DETERMINACIÓN DE NMP-22 COMO MARCADOR DE RECIDIVAS EN EL CÁNCER VESICAL 305 urología experimental e investigación 2 Arch. Esp. de Urol., 53, 4 (305-312), 2000 Determinación de NMP-22 como marcador de recidivas en el cáncer vesical. Estudio preliminar. FRANCISCO JAVIER PÉREZ GARCÍA1, SAFWAN ESCAF BARMADAH2, JESÚS Mª FERNÁNDEZ GÓMEZ2, JUAN JAVIER RODRÍGUEZ MARTÍNEZ2 Y JOSÉ LUIS MARTÍN BENITO3. Servicios 1 Hospital 2 Hospital 3 Hospital de Urología. San Agustín. Avilés. Asturias. Central de Asturias. Oviedo. Asturias. Monte Naranco. Oviedo. Asturias. España. Resumen.- OBJETIVO: 1.- Valorar la eficacia de NMP-22 como test diagnóstico en recidivas de tumores vesicales. 2.- Comparar la eficacia de NMP-22 con las citologías de orina. MÉTODO: Se incluyeron 30 pacientes con tumor vesical y se realizaron controles citológicos, cistoscópicos y de marcador NMP-22 a los 3 y 6 meses de la RTU vesical. Se consideró test positivo cuando el marcador señalaba cifras superiores a 10 U/ml. RESULTADOS: El rango de edad se situó entre 41 y 87 años con una media de 73,4 años. Un 83,4% fueron varones y un 16,6% mujeres. Un 80,7% fueron T1, un 15,3% T2-T3, siendo el grado un 76,8% GI y II y un 23,2% GIII. El NMP-22 mostró una sensibilidad del 69%, especificidad del 64%, valor predictivo positivo 52% y valor predictivo negativo 78%, cuando se consideró como unidad de análisis la presencia de recidivas tanto a los 3 como a los 6 meses, para una tasa de recidivas del 36%. La citología mostró una sensibilidad del 44%; una especificidad del 92%; un VPP del 77% y un VPN del 74%. Cuando se utilizaron los test en paralelo, obtuvimos una sensibilidad del 87,5%; una especificidad del 64,2%; un VPP del 58,3% y un VPN del 90%. En los tumores de grado I los niveles de NMP-22 mostraron una sensibilidad del 100% y una especificidad del 77,7% un VPP del 60% y un VPN del 69%. CONCLUSIONES: El marcador NMP-22 ha demostrado una sensibilidad aceptable pero con un VPP bajo con lo que no evitamos el uso de la cistoscopia del control. El uso de NMP-22 y citologías en paralelo aumenta la sensibilidad y el VPN. Encontramos muy útil el NMP-22 en recidivas de bajo grado. Palabras clave: Tumores vesicales. Marcadores tumorales. NMP-22. Citología. Correspondencia Francisco Javier Pérez García C/ Catedrático José Mª Martínez Cachero, 10-5ºD 33013 Oviedo. España. Trabajo recibido el 2 de diciembre de 1999. Summary.- OBJECTIVES: The present study was conducted to determine the efficacy of NMP-22 as a diagnostic test for recurrence of bladder tumors and to compare its efficacy with urine cytology. METHODS: 30 patients (25 male, 5 female), aged 41 87 years (mean 73.4), with bladder tumor were evaluated by cytology, cystoscopy and determination of NMP-22 at 3 and 6 months post-TUR of the bladder. A positive test was defined as NMP-22 greater than 10 U/ml. 306 F.J. PÉREZ GARCÍA, S. ESCAF BARMADAH, J.Mª. FERNÁNDEZ GÓMEZ Y COLS. RESULTS: 80.7% were T1, 15.3% T2-T3, 76.8% were grade I and II, and 23.2% were grade III. NMP-22 showed a sensitivity of 69%, a specificity of 64%, a positive predictive value of 52% and a negative predictive value of 78%, using tumor recurrence at 3 and 6 months as the unit of analysis, for a recurrence rate of 36%. Cytology showed a sensitivity of 44%, a specificity of 92%, a positive predictive value of 77% and a negative predictive value of 74%. When both tests were used, we obtained a sensitivity of 87.5%, a specificity of 64.2%, a positive predictive value of 58.3% and a negative predictive value of 90%. In grade I tumors, determination of NMP-22 had a sensitivity of 100%, a specificity of 77.7%, a positive predictive value of 60% and a negative predictive value of 69%. CONCLUSIONS: NMP-22 showed an acceptable sensitivity but a low positive predictive value, therefore control cystoscopic evaluation cannot be avoided. The sensitivity and negative predictive values increased when NMP-22 and cytology are used in combination. We found NMP-22 to be a very useful marker for recurrence of low grade tumors. Keywords: Bladder tumor. Tumor markers. Nuclear matrix protein. NMP-22. Cytology. INTRODUCCIÓN El cáncer vesical es una de las enfermedades más comúnmente tratadas por el urólogo. En Asturias, es en frecuencia la segunda neoplasia después del cáncer de pulmón. En varones la tasa de incidencia es de 54,8 y en mujeres de 8,8 por 100.000 habitantes. Las tasas de mortalidad específica por esta causa, se sitúan en cifras de 17,4 por cien mil varones y 4,42 por cien mil mujeres (1). En la práctica el cáncer vesical se manifiesta en dos formas principales: tumores superficiales de bajo grado y neoplasias invasoras de alto grado. Globalmente, alrededor del 72% de los pacientes se presentan con una enfermedad localizada, un 20% con enfermedad regional y un 3% con metástasis a distancia (2). En general, las tasas de mortalidad por cáncer vesical representan alrededor del 20% de las tasas de incidencia, lo que indica que la mayoría de los pacientes con cáncer de vejiga fallece por otras causas. Las proteínas de la matriz nuclear (NMP) se expresan de forma precoz en las células tumorales; encontrándose 10 veces más concentradas en tejidos neoplásicos que en normales. Son específicas para cada tipo de células y varían en función del tipo, grado de diferenciación, ciclo celular y tipo de cáncer. Actualmente se han identificado más de 200 proteínas de la matriz nuclear. Se eliminan de las células después de su muerte. La NMP22 es una de las proteínas de la matriz nuclear reconocidas por dos anticuerpos monoclonales, (Mab 302-22 y Mab 302-18). El antígeno detectado por estos dos anticuerpos monoclonales se encuentra en el núcleo de las células tumorales y se une a algunos cromosomas (3). En general, la NMP22 se sabe que se libera como proteína con peso molecular de 19 y más de 300 KD en orina de pacientes con cáncer vesical (4). Comparado con los controles sanos, los pacientes con cáncer tienen niveles elevados de NMP22 en su suero (5) y así nos centramos en la orina como un test simple, evaluando los valores de NMP22 urinario en pacientes con cáncer urotelial. Los tumores de vejiga son frecuentes, presentando además una alta tasa de recidivas como hemos visto anteriormente. Estas recidivas además se presentan en períodos cortos de tiempo. Todo ello origina que el paciente necesite frecuentes controles en su seguimiento, realizado en la actualidad con cistoscopias y citologías, con la consecuencia del incremento de ocupación de quirófano endoscópico y de tiempo de asistencia para los profesionales y con el consecuente sufrimiento para el paciente al tener que someterse a frecuentes controles cistoscópicos. Por otro lado, la citología es un test cuyos resultados son observador dependientes. El encontrar un marcador de las características de NMP-22 que sirva para clasificar adecuadamente a los pacientes, con la ventaja de ser independiente del observador, de manejo sencillo, ya que se trata de una determinación por el método ELISA; podría servir para el seguimiento del paciente sin necesidad de la realización tan frecuente de estudios endoscópicos y podría además eliminar carga de trabajo al sistema. OBJETIVO 1.- Valoración de la eficacia de la determinación de NMP-22 en orina mediante anticuerpos monoclonales como test diagnóstico en las recidivas de los tumores de vejiga. DETERMINACIÓN DE NMP-22 COMO MARCADOR DE RECIDIVAS EN EL CÁNCER VESICAL 2.- Comparar la eficacia del NMP22 frente a la eficacia de la citología de orina en la predicción de recidivas y considerar la posibilidad de utilizar este marcador como sustitutivo de las citologías y cistoscopias seriadas en el seguimiento de pacientes con tumor vesical superficial. MATERIAL Y MÉTODO Se incluyeron en el estudio 30 pacientes, del Servicio de Urología del Hospital Central de Asturias (Centro General); de raza blanca, con diagnóstico cistoscópico de tumor vesical, que iban a ser sometidos a RTU vesical. Los pacientes fueron informados verbalmente y por escrito del protocolo de estudio introducido dentro del seguimiento rutinario y sistemático de los pacientes con tumores de vejiga que se realiza en el Servicio de Urología. Se recogió a cada paciente una muestra de orina la mañana de la intervención para una análisis basal de marcador NMP22 y posteriormente otras dos muestras a los 90 y 180 días de la intervención junto con 3 muestras para citología de orina en las mismas fechas. Se consideró positivo al test NMP-22 aquellos pacientes con una cifra superior a las 10 U/ml siguiendo a Soloway y col. 1996 (6). Se consideró positiva la citología en aquellos pacientes en los que al menos una de las tres muestras recogidas a los 90 y 180 días fueran informadas por el patólogo como positivas para malignidad a carcinoma urotelial. En dichas fechas se realizó cistoscopia como test de referencia. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS DE NMP22 Cada paciente recogía una muestra de orina por micción espontánea entre la media noche y el mediodía (00.00 - 12.00 horas) en un recipiente de 100 cc estéril. El paciente acudía con la muestra a nuestra consulta donde se estabilizaba la muestra extrayendo con un cuentagotas orina y traspasándola al kit de recolección (Matritech NMP22 Urine Collection Kit, D2000F). Cada frasco de recolección de orina estabilizada se congeló a -80º C. hasta la fecha de análisis. PREPARACION DE LAS MUESTRAS · Las muestras congeladas se descongelaron a temperatura ambiente. 307 · Centrifugación de las muestras estabilizadas en tubos de plástico a 500-1000 r.p.m. durante 15 minutos para separar cualquier precipitado. · Pipeteado de un volúmen de 0,5 ml de cada tubo para crear una muestra única combinada. Este pool es la muestra a utilizar. PROCEDIMIENTO Se utilizó el kit desarrollado por Matritech Inc (Newton, USA) utilizando anticuerpos Mab302-18 y Mab302-22 y la medición se realizó mediante un análisis ELISA. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico se realizó con el programa informático SPSS para windows, utilizando como estadístico la Chi cuadrado para estudiar asociación estadística y la Phi para el estudio de intensidad de la relación. También se utilizó el test no paramétrico de U de Mann-Whitney para comparación de medianas. RESULTADOS DESCRIPCIÓN DE LA SERIE Se incluyeron 30 casos diagnosticados de tumor vesical post-RTU, de los cuales 4 fueron excluidos por presentar resultado histológico de normalidad, lo que supone un 13,3% de la serie. Tres casos no completaron el seguimiento hasta los 90 días y un paciente no lo completó hasta los 180 días. En relación con la edad, el rango se situó entre 41 y 87 años con una media de 73,4 años y una mediana de 74,5 años. En cuanto al sexo muestra serie presentó un 83,4% de varones y un 16,6% de mujeres. Con respecto al estadío tumoral (T) de la clasificación TNM, un 80,7% T1; 11,7% T2; 3,8% T3 y 3,8% Cis. En cuanto al grado tumoral al inicio del estudio, la distribución fue, un 46,1% GI; 30,7% GII; 19,2% GIII y 3,8% Cis El control evolutivo de los casos, mostró un porcentaje del 39% (9 casos) de recidiva a los 90 días. Un 8,6% de la serie (2 casos) recidivaron a los 180 días y un 52,7% (11 casos) no recidivaron a lo largo del estudio. Se produjeron un 55% de segundas recidivas (5 casos); esto es, de los 9 casos que recidivaron a los 90 días, 5 tuvieron otra recidiva en los 90 días siguientes. (Nota: Se excluyeron tanto los casos que presentaban 308 F.J. PÉREZ GARCÍA, S. ESCAF BARMADAH, J.Mª. FERNÁNDEZ GÓMEZ Y COLS. TABLA I RESULTADOS DE CITOLOGÍA Y NMP-22 EN RECIDIVAS A 90 DÍAS anatomía patológica normal al inicio del estudio, como los que no completaron el seguimiento). Analizando los casos que recidivaron en relación con el nivel de marcador NMP-22; se observó, que la mediana de los valores de NMP-22 fue de 21,45U/ml, mientras que para los casos sin recidivas, la mediana fue de 6,6 U/ml. La comparación de medianas aplicando el Test de Mann-Whitney no mostró asociación estadísticamente significativa. U(157,291,NS)=293. COMPROBACIÓN DE OBJETIVOS Considerando la observación a los 90 días y comprobando la presencia o no de recidivas mediante el test de referencia, la cistoscopia, el estudio del marcador NMP-22, ofreció una sensibilidad del 77,7%, una especificidad del 71,4%, un valor predictivo positivo del 63,6% y un valor predictivo negativo del 83,3%. La prevalencia de recidivas encontrada fue del 39%. Se encontró asociación estadísticamente significativa entre las recidivas tumorales y el marcador NMP-22 (Chi cuadrado = 0,21), existiendo una concordancia entre ambos del 48% (Phi: 0,48; p: 0,02) (Tabla I). En esta misma observación, a los 90 días, el estudio de la citología ofreció una sensibilidad del 55,5%, una especificidad del 92,8%, un valor predictivo positivo del 83,3% y un valor predictivo negativo del 76,4%. También en esta ocasión, se encontró asociación estadísticamente significativa entre la presencia de recidivas y el resultado de la citología ( Chi cuadrado =0,009), existiendo una concordancia entre ambas del 53% (Phi: 0,53; p: 0,009) (Tabla I). En la observación a los 180 días, utilizando como diagnóstico de recidiva la cistoscopia, aparecieron un 33% de recidivas. Analizando la relación entre el nivel de NMP-22 y la presencia de recidivas no se encontró asociación estadísticamente significativa entre ambas variables. Considerando el estudio de la citología tampoco se encontró asociación estadísticamente significativa entre ambas variables (Tabla II). Considerando como unidad de análisis la presencia total de recidivas, (episodios de enfermedad) tanto primeras recidivas a los 90 días o 180 días como segundas recidivas a los 180 días; el estudio del NMP-22, mostró una sensibilidad del 69%; una especificidad del 64%; un valor predictivo positivo del 52% y un valor predictivo negativo del 78%. La tasa de recidivas es del 36%. Se encontró asociación estadísticamente significativa entre ambas variables TABLA II RESULTADOS DE CITOLOGÍAS Y NMP-22 EN LAS RECIDIVAS A LOS 180 DÍAS DETERMINACIÓN DE NMP-22 COMO MARCADOR DE RECIDIVAS EN EL CÁNCER VESICAL 309 TABLA III CITOLOGÍA Y VALORES DE NMP-22 EN EL TOTAL DE RECIDIVAS (Chi cuadrado=4), con una intensidad de relación del 30% (Phi:0,30) (Tabla III). Sobre la misma unidad de análisis, presencia de recidiva, el estudio de la citología ofreció una sensibilidad del 44%; una especificidad del 92%; un valor predictivo positivo del 77% y un valor predictivo negativo del 74%, siendo la tasa de recidivas del 36%. Se encontró asociación estadísticamente significativa (Chi cuadrado = 6,27), entre ambas variables con una intensidad de relación del 37%. (Phi:0,37). (Tabla III). A continuación se resumen los valores de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y tasas de recidivas para el marcador NMP-22 y la citología, obtenidos en los controles realizados primero a los 90 dias y después los obtenidos en ambas observaciones. (conjuntamente a los 90 y 180 días) (Tabla IV). Se analizó la eficacia del uso de ambos test NMP-22 y citología en paralelo como diagnóstico de recidivas tumorales y se comparó con el uso de los test de forma individual, los valores se muestran en la Tabla V. TABLA IV VALORACIÓN DE NMP-22 Y CITOLOGÍAS EN EL DIAGNÓSTICO TABLA V COMPARACIÓN DEL USO DE AMBOS TEST EN PARALELO CON CADA TEST INDIVIDUAL 310 F.J. PÉREZ GARCÍA, S. ESCAF BARMADAH, J.Mª. FERNÁNDEZ GÓMEZ Y COLS. TABLA VI VALORACIÓN DE NMP-22 Y CITOLOGÍAS EN EL DIAGNÓSTICO DE RECIDIVAS DE TUMORES GI ANALISIS SEGÚN EL GRADO TUMORAL Observando sólo los tumores GI, se analizaron los niveles del marcador NMP-22 y de la citología respecto a la presencia de recidivas por cistoscopia realizada a los 90 y 180 días. Estas variables están estadísticamente asociadas con una chi cuadrado = 6,08 para el NMP-22 y con una chi cuadrado = 5,58 para la citología (Tabla VI). DISCUSIÓN La incidencia del cáncer vesical ha aumentado significativamente en los últimos años. El diagnóstico precoz y la aparición de terapias adyuvantes en el carcinoma transicional superficial han contribuido a la disminución relativa de la mortalidad. La cistoscopia y la citología de orina son métodos diagnósticos efectivos para la vigilancia del cáncer urotelial. Sin embargo el estudio mediante cistoscopia es invasivo y no puede realizarse en todos los pacientes. La citología de orina también tiene distintos inconvenientes, tales como el entrenamiento requerido por el analista a la hora de hacer el estudio, la imposibilidad de cuantificación y la baja sensibilidad. Recientemente, han aparecido trabajos de determinación de DNA nuclear mediante citometría de flujo (7 y 8), determinación del antígeno carcinoembrionario (CEA) (9 y 10), y antígeno tumoral vesical (BTA), (11,12,13 y 14) para la vigilancia del cáncer urotelial, pero estos test no son ampliamente utilizados, tienen una sensibilidad insuficiente cuando se utilicen solos y deberían ser utilizados en conjunción con la citología urinaria. Actualmente no hay pruebas alternativas a la cistoscopia o citología de orina. Por ello nos centra- mos en NMP-22, como marcador urinario e investigamos su utilidad clínica como un sustituto para la citología urinaria en la detección del cáncer de urotelio. A lo largo del seguimiento del estudio, se produjeron 16 episodios de enfermedad o recidivas correspondientes al 36% de tasa de recidiva (5 pacientes tuvieron 2 recidivas y 6 pacientes una recidiva), cifras similares a las obtenidas por Soloway y col. (6) en cuyo estudio la tasa de recidivas fue del 31%. El análisis a los 90 días ofreció una mediana de NMP-22 para los que recidivaron de 21,45 U/ml y de 6,6 U/ml para los que no recidivaron, cifras también similares a las obtenidas por Soloway y col. en 1996 (6) (20,81 U/ml y 5,45 U/ml), aunque en nuestro caso no se encontró asociación estadísticamente significativa al realizar el test de Mann-Whitney. No encontramos efecto del grado tumoral ni del estadío tumoral con los niveles del NMP-22, al igual que otros autores (15 y 16). En el estudio actual, utilizando un límite de NMPO22 urinario de 10 U/ml, el NMP-22 mostró una sensibilidad del 69%, una especificidad del 64%, un VPP del 52% y un VPN del 78% para un 36% de prevalencia de enfermedad o de recidivas. La sensibilidad es inferior en nuestro estudio respecto a las referidas por Soloway 1996 (6) con una tasa de recidivas del 31% similar a la nuestra y Miyanaga 1998 (16) con una tasa de recidivas inferior. La especificidad fue similar a los estudios antes referidos, en nuestro caso del 64% en comparación con el 79% de Soloway (6) y el 64,3% de Miyanaga (16). El VPP fue del 52%, similar a lo referido en la literatura revisada, un 58% para Soloway (6) y un 30,9% para Miyanaga (16). Un 48% de los casos DETERMINACIÓN DE NMP-22 COMO MARCADOR DE RECIDIVAS EN EL CÁNCER VESICAL positivos en nuestro estudio, no fueron clasificados como tales. El VPN fue del 78%, esto es, un 22 de casos sanos no fueron clasificados como tales. En relación a la literatura el valor de nuestros datos muestra un VPN algo inferior (86% para Soloway (6) y 94% para Miyanaga 1988 (16)). En resumen nuestros resultados han sido más favorables para la clasificación de enfermos que los vistos en la literatura (16), pero no en comparación con el estudio de Soloway (6). Sin embargo, para la clasificación de sanos son ligeramente más desfavorables que lo publicado. En cuanto a la citología, nuestro estudio muestra una sensibilidad del 44%; una especificidad del 92%; un VPP del 77% y un VPN del 74%, datos similares a la literatura (16 y15). Comparando NMP-22 con la citología obtuvimos una mejor clasificación de los pacientes positivos por citología que por el NMP-22 (VPP 77% para citología y 52% para NMP-22), lo que significa que usando NMP-22 dejamos de clasificar casi la mitad de los enfermos, mientras que con citologías dejamos de clasificar o perdemos un tercio de los enfermos. En cuanto a la clasificación de sanos, la citología y NMP-22 presentan similares porcentajes de clasificación. En cualquier caso el uso de cualquiera de los test, deja de clasificar como sanos una cuarta parte de ellos. Si utilizamos los dos test en paralelo, el VPP es del 58,3%, algo mayor que utilizándo NMP-22 solo pero inferior al 77% de la citología, con lo cual no clasificaríamos con ello más pacientes. El VPN de las dos pruebas en paralelo es del 90%, superior a los test utilizados individualmente, con lo que clasificaríamos mejor a los sanos. Analizando los tumores de bajo grado (GI) al inicio del estudio y considerando el total de recidivas en el seguimiento hasta 180 días, obtuvimos asociación significativa entre variable y resultados de citología y NMP-22. El VPP de NMP-22 fue del 60% y del 100% para la citología. En contraposición el VPN de NMP-22 fue del 100% mientras que para la citología fue del 69% (para una tasa del 22% de recidivas tumorales GI), lo que significa que la citología clasifica mejor a los positivos y el NMP-22 a los negativos. 311 CONCLUSIONES 1.- Para la detección de recidivas tumorales, el marcador NMP-22 ha demostrado una sensibilidad aceptable, a costa de un valor predictivo bajo, con lo que no evita la realización de cistoscopias en un alto porcentaje de pacientes sanos mal clasificados como enfermos por el test. 2.- El uso de NM-P22 y citologías en paralelo, aumenta la sensibilidad y el valor predictivo negativo. 3.- El marcador NMP-22 se ha demostrado, en nuestro estudio, de mucha utilidad en la detección de recidivas en tumores vesicales de bajo grado. 4.- La cistoscopia sigue siendo método de control de referencia. BIBLIOGRAFÍA Y LECTURAS RECOMENDADAS (*lectura de interés y **lectura fundamental) *1. Registro de Tumores. Consejeria de Servicios Sociales. 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