied and Environmental Microbiology. 55: 1214-1218. SCHAUER, M., Massana, R., Pedros-Alio, C. 2000. Spatial diferences in bacterioplankton composition along the Catalan coast (NW Mediterranean) assessed by molecular fingerprinting. FEMS Microbiology Ecology. 33: 51-59. SEKIGUCHI, H., Tomioka, N., Nakahara, T and Uchiyama, H. 2001. A single band does not always represent single bacterial strains in denaturing gradient gel electrophoresis analysis. Biotechnology Letters 23: 1205–1208. SEKIGUCHI, H., Watanabe, M., Nakahara, T., Xu, B. And Uchiyama, H. 2002. Succesion of bacterial Community Structure along the Changjiang River Determined by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Clone Library Analsis. Applied and Environmental Microbiology. 68: 5142-5150. SHIAH, Fun-Kwo and Ducklow, H.W. 1994. Temperature regulation of hetrophic bacterioplankton abundance, and specific growth rate in Chesapeake Bay. Linnology and Oceanography. 39: 1243-1258. 84 SHIMIZU S., Akiyama M., Naganuma T., Fujioka M., Nako M., Ishijima, Y. 2007. Molecular characterization of microbial communities in deep coal seam groundwater of northern Japan. Geobiology. 5: 423-433. SHRESTHA, M.P., Noll, M and Liesack, Werner. 2007. Phylogenetic identity, growth-response time and rRNA operon copy number of soil bacteria indicate different stages of community succession. Environmental Microbiology. 9: 24642474. SIMEK, K and Kojecka, J. 1999. Shifts in bacterial community composition associated with different microzooplankton size fraction in eutrophic reservoir. Limnol. Oceanogr. 44: 1634-1644. SIMEK, K., Hornak, K., Jezvera, J., Nedoma, J., Vrba, J., Straskrabova, V., Macek, M., Dolan, J. and Hahn, M. 2006. Maximum growth rates and possible life strategies of different bacterioplankton groups in relation to phosphorus availability in a freshwater reservoir. Environmental Microbiology. 12: 1613- 1624. SIMON, M and Wunsch. 1998. Temperature control of bacterioplantkton growth in a temperate large lake. Aquatic Microbial ecology. 16: 119-130. SPRING, S., Schulze, R., Overmann, J., Schleifer, K. 2000. Identification and characterization of ecologically significant prokaryotes in the sediment of freshwater lakes: molecular and cultivation studies. FEMS Microbiology Review. 24: 573-590. SCHWARZ, J., Eckert, W., Conrad, R. 2006. Community structure of Archaea and Bacteria in a profundal lake sediment Lake Kinneret (Israel). Systematic and Applied Microbiology. Pag. 1-15. STACKEBRANDT, E., Fruhling, A., Cousin Sylvie., Brambilla, E., Lunsdorf, H., Verbarg, S. 2008. Methylibium subsaxonicum spec. nov., a Betaproteobacterium Isolated from a Hardwater Rivulet. Curr Microbiol. 56: 298-305. 85 TAMAKI, H., Sekiguchi, Y., hanada, S., Nakamura, K, Matsumura. and Kamagata,Y. 2004. Comparative Analisis of Bacterial Diversity in Freswater Sedimento of Shallow Eutrophic lake by molecular and improved Cultivation-Based Techinques. Applied and Environmental Microbiology. 21: 2162-2169. TOCKNER, K., F. Malard, U. Uehlinger and Ward, J. V. 2002. Nutrients and organic matter in a glacial river-floodplain system (Val Roseg, Switzerland). Limnol. Oceanogr. 47: 266-277. TOOLAN, T., Wehr, J.D., and Findlay, S. 1991. Inorganic phosphorus stimulation of bacterioplankton production in a meso-eutrophic lake. Appl Environ Microbiol 57: 2074– 2078. URBACH, E., Vergin, K.L., Young, L. Morse, A. 2001. Unusual bacterioplankton community structure in ultra-oligotrophic Crater Lake. Limmol. Oceanogr. 46: 557572. VAN der Gucht, K., Vandekerckhove, T., Vloemans, N., Cousin, S., Muylaert, K., Sabbe, K., Gillis, Declerk, S., Meester, L., Vyverman, W. 2005. Characterization of bacterial communities in four freshwater lakes differing in nutrient load and food web structure. FEMS Microbiology Ecology. 53: 205-220. VANNOTE, R. L., Minshall, G., Cummins, K. W., Sedell, J. R., Cushing, C. E. 1980. The river continuum concept. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 37: 130-137. VREDE, K., Vrede, T., Isaksson, A and Karlsson, A. 1999. Effects of Nutrients (Phosphorous, Nitrogen, and Carbon) and Zooplankton on Bacterioplankton and Phytoplankton-A Seasonal Study. Limnology and Oceanography. 44: 1616-1624. WARD, J. V., 1998. Riverine landscapes: Biodiversity patterns, disturbance regimes, and aquatic conservation. Biological Conservation 83: 269-278. 86 WEBER A. Karrie., Urrutia M. Matilde., Churchill F., Roden E. Eric. 2006. Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms Environmental Microbiology. 8: 100-113. WETZEL, R. 2001. Limnology. Lake and river ecosystem. A Harcourt science and technology company. Third ed. Academic press United States of America. p 1006. WINTER, C., Hein, T., Kavka G., Mach R. and Farnleitner A. 2006. Longitudinal Changes in the bacterial Composition of the Danube River: a Whole-River Approach. Applied and Environmental Microbiology. 73: 421-431. WOBUS, A., Bleul, C., Maassen, S., Scheerer., Schuppler, M., Jacobs, E., Roske, I. 2003. Microbial diversity and functional characterization of sediments from reservoirs of diferent trophic state. FEMS Microbiology. 46: 331-347. ZWART, G., Crump, B.C. Miranda, P., Agterveld, K., Hagen, F., Han, S. 2002. Typical freshwater bacteria: an analysis of available 16S rRNA gene sequences from plankton of lakes and rivers. Aquatic Microbial Ecology. 28: 141-155. 87 ANEXOS Anexo 1. Valores medios mensuales obtenidos de series históricas en la estación Maracay, Departamento Quindío, Municipio Quimbaya perteneciente a la cuenca del río La Vieja. Cenicafe 88 Anexo 2. Encuesta a dueños y/o administradores de las fincas asociadas a los sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja Parámetros Area (ha) Tiempo del sistema productivo (años) Cuenca del río la Vieja Ganadería Ganadería Carne Leche 33 25 Cultivos Mixtos 40 4 15 22 7 10 88 13 44 4 4 3 Compost, urea, Gallinaza, NPK Potreros NPK NPK15-15-15 Área de cultivo 25-50 0 0 Cultivos Plátano, cítricos Uso de herbicida No utiliza No utiliza Uso de plaguicida/plagas Hormiga arriera, mojojoy y palomilla No utiliza Tratamiento de agua residual No utiliza Habitantes (N° máximo) Cabezas de ganado (N°) Animales (N°) Área de bosque natural (ha) Uso/Tipo de abono pastos Protección contra erosión 57 87 1 No utiliza 89 0 Vegetación natural Pozo séptico 0 Café diferentes variedades y plátano Run up, Socar, Glifosol o estelar Gota, Broca, minador, picudo Cultivos protectores Pozo séptico Anexo 3. Correlación entre las variables ambientales y los ejes explicativos en el análisis de Componentes principales (ACP). Variables ambientales Eje 1 Eje 2 Altitud -0.57 -0.4 Temperatura 0.53 0.34 Oxigeno -0.71 -0.35 Conductividad 0.88 0.25 Velocidad -0.42 0.65 Ortofosfato (PO4) Turbidez 0.85 0.50 -0.015 Sólidos Totales 0.72 0.04 Alcalinidad 0.86 0.23 Nitrógeno Total 0.37 -0.56 Fósforo Total 0.81 0.05 90 0.17