Espectroscopía in vivo vs espectroscopía ex vivo. Ventajas y limitaciones de cada una de ellas. Poster no.: S-1093 Congreso: SERAM 2014 Tipo del póster: Presentación Electrónica Educativa Autores: 1 2 2 I. I. García Bocanegra , E. Pardo Susacasa , G. Díaz Córdoba , 2 2 M. C. Muñoz Hernández , C. Ventura Gómez , M. L. García 2 1 2 Martín ; Torremolinos/ES, Málaga/ES Palabras clave: Imagen molecular, Educación, , RM-Espectroscopía, RM, Experimental, Patología DOI: 10.1594/seram2014/S-1093 Cualquier información contenida en este archivo PDF se genera automáticamente a partir del material digital presentado a EPOS por parte de terceros en forma de presentaciones científicas. Referencias a nombres, marcas, productos o servicios de terceros o enlaces de hipertexto a sitios de terceros o información se proveen solo como una conveniencia a usted y no constituye o implica respaldo por parte de SERAM, patrocinio o recomendación del tercero, la información, el producto o servicio. 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Página 1 de 18 Objetivo docente El objetivo de esta comunicación es acercar la metabolómica por resonancia magnética (espectroscopía de alta resolución) al radiólogo clínico y comparar la espectroscopía in vivo (espectroscopía de RMN utilizadas en clínica) con las espectroscopía de alta resolución ex vivo (espectroscopía de ángulo mágico, HR-MAS). Se analizan las diferencias, ventajas y limitaciones de cada técnica en distintos tejidos. La espectroscpía de alta resolución utilizada en los estudios de metabolómica es una técnica en la que se emplean espectrómetros verticales de alto campo (11-23 Teslas) para el análisis de biofluidos o de pequeñas piezas de tejido intacto (por ejemplo de biopsias), obteniéndose resultados espectroscópicos de múltiples metabolitos que no son visibles mediante espectroscopía in vivo. En esta comunicación nos centraremos en la técnica que analiza tejido intacto, conocida como HR-MAS, del inglés high resolution magic angle spinning. Fig.1 La espectroscopía por HR-MAS tiene mucha mayor sensibilidad y resolución que la espectroscopía in vivo, lo que permite determinar el perfil metabólico o "metabolic fingerprint", de una muestra te tejido de entre 5 y 20 mg. La resolución espectral es comparable a la que se obtiene en espectroscopía de líquidos, a partir de extractos de tejidos, con la gran ventaja de que no requiere manipulación alguna de la muestra y por tanto el tejido puede recuperarse y reutilizarse posteriormente para diagnóstico en anatomía patológica. Fig.2 Actualmente la espectroscopía ex vivo no está implantada en Hospitales, pero sus resultados en investigación prometen un interesante futuro para el diagnóstico y manejo de los pacientes. Images for this section: Página 2 de 18 Fig. 2: La espectroscopía por HR-MAS ex vivo tiene gran sensibilidad y resolución comparada con la espectroscopía in vivo, lo que permite determinar el perfil metabólico o "metabolic fingerprint" de una muestra de tejido intacto, mientras que la espectroscopía in vivo sólo permite resolver unos pocos metabolitos. Página 3 de 18 Fig. 1: Espectrómetro vertical de alta resolución de 600 MHz (14T), con sonda de HRMAS (izquierda); rotor de zirconio e inserto en el que se coloca la pieza de tejido para su ánlisis por HR-MAS (derecha). Página 4 de 18 Revisión del tema La espectroscopía in vivo que se realiza habitualmente en clínica es una técnica no invasiva que puede aportar importante información para el diagnóstico y seguimiento de distintas lesiones. Las aplicaciones más conocidas actualmente de la espectroscopía in vivo son las que 1 se llevan a cabo mediante espectroscopía localizada de H, monovoxel o multivoxel (imagen espectroscópica), en cerebro, próstata o mama. Existen otras modalidades, 31 13 como la espectroscoía de P ó C, pero son mucho menos frecuentes y sólo se llevan a cabo en unos pocos centros especializados. Sin ninguna duda, el uso clínico más extendido se circunscribe al sistema nervioso central. Los principales metabolitos empleados en diagnóstico en el SNC son (Fig. 3): NAA (N-acetil aspártico) - Marcador Neuronal. Su disminución refleja un empobrecimiento neuroaxonal (típico en los tumores gliales) mI(mioinositol) - Marcador Glial Su aumento refleja un aumento de la contribución glial (en tumores gliales es indicativo de tumor bajo grado). Su disminución indica desdiferenciación glial (tumores de alto grado) Cho (Colina) - Metabolismo de Membrana. En Tumores es Indicador de Actividad Proliferativa. Aumenta en procesos de desmielinización e inflamatorios Cr (Creatina) - Marcador del Metabolismo Energético. Se encuentra típicamente disminuida en tumores malignos (alto grado) Lípidos móviles - Marcador de Malignidad (necrosis). No se suele hablar de malignidad a menos que estén presentes. También aparecen con tratamiento radioterápico (radionecrosis). Lac (Lactato) - Marcador del Metabolismo Anaeróbico. Típico de tumores activos frente a tumores quiescentes. También aparece en procesos hipóxicos/isquémicos e infecciosos/inflamatorios. En cuanto a la próstata, el número de metabolitos observados es menor: Citrato - Marcador de tejido glandular prostático sin alteraciones. Disminuye drásticamente en los adenocarcinomas. Cho (Colina) - Marcador de actividad proliferativa. Aumenta en los adenocarcinomas. Página 5 de 18 Poliaminas. Al igual que el citrato, su presencia es indicador de metabolismo glandular normal y se encuentran disminuidas en los adenocarcionomas. Por último, en la mama, dada la gran contribución de las señales de lípidos, que dificultan la observación de la mayoría de los metabolitos in vivo, el único metabolito que se utiliza para el diagnóstico tumoral es la colina, que se eleva de forma significativa en los tumores. La espectroscopía por HR-MAS ex vivo por su lado tiene la ventaja de tener una gran sensibilidad y resolución espectral lo que permite la detección de múltiples metabolitos no visibles por espectroscopía in vivo, por tanto, la especificidad diagnóstica es mucho más alta. Así por ejemplo, la espectroscopía in vivo sólo permite resolver un pico en la zona de los metabolitos derivados de colina, mientras que el HR-MAS permite separar sus diferentes componentes: fosfocolina(PC) glicerofosfocolina(GPC) y colina (Cho). Fig. 4 y Fig. 5. Se realiza revisión bibliográfica de los resultados de la espectroscopía in vivo en comparación con la espectroscopía de alta resolución ex vivo y de la aportación en el diagnóstico de distintas patologías de ambas técnicas, en concreto en tres tipos tumorales: cerebral, próstata y mama. CEREBRAL Espectroscopía invivo: La espectroscopía in vivo a nivel cerebral ha demostrado su utilidad en la evaluación tumoral, para ello se han medido principalmente varios metabolitos: NAA, Cho, lactato, Creatina y Mioinositol. Fig. 3 Los niveles de Cho aumetan en multitud de tumores, pero a nivel cerebral además sus niveles son significativamente mas altos cuanto mayor grado presente el tumor, por tanto son útiles para diferenciar gliomas de bajo, alto grado y patología benigna cerebral. El NAA (ácido N-Acetil Aspártico) disminuye en aquellas patologías en la que existe empobrecimiento neuroaxonal, como ocurre en los tumores gliales. (19) Estos metabolitos se han utilizado para diferenciar gliomas de bajo grado con lesiones isquémicas en personas jóvenes sin factores de riesgo para infarto cerebral donde el diagnóstico por imagen de RMN resulta cuanto menos complicado, así, los gliomas de bajo grado presentan picos altos de Cho (colina), ausencia de NAA (Nacetil aspartato) y Lactato indetectable, mientras que los infartos presentan picos bajos de Cho, de NAA y un aumento significativo del Lactato. EL Lactato se ha visto aumentado en gliomas de Página 6 de 18 alto grado, pero estos no suelen presentar dificultad para su diagnóstico en la imagen. (19) Espectroscopía ex vivo: El HR-MAS a nivel cerebral es capaz de cuantificar multitud de metabolitos que no son visibles por espectroscopía convencional in vivo. Martinez Bisbal y otros realizaron espectro HR-MAS de biopsias de gliomas de alto grado, determinando 37 metabolitos. (12) Por otro lado se ha demostrado que existe una buena correlación del diagnóstico in vivo y ex vivo con la única salvedad de que en ex vivo aumentan metabolitos relacionados con el metabolismo anaeróbico, lactato y alanina, debido al periodo de hipoxia que experimentan las piezas de tejido hasta que son congeladas. (12) En estudio publicado en 2009 se determinó que los distintos niveles de los componentes del pico de colina total (tCho), GPC (glicerofosfocolina), PC (fosofocolina) y Cho (Colina libre), y la relación entre estos, es diferente según se trate de gliomas de bajo o alto grado. Así, en gliomas de bajo grado el componente que predomina es la GPC mientras que en Gliomas de alto grado predomina la PC. (8) Fig. 5 Por otro lado parece existir correlación entre determinados metabolitos detectados por HR-MAS y la gradación del tumor. Así el aumento del ratio PC/GPC se caracteriza con formas severas de glioblastoma multiforme. Y un aumento del ratio de mioinositol/Cho permite diferenciar la evolución clínica de distintos gliomas de bajo grado. (9) También ha sido demostrada la utilidad de HR-MAS para el diagnóstico diferencial entre agresividad de meningiomas, se determinó que los metabolitos glutamina y glutamato que están relacionados con el metabolismo del glutatión están significativamente más aumentados en meningiomas más agresivos y con mayor posibilidad por tanto de recurrencia. (16) PRÓSTATA Espectroscopía in vivo En la próstata la espectroscopía in vivo mediante RMN endorectal con técnica multivoxel ha demostrado gran utilidad para el diagnóstico del cáncer de próstata. Las células epiteliales prostáticas tienen la peculiaridad de producir gran cantidad de citrato en condiciones normales, como consecuencia de una inhibición de la enzima aconitasa Página 7 de 18 mediada por zinc. Sin embargo, cuando se produce tranformación tumoral, esta inhibición se pierde y los niveles de citrato caen drásticamente (Fig. 6). Por otro lado, como en otros procesos tumorales, la colina aumenta significativamente. Esta técnica ha demostrado ser de gran utilidad en casos de PSA elevado para localizar zonas de sospecha tumoral y así dirigir la dirigir la biopsia hacia una zona concreta (Fig. 7). Por otro lado, en casos de tratamiento radioterápico, la espectroscopía prostática es de gran utilidad para el diagnóstico de recidiva local, ya que tras el tratamiento el tejido prostático presenta una apariencia anodina y las técnicas de imagen resultan poco informativas. Sin embargo, la espectroscopía permite observar el pico de colina en aquellas zonas en las que hay recidiva. (5) Espectroscopía ex vivo La determinación de metabolitos ex vivo que no son resueltos mediante espectroscopía in vivo han aportado información relevante en el cáncer de próstata. Así se ha determinado que se puede diferenciar entre tejido maligno y no maligno utilizando los ratios de los espectros de GPC (Glicerofosfocolina) + PC (fosfocolina) y Creatina. Además se ha determinado que los derivados de colinas son mejores biomarcadores de tumor que el propio citrato, especialmente en la próstata central, ya que el citrato aparece alto en células epiteliales prostáticas y bajo en tumor, pero también aparece bajo en estroma. Sin embargo las colinas aparecen altas sólo en tejido tumoral. (20) Por otro lado se ha visto que la relación Citrato/Creatina se relaciona significativamente con la agresividad tumoral. (20) Por último, resulta interesante mencionar el trabajo de Asten et al. en el que se demuestra que el tejido de biopsia prostático no se altera después de realizarse el análisis por HRMAS, por lo que puede ser utilizado para diagnóstico histológico.(1) MAMA Espectroscopía in vivo: La elevación del pico de colina, al igual que en otros tipos de cáncer, se utiliza como biomarcador de actividad tumoral, sin embargo hay que ser cauto con esta afirmación ya que, según se ha mostrado en varias publicaciones, la elevación de colina puede deberse también a otras patologías de carácter benigno, en concreto fibroadenomas, adenomas tubulares y durante la lactancia (4,7,14). Página 8 de 18 Por otro lado, la cuantificación de este metabolito mediante espectroscopía in vivo ha demostrado su utilidad para determinar la respuesta a tratamiento antes de que aparezca datos de respuesta clínica. Así, hay estudios que indican que a las 24 horas del tratamiento con doburrobuxina, existen cambios significativos del pico de colina en la lesión tumoral y que la disminución del pico a las 24 horas se asocia a una mejor respuesta al tratamiento. (4,13) Espectrocopía ex vivo: Al igual que en otros tejidos la espectroscopía ex vivo permite el análisis de muchos metabolitos no visibles mediante espectroscopía in vivo. Lo que plantea la posibilidad de establecer un diagnóstico de agresividad tumoral basado en el perfil metabolico o metaboloma. Esto resulta especialmente atractivo en el caso de la mama porque la espectroscopía in vivo plantea grandes dificulatades por la gran abundancia de lípidos en el tejido mamario, que dificultan enormemente su realización de forma rutinaria. Fig. 8 Se ha demostrado que existe un patrón metabolómico de cáncer de mama, caracterizado fundamentalmente por aumento de Lactato y Glicina, y de PC con respecto a GPC. Comparando el perfil metabolómico con parámetros clínicos, se ha demostrado que la Glicina, Taurina y PC están más elevadas en tumores de mayor grado, y que la relación PC/GPC está muy aumentada en tejido tumoral con respecto a sano. (18) En otro estudio se detectó que niveles altos de glicina y lactato predecían significativamente menor supervivencia a los 5 años en cánceres con RE (receptores estrogénicos positivos), mientras que esta relación no se daba en pacientes con RE negativos. Los resultados de predicción de supervivencia a los 5 años en mujeres con cánceres RE positivos resultaron más robustos que la predicción realizada clínicamente. (10) En los modelos de mejor pronóstico (basal-like) la concentración de GPC es más alta que la concentración de PC, y lo contrario ocurre en los luminal-like. (15, 11) La repercusión de un posible paralelismo entre perfil metabólico y tipo genético supone un importante campo para la metabolómica, ya que los estudios genotípicos de cáncer de mama tienen un alto coste, su realización requiere de mucho tiempo y además la realización de estos supone la destrucción de las muestras. Images for this section: Página 9 de 18 Fig. 4: Espectro cerebral de 1H in vivo en el que se muestra el pico de colina total (tCho) compuesto fundamentalmente por tres metabolitos, colina, fosfocolina y glicerolfosfocolina, que no se pueden diferenciar in vivo. Página 10 de 18 Fig. 3: Espectro monovoxel de 1H in vivo de tejido cerebral sano en el que se indican los principales metabolitos que se pueden observar en este tipo de estudios. Página 11 de 18 Fig. 5: Espectros de 1H HR-MAS (high resolution magic angle spinning) de biopsias de tumores gliales en los que se muestra cómo la mayor resolución espectral permite diferenciar los componentes indivudales que contribuyen del pico de colina total (tCho): colina, fosfocolina y glicerofosfocolina. Las relaciones entre estos tres metabolitos permiten diferenciar gliomas de bajo y alto grado. Página 12 de 18 Fig. 6: Señal de citrato según se observa in vivo a 1.5 T y tabla de la concentración en los diferentes tejidos. Página 13 de 18 Fig. 7: Imagen espectroscópica (o espectroscopía multivoxel) de prostata in vivo. El espectro correspondiente a la zona tumoral (rojo) muestra un aumento del pico de colina y descenso de citrato en comparación con el espectro de una zona sana (verde). Se muestra además el corte histológico en el que se confirma que la alteración del perfil metabólico corresponde a un nódulo tumoral. Página 14 de 18 Fig. 8: Espectro de 1H HR-MAS de una biopsia de cáncer de mama. A diferencia de la espectroscopía in vivo que unicamente permite ver lípidos y colina, esta técnica permite obtener el perfil metabólico completo de la biopsia. Página 15 de 18 Conclusiones La espectroscopía invivo aporta importante información metabólica para el diagnóstico de distintas patologías, de forma no invasiva, no obstante, esta técnica presenta ciertas limitaciones, como son la baja resolución espectral, es decir, el número de metabolitos que se pueden identificar/cuantificar, lo que se traduce en una baja especificidad diagnóstica. La espectroscopía exvivo, sin embargo, posee una resolución espectral y sensibilidad muy superior a las técnicas in vivo, lo que permite detectar un gran número de metabolitos, y por tanto mejora enormemente su capacidad diagnóstica. Sin embargo, no hay que olvidar que se trata de una técnica invasiva, ya que se basa en el análisis de piezas de tejido (biopsias, piezas quirúrgicas…), y por tanto pierde su utilidad en aquellas lesiones que resulta imposible biopsiar. En conclusión, cada técnica tiene su valor añadido y sus limitaciones, y es el correcto uso de ellas y la combinación de las mismas con otros parámetros diagnósticos, donde reside su potencial clínico. Bibliografía 1) Asten J, Cuijpers V, Hulsbergen-van de Kaa C, et al. High resolution magic angle spinning NMR spectroscopy for metabolic assessment of cancer presence and Gleason score in human prostate needle biopsies. Magn Reson Mater Phy. 2008;21:435-42. 2)Bathen TF, Geurts B, Sitter B, Fjøsne HE, Lundgren S, Buydens LM, Gribbestad IS, Postma G, Giskeødegård GF. Feasibility of MR metabolomics for immediate analysis of resection margins during breast cancer surgery. 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