INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA Kit ELISA para la detección del Inmunocomplejo de las variantes del Antígeno de Carcinoma de Células Escamosas (SCCA-IgM) Rev. 02/2015 XG003.P 96 Tests SOLO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO Fabricado en: Benedetti & Co Biosolutions s.r.l. Via Bolognese, 250 51100 Pistoia ES SÍMBOLOS UTILIZADOS EN LA ETIQUETA Dispositivo diagnóstico in vitro Numero de lote Código de catálogo Fecha de caducidad (utilizar antes de…) Limitaciones de temperatura (conservar a …..) Número de test Atención, leer las Instruccione de uso Riesgo Biológico 1.0 USO Hepa-IC es un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) para la medida cuantitativa de los Inmunocomplejos de las variantes del Antígeno del Carcinoma de Células Escamosas (SCCA-IgM). 2.0 EXPLICACIÓN DEL TEST Hepa-IC es un innovativo método de diagnóstico in-vitro basado en la detección de las variantes del Antígeno del Carcinoma de Células Escamosas (SCCA) como Complejos Inmunes circulates (IC). Hepa-IC es un ensayo ELISA altamente específico y sensible para la detección del Hepatocarcinoma (HCC) diseñada para medir SCCA-IgM en el suero de los pacientes (1-15). La cantidad de SCCA-IgM está expresada en Unidades Arbitrarias (AU/mL), usando un calibrador específico como referencia. La medida de SCCA-IgM ofrece la posibilidad de aumentar notablemente la sensibilidad de la detección de HCC sin comprometer la especificidad comparado con los niveles en suero de alfa-fetoproteína (AFP) (1,8,9,11-15). La evaluación de SCCAIgM es también útil en la monitorización del desarrollo de HCC en pacientes con Hepatitis crónica (CH) o cirróticos (CR) (2-7,10). 3.0 PRINCIPIO DEL TEST Los calibradores estándar y las muestras son simultáneamente incubadas en los pocillos de una placa microtituladora sensibilizada con anticuerpo anti-SCCA. El inmunocomplejo SCCA-IgM es detectado mediante la incorporación de un anticuerpo secundario conjugado con enzima y el sustrato de la enzima (TMB). El color desarro INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA llado es proporcional a la cantidad del inmunocomplejo de la muestra. 4.0 REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS XG003-PL: microplaca de 96 pocillos, sensibilizada con anticuerpo anti-SCCA purificado de conejo. XG003-Calibrator: Dos viales de calibrador liofilizado de PBS. Polvo blanco. Concentración exacta en la etiqueta. XG-EA2: 14 mL de una solución de anticuerpo secundario anti-IgM conjugado con peroxidasa listo para usar. XG-CH7: 14 mL de una solución cromógena lista para usar de TMB (3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine). XG-ST7: 14 mL de solución bloqueadora de H2SO4 0.3M lista para usar. XG-DB5: 5 mL de solución de dilución concentrada 5x. Diluir con agua desionizada. Una vez diluida, la solución contiene 1% BSA y 0.05% Tween 20. Contiene Proclin como conservante. XG-WB3: 100 mL de solución de lavado concentrada 10x. Diluir con agua desionizada. 5.0 EQUIPAMIENTO NECESARIO NO SUMINISTRADO Pipetas de precisión con puntas desechables Lavador de microplacas Lector de microplacas con filtro 450 ± 20 nm Agua destilada o desionizada 6.0 CONDICIONES ALMACENAMIENTO El kit tiene que ser conservado entre 2 y 8°C. La fecha de caducidad está impresa en cada componente y en la etiqueta del kit. 7.0 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 7.1 NORMAS DE SEGURIDAD • SOLO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO • La solución del estándar XG003Calibrator contiene proteínas de orígen humano. Este material ha sido analizado mediante métodos aprobados para la presencia de anticuerpos directos contra el virus del HIV, contra el virus HCV y para la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg), y se han obtenido resultados negativos. Como ningún test puede ofrecer la completa seguridad de la ausencia de los virus HIV, HBV, HCV, y otros agentes infecciosos, todos los reactivos de origen humano deben ser considerados potencialmente infecciosos. Como consecuencia, se recomienda manejar estos reactivos y muestras de origen humano de acuerdo con el Procedimiento Estándar OSHA para patógenos presentes en la sangre (16). La buena práctica de laboratorio y nivel de seguridad 2 deben ser usados en el caso de materiales que contienen o sospechosamente contienen agentes infecciosos (18, 19). • No pipetear con la boca. Usar guantes de un solo uso y protección para los ojos a la hora de manipular las muestras y durante el test. Lavar las manos una vez terminado el test. • Los siguientes reactivos tienen concentraciones base de sustancias nocivas o irritantes: • El tampón de lavado (XG-WB3) contiene detergentes; • El conjugado (XG-EA2) contiene fenol; • El sustrato (XG-CH7) es ácido; • Si un reactivo entra en contacto con la piel o con los ojos lavar abundantemente con agua. • El material que no es de un solo uso debe ser esterilizado después de usarse preferiblemente en autoclave durante una hora a 121 °C. El material de un solo uso debe ser autoclavado o incinerado. • El ácido sulfúrico presente en la solución bloqueadora (XG-ST7) y el ácido clorídrico INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA utilizado para lavar el material de vidrio son corrosivos; estas sutancias tienen que ser utilizadas con cuidado. En caso de contacto con la piel o los ojos, lavar abundantemente con agua. • Los ácidos neutralizados y otros residuos líquidos deben ser desinfectados añadiendo hipoclorito de sodio a un volumen suficiente para obtener una concentración de al menos 1%. Una exposición al hipoclorito de sodio al 1% de al menos 30 minutos debería ser suficiente para garantizar una desinfección eficaz. Eventuales derramamientos de material potencialmente infeccioso deben ser eliminados inmediatamente con papel absorbente y la zona contaminada deberá ser limpiada con por ejemplo hipoclorito de sodio 1% antes de continuar con el trabajo. Si un ácido está presente, no deberá utilizarse el hipoclorito de sodio antes de que la zona haya sido secada. Todos los materialesutilizados para limpiar eventuales derramamientos, incluidos guantes, tienen que ser tratados como residuos potencialmente infeccioso. No meter en el autoclave material que contiene hipoclorito de sodio. 7.2 PRECAUCIONES TÉCNICAS • Conservar de 2 a 8°C • Antes del uso, poner los reactivos y muestras a temperatura ambiente (1830°C). Volver a poner los reactivos a la temperatura aconsejada de conservación inmediatamente después de su uso. • Abrir la bolsa de la placa al menos media hora después de haber estado a temperatura ambiente. • No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad. Evitar la contaminación por microorganismos de los reactivos porque disminuye la validez del producto y puede dar resultados erróneos. • No modificar el procedimiento ni sustituir los reactivos con los de otros productores • • • • • • • • • • o otros lotes. No disminuir el tiempo de incubación recomendado. Toda la cristalería que se usa en el test debe ser lavada atentamente con ácido clorídrico 2M y aclarada con agua destilada o desionizada. Evitar el uso de congeladores con autodescongelación para la conservación de las muestras. No exponer a los reactivos a fuerte iluminación ni a vapor de hipoclorito durante la conservación y las fases de incubación. Evitar que los pocillos se sequen durante el test. Evitar la contaminación entre reactivos. Es importante utilizar pipetas “dedicadas” para el uso. Evitar tocar el borde del pocillo con el conjugado. No soplar sobra las microplacas. Los ensayos inmunoenzimáticos pueden presentar un particular efecto sobre el borde (“edge effect”); se puede minimizar aumentado la humedad durante las fases de incubación. Las placas tienen que estar cubiertas con un cubreplacas y ser incubadas en la oscuridad. Como alternativa, se pueden incubar en un analizador adecuado. Para más detalles consultar el manual operativo específico del instrumento. No se pueden usar incubadores a CO2. Antes de leer la placa asegurarse que el fondo de la misma esté limpio y seco y que no haya búrbujas en la superficie del líquido. Puede ser una fuente de error el uso de muestras altamente hemolizadas, suero no completamente coagulado o muestras que presentan contaminación microbiológica. Leer el manual operativo relativo a cualquier instrumento utilizado, con atención a los siguientes puntos: • Instalación y requisitos particulares; INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA • • • Principio operativo, instrucciones, precauciones, riesgos; Instrucciones específicas del producto y utilización del instrumento; Manutención y asistencia técnica. 8.0 RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El suero es la muestra recomendada para la ejecución del test Hepa-IC. Las muestras de suero deben ser extraídas en condiciones asépticas y en modo que no se produzcan fenómenos de hemólisis. Las muestras pueden ser conservadas a 28°C si el experimento se realiza en las 24 horas siguientes a la extracción, en caso contrario las muestras deben ser congeladas. Cuando se descongelan, la muestra debe ser delicadamente agitada para asegurarse la consistencia y homogeneidad de los resultados. Evitar ciclos repetidos de congelamiento y descongelamiento. Las muestras que presentan sedimentos, eritrocitos o turbidez tienen que ser centrifugadas y clarificadas antes de efectuar el test. 9.0 INSTRUCCIONES DE USO 9.1 NOTAS TÉCNICAS • Permitir a las muestras y a los reactivos de alcanzar la temperatura ambiente antes de ejecutar el test. No descongelar las muestras o los reactivos al baño María. • Agitar delicadamente las muestras y los reactivos antes del uso. • Evitar la formación de espuma . Evitar la exposición de los reactivos a fuentes de calor excesivo o de luz durante la conservación y la incubación. • Las muestras y el estándar deberían ser analizados por duplicado. • Realizar una curva estándar para cada test. • Usar solo strip sensibilizadas y provenientes del mismo lote para cada test. No mezclar reactivos provenientes de kits pertenecientes a lotes diversos. • Realizar la incubación en una caja cerrada con un papel húmedo en la base con el objetivo de prevenir una evaporación excesiva. 9.2 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS • Reconstituir el calibrador XG003 con 440 μL de agua desionizada en cada vial. • Preparar la cantidad necesaria del buffer de dilución XG-DB5 diluyendo 5 veces la solución concentrada con agua desionizada. Si aparecen cristales tras la refrigeración, calentad la botella a 37°C y agitad hasta su disolución. • Preparar la cantidad necesaria del buffer de lavado XG-WB3 diluyendo 10 veces la solución concentrada en agua desionizada. 9.3 EJECUCIÓN DEL TEST 1. Preparar los reactivos como descrito anteriormente. 2. Preparar la microplaca con suficientes pocillos para llevar a cabo el test del estándar y las muestras. 3. Extraer de la matriz de la microplaca las strips sobrantes y conservarlas en la bolsa de plástico con el desecante suministrado. 4. Lavar las strips de la microplaca tres veces con el buffer de lavado XG-WB3 (300 μL/well). 5. Distribuir 100 μL/pocillo del calibrador estándar (por duplicado) empezando por la solución reconstituida y llevando a cabo en la placa diluciones seriadas con factor de dilución 2 con el objetivo de obtener una curva de calibración de 7 puntos. Usar el buffer de dilución XG-DB5 como diluyente (videoclip en http://www.xeptagen.com/elisains). Para la concentración exacta del calibrador reconstituido, hacer referencia al valor de cocentración (AU/mL) indicado en el vial XG003-Calibrator. Distribuir también 100 μL/pocillo del buffer de dilución DB5 como blanco por duplicado. INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA 6. Distribuir 100 μL/pocillo de las muestras diluidas 8 veces (1:8) por duplicado. Usar el buffer de dilución XG-DB5 como diluyente. 7. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 8. Lavar seis veces con el buffer de lavado XG-WB3 (300 μL/pocillo). 9. Añadir 100 μL/pocillo de la solución del anticuerpo secundario conjugado XGEA2. 10. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 11. Lavar seis veces con el buffer de lavado XG-WB3 (300 μL/pocillo). 12. Distribuir 100 μL/pocillo de la solución cromógena XG-CH7. 13. Permitir que la solución se colore durante 10-15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, añadir 100 µL/pocillo de la solución de stop XG-ST7 y medir los valores OD de cada pocillo usando un lector de placas ELISA equipado con un filtro de 450 nm. Una vez bloqueada la reacción debe leerse dentro de una hora. 14. Interpretar los valores de OD con el software Xerepro (http://www.xeptagen.com/software) o como descrito en la próxima sección: Elaboración de los resultados. 10.0 RESULTADOS 10.1 ELABORACIÓN DE LOS RESULTADOS a. Calcula la media de las densidades ópticas obtenidas por duplicado para cada punto del calibrador estándar y de las muestras. b. Sustrae la media de las absorbancias del blanco. c. Costruye la curva estándar colocando las concentraciones del calibrador conocidas en el eje X y los relativos valores de absorbancia en el eje Y. d. Calcula la concentración de SCCA-IgM de las muestras por interpolación con un curva de regresión según una ecuación a cuatro parámetros. e. Multiplica por el factor de dilución con el objetivo de obtener la concentración de las muestras antes de la dilución. 10.2 CONTROL DE CALIDAD El coefficiente de variación intra- e interensayo ha sido determinado sobre 4 curvas estándar y ha resultado ser inferior a 15%. Para un esperimento óptimo, la absorbancia relativa al blanco debería ser inferior a 0.2 OD@450. Se recomienda que cada laboratorio efectúe el test utilizando sus propias muestras analizadas precedentemente y con resultado positivo como control de calidad interno para asegurarse de la exactitud del procedimento y los reactivos. 10.3 INTERPRETACIÓN Hepa-IC puede ser utilizado para (1-15, 2024): • el diagnóstico de HCC ya que el análisis de SCCA-IgM es altamente sensible, hasta un 70% de detección de HCC, y extremadamente específico, hasta el 100% en sujetos sin enfermedad. • evaluar el riesgo de la evolución a HCC en pacientes con enfermedades hepáticas benignas. • monitorar la progresión de la hepatitis en pacientes HCV positivos. • proporcionar la respuesta del paciente al tratamiento de la hepatitis C. • determinar el pronóstico de pacientes con HCC ya que los niveles de SCCA-IgM elevados están asociados con periodos de supervivencia más breves. • monitorar la eficacia del tratamiento en pacientes con HCC. INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA 11.0 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO 11.1 INTERVALO El intervalo de calibración está comprendido entre 5 y 200 AU/mL. El “efecto gancho” puede verificarse para valores de cocentración superiores a 200 AU/mL (valor leído en la curva de calibración antes de multiplicar por la dilución). Las muestras con valores superiores a 200 AU/mL deben ser aún más diluidas y analizadas de nuevo. 11.2 PRECISIÓN Precisión intraensayo Muestra C1 C3 N 8 8 AU/mL 112 249 CV 2.3% 6.4% H5 8 565 6.3% H1 8 1014 12.3% Precisión interensayo Campione C1 C3 N 24 24 AU/mL 111 254 CV 1.3% 4.1% H5 24 580 2.3% H1 24 1140 11% REFERENCIAS 1. Giannelli G, Fransvea E, Trerotoli P, Beaugrand M, Marinosci F, Lupo L, Nkontchou G, Dentico P, Antonaci S. Clinical validation of combined serological biomarkers for improved hepatocellular carcinoma diagnosis in 961 patients. Clin Chim Acta. 383:14752, 2007 2. 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New frontiers in biomarkers for hepatocellular carcinoma. Dig Liver Dis. 38: 854-9, 2006 7. Pontisso P, Quarta S, Caberlotto C, Beneduce L, Marino M, Bernardinello E, Tono N, Fassina G, Cavalletto L, Gatta A, Chemello L. Progressive increase of SCCA-IgM immune complexes in cirrhotic patients is associated with development of hepatocellular carcinoma. Int J Cancer. 119: 735-40, 2006. 8. Beneduce L, Marino M, Gallotta A, Pesce G, Pontisso P, Fassina G. A new class of biomarkers for hepatocellular INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA carcinoma; IgM immune complexes. J Clin Virol.36: S48, 2006 9. Beneduce L, Gallotta A, Marino M, Fassina G. Improvement of sensitivity for liver cancer detection by simultaneous evaluation of SCCA-IgM, AFP-IgM complexes and free AFP. J Hepatol. 44: S97, 2006 10. Quarta S, Caberlotto C, Beneduce L, Castaldi F, Marino M, Fassina G, Tono N, Cavalletto L, Chemello L, Gatta A, and Pontisso P. 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