Fundamentos y tipos de elisa

Fundamentos y Tipos de ELISA
Autor: Cultek, S.L.U
El ELISA es una técnica que se basa en el uso de un antígeno o un anticuerpo
marcado con una enzima; al estar uno estos componentes marcado y fijado a un soporte,
se interrumpe la reacción antígeno-anticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato
especifico sobre la enzima que producirá un color determinado observable a simple
vista o cuantificable por un espectrofotómetro o analizar la reacción antígeno
anticuerpo. Existen diversos tipos de ELISA los que se marca el anticuerpo: directo,
indirecto, sándwich: Doble, Heterólogo.
En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el antígeno o
anticuerpo, luego se agrega
la muestra problema con la mezcla de antígenos o
anticuerpos, se une el antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno ya
tapizado, lavado para eliminar el exceso no unido. Adición del anticuerpo secundario
marcado con la enzima , unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
,lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no adherida , adición del
substrato, unión del substrato a la enzima, para luego obtener la coloración color
ELISA directo: En este se fija el antígeno al soporte, se lava para eliminar los
no fijados, luego se adicionan los anticuerpos marcados con la enzima para que reacción
con el antígeno y que solubilizado el complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no
reaccionaron y se agrega un sustrato específico para la enzima, al final se observa la
coloración. ELISA indirecto: En este la diferencia viene dad que a nivel que el elemento
marcado por la enzima es un anti-anticuerpo que va a reaccionar con el anticuerpo, que
reacciono junto al antígeno previamente fijado;
finalmente agrega un sustrato
específico para la enzima, se lava y se observa la coloración.
ELISA sándwich doble: Se fija al soporte el anticuerpo específicos del antígeno
en el suero problema, posteriormente se añade el suero problema y los antígenos de
fijan a los anticuerpo, luego se lava para eliminar elementos no fijados, posteriormente
se añaden anticuerpos conjugados con una enzima(de diferente epítopo a los
previamente fijados) estos reaccionan con los antígenos de la muestra problema que se
encuentran fijados a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se añade un sustrato a la
enzima marcadora y se observa el color visual o por colorimetría, en cuanto al ELISA
sándwich triple la diferencia viene dada por que los segundos anticuerpos que se
colocan no son marcados con la enzima, si no que luego se coloca anti-anticuerpos
conjugados con la enzima que reaccionaran con los anticuerpo que se colocaron luego,
posteriormente se lava y se coloca el sustrato especifico para la enzima.
ELISA Competitivo: Fijación de anticuerpos específicos al soporte anticuerpos,
adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado
en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos (objeto de
estudio).Al mismo tiempo, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso
anterior, marcados con una enzima, lavar. Agregar un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o
colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados.
Si las lecturas de ambas pruebas son iguales, el antígeno a estudio no tiene nada que
ver con los anticuerpos empleados en el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de
ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio, está relacionado con el anticuerpo
empleado para tapizar el soporte y la diferencia de absorbancia o densidad óptica, es
proporcional a la concentración del antígeno problema.
Métodos específicos
Para lograr el tapizado de antígenos y anticuerpos de diluye el antígeno o
anticuerpo en tampón carbonato (pH 9,6) y se incuba luego durante 3h a 37°C o 16h a
4°C, también de puede incubar a 40-50°C en tampón fosfato (PBS) o en agua fisiológica
tamponada pH 7,2-7,4. En cuanto a la solución de lavado se elaborara una solución
salina con Tween 20 como agente tensioactivo8, 5gr. De igual forma se debe conjugar
la enzima, esta debe de poder unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, un substrato
cromogénico o fluorogénico conveniente. Las enzimas más utilizadas son las fosfatas
alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa.
Métodos de lectura de resultados
Colorimetría: En estos ensayos se obtiene un producto de reacción coloreado que
absorbe luz, siendo la densidad óptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de
producto medido. Para todos los ensayos enzimáticos, la etapa final es la adición del
substrato enzimático, este es escogido por su rendimiento en la reacción enzimática.
Para ensayos colorimétricos, la tasa de desarrollo de color es proporcional, dentro de un
cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimático presente.
Fluorescencia: La fluorescencia es una variación de la colorimetría en este un
producto de reacción emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada
longitud de onda, siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz
emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizado. En comparación con los
métodos colorimétricos, los ensayos de fluorescencia son ligeramente más sensibles y,
sufren a cambios de pH, temperatura, restos de detergente en el lavado y concentración
iónica. Lo que lo hace mas funcional es que amplia el rango de medida en cuanto al
obtenido en los ensayos colorimétricos.
Luminiscencia: En este proceso la enzima actúa sobre un sustrato generando un
producto capaz de emitir fotones en lugar de generar un color visible, este proceso se
define como la capacidad de emitir luz por parte una sustancia esta puede ser mediante
una reacción química (quimioluminiscencia), mediante una longitud de onda
(fotoluminiscencia= florescencia) o mediante un producto al ser degradado
(bioluminiscencia).
Para poder interpretar los resultados, se puede observar el color a simple vista,
pero el ojo humano no es capaz de notar la variación de 0,1 de densidad óptica, por eso
se usa el espectrofotómetro para poder así cuantificar los resultados. Es importante
resaltar que las soluciones ELISA es un método de inmunodetección que se utiliza para
detectar diversas patologías animales y vegetales.