nuevo "bacillus thuringiensis" activo contra plagas de

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 084 659
kInt. Cl. : C12N 15/32,
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
C12N 1/20, C12N 5/10,
A01N 63/02, C12Q 1/02,
//(C12N 1/20, C12R 1:07)
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 90306594.4
kFecha de presentación : 18.06.90
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 405 810
kFecha de publicación de la solicitud: 02.01.91
T3
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54 Tı́tulo: Nuevo aislado de Bacillus thuringiensis activo contra pestes de lepidópteros, y genes que
codifican nuevas toxinas activas en lepidópteros.
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73 Titular/es: Mycogen Corporation
14.12.89 US 451261
5501 Oberlin Drive
San Diego, California 92121, US
k
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.05.96
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45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.05.96
ES 2 084 659 T3
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30 Prioridad: 27.06.89 US 371955
Aviso:
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72 Inventor/es: Payne, Jewel y
Sick, August J.
k
74 Agente: Carpintero López, Francisco
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Antecedentes de la Invención
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Los pesticidas microbianos más ampliamente utilizados se derivan de la bacteria Bacillus thuringiensis. Este agente bacteriano se utiliza para controlar una amplia gama de orugas y escarabajos comedores
de hojas, ası́ como mosquitos. El Bacillus thuringiensis produce un cuerpo o cristal paraesporal proteinaceo que es tóxico al ser ingerido por un insecto huésped susceptible. Por ejemplo, B. thuringiensis subsp.
kurstaki HD-1 produce una inclusión de cristal que consiste en una biotoxina llamada toxina delta que es
tóxica para la larvas de muchos insectos lepidópteros. El clonado, la secuenciación, y la expresión de este
gen de proteı́na cristalina de B.t. en Escherichia coli se ha descrito en la literatura publicada (Schnepf,
H.E. y Whitely, H.R. [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897; Schnepf et al.). La patente de
EE.UU. 4.448.885 y la patente de EE.UU. 4.467.036 describen ambas la expresión de la proteı́na cristalina
de B.t. en E.coli.
Breve resumen de la Invención
El objeto de la invención se refiere a un nuevo aislado de Bacillus thuringiensis designado B.t. PS81I
que tiene actividad contra todas las pestes de lepidópteros probadas.
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También se describen y se reivindican todos los genes nuevos de la toxina que expresan toxinas tóxicas
para los insectos lepidópteros. Estos genes de toxina pueden transferirse a huéspedes adecuados via un
plásmido vector.
Especı́ficamente, la invención comprende un nuevo aislado B.t. llamado B.t. PS81I, los mutantes del
mismo, y nuevos genes de la endotoxina δ derivados de este aislado B.t. que codifican proteı́nas que son
activas contra las pestes de lepidópteros.
Descripción Detallada de la invención
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Los nuevos genes de la toxina de la presente invención se obtienen a partir de un nuevo aislado de
B.thuringiensis (B.t.) activo en lepidópteros designado PS81I.
Caracterı́sticas de PS81I de B.t.
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Morfologı́a de la colonia - Colonia grande, de superficie mate, B.t. tı́pica
Morfologı́a de la célula vegetativa - B.t. tı́pica
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Serotipo flagelar - 7, aizawai.
Inclusiones intracelulares - las células esporulantes producen un cristal bipiramidal.
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Preparaciones de plásmido - electroforesis en gel de agarosa de preparaciones de plásmido que diferencian PS81I de B.t. de HD-1 de B.t..
Proteı́nas solubles alcalinas - análisis SDS-PAGE muestra una banda de proteı́na a ca. 130.000 daltons.
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Toxinas únicas - se han identificado cuatro únicas toxinas en PS81I de B.t..
Actividad -PS81I de B.t. mata todos los Lepidópteros probados.
Procedimientos de bioensayo:
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Se ensayaron las esporas y cristales de PS81I de B.t. contra: Lombriz guerrera de remolacha, Spodoptera exigua; Mariposa diamante, Plutella xylostella; lombriz de la yema del abeto del oeste, Choristoneura
occidentalis.
Los valores LC50 fueron los siguientes:
Lombriz guerrera de remolacha - 2,53 ppm
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Mariposa Diamante - 0,16 ppm
Lombriz de la yema del abeto del oeste - 3,2 ppm
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Procedimiento de bioensayo: se prepararon diluciones de un sedimento de una espora y cristal mezclado con Dieta de Insecto USDA (Technical Bulletin 1528, Departamento de Agricultura de EE.UU.),
y se vertió en pequeñas bandejas de plástico. Se colocaron las larvas en la mezcla de dieta y se mantuvieron a 25◦ C (2da instar tardı́a de larvas de mariposa diamante, 2da instar temprana de larvas de
lombriz guerrera de remolacha, 4a instar de larvas de lombriz de la yema del abeto del oeste). Se registró
la mortalidad después de seis dı́as.
PS81I de B.thuringiensis, NRRL b-18484, y los mutantes del mismo, pueden cultivarse utilizando
medios y técnicas de fermentación estándares conocidos. Después de completarse el cı́rculo de fermentación, pueden recogerse las bacterias separando primero las esporas y los cristales de B.t. del caldo de
fermentación por medios bien conocidos en la técnica. Las esporas y los cristales de B.t. recuperados
pueden formularse en un polvo humedecible, un concentrado lı́quido, gránulos u otras formulaciones por
la adición de agentes tensioactivos, dispersantes, portadores inertes y otros componentes para facilitar el
manejo y la aplicación para pestes diana particulares. Los procedimientos de formulación y aplicación
son bien conocidos en la técnica y se utilizan con cepas comerciales de B. thuringiensis (HD-1) activas
contra Lepidoptera, por ejemplo, orugas. Puede utilizarse PS81I de B.t., y mutantes del mismo, para
controlar las pestes de lepidópteros.
Un subcultivo de PS81I de B.t. y los huéspedes E. coli que albergan los genes de toxina de la invención,
se depositaron en la colección permanente de Northern Research Laboratory, Departamento de EE.UU.
de Agricultura, Peoria, Illinois, USA. Los números de acceso y las fechas de depósito son las siguientes:
Subcultivo
PS81I de B.t.
E. coli(NM522)(pMYC392)
E. coli(NM522)(pMYC393)
E. coli(NM522)(pMYC394)
E. coli(NM522)(pMYC1603)
Número de Acceso
NRRL B-18484
NRRL B-18498
NRRL B-18499
NRRL B-18500
NRRL B-18517
Fecha de Depósito
19 de abril de 1989
17 de mayo de 1989
17 de mayo de 1989
17 de mayo de 1989
30 de junio de 1989
Los genes de toxina de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes
microbianos. La expresión de los genes de toxina afecta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Con huéspedes adecuados, por ejemplo Pseudomonas, los
microbios pueden aplicarse al sitio de los insectos lepidópteros donde proliferarán y serán ingeridos por los
insectos. El resultado es un control de los insectos indeseados. Alternativamente, el microbio que alberga
el gen de la toxina puede tratarse bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en
la célula. La célula tratada puede aplicarse a continuación al entorno de la(s) peste(s) diana. El producto
resultante mantiene la toxicidad de la toxina de B.t..
Cuando se introduce el gen de la toxina de B.t. via un vector adecuado en un huésped microbiano, y
dicho huésped se aplica al entorno en estado vivo, es esencial que se utilicen ciertos microbios huéspedes.
Se seleccionan los microorganismos huéspedes que se conocen que ocupan la “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de más interés. Estos microorganismos se seleccionan
para que sean capaces de competir con éxito en el entorno particular (cultivos y otros habitats de insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionen el mantenimiento estable y la expresión del
gen que expresa el pesticida polipeptı́dico y, deseablemente, proporcionen la protección del pesticida de
la degradación ambiental y la inactivación.
Se conocen un gran número de microorganismos que habitan el fitoplano (la superficie de las hojas
de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea a las raı́ces de las plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De particular
interés son microorganismos tales como la bacterias, por ejemplo del género Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xantohomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius,
Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Artrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos,
particularmente levaduras, por ejemplo el género Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son las especies bacterianas de la fitosfera
como Pseudomonas syringae. Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobiummelioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula
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rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y
Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados.
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Están disponibles una amplia variedad de vias para introducir un gen de B.t. que expresa una toxina
en el microorganismo huésped bajo condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del
gen. Se pueden proporcionar construcciones de ADN que incluyan las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción para la expresión del gen de la toxina, el gen de la toxina bajo su control
regulador y una secuencia de ADN homóloga con una secuencia en el organismo huésped, por la que
se produce la integración, y/o un sistema de replicación que es funcional en el huésped, por el que se
produce la integración o el mantenimiento estable.
Las señales de iniciación de la transcripción incluirán un promotor y un sitio de comienzo de la iniciación de la transcripción. En algunos casos, será deseable suministrar una expresión regulada de la
toxina, de manera que la expresión de la toxina solo se producirá después de la liberación al entorno.
Esto puede conseguirse con operadores o con una región de unión a un activador o potenciadores, que son
capaces de inducción al inducirse un cambio en el entorno fı́sico o quı́mico de los microorganismos. Por
ejemplo, puede emplearse una región reguladora sensible a la temperatura, de manera que los organismos
pueden crecer en el laboratorio sin expresión de una toxina, pero que al liberarse al entorno, puede comenzar la expresión. Otras técnicas pueden emplear un medio nutriente especı́fico en el laboratorio que
inhibe la expresión de la toxina, mientras que el medio nutriente del entorno permitirá la expresión de
la toxina. Para la iniciación de la traducción, podrán estar presentes un sitio de unión al ribosoma y un
codon de iniciación.
Pueden emplearse varias manipulaciones para potenciar la expresión del ARN mensajero, particularmente utilizando un promotor activo, ası́ como empleando secuencias que potencian la estabilidad del
ARN mensajero. La región de terminación de la transcripción y de la traducción incluirá codon(es) de
parada, una región terminadora, y opcionalmente, una señal de poliadenilación. Puede emplearse una
secuencia “lider” hidrofóbica del extremo amino de la secuencia polipeptı́dica traducida para promover
la secreción de la proteı́na a través de la membrana interna.
En la dirección de la transcripción, es decir en la dirección 5’ a 3’ de la secuencia codificante o secuencia sentido, la construcción contendrá la región reguladora transcripcional, si hay, y el promotor, en
el que la región reguladora puede estar bien en 5’ o en 3’ del promotor, el sitio de unión al ribosoma, el
codon de iniciación, el gen estructural que tiene una secuencia de lectura abierta en fase con el codon
de iniciación, el(los) codon(es) de parada, la secuencia señal de poliadenilación, si hay, y la región terminadora. Esta secuencia como una doble cadena puede utilizarse en sı́ misma para la transformación de
un microorganismo huésped, pero normalmente estará incluida en una secuencia de ADN que incluya un
marcador, donde la segunda secuencia de ADN puede unirse a la construcción de expresión de la toxina
durante la introducción del ADN en el huésped.
Por marcador se prefiere un gen estructural que dispone para la selección de estos huéspedes que han
sido modificados o transformados. El marcador aportará normalmente una ventaja selectiva, por ejemplo,
proporcionando una resistencia a un biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos o metales pesados;
complementación, como para proporcionar prototropı́a a un huésped auxotrópico, o los similares. Preferiblemente, se emplea la complementación, de forma que el huésped modificado no sólo sea seleccionado,
sino que además sea competitivo en el campo. Pueden emplearse uno o más marcadores en el desarrollo
de construcciones, ası́ como para modificar el huésped. Los organismos pueden ser modificados adicionalmente aportando una ventaja competitiva contra otros microorganismos en el campo. Por ejemplo,
los genes que expresan agentes quelantes metálicos, por ejemplo, sideróforos, pueden introducirse en el
huésped junto con el gen estructural que expresa la toxina. De esta manera, la expresión potenciada
de un sideróforo puede proporcionar una ventaja competitiva para el huésped que produce la toxina, de
manera que pueda competir eficientemente con los microorganismos de tipo salvaje y ocupar de forma
estable un nicho en el entorno.
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Cuando no está presente ningún sistema de replicación funcional, la construcción incluirá además una
secuencia de al menos 50 pares de bases (pb), preferiblemente al menos alrededor de 100 pb, y normalmente no más de alrededor de 1000 pb de una secuencia homóloga con una secuencia en el huésped. De
esta manera, la probabilidad de recombinación legı́tima se potencia, de forma que el gen se integrará
en el huésped y será mantenido establemente por el huésped. Deseablemente, el gen de la toxina estará
próximo al gen que aporta la complementación ası́ como del gen que aporta la ventaja competitiva. Por
lo tanto, en el caso de que se pierda un gen de toxina, sea muy probable que el organismo resultante haya
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perdido también el gen de la complementación y/o el gen que aporta la ventaja competitiva, de manera
que no sean capaces de competir en el entorno con el gen que retiene la construcción intacta.
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Estan disponibles un gran número de regiones reguladoras de la transcripción a partir de una amplia
variedad de microorganismos huéspedes, tales como bacterias, bacteriófagos, cianobacterias, algas, hongos, y los similares. Varias regiones de regulación transcripcional incluyen las regiones asociadas con el
gen trp, el gen lac, el gen gal, los promotores derecha e izquierda lambda, el promotor tac, los promotores
de ocurrencia natural asociados con el gen de la toxina, cuando son funcionales en el huésped. Véase
por ejemplo, las patentes de EE.UU. nos. 4.332.898, 4.342.832 y 4.356.270. La región de terminación
puede ser la región de terminación asociada normalmente con la región de iniciación de la transcripción,
o una región de iniciación de la transcripción diferente, de forma que las dos regiones son compatibles y
funcionales en el huésped.
Cuando se desea el mantenimiento o la integración episomial estable, se empleará un plásmido que
tenga un sistema de replicación que sea funcional en el huésped. El sistema de replicación puede derivarse
del cromosoma, un elemento episomial presente normalmente en el huésped o un huésped diferente, o
un sistema de replicación de un vius que es estable en el huésped. Están disponibles un gran número
de plásmidos tales como pBR322, pACYC184, RSF1010, pRO1614 y los similares. Véase, por ejemplo,
Olson et al., (1982) J. Bacteriol. 150:6069, y Bagdasarian et al., (1981) Gene 16:237, y las patentes de
EE.UU. Nos. 4.356.270, 4.362.817, y 4.371.625.
El gen de B.t. puede introducirse entre la región de iniciación de la transcripción y la traducción
y la región de terminación de la transcripción y la traducción, para que esté bajo el control regulador
de la región de iniciación. Esta construcción estará incluida en un plásmido, que incluirá al menos un
sistema de replicación, pero puede incluir más de uno, cuando se emplea un sistema de replicación para
el clonado durante el desarrollo del plásmido y es necesario el segundo sistema de replicación para funcionar en el último huésped. Además, pueden estar presentes uno o más marcadores, que se han descrito
previamente. Cuando se desea la integración, el plásmido incluirá deseablemente una secuencia homóloga
con el genoma del huésped.
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Los transformantes pueden aislarse de acuerdo con las vias convencionales, empleando normalmente
una técnica de selección que permita la selección del organismo deseado en contra de los organismos no
modificados o los organismos transferidos, cuando estén presentes. Los transformantes pueden probarse
después para actividad pesticida.
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Células huésped adecuadas, en las que las células que contienen pesticida serán tratadas para prolongar la actividad de la toxina en la célula cuando la célula entonces tratada se aplique al entorno de
la(s) peste(s) diana, pueden incluir o bien procariotas o bien eucariotas, estando normalmente limitadas a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, tales como
mamı́feros. Sin embargo, pueden utilizarse organismos que producen sustancias tóxicas a organsimos superiores, cuando la toxina no es estable o el nivel de aplicación es suficientemente bajo como para impedir
cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamı́fero. Como huéspedes, de particular interés serán los
procariotas y los eucariotas inferiores, tales como hongos. Procariotas ilustrativos, tanto gram-negativos
como positivos , incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella y
Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal como photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae: Pseudomonadaceae, tal
como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomycetales, y Nitrobacteraceae. Entre los
eucariotas están los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levaduras, tales como
Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y la levadura Basidiomycetes, tal como Rhodorotula, Aureobasidium, Sporobolomyces, y los similares.
Caracteristicas de particular interés para seleccionar una célula huésped para fines de producción incluyen la fácil introducción del gen de B.t. en el huésped, la disponibilidad de los sistema de expresión, la
eficiencia de expresión, la estabilidad del pesticida en el huésped, y la presencia de capacidades genéticas
auxiliares. Caracterı́sticas de interés para uso como una microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación, y empaquetamiento intracelular o formación de cuerpos de inclusión; afinidad por las hojas; carencia de toxicidad para mamı́feros;
atracción a pestes para ingestión; capacidad de matar y fijar sin dañar a la toxina; y las similares. Otras
consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manejo, economı́a, estabilidad al almacenamiento,
y las similares.
Organismos huésped de particular interés incluyen levaduras, tales como sp. Rhodotorula , sp. Aureo5
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basidium, sp. Saccharomyces, y sp. Sporobolomyces; organismos filoplanos tales como sp. Pseudomonas,
sp. Erwinia, y sp. Flavobacterium; u otros organismos tales como Escherichia, sp. Lactobacillus, sp
Bacillus, sp. Streptomyces, y los similares. Organismos especı́ficos incluyen Pseudomonas aeruginosa,
pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans y los similares.
La célula cuando se trate estará intacta normalmente y estará sustancialmente en la forma proliferativa, antes que en forma de espora, aunque en algunos casos pueden emplearse esporas.
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El tratamiento de la células microbianas, por ejemplo, un microbio que contiene el gen de la toxina
de B.t., puede ser por medios quı́micos o fı́sicos, o por combinación de medios quı́micos y/o fı́sicos, siempre que la técnica no afecte destruyendo las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular
de protección de la toxina. Ejemplos de reactivos quı́micos son agentes halogenantes, particularmente
halógenos de n◦ atómico 17-80. Más particularmente, puede utilizarse iodo bajo condiciones suaves y
durante tiempo suficiente para conseguir los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el
tratamiento con aldehı́dos, tales como formaldehı́do y glutaraldehı́do; antiinfecciosos, tales como cloruro
de zefiran y cloruro de cetilpiridina; alcoholes, tales como isopropilo y etanol; varios fijadores histológicos,
tales como ioduro de Lugol, fijador de Bouin, y fijador de Helly (Véase Humanson, Gretchen l., Animal
Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes fı́sicos (calor) y
quı́micos que mantengan y prolonguen la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula
se administra al animal huésped. Ejemplos de medios fı́sicos son la radiación de onda corta tal como la
radiación gamma y la radiación X, congelación, irradiación UV, liofilización, y los similares.
Las células tendrán generalmente la estabilidad estructural potenciada lo que mejorará la resistencia a
las condiciones ambientales. Cuando el pesticida está en una proforma, el procedimiento de inactivación
deberı́a seleccionarse de manera que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del
pesticida por el patógeno de peste diana. Por ejemplo, el formaldehı́do entrecruzará proteı́nas y podrı́a
inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida polipeptı́dico. El método de inactivación o destrucción retiene al menos una parte sustancial de la bio-disponibilidad o bioactividad de la toxina.
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El huésped celular que contiene el gen insecticida de B.t. puede cultivarse en cualquier medio nutriente conveniente, en el que la construcción de ADN proporciona una ventaja selectiva, proporcionando
un medio selectivo de forma que todas o sustancialmente todas las células retengan el gen de B.t.. Estas células pueden entonces cultivarse de acuerdo con vias convencionales. Alternativamente, las células
pueden tratarse antes de recogerse.
Las células B.t. pueden formularse de varias formas. Estas pueden emplearse como polvos humedecibles, gránulos o polvos, mezclándolas con varios materiales inertes, tales como minerales inorgánicos
(filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y los similares) o materiales botánicos (mazorcas pulverizadas, cáscaras de arroz, cascaras de nuez, y los similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes
para esparcir o pegar, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas, o tensioactivos. Las formulaciones lı́quidas pueden tener base acuosa o no acuosa y emplearse como espumas, geles, suspensiones,
concentrados emulsificables, o los similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes
tensioactivos, emulsificantes, dispersantes, o polı́meros.
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La concentración pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o si va a utilizarse directamente. El pesticida estará presente
en al menos un 1% en peso y puede estar en un 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán desde
alrededor de 1-95% en peso de pesticida, mientras que las formulaciones lı́quidas tendrán generalmente
desde alrededor de 1-60% en peso de los sólidos en la fase lı́quida. Las formulaciones tendrán generalmente desde alrededor de 102 hasta alrededor de 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán
a alrededor de 50 mg (lı́quido o seco) hasta 1 kg o más por hectárea.
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Las formulaciones pueden aplicarse al entorno de la(s) peste(s) de lepidópteros, por ejemplo plantas,
suelo o agua, mediante pulverización, espolvoreado, rociado o las similares.
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Los mutantes de PS81I pueden hacerse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo,
puede obtenerse un mutante asporógeno mediante mutagénesis de PS81I con sulfonato de etilmetano
(EMS). Pueden hacerse mutantes utilizando luz ultravioleta y nitrosoguanidina por procedimientos bien
conocidos en la técnica.
Un porcentaje menor de mutantes asporógenos permanecerán intactos y no lisarán durante largos
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perı́odos de fermentación; estas cepas se designan lisis menos (-). Las cepas lisis menos pueden identificarse seleccionando mutantes asporógenos en medio en un matraz de agitación y seleccionando aquellos
mutantes que están todavı́a intactos y contienen cristales de toxina al final de la fermentación. Las cepas lisis menos son adecuadas para un procedimiento de fijación celular que rendirá una proteı́na toxina
protegida y encapsulada.
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Para preparar una variante resistente de fago de dicho mutante asporógeno, se esparce un alı́cuota del
lisado del fago sobre agar nutriente y se deja secar. Después se plaquea directamente una alı́cuota de la
cepa bacteriana sensible al fago sobre el lisado seco y se deja secar. Se incubaron las placas a 30◦ C. Las
placas se incubaron durante 2 dı́as y al cabo de este tiempo, podı́an verse numerosas colonias creciendo
sobre el agar. Se cogieron y subclonaron algunas de estas colonias sobre placas de agar nutriente. Estos
cultivos aparentemente resistentes se probaron para resistencia trazando una cruz con el lisado del fago.
Se traza una lı́nea del lisado del fago sobre la placa y se deja secar. Después los cultivos presumiblemente
resistentes se trazan de forma cruzada sobre la lı́nea del fago. Los cultivos de bacterias resistentes no
muestran lisis en ningún punto a lo largo de la traza cruzada de la lı́nea del fago después de incubación a
lo largo de la noche a 30◦ C. La resistencia al fago es confirmada después plaqueando un tamiz del cultivo
resistente sobre una placa de agar nutriente. La cepa sensible se plaquea también de la misma manera
para servir como control positivo. Después de secar, se plaquea una gota del lisado del fago en el centro
de la placa y se deja secar. Los cultivos resistentes no mostraron lisis en el area en el que se habı́a situado
el lisado del fago después de incubación a 30◦ C durante 24 horas.
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A continuación se presentan ejemplos que ilustran los procedimientos, que incluyen la mejor forma
para practicar la invención. Estos ejemplos no deben ser tomados en sentido limitante. Todos los porcentajes se dan en peso y todas las proporciones de mezcla solvente son en volumen a menos que se indique
lo contrario.
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Ejemplo 1
Cultivo de PS81I de B. t.
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Puede utilizarse un subcultivo de PS81I de B.t., o mutantes del mismo, para inocular el siguiente
medio, una peptona, glucosa, sales de medio.
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Bacto peptona
Glucosa
KH2 PO4
K2 HPO4
Solución salina
Solución de CaCl2
Solución de sales (100 ml)
MgSO4 .7H2 O
MnSO4 .H2 O
ZnSO4 .7H2 O
FeSO4 .7H2 O
Solución de CaCl2 (100 ml)
CaCl2 .2H2 O
pH 7,2
7,5 g/l
1,0 g/l
3,4 g/l
4,35 g/l
5,0 ml/l
5,0 ml/l
2,46
0,04
0,28
0,40
g
g
g
g
3,66 g
La solución de sales y la solución de CaCl2 están esterilizadas en filtro y se añaden al caldo hervido y
en el autoclave al tiempo de la inoculación. Se incubaron los matraces a 30◦ C sobre un agitador rotatorio
a 200 rpm durante 64 horas.
El procedimiento anterior puede ser fácilmente escalado a fermentadores grandes por procedimientos
bien conocidos en la técnica.
Las esporas de B.t. y/o cristales, obtenidos en la fermentación anterior, pueden aislarse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Un procedimiento usado frecuentemente es someter el caldo de
fermentación colectado a técnicas de separación, por ejemplo, centrifugación.
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Ejemplo 2
Clonado de genes de la toxina nueva a partir del aislado PS81I y transformación en Escherichia coli
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Se preparó ADN celular total a partir de células B.t. crecidas a densidad óptica baja (OD600 = 1,0).
Se recuperaron las células por centrifugación y se pusieron en protoplastos en tampón TES (Tris-Cl 30
mM, ácido etilenodiaminotetraacético 10 mM [EDTA], NaCl 50 mM, pH = 8,0) que contiene sacarosa al
20% y 50 mg/ml de lisozima. Los protoplastos se lisaron por adición de dodecil sulfato de sodio (SDS) a
una concentración final de 4%. El material celular se precipitó a lo largo de la noche a 4◦ C en cloruro de
potasio neutro 100 mM (concentración final). Se extrajo el sobrenadante dos veces con fenol/cloroformo
(1:1). Se precipitó el ADN con etanol y se purificó por bandeo isopı́cnico sobre un gradiente de cesio.
Se digirió con EcoRI el ADN celular total de PS81I y HD-1 de B.t.k. y se separó por electroforesis
sobre un gel tamponado al 0,8% (p/v) de Agarosa-TAE (tris-Cl 50 mM, NaOAc 20 mM, EDTA 2,5 mM,
pH 8,0). Se hibridó una tinción Southern del gel con una sonda marcada radiactivamente [32P] contra
el fragmento de 3,3 Kb NsiI al fragmento NsiI del gen de la toxina contenido en el plásmido pM3,130-7
de NRRL B-18332 y el fragmento de 2,4 Kb NsiI a KpnI del gen de la toxina “clase 4,5 Kb” (Kronstad y Whitely [1986] Gene USA 43:29-40). Estos dos fragmentos se combinaron y se utilizaron como la
sonda. Los resultados muestran que los fragmentos que hibridan de PS81I son distintos de los de HD-1.
Especı́ficamente, se detectaron bandas que hibridaban en PS81I en el intervalo de tamaños de 1,5 Kb a
2,5 Kb, 2,3 Kb, 1,95 Kb, y 1,6 Kb en lugar de la única banda hibridante de 1,9 Kb en HD-1.
La siguiente descripción esboza las etapas realizadas para clonar dos de los tres fragmentos EcoRI
descritos anteriormente. Se digirieron con EcoRI doscientos microgramos de ADN celular total de PS81I
y se separaron por electroforesis sobre un gel preparativo de Agarosa-TAE al 0,8% (p/v). Se cortó
la región de 1,5 Kb a 2,3 Kb del gel y el ADN de la misma se electroeluyó y se concentró utilizando
una columna de intercambio iónico ELUTIPM C -d (Schleider y Schuell, Keene, NH) según las especificaciones del fabricante. Se ligaron los fragmentos EcoRI aislados a brazos EcoRI de LAMBDA ZAPM C
(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) y se empaquetaron utilizando extractos Gigapak GOLDM C
(Stratagene). El fago recombinante empaquetado se plaqueó con la cepa BB4 de E. coli (Stratagene) para
dar una alta densidad de placa. Se seleccionaron las placas por procedimientos estándares de hibridación
de ácidos nucleı́cos con la sonda marcada radioactivamente. Se purificaron las placas que hibridaron y
se re-seleccionaron a una densidad de placa menor. El fago purificado resultante se cultivó con el fago
helper R408 M13 (Stratagene) y el plásmido recombinante BlueScriptM C (Stratagene) se escindió automáticamente y se empaquetó. El “medio fago” se re-infectó en células E. coli XL-1-Blue (Stratagene)
como parte del procedimiento de escisión automático. Se seleccionaron las células XL-1 Blue infectadas para resistencia a ampicilina y se analizaron las colonias resultantes por un procedimiento estándar
de purificación rápida de plásmido para identificar los plásmidos deseados. Los plásmidos, designados
pM2,31-4 y pM2,3-1, contienen aproximadamente insertos EcoRI de 1,95 Kb y 1,6 Kb, respectivamente.
La secuencia de ADN de ambos insertos se determinó utilizando oligonucleótidos iniciadores T7 y T3 de
Stratagene, más un grupo de oligonucleótidos iniciadores internos existentes del gen de la endotoxina de
B.t.. Se secuenciaron alrededor de 500 pb del inserto en pM2,31-4. De la misma manera, se secuenciaron
aproximadamente 1,0 Kb del inserto en pM2,31-1. El análisis de datos que compara las dos secuencias a
otros genes secuenciados y clonados de endotoxina de B.t. mostró que se habı́an encontrado dos secuencias distintas de genes de toxina parcial única. Se construyeron oligonucleótidos sintéticos a regiones en
ambas secuencias que tenı́an una homologı́a mı́nima a otros genes de endotoxina de B.t. caracterizados.
El oligonucleótido de 42 mer construido para la secuencia del inserto en pM2,31-4 fue GGATACCGGTGACCCATTAACATTCCAATCTTTTAGTTACGC; se utilizó para aislar una secuencia del gen de la
toxina llamada 81IA. El oligonucleótido de 40 mer construido para la secuencia del inserto en pM2,31-1
fue GAAGTTTATGGCCTCTTTCTGTAGAAAATCAAATTGGACC; se utilizó para aislar una secuencia del gen de la toxina llamada 81IB.
Para clonar ambos genes de toxina completos, se construyó una librerı́a parcial Sau3A. El ADN celular total de PS81I parcialmente digerido con Sau3A y tamaño fraccionado por electroforesis en una
mezcla de fragmentos de 9-23 kb sobre un gel de agarosa-TAE al 0,6%, y purificado como se describió
previamente, se ligó en LambdaGEM-11M C (PROMEGA). Un fago empaquetado se plaqueó sobre células
E. coli P2392 (Stratagene) a un tı́tulo alto y se seleccionaron utilizando oligonucleótidos sintéticos marcados radioactivamente (mencionados anteriormente) como sondas de hibridación de ácido nucleı́co. Se
reseleccionaron placas de hibridación, utilizando cada sonda, a una densidad de placa menor. La placas
purificadas que hibridaron con cada sonda se utilizaron para infectar células de E. coli P2392 en cultivo
lı́quido para la preparación de fago para el aislamiento de ADN. Se aisló el ADN por procedimientos
estándares. Se digirieron cantidades preparativas de ADN con Sal1 (para liberar el ADN insertado a
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5
partir de brazos lambda) y se separaron por electroforesis sobre un gel de agarosa-TAE al 0,6%. Los
fragmentos grandes, electroeluı́dos y concentrados como se describió anteriormente, se ligaron a pUC19
(NEB) digerido con Sal1 y desfosforilado. Se introdujo la mezcla de ligazón por transformación en células
E. coli competentes DH5(α) (BRL) y se plaqueó sobre agar LB que contenı́a ampicilina, isopropil(β)D-tiogalactósido (IPTG), y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-(β)-D-galactósido (XGAL). Se sometieron colonias
blancas, con inserciones prospectivas en el gen (β)-galactosidasa de pUC19, a procedimientos rápidos de
puricación estándares de plásmido para aislar los plásmidos deseados. El plásmido pM3,122-1 contiene
un fragmento Sau3A de 15 Kb aislado utilizando la sonda de oligonucleótido 81IA. El plásmido pM4,59-1
contiene un fragmento de Sau3A de 18 Kb aislado utilizando la sonda de oligonucleótido 81IB.
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El plásmido pM3,122-1 se digirió con varias enzimas de restricción y se tiñó Southern. La tinción se
sondó con una sonda de oligonucleótido especı́fico 81LA marcados radioactivamente [32 P], ası́ como los
iniciadores de secuenciación de oligonucleótidos marcados fabricados a partir de genes de toxina de B.t.k
conocidos. El autoradiograma resultante mostró que estaban presentes dos genes de toxina en tándem
sobre este fragmento clonado Sau3A. El plásmido pM3,122-1, tenı́a un fragmento de NdeI de 4,0 Kb que
hibridó con sondas de oligonucleótidos fabricadas a partir de genes de B.t.k conocidos. Este fragmento,
sin embargo, no hibridó con los oligonucleótidos especı́ficos para 81IA o 81IB; se habı́a descubierto un
nuevo gen de toxina y fue llamado subsiguientemente 81IA2. Se aisló el fragmento NdeI de 4,0 Kb y se
clonó en pUC19, rindiendo el plásmido pMYC392. Se aisló el gen de toxina 81IA digiriendo pM3,122-1
con HindIII, produciendo la delección de la mayorı́a del gen de toxina 81IA2. El fragmento se recircularizó
para formar pMYC1603. El gen de toxina 81IA es único basado en su mapa de restricción y está siendo
secuenciado actualmente.
El plásmido pM4,59-1 se digirió con varias enzimas de restricción y se hizo una tinción Southern.
La tinción se sondó con la sonda de oligonucleótido especı́fico 81IB marcada radioactivamente [32 P], ası́
como con oligonucleótidos iniciadores de secuencia marcados fabricados para genes de toxina de B.t.k
conocidos. El plásmido pM4,59-1 se mapeó y se encontró que contenı́a sólo un gen de toxina de 81IB
parcial. Se descubrió una secuencia de lectura abierta completa (ORF) de un segundo gen de toxina sobre
el fragmento de 18 Kb y se llamó 81IB2. Se clonó el gen de toxina 81IB2 separadamente del gen de toxina
81IB por digestión de pM4,59-1 con NdeI y SmaI, rellenando el saliente NdeI y ligando el fragmento lineal
de nuevo. El plásmido resultante se llamó pMYC394. Se aisló la ORF completa del gen de toxina 81IB
de otro fragmento Sau3A, se clonó a partir de la librerı́a lambda, sobre un fragmento de 7,3 Kb HindIII
en pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante es pMYC393.
Los genes de toxina se secuenciaron por el método Sanger estándar de terminación de cadena dideoxi
utilizando oligonucleótidos iniciadores fabricados para la “clase 4,5 Kb” del gen de toxina y “andando”
con iniciadores fabricados para las secuencias de los nuevos genes de toxina. El análisis de secuencia de
los cuatro genes de toxina descubrió secuencias de lectura abierta únicas y dedujo proteı́nas de endotoxina
únicas. La toxina de esta invención se muestra en el gráfico A. La ORF es de 3716 pb y el peso molecular
de la endotoxina que se deduce es de 133.621 daltons.
Se han expresado proteı́nas de endotoxina en Pseudomonas y/o Bacillus a partir de genes de toxina.
El análisis de tinción SDS-PAGE/Western, utilizando anticuerpos policlonales dirigidos contra la toxina
de clase “6,6 Kb”, verificó que cada gen codifica una proteı́na inmunorreactiva de aproximadamente
130.000 daltons. Las proteı́nas de toxina codificadas por los genes del sujeto de la invención expresadas
o en huésped Bacillus o en huésped Pseudomonas tienen actividad contra todos los insectos lepidópteros
probados: Trichoplusia ni, Spodoptera exigua, Plutella xylostella y Choristoneura occidentalis.
Los procedimientos de clonación anteriores se llevaron a cabo utilizando procedimientos estándares a
menos que se indique de otra manera.
Los diferentes procedimientos empleados en la preparación de plásmidos y la transformación de organismos huéspedes es bien conocido en la técnica. Además, son bien conocidos en la técnica los procedimientos para la utilización del bacteriófago lambda como vehı́culo de clonación, es decir, la preparación
del ADN lambda, en empaquetamiento in vitro, y la transfección de ADN recombinante. Todos estos
procedimientos están descritos en Maniatis, T., Fritsch, E.F., y Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning:
A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. De esta manera, está dentro de la
capacidad de los expertos en la técnica de ingenierı́a genética extraer ADN a partir de células microbianas, realizar digestiones con enzimas de restricción, hacer electroforesis de fragmentos de ADN, cortar
y unir un plásmido y un inserto de ADN, ligar ADN, transformar células, preparar ADN de plásmido,
hacer electroforesis de proteı́nas y secuenciar ADN.
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Las enzimas de restricción descritas en este documento pueden adquirirse de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA, o Boehringer-Mannheim, Indianapolis,
IN. Las enzimas se utilizan según las instrucciones proporcionadas por el suministrador.
5
10
Los plásmidos que contienen los genes de toxina de B.t. pueden eliminarse de los microbios huésped
transformados mediante el uso de procedimientos estándares bien conocidos. Por ejemplo, los microbios
huéspedes pueden someterse a procedimientos de gradientes de densidad isopı́cnicos de lisado aclarado,
y los similares, para recuperar el plásmido deseado.
Ejemplo 3
Inserción de genes de toxina en plantas
15
20
Los nuevos genes que codifican para las nuevas toxinas insecticidas, según se describen en este documento, pueden insertarse en células de planta utilizando el plásmido Ti de Agrobacter tumefaciens. Las
células de plantas pueden después regenerar plantas (Zambryski, P., Joos, H. Gentello, C., Leemans, J.,
Van Montague, M. y Schell, J [1983] Cell 32:1033-1043). Un vector particularmente útil en este aspecto
es pEND4K (Klee, H.J., Yanofsky, M.F. y Nester, E.W. [1985] Bio/Technology 3:637-642). Este plásmido
puede replicarse tanto en células de planta como en bacterias y tiene múltiples sitios de clonado para
genes pasajeros. El gen de la toxina, por ejemplo, puede insertarse en el sitio BamHI de pEND4K, propagarse en E. coli, y transformarse en células de planta apropiadas.
Ejemplo 4
25
30
35
Clonado de nuevos genes de B. thuringiensis en Baculovirus
Los nuevos genes de la invención pueden clonarse en baculovirus tales como el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV). Pueden construirse plásmidos que contengan el genoma
AcNPV clonado en un vector de clonado comercial tal como pUC8. El genoma de AcNPV se modifica
de manera que se elimina la región codificante del gen de la polihedrina y un único sitio de clonado para
un gen pasajero se sitúa directamente detrás del promotor de la polihedrina. Ejemplso de tales vectores
son pGP-B6874, descrito por Pennock et al. (Pennock, G.D., Shoemaker, C. y Miller, L.K. [1984] Mol.
Cell. Biol. 4:399-406), y pAC380, descrito por Smith et al. (Smith, G.E., Summers, M.D. y Fraser, M.J.
[1983] Moll. Cell. Biol. 3:2156-2165). El gen que codifica la nueva proteı́na toxina de la invención puede
modificarse con ligandos BamHI en regiones apropiadas tanto corriente arriba como corriente abajo a
partir de la región codificante e insertarse en un sitio pasajero de uno de los vectores AcNPV.
La nueva secuencia de nucleótidos que codifica la nueva toxina de B.t., y la secuencia de aminoácidos
deducida se muestran en el gráfico A.
40
Es bien conocido en la técnica que la secuencia de aminoácidos de una proteı́na se determina mediante
la secuencia de nucleótidos del ADN. Debido a la redundancia del código genético, es decir, puede utilizarse más de un triplete de nucleótidos codificante (codon) para la mayorı́a de los aminoácidos utilizados
para hacer proteı́nas, diferentes secuencias de nucleótidos pueden codificar para un aminoácido particular.
45
La nueva toxina de B.t. puede prepararse via cualquier secuencia de nucleótidos (equivalente a la
mostrada) que codifique la misma secuencia de aminoácidos; La presente invención incluye tales secuencias de nucleótidos equivalentes.
50
Se ha mostrado que pueden construirse proteı́nas de estructura y función identificadas cambiando
la secuencia de aminoácidos, si tales cambios no alteran la estructura secundaria de la proteı́na; véase
Kaiser, E.T. y Kezdy, F.J. (1984) Science 223:249-255. La presente invención incluye mutantes de las
secuencias de aminoácidos descritas en este documento que tienen una estructura secundaria inalterada
de proteı́na o, si la estructura está alterada, el mutante mantiene la actividad biológica en algún grado.
55
60
10
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Gráfico A
5
5
10
15
Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu
ATG GAG AAT AAT ATT CAA AAT CAA TGC GTA CCT TAC AAT TGT TTA
20
25
30
Asn Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly
AAT AAT CCT GAA GTA GAA ATA TTA AAT GAA GAA AGA AGT ACT GGC
10
35
40
45
Arg Leu Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu
AGA TTA CCG TTA GAT ATA TCC TTA TCG CTT ACA CGT TTC CTT TTG
15
20
25
50
55
60
Ser Glu Phe Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp
AGT GAA TTT GTT CCA GGT GTG GGA GTT GCG TTT GGA TTA TTT GAT
65
70
75
Leu Ile Trp Gly Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu
TTA ATA TGG GGT TTT ATA ACT CCT TCT GAT TGG AGC TTA TTT CTT
80
85
90
Leu Gln Ile Glu Gln Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu
TTA CAG ATT GAA CAA TTG ATT GAG CAA AGA ATA GAA ACA TTG GAA
95
100
105
Arg Asn Arg Ala Ile Thr Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr
AGG AAC CGG GCA ATT ACT ACA TTA CGA GGG TTA GCA GAT AGC TAT
30
110
115
120
Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn
GAA ATT TAT ATT GAA GCA CTA AGA GAG TGG GAA GCA AAT CCT AAT
35
40
45
125
130
135
Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr
AAT GCA CAA TTA AGG GAA GAT GTG CGT ATT CGA TTT GCT AAT ACA
140
145
150
Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn Asn Phe Thr Leu Thr Ser
GAC GAC GCT TTA ATA ACA GCA ATA AAT AAT TTT ACA CTT ACA AGT
155
160
165
Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu
TTT GAA ATC CCT CCT TTA TCG GTC TAT GTT CAA GCG GCG AAT TTA
170
175
180
His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe Gly Gln Gly Trp
CAT TTA TCA CTA TTA AGA GAC GCT GTA TCG TTT GGG CAG GGT TGG
50
185
190
195
Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn Arg Leu Ile
GGA CTG GAT ATA GCT ACT GTT AAT AAT CAT TAT AAT AGA TTA ATA
55
60
200
205
210
Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr Tyr Asn
AAT CTT ATT CAT AGA TAT ACG AAA CAT TGT TTG GAC ACA TAC AAT
215
220
225
Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp Ala
CAA GGA TTA GAA AAC TTA AGA GGT ACT AAT ACT CGA CAA TGG GCA
11
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230
235
240
Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Trh Val Leu Asp
AGA TTC AAT CAG TTT AGG AGA GAT TTA ACA CTT ACT GTA TTA GAT
5
245
250
255
Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile
ATC GTT GCT CTT TTT CCG AAC TAC GAT GTT AGA ACA TAT CCA ATT
10
260
265
270
Gln Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val
CAA ACG TCA TCC CAA TTA ACA AGG GAA ATT TAT ACA AGT TCA GTA
15
20
275
280
285
Ile Glu Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn
ATT GAG GAT TCT CCA GTT TCT GCT AAT ATA CCT AAT GGT TTT AAT
290
295
300
Arg Ala Glu Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met
AGG GCG GAA TTT GGA GTT AGA CCG CCC CAT CTT ATG GAC TTT ATG
305
310
315
Asn Ser Leu Phe Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val
AAT TCT TTG TTT GTA ACT GCA GAG ACT GTT AGA AGT CAA ACT GTG
25
320
325
330
Trp Gly Gly His Leu Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg
TGG GGA GGA CAC TTA GTT AGT TCA CGA AAT ACG GCT GGT AAC CGT
30
35
40
335
340
345
Ile Asn Phe Pro Ser Tyr Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile
ATA AAT TTC CCT AGT TAC GGG GTC TTC AAT CCT GGT GGC GCC ATT
350
355
360
Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser
TGG ATT GCA GAT GAG GAT CCA CGT CCT TTT TAT CGG ACA TTA TCA
365
370
375
Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly Phe Gly Asn Pro His Tyr Val
GAT CCT GTT TTT GTC CGA GGA GGA TTT GGG AAT CCT CAT TAT GTA
380
385
390
Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln Gln Thr Gly Thr Asn His
CTG GGG CTT AGG GGA GTA GCA TTT CAA CAA ACT GGT ACG AAC CAC
45
395
400
405
Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile Asp Ser Leu Asp Glu
ACC CGA ACA TTT AGA AAT AGT GGG ACC ATA GAT TCT CTA GAT GAA
50
55
60
410
415
420
Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp Asn Asp Tyr Ser
ATC CCA CCT CAG GAT AAT AGT GGG GCA CCT TGG AAT GAT TAT AGT
425
430
435
His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro Gly Glu Ile
CAT GTA TTA AAT CAT GTT ACA TTT GTA CGA TGG CCA GGT GAG ATT
440
445
450
Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Thr His
TCA GGA AGT GAT TCA TGG AGA GCT CCA ATG TTT TCT TGG ACG CAC
12
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455
460
465
Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile Thr
CGT AGT GCA ACC CCT ACA AAT ACA ATT GAT CCG GAG AGG ATT ACT
5
10
15
470
475
480
Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr
CAA ATA CCA TTG GTA AAA GCA CAT ACA CTT CAG TCA GGT ACT ACT
485
490
495
Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg
GTT GTA AGA GGG CCC GGG TTT ACG GGA GGA GAT ATT CTT CGA CGA
500
505
510
Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly
ACA AGT GGA GGA CCA TTT GCT TAT ACT ATT GTT AAT ATA AAT GGG
515
520
525
Gln Leu Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr
CAA TTA CCC CAA AGG TAT CGT GCA AGA ATA CGC TAT GCC TCT ACT
20
530
535
540
Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe
ACA AAT CTA AGA ATT TAC GTA ACG GTT GCA GGT GAA CGG ATT TTT
25
30
35
545
550
555
Ala Gly Gln Phe Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr
GCT GGT CAA TTT AAC AAA ACA ATG GAT ACC GGT GAC CCA TTA ACA
560
565
570
Phe Gln Ser Phe Ser Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe
TTC CAA TCT TTT AGT TAC GCA ACT ATT AAT ACA GCT TTT ACA TTC
575
580
585
Pro Met Ser Gln Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser
CCA ATG AGC CAG AGT AGT TTC ACA GTA GGT GCR GAT ACT TTT AGT
590
595
600
Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val
TCA GGG AAT GAA GTT TAT ATA GAC AGA TTT GAA TTG ATT CCA GTT
40
605
610
615
Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys
ACT GCA ACA TTT GAA GCA GAA TAT GAT TTA GAA AGA GCA CAA AAG
45
50
55
620
625
630
Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Ile Asn Gln Ile Gly Ile Lys
GCG GTG AAT GCG CTG TTT ACT TCT ATA AAC CAA ATA GGG ATA GGG
635
640
645
Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val
ACA GAT GTG ACG GAT TAT CAT ATT GAT CAA GTA TCC AAT TTA GTG
650
655
660
Asp Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu
GAT TGT TTA TCA GAT GAA TTT TGT CTG GAT GAA AAG CGA GAA TTG
665
670
675
Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn
TCC GAG AAA GTC AAA CAT GCG AAG CGA CTC AGT GAT GAG AAT TTA
60
13
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680
685
690
Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Lys Gly Ile Asn Arg Gln Leu Asp
TTA CTT CAA GAT CCA AAC TTC AAA GGC ATC AAT AGG CAA CTA GAC
5
695
700
705
Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Arg Gly Asp
CGT GGT TGG AGA GGA AGT ACG GAT ATT ACC ATC CAA AGA GGA GAT
10
15
20
710
715
720
Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp
GAC GTA TTC AAA GAA AAT TAT GTC ACA CTA CCA GGT ACC TTT GAT
725
730
735
Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Ley Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys
GAG TGC TAT CCA ACG TAT TTA TAT CAA AAA ATA GAT GAG TCG AAA
740
745
750
Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp
TTA AAA CCC TAT ACT CGT TAT CAA TTA AGA GGG TAT ATC GAG GAT
755
760
765
Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His
AGT CAA GAC TTA GAA ATC TAT TTG ATC CGC TAT AAT GCA AAA CAC
25
770
775
780
Glu Thr Val Asn Val Leu Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser
GAA ACA GTA AAT GTG CTA GGT ACG GGT TCT TTA TGG CCG CTT TCA
30
35
40
785
790
795
Val Gln Ser Pro Ile Arg Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala
GTC CAA AGT CCA ATC AGA AAG TGT GGA GAA CCG AAT CGA TGC GCG
800
805
810
Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp
CCA CAC CTT GAA TGG AAT CCT GAT CTA GAT TGT TCC TGC AGA GAC
815
820
825
Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile
GGG GAA AAA TGT GCA CAT CAT TCG CAT CAT TCC TCC TTG GAC ATT
830
835
840
Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Asp Val Trp Val
GAT GTT GGA TGT ACA GAC TTA AAT GAG GAC TTA GAT GTA TGG GTG
45
845
850
855
Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn
ATA TTC AAG ATT AAG ACG CAA GAT GGC CAT GCA AGA CTA GGA AAT
50
55
60
860
865
870
Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala
CTA GAG TTT CTC GAA GAG AAA CCA TTA GTC GGG GAA GCA CTA GCT
875
880
885
Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys
CGT GTG AAA AGA GCA GAG AAA AAA TGG AGA GAT AAA CGT GAA AAA
890
895
900
Leu Glu Leu Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser
TTG GAA TTG GAA ACA AAT ATT GTT TAT AAA GAG GCA AAA GAA TCT
14
ES 2 084 659 T3
905
910
915
Val Asp Ala Leu Phe val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala
GTA GAT GCT TTA TTT GTA AAC TCT CAA TAT GAT CAA TTA CAA GCG
5
10
15
920
925
930
Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His
GAT ACG AAT ATT GCC ATG ATT CAT GCG GCA GAT AAA CGT GTT CAT
935
940
945
Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly
AGA ATT CGG GAA GCG TAT CTT CCA GAG TTA TCT GTG ATT CCG GGT
950
955
960
Val Asn Val Asp Ile Phe Glu Glu Leu Lys Gly Arg Ile Phe Thr
GTA AAT GTA GAC ATT TTC GAA GAA TTA AAA GGG CGT ATT TTC ACT
965
970
975
Ala Phe Phe Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp
GCA TTC TTC CTA TAT GAT GCG AGA AAT GTC ATT AAA AAC GGT GAT
20
980
985
990
Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp
TTC AAT AAT GGC TTA TCA TGC TGG AAC GTG AAA GGG CAT GTA GAT
25
30
35
995
1000
1005
Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu
GTA GAA GAA CAA AAC AAC CAC CGT TCG GTC CTT GTT GTT CCG GAA
1010
1015
1020
Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg
TGG GAA GCA GAA GTG TCA CAA GAA GTT CGT GTC TGT CCG GGT CGT
1025
1030
1035
Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu
GGC TAT ATC CTT CGT GTC ACA GCG TAC AAG GAG GGA TAT GGA GAA
1040
1045
1050
Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu
GGT TGC GTA ACC ATT CAT GAG ATC GAG AAC AAT ACA GAC GAA CTG
40
1055
1060
1065
Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr
AAG TTT AGC AAC TGC GTA GAA GAG GAA GTC TAT CCA AAC AAC ACG
45
50
55
1070
1075
1080
Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly
GTA ACG TGT AAT GAT TAT ACT GCA AAT CAA GAA GAA TAC GGG GGT
1085
1090
1095
Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Tyr Gly Ser
GCG TAC ACT TCC CGT AAT CGT GGA TAT GAC GAA ACT TAT GGA AGC
1100
1105
1110
Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys
AAT TCT TCT GTA CCA GCT GAT TAT GCG TCA GTC TAT GAA GAA AAA
1115
1120
1125
Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg
TCG TAT ACA GAT GGA CGA AGA GAC AAT CCT TGT GAA TCT AAC AGA
60
15
ES 2 084 659 T3
1130
1135
1140
Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys
GGA TAT GGG GAT TAC ACA CCA CTA CCA GCT GGC TAT GTG ACA AAA
5
1145
1150
1155
Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile
GAA TTA GAG TAC TTC CCA GAA ACC GAT AAG GTA TGG ATT GAG ATC
10
15
1160
1165
1170
Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu
GGA GAA ACG GAA GGA ACA TTC ATC GTG GAC AGC GTG GAA TTA CTC
Leu Met Glu Glu
CTT ATG GAG GAA
20
25
30
35
40
45
50
55
60
16
ES 2 084 659 T3
REIVINDICACIONES
1. Bacillus thuringiensis PS81RRI disponible bajo el número de acceso NRRLB-18484.
5
10
2. Una toxina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el gráfico A, o un mutante de la
misma, que tiene actividad contra Spodoptera exigua, Plutella xylostella, y Choristoneura occidentalis, y
es inmunoreactiva con anticuerpos para la secuencia mostrada en el gráfico A, y en la que la secuencia
de la misma es codificada por una secuencia de ADN que hibrida con la siguiente secuencia:
GGATACCGGTGACCCATTAACATTCCAATCTTTTAGTTACGC.
3. ADN que codifica una toxina de Bacillus thuringiensis según la reivindicación 2.
4. ADN según la reivindicación 3, que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el gráfico A.
15
20
5. Un vector de transferencia de ADN recombinante que comprende ADN según la reivindicación 3 o
la reivindicación 4.
6. Un huésped procariota o eucariota al que ha sido transferido y replicado un vector de transferencia
de ADN según la reivindicación 5.
7. Un microorganismo capaz de expresar una toxina de Bacillus thuringiensis que tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en el gráfico A.
25
30
8. Un microorganismo según la reivindicación 7, que es una especie de Pseudomonas, Azotobacter,
Erwinia, Serratia, Klebsiella, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter
o Alcaligenes; un procariota seleccionado entre Enterbacteriaceae, Bacillaceae, Rhizobiaceae, Spirillaceae,
Lactobacillaceae, Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae; o un eucariota inferior seleccionado entre Phycomycetos, Ascomycetos y Basiodiomycetos.
9. Un microorganismo según la reivindicación 8, que es Pseudomonas fluorescens o Escherichia coli.
10. Un microorganismo según la reivindicación 9, que es E. coli (NM522) (pMYC 1603) disponible
bajo el número de acceso NRRL B-18517.
35
40
11. Un microorganismo según la reivindicación 7, que es una bacteria pigmentada, una levadura
pigmentada o un hongo pigmentado.
12. Un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, que es pigmentado y
adherente a filoplanos.
13. Células sustancialmente intactas de un microorganismo unicelular según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 6 a 12, que contienen la toxina.
45
50
14. Células según la reivindicación 13, obtenidas por tratamiento con iodo u otros medios quı́micos o
fı́sicos para prolongar la actividad insecticida en el entorno.
15. Una composición que comprende un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones
1 y 6 a 12, en asociación con un excipiente insecticida o con ingredientes de formulación para aplicarse
como revestimiento de semillas.
16. Una composición según la reivindicación 15, en la que el microorganismo está en forma de esporas
o cristales.
55
60
17. Una composición según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en la que el excipiente comprende fago estimulantes o atrayentes de escarabajos.
18. Un procedimiento para controlar una peste de insecto lepidóptero, que comprende poner en contacto la peste o su entorno con un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a
12.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que la administración es a la rizosfera, al
filoplano, o a una masa de agua.
17
ES 2 084 659 T3
20. Un procedimiento según la reivindicación 18, que comprende colocar un gránulo señuelo que comprende el microorganismo, por ejemplo como esporas o cristales, sobre o en el suelo al plantar la semilla
de una planta que se sabe que alimenta a la peste.
5
21. Un procedimiento según la reivindicación 20, en el que el gránulo señuelo se pone al mismo tiempo
que se planta en el suelo la semilla de maı́z.
22. El plásmido pMYC 1603, disponible en un huésped según la reivindicación 10.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
18