UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LOS CONSTITUYENTES ANTITUBERCULOSOS DE LA CÁSCARA DE Citrus aurantifolia POR Q.F.B. NALLELY ELIZABETH SANDOVAL MONTEMAYOR COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN EN FARMACIA Agosto 2011 Aprobación de la tesis “AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LOS CONSTITUYENTES ANTITUBERCULOSOS DE LA CÁSCARA DE Citrus aurantifolia” ______________________________________ Dra, María del Rayo Camacho Corona Presidente ______________________________________ Dr. Edgar Abraham García Zepeda Secretario ______________________________________ Dra. Elvira Garza Gonzalez Vocal ______________________________________ Dra. María Teresa Garza González Sub-directora de Estudios de Posgrado Agosto 2011 i Revisión de la Tesis “AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LOS CONSTITUYENTES ANTITUBERCULOSOS DE LA CÁSCARA DE Citrus aurantifolia” ______________________________________ Dra, María del Rayo Camacho Corona ______________________________________ Dr. Edgar Abraham García Zepeda ______________________________________ Dra. Elvira Garza Gonzalez ______________________________________ Dra. Ivonne A. Camacho Mora ______________________________________ MC. Rosario González González Agosto 2011 ii RESUMEN Nallely Elizabeth Sandoval Montemayor Fecha de Graduación: Agosto, 2011 Universidad Autónoma de Nuevo León Facultad de Ciencias Químicas Título del estudio: AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LOS CONSTITUYENTES ANTITUBERCULOS DE LA CÁSCARA DE Citrus aurantifolia Número de páginas: Candidato para el grado de Maestría en Ciencias con Orientación en Farmacia Área de estudio: Química y Farmacología de Productos Naturales Propósito y Método de estudio: La tuberculosis es una enfermedad causada por el Mycobacterium tuberculosis. De acuerdo a datos estadísticos reportados en el 2009 por la Organización Mundial de la Salud (OMS), se registraron 9.4 millones de nuevos casos de tuberculosis y 1.3 millones de muertes. En México, la Secretaría de Salud reportó 15,384 casos de tuberculosis pulmonar en el 2011 y en 2009 reportó 1,872 defunciones. La resistencia de M. tuberculosis a los fármacos antituberculosos, los efectos adversos y el tiempo de tratamiento, así como la combinación letal de la tuberculosis con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), han creado la necesidad de buscar nuevas alternativas para el tratamiento de esta enfermedad. Las plantas medicinales nos proporcionan una fuente invaluable de nuevos fármacos con actividad antituberculosa. Es por ello que en este proyecto se estudió el extracto hexánico de la cáscara de Citrus aurantifolia ya que en estudios anteriores dicho extracto presentó actividad antituberculosa en contra de una cepa sensible y tres cepas monoresistentes; por lo que se decidió llevar a cabo el fraccionamiento del extracto, así como también la separación e identificación de los constituyentes antituberculosos, empleando técnicas cromatográficas y espectroscópicas, así como la utilización del método de Alamar azul para la determinación de la actividad antituberculosa. Conclusiones y contribuciones: Se lograron aislar, purificar y caracterizar estructuralmente cinco compuestos: 5-geranoxi-psoraleno, 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina, 5,7-dimetoxi-cumarina, 5,8-dimetoxipsoraleno y 5-metoxi-psoraleno. Asimismo se identificaron por CG/EM 40 compuestos: nueve monoterpenos, cinco sesquiterpenos, cinco cetonas, cuatro alcanos, cuatro cumarinas, tres ácidos grasos, tres alcoholes, dos ésteres, dos éteres, un fenol, un aldehído y una hidroxiacetona. Los ácidos grasos palmítico, linoléico y oléico; y las furanocumarinas 5-geranoxi-psoraleno y 5,8-dimetoxi-psoraleno son buenos prototipos moleculares para la síntesis de nuevos fármacos antituberculosos. Dra. María del Rayo Camacho Corona Dra. Elvira Garza González (Firma del asesor) (Firma del Co-asesor) iii AGRADECIMIENTOS Dra. María del Rayo Camacho Corona Por la paciencia y dedicación durante mi estancia en la maestría. Dra. Elvira Garza González (Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, UANL) Por la atención y facilidades brindadas para la realización de los ensayos con Mycobacterium tuberculosis. Dra. Laura Álvarez Berber (Centro de Investigaciones Químicas de la Universidad Autónoma de Morelos) Por el apoyo en la adquisición de los espectros de RMN de Ca4, Ca6, Ca7 y Ca8; así como también de analizar el extracto hexánico de C. aurantifolia en el CG-EM. Dra. Verónica M. Rivas Galindo (Facultad de Medicina, UANL) Por el apoyo en analizar la muestra Ca9 en el aparato de RMN. CONACYT Por el apoyo de la beca económica, durante la realización de esta tesis. Asimismo, por la aprobación del proyecto número 10607 de Ciencia Básica en el 2009, ya que con este apoyo, se ha podido pagar los consumibles requeridos para este proyecto. Facultad de Ciencias Químicas (UANL) Por las facilidades brindadas durante mi carrera profesional y la maestría. iv DEDICATORIA A Dios por darme la vida y permitirme realizar mis estudios, a Él le debo lo que soy, Él me da la fortaleza de seguir adelante y la Fe que necesito cada día para afrontar mis decisiones. A mi familia, quienes por sobre todas las cosas me apoyaron y soportaron en mis crisis de estrés, gracias a ellos que siempre están conmigo en cualquier momento para ayudarme y alentarme a nunca dejar el camino que tomé. Gracias a mi papá que es mi ejemplo a seguir, quien logró salir adelante con sacrificios para que nuestra familia tuviera lo mejor posible, yo por eso te admiro papi, porque se lo que te costó estar en donde estás. Gracias mamá por ser siempre la mejor mamá, por que tus sacrificios son un ejemplo para mí y un ejemplo a seguir, gracias por cada lonche que me preparaste. A mi tía Pera que me apoyo en todo momento y quien fue la que más soportó mi estrés, gracias por tantas veces que me diste un aventón a la escuela y por los consejos que me brindas, eres como una segunda hermanita porque contigo convivo en todo aspecto como tal. A mi hermana Yadira que es una gorrosita, pero a la cual quiero mucho, hermanita recuerda que tú siempre puedes lograr lo que te propongas, nunca tengas miedo de nada. A mi novio Cutberto, por todo su amor y apoyo, gracias por nunca truncar mis sueños y apoyarme en cada decisión, tu bien sabes que lo que haga hoy en adelante será para un bien común… Te amo! Y que sería de mi sin mis compañeros de generación? Erika eres una excelente persona la cual admiro por su paciencia, Darío compartimos el mismo gusto por los perritos y hasta nos hizo llorar la misma película, Panchito eres digno de admiración, tu manera de salir adelante a pesar de las adversidades porque a pesar de todo tienes esas ganas de estudiar, Laurita aprendí a conocerte mejor, lo que nunca fue en licenciatura, eres una persona maravillosa con nobles sentimientos y Olivia gracias por permitirme conocerte más y más cada día eres una gran amiga para mí y a pesar de ser tan distintas sabemos v apoyarnos y respetar nuestras formas de ser, te quiero amiga…. A todos ustedes los quiero y me siento muy dichosa por haber compartido las horas de clase y relajo con ustedes. ¿Qué difícil hubiera sido para mí montar mi primera columna y cargar litros y litros de solvente? Gracias Juan Manuel alias “el socarrón” por ser mi maestro pues tú me enseñaste a trabajar en el laboratorio desde que entré al servicio, gracias por enseñarme a trabajar con la micobacteria y pasarme todos tus tips. Eres un socarrón muy bueno porque aguantaste mis achaques de desesperación, pero sobre todo aprendí a sacarte las palabras aunque fuera a tirabuzón y a pesar de eso al final de todo terminabas hablando tu solito. Gracias maestra Paty por todo su apoyo, por escucharme y entenderme, con su presencia hizo los días más llevaderos, y usted para mí es una amiga y ánimo ya falta menos para que termine su doctorado. A todos mis compañeros del laboratorio como Paty Tecate, tan ñoña y dedicada que es ella, admiro la pasión con la que haces lo que te gusta niña! A la nueva integrante del laboratorio de química de productos naturales que es Adrianita y también a la chica loca de licenciatura llamada Iris (alias Isis) y que nunca deja de reir. Gracias a los vecinos, por esas comidas llenas de risa y amontonamiento porque en esa mesita hacíamos milagros y no entiendo como cabía tanta gente. A Raúl, Ivette, Eder, Hulk, Jorge, mi amiguis Oli y al doc Isaías que me permitió comer en su laboratorio y que siempre me supo escuchar. Gracias a todos y cada una de las personas que hicieron mi estancia en la maestría una experiencia inolvidable, que Dios los bendiga hoy y siempre! vi TABLA DE CONTENIDO Capítulo Página 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Tuberculosis 1.1.2 Diagnóstico 1.1.3 Profilaxis 1.1.4 Tratamiento 1.1.5 Epidemiología 1.1.6 Problemática Actual 1.2 Medicina Tradicional 1.3 Citrus aurantifolia 1 2 3 4 8 9 10 12 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 2.1 Hipótesis 2.2 Objetivo General 2.2.1 Objetivos Específicos 27 27 27 3. METODOLOGÍA 3.1 Estudio Fitoquímico 3.1.1 Recolección del material vegetal 3.1.2 Obtención del extracto hexánico 3.1.3 Fraccionamiento del extracto 3.1.3.1 Aislamiento y purificación de los principios antituberculosos 3.1.3.2 Compuesto Ca4 (5-Geranoxi-psoraleno) 3.1.3.3 Compuesto Ca6 (5-Geranoxi-7-metoxi-cumarina) 3.1.3.4 Compuesto Ca7 (5,7-Dimetoxi-cumarina o limetina) 3.1.3.5 Compuesto Ca8 (Bergapteno o 5-Metoxi-psoraleno) 3.1.3.6 Compuesto Ca9 (Isopimpinellina o 5,8-Dimetoxipsoraleno) 3.1.4 Separación e identificación de los componentes volátiles del extracto hexánico por CG/EM 3.1.5 Identificación de los compuestos aislados y purificados 3.2 Ensayo Biológico vii 28 28 28 28 30 30 31 31 31 32 32 33 33 3.2.1 Preparación de las muestras a evaluar 3.2.2 Preparación del inóculo bacteriano 3.2.3 Desarrollo del ensayo biológico 3.3 Disposición de residuos: parte fitoquímica y ensayos biológicos 33 33 34 35 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37 4.1 Caracterización estructural de los compuestos aislados y purificados del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia 4.1.1 Elucidación estructural del compuesto 5-geranoxi-psoraleno (Ca4) 4.1.2 Elucidación estructural del compuesto 5-geranoxi-7-metoxicumarina (Ca6) 4.1.3 Elucidación estructural del compuesto 5,7-dimetoxi-cumarina o limetina (Ca 7) 4.1.4 Elucidación estructural del compuesto 5-metoxi-psoraleno o Bergapteno (Ca8) 4.1.5 Elucidación estructural del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno o Isopimpinellina (Ca9) 4.2 Compuestos identificados por CG/EM 4.3 Actividad antituberculosa de los compuestos identificados y caractarizados del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia 37 44 52 54 60 69 76 5. CONCLUSIONES 81 6. FUTURAS INVESTIGACIONES 83 BIBLIOGRAFÍA 84 APÉNDICE- Espectros de masas de los compuestos identificados del extracto hexánico de Citrus aurantifolia 94 RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO 115 viii LISTA DE FIGURAS Figura Página 1. Estructura de la pared celular de M. tuberculosis 2. Estructura química de los fármacos antituberculosos de primera línea 3. Estructura química de los fármacos antituberculosos de segunda línea 1 7 7 4. Reducción de resazurina a resofurina 34 5. Diagrama del desarrollo del ensayo biológico 36 6. Espectro de RMN 1H (700 MHz, CDCl3) de 5-geranoxi-psoraleno 40 13 7. Espectro de RMN C (176 MHz, CDCl3) de 5-geranoxi-psoraleno 41 8. Estructura del compuesto 5-geranoxi-psoraleno 39 9. Espectro de COSY de 5-geranoxi-psoraleno 42 10. Espectro de HMBC de 5-geranoxi-psoraleno 43 1 11. Espectro de RMN H (400 MHz, CDCl3) del compuesto 5-geranoxi-7metoxi-cumarina 12. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) del compuesto 5-geranoxi-7metoxi-cumarina 13. Estructura del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina 47 14. Espectro COSY del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina 49 15. Espectro HSQC del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina 50 16. Espectro HMBC del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina 17. Estructura del compuesto 5,7-dimetoxi-cumarina 18. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) del compuesto 5,7-dimetoxicumarina 19. Espectro de RMN 1H (700 MHz, CDCl3) del compuesto 5-metoxipsoraleno 20. Espectro de RMN 13C (176 MHz, CDCl3) del compuesto 5-metoxipsoraleno 21. Estructura química del compuesto 5-metoxi-psoraleno 22. Espectro COSY del compuesto 5-metoxi-psoraleno 23. Espectro HMBC del compuesto 5-metoxi-psoraleno 24. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno. 25. RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno 26. Estructura del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno 51 52 53 ix 48 45 56 57 55 58 59 63 64 61 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. Espectro de DEPT 45 del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Espectro de DEPT 90 del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Espectro de COSY del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Espectro de NOESY del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Espectro HETCOR del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Estructura química de los compuestos identificados del extracto hexánico de C. aurantifolia Estructura química de los compuestos identificados del extracto hexánico de C. aurantifolia Espectro de masas del compuesto tetrahidro-2-metil-2H-pirano Espectro de masas del compuesto 4-Hexen-3-ona Espectro de masas del compuesto 3-Metil-3-penten-2-ona Espectro de masas del compuesto 3-Hexen-2-ona Espectro de masas del compuesto Pinacol Espectro de masas del compuesto Resorcinol Espectro de masas del compuesto p-Cimeno Espectro de masas del compuesto 1-Metoxiciclohexeno Espectro de masas del compuesto Óxido de linalol Espectro de masas del compuesto Acetato de crisantenilo Espectro de masas del compuesto Corilon Espectro de masas del compuesto Terpinen-4-ol Espectro de masas del compuesto α-Terpineol Espectro de masas del compuesto 3-Metil-1,2-ciclopentanediona Espectro de masas del compuesto Carvona Espectro de masas del compuesto Geraniol Espectro de masas del compuesto Citral Espectro de masas del compuesto 1,8-Dimetil-4-(1-metiletil)spiro[4,5]dec-6-en-8-ona Espectro de masas del compuesto Formato de geranilo Espectro de masas del compuesto Ácido oléico Espectro de masas del compuesto Acetato de (2)-7-metil -8-tetradecenilo Espectro de masas del compuesto α-bergamoteno Espectro de masas del compuesto Trans-α -bisaboleno Espectro de masas del compuesto Óxido de cariofileno Espectro de masas del compuesto Espatulenol Espectro de masas del compuesto 7-metoxi-cumarina Espectro de masas del compuesto 1-heptatriacotanol Espectro de masas del compuesto Trans-fitol Espectro de masas del compuesto Versálido Espectro de masas del compuesto Palmitato de metilo Espectro de masas del compuesto Ácido palmítico Espectro de masas del compuesto 5,7-dimetoxi-cumarina Espectro de masas del compuesto 5-metoxi-psoraleno Espectro de masas del compuesto Ácido linoléico Espectro de masas del compuesto Tricosano x 65 65 66 67 68 72 73 95 95 96 96 97 97 98 98 99 99 100 100 101 101 102 102 103 103 104 104 105 105 106 106 107 107 108 108 109 109 110 110 111 111 112 69. 70. 71. 72. 73. Espectro de masas del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Espectro de masas del compuesto Pentacosano Espectro de masas del compuesto Tetracosanal Espectro de masas del compuesto Octacosano Espectro de masas del compuesto Nonacosano 112 113 113 114 114 LISTA DE TABLAS Tabla Página 1. Fármacos antituberculosos de primera y segunda Línea 2. Ejemplos de fármacos obtenidos a partir de plantas medicinales 3. Fraccionamiento del extracto hexánico y compuestos mayoritarios observados por cromatografía en capa fina 4. Constantes espectroscópicas de RMN de 1H y 13C y HMBC de 5geranoxi-psoraleno 5. Constantes espectroscópicas de RMN de 1H y 13C y HMBC de 5geranoxi-7-metoxi-cumarina 6. Constantes espectroscópicas de RNM 1H del compuesto 5,7-dimetoxicumarina 7. Constantes espectroscópicas de RMN de 1H y 13C y HMBC de 5metoxi-psoraleno 8. Constantes espectroscópicas de RMN 1H y 13C del compuesto 5,8dimetoxi-psoraleno 9. Compuestos separados e identificados por CG/EM del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia. 10. Compuestos identificados por primera vez en la cáscara de C. aurantifolia 11. Actividad en contra de M. tuberculosis H37Rv de los compuestos 5 11 29 39 46 52 55 62 69 75 76 identificados en el extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia 12. Actividad en contra de cepas resistente de M. tuberculosis de los compuestos identificados en el extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia xi 77 NOMENCLATURA ADN Ácido desoxirribonucléico AEDA Aroma-extraction dilution analysis ARN Ácido ribonucléico ATCC American Type Culture Collection BCG Bacilo de Calmette-Guérin Ca Citrus aurantifolia CCF Cromatografía en Capa Fina CG/EM Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría de Masas CG-O Cromatografía de Gases acoplado a Olfatometría CI50 Concentración Inhibitoria 50 CMI Concentración Mínima Inhibitoria COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DFPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo DH Deshidrogenasa xii DMSO Dimetilsulfóxido DPP Derivado Proteico Purificado g Gramos h Horas HETCOR Heteronuclear Correlation HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HPLC High-performance liquid chromatography Hz Hertz IR Infrarrojo J Constante de acoplamiento kg Kilogramos mg Miligramos μg Microgramos MHz Mega Hertz mL Mililitros MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol xiii nm Nanómetros NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy OADC Ácido oléico, Abúmina, Dextrosa y Catalasa pf Punto de Fusión ppm Partes por millón Rf Factor de retención RMN Resonancia Magnética Nuclear SNC Sistema Nervioso Central TB Tuberculosis TB-MFR Tuberculosis multi-fármaco resistente TB-XDR Tuberculosis Extremadamente Resistente VIH Virus de Inmunodeficiencia Humana xiv CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN 1.1 Tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad contagiosa causada por el Mycobacterium tuberculosis, también conocido como bacilo de Koch. Entre las características más sobresalientes del género Mycobacterium se encuentran que son: bacilos gram positivos, ácido-alcohol resistentes, no esporulados y no móviles. Poseen una pared celular compleja constituida por ácidos micólicos, los cuales se encuentran unidos a D-arabinosa y D-galactosa que a su vez están unidos al esqueleto de péptidoglicano (1). Una imagen de la estructura de la pared celular de M. tuberculosis es mostrada en la Figura 1. Figura 1. Estructura de la pared celular de M. tuberculosis (2) ~1~ La infección por M. tuberculosis se da por transmisión directa de persona a persona por medio de pequeñas gotitas de saliva que contienen a los microorganismos, estos son transportados por el aire desde un caso activo hasta un huésped susceptible (3). Estas gotitas pueden llegar a los alvéolos pulmonares desencadenando una respuesta inmunológica celular llevada a cabo por los antígenos de la membrana y del citoplasma de las micobacterias, posteriormente los macrófagos reconocen y procesan dichos antígenos y los muestran a los linfocitos T para estimular la transformación de los macrófagos en células especializadas, las cuales se sitúan alrededor de los bacilos dando lugar al granuloma tuberculoso. En muchos casos, este sistema de defensa controla la infección; sin embargo, pueden quedar microorganismos latentes pudiendo activarse en algún momento de la vida del huésped (4) dando lugar a la enfermedad con signos y síntomas característicos como: malestar general, pérdida de peso, tos y sudoración nocturna; escasamente se presentan esputos de carácter purulento y en ocasiones con sangre (1). 1.1.1 Diagnóstico El diagnóstico de la tuberculosis se basa en una suma de elementos que indican la presencia o ausencia de M. tuberculosis. Entre las pruebas útiles para el diagnóstico se encuentran las siguientes (5): Prueba de la tuberculina. Se basa en el hecho de que los individuos infectados con bacilos tuberculosos desarrollan hipersensibilidad al Derivado Proteico Purificado de Seibert (DPP) (6). El DPP es aplicado de manera intradérmica ~2~ en el antebrazo, siendo positiva cuando se presenta induración palpable de 10 mm en 48 horas en el sitio de aplicación (4). Radiografía de tórax. Baciloscopía. Se basa en la presencia de bacilos ácido-alcohol resistente en un frotis por medio de la tinción Ziehl-Neelsen en muestras de esputo, aunque también se puede utilizar pus, líquido cefalorraquídeo y líquidos de cavidades serosas inflamadas (6). 1.1.2 Profilaxis La vacuna derivada del Bacilo de Calmette y Guérin (vacuna BCG) es una de las vacunas más utilizada en los países en los que forman parte del programa nacional de inmunización infantil. Esta vacuna fue obtenida por Calmette y Guérin, quienes sometieron una cepa de Mycobacterium bovis a numerosos ciclos de atenuación durante 13 años, siendo en el año de 1921 cuando se utilizó por primera vez en seres humanos. Actualmente todas las cepas vacunales derivan del aislado original de M. bovis y para evitar desviaciones respecto a la BCG original, la OMS ha conservado desde 1956 muestras liofilizadas de las cepas vacunales (7). Sin embargo, la vacunación con BCG presenta algunas desventajas; una de ellas es la hipersensibilidad que provoca en la prueba de la tuberculina ya que no se puede distinguir entre la hipersensibilidad causada por una infección o la causada con la vacuna BCG (8). Cabe mencionar que la vacunación con BCG no evita la infección primaria y, lo que es más importante, no evita la reactivación de la infección pulmonar latente (7). ~3~ 1.1.3 Tratamiento El tratamiento de la tuberculosis se basa en conceptos distintos a las demás enfermedades infecciosas, ya que M. tuberculosis tiene un tiempo de generación prolongado y la capacidad para entrar en periodos de latencia con una actividad metabólica limitada, lo que condiciona la acción de algunos fármacos antituberculosos como la isoniazida. Aunado a este factor, existe el hecho de que la pared celular de M. tuberculosis es compleja, hidrófoba y con una permeabilidad reducida para un gran número de compuestos, en consecuencia, el tratamiento de la tuberculosis se realiza con agentes antimicrobianos específicos (9). Además de considerar la relación que hay entre el fármaco y la micobacteria para un tratamiento efectivo, es importante tomar en cuenta la aceptación por parte del paciente, los efectos adversos de los fármacos y las interacciones farmacológicas, ante todo en los pacientes que reciben tratamiento para el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) (9). M. tuberculosis y otras micobacterias suelen desarrollar resistencia con rapidez cuando se encuentran frente a un solo fármaco, de manera que para desarrollar un tratamiento eficaz es necesario administrar un esquema prolongado de varios medicamentos, que va de 6 meses en una tuberculosis no resistente y de dos años en una tuberculosis resistente (9). En la Tabla 1 se enlistan los diferentes fármacos utilizados en el tratamiento de la tuberculosis, incluyendo sus mecanismos de acción, sus principales efectos adversos (10) y concentración mínima inhibitoria (CMI). Cabe mencionar que los ~4~ medicamentos utilizados para el tratamiento de la tuberculosis se dividen en dos categorías: Primera línea (Figura 2) y segunda línea (Figura 3); estos últimos se administran cuando el paciente presenta resistencia a los de primera línea. El esquema de tratamiento antituberculoso más utilizado en pacientes no resistentes se lleva a cabo en seis meses y consiste en la administración de isoniazida, rifampicina, etambutol y pirazinamida los primeros dos meses, seguido de isoniazida y rifampicina los siguientes cuatro meses (9). TABLA 1 Fármacos Antituberculosos de Primera y Segunda Línea Fármaco CMI (μg/mL) Mecanismo de Acción Efectos adversos Primera Líneaa Isoniazida Rifampicin a Etambutol Inhibidor de la síntesis de ácidos micólicos (profármaco). Inhibidor de la polimerasa de ARN dependiente de ADN de la micobacteria. Bloqueador de transferasas de arabinosilo involucradas en la biosíntesis de la pared celular. Estreptomi cina Inhibe la síntesis de proteínas al alterar la función de los ribosomas. Actúa como un bactericida. Pirazinami da El mecanismo de acción se desconoce. Muestra actividad bactericida a un pH ácido. ~5~ 0.025 -0.2 Erupciones, fiebre, ictericia y neuritis periférica 0.005b-0.5c Erupciones, fiebre, náusea y vómito. b 1-5c c Neuritis óptica Ototoxicidad, nefrotoxicidad 8c-10b 12.5b-20c Daño hepático. CONTINÚA Fármaco Etionamida Ácido Aminosalicí lico Cicloserina Amikacina Kanamicina a Mecanismo de Acción CMI (μg/mL) Segunda Líneaa El mecanismo de acción no está bien definido, pero se cree que ocurre una 0.5-2.5b deficiencia en la síntesis de la pared celular. Es un bacteriostático cuyo mecanismo de acción es similar al de las sulfonamidas, las cuales impiden que el 1b ácido para-aminobenzóico (PABA) sea utilizado de manera normal en la síntesis de ácido fólico. Inhibe las reacciones en que interviene la D-alanina en la síntesis de la pared bacteriana. Inhibe la síntesis de proteínas al unirse a la subunidad 30S de los ribosomas 5-20b 1c-4b 1 c Efectos adversos Anorexia, náusea, vómito, irritación gástrica y diversos síntomas neurológicos. Trastornos digestivos (anorexia, náusea, dolor epigástrico, dolor abdominal y diarrea) Reacciones adversas en el Sistema Nervioso Central (SNC) como; somnolencia, cefalalgia, temblor, disartria, vértigo etc. Nefrotoxicidad y ototoxicidad Mecanismos de acción como agente antimicrobiano. bBrunton et al., 2007. cColl , 2009. ~6~ Figura 2. Estructura química de los fármacos antituberculosos de primera línea. + Figura 3. Estructura química de los fármacos antituberculosos de segunda línea. ~7~ 1.1.4 Epidemiología La tuberculosis es una enfermedad ligada a la pobreza por ende la mejora de las condiciones socioeconómicas frena la transmisión de la enfermedad; sin embargo, la incidencia de la tuberculosis se ha visto incrementada debido al aumento de la pobreza y a la inmunodeficiencia presentada en los pacientes con VIH (7). En el 2009 la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó 9.4 millones de nuevos casos, equivalentes a 139 casos por cada 100, 000 habitantes en todo el mundo; y la vez representa 1.4 millones de VIH positivos lo que representa el 15% de la población mundial (11). El número de muertes en ese mismo año fue de 1.3 millones y se estima que se presentaron 28 muertes por cada 100, 000 habitantes, en dicha estimación fue tomada en cuenta la población de VIH negativos como positivos (11). En México, la Secretaría de Salud publicó en el 2011 la presencia de 15,384 casos de tuberculosis pulmonar en el 2010, donde las entidades federativas que presentaron mayores tasas de incidencia fueron los estados de Baja California Norte, Tamaulipas, Guerrero, Sonora, Nayarit, Veracruz, Chiapas, Nuevo León y Tabasco. Asimismo, la Secretaria de Salud publicó en el 2011 un número de 1,872 defunciones en el 2009 por tuberculosis pulmonar (12). ~8~ 1.1.5 Problemática Actual La resistencia a los antibióticos es un problema generalizado en la mayoría de las enfermedades infecciosas y es consecuencia de un tratamiento parcial u anómalo por parte del paciente, o debido a que las pautas dictadas por el médico son erróneas (13). La tuberculosis presenta dos tipos de resistencia a los antibióticos utilizados; la primera se denomina tuberculosis multi-fármaco resistente (TB-MFR), la cual se caracteriza por ser resistente a dos de los fármacos antituberculosos más potentes: rifampicina e isoniazida. La tuberculosis multi-fármaco resistente, en general, da lugar a una terapia prolongada de hasta dos años con fármacos antituberculosos de segunda línea, que son a su vez más caros y con efectos secundarios más graves que los de primera línea. Además, existe un segundo tipo de resistencia, la llamada tuberculosis ultrarresistente o extremadamente resistente (TB-XDR), que es definida como la tuberculosis multi-fármaco resistente que no es sensible a las fluoroquinolonas y al menos a uno de los tres antibióticos de segunda línea (amikacina, capreomicina o kanamicina) (14). En este sentido, la OMS estima que en el 2009 aparecieron 250, 000 casos de TB-MFR que causaron 150, 000 muertes; sin embargo, no han sido realizadas estimaciones oficiales del número de casos de TBXDR (15). La tuberculosis puede afectar gravemente a las personas infectadas con VIH, ya que al tener deprimido el sistema inmune provoca que el M. tuberculosis pase de un estado latente a uno reactivo, presentando un gran índice de mortalidad en las personas que padecen estas dos enfermedades. Según la OMS, una persona infectada con VIH tiene un riesgo de padecer tuberculosis entre el 5% y 15% en el lapso de un ~9~ año, frente al 10% que presenta una persona con el sistema inmunitario intacto a lo largo de su vida (16). Aunado a los problemas mencionados anteriormente, el tiempo de tratamiento para la tuberculosis resulta ser muy largo, siendo aproximadamente de seis meses en una tuberculosis no resistente. Sin embargo, en una tuberculosis multi-fármaco resistente (MDR-TB) y en personas VIH positivas el tiempo de tratamiento es cerca de dos años, por tal motivo se debe tener especial cuidado en el tratamiento de estos pacientes (13). A pesar de la problemática presentada por la tuberculosis, existe una solución que consiste en la utilización de las plantas medicinales, ya que cuentan con virtudes curativas lo que ha permitido controlar distintas enfermedades desde el comienzo de la historia de la humanidad. 1.2 Medicina Tradicional De acuerdo a la OMS, la medicina tradicional es la suma completa de conocimientos, técnicas y prácticas fundamentadas en las teorías, creencias y experiencias propias de diferentes culturas y que se utilizan para mantener la salud, prevenir, diagnosticar y mejorar o tratar trastornos físicos o mentales (17). En México, la medicina tradicional es un mosaico de piezas procedentes de culturas indígenas diferentes que han determinado históricamente el desarrollo de la cultura nacional (18). En este sentido la medicina tradicional indígena mexicana se define como el conjunto de conocimientos acumulados a través de la historia por los pueblos indígenas y rurales, que están basados en rituales, mística y magia, con ~ 10 ~ profundos conocimientos sobre la salud y la enfermedad de origen prehispánico (19,20). Cabe mencionar que la mayoría de los conocimientos prehispánicos acerca de las plantas medicinales de México quedaron grabados en un histórico documento de la herbolaria medicinal Azteca llamado Códice de la Cruz-Badiano (21). Dichos conocimientos han perdurado gracias al interés de las generaciones futuras y al aprovechamiento de la comunidad científica para estudiar la composición y actividades biológicas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional. A partir de las plantas medicinales, los científicos han logrado aislar, caracterizar y evaluar compuestos con actividad farmacológica, de los cuales algunos se han desarrollado como fármacos para el tratamiento de diferentes enfermedades ver Tabla 2 (21). TABLA 2 Ejemplos de fármacos obtenidos a partir de plantas medicinales Compuesto Planta Cafeína Camellia sinensis Codeína Colchicina Digoxina Morfina Pseudoefedrina Vinblastina Vincristina Taxol Papaver somniferum Colchicum autumnale Digitalis lanata Papaver somniferum Ephedra sinica Catharanthus roseus Catharanthus roseus Taxus brevifolia ~ 11 ~ Acción Farmacológica Estimulante del Sistema Nervioso Central Analgésico Antiinflamatorio Cardiotónico Analgésico Simpaticomimético Antitumoral Antitumoral Antitumoral Un ejemplo de la aplicación de la medicina tradicional es un estudio realizado por Camacho-Corona y colaboradores en el 2008 en la Facultad de Ciencias Químicas, quienes reportaron la actividad antituberculosa de 9 plantas utilizadas en la medicina tradicional mexicana para el tratamiento de la tuberculosis y enfermedades respiratorias. Una de las plantas utilizadas en este estudio fue Citrus aurantifolia, específicamente la cáscara del fruto, donde el extracto hexánico presentó actividad en contra de M. tuberculosis (22). 1.3 Citrus aurantifolia La lima, también conocida como limón criollo, limón agrio o limón mexicano (23), es originaria del sureste de Asia, especialmente en el oriente de la India, y fue introducida por los españoles en las islas del Caribe y México (24). El limón es el fruto del árbol que pertenece a la familia de las Rutáceas y su nombre científico es Citrus aurantifolia, el cual es un árbol pequeño muy ramificado de entre 4 y 5 m de altura, con un tronco torcido y ramas provistas de espinas (25,26). Los principales países productores de C. aurantifolia son; Brasil, México, Jamaica, Haití, Martinica, Kenia, India, Estados Unidos y Egipto (26). En México, los cítricos ocupan el 40% de la superficie de producción frutícola desde Colima hasta Oaxaca; asimismo, se han identificado varias especies de limón: ácidas y dulces. Dentro de las ácidas se encuentra el limón mexicano y el limón persa (Citrus latifolia), ocupando el 80 y 20%, respectivamente, de la superficie nacional plantada de limones (24). El limón es ampliamente utilizado en la industria alimenticia, de hecho uno de los principales subproductos es el aceite esencial que es utilizado como potenciador de ~ 12 ~ sabor en alimentos y bebidas, además de ser ingrediente indispensable en los perfumes y en la industria farmacéutica para enmascarar sabores desagradables de algunos medicamentos (25). Cabe mencionar que en México, el aceite esencial es el principal subproducto de exportación (24). En cuanto a los usos tradicionales, las hojas han sido utilizadas para el tratamiento de enfermedades de la piel y como agente antiinflamatorio (27). Por otro lado, el té preparado del jugo, cáscaras u hojas es recomendado como expectorante y logra aliviar la gripe y el resfriado, además el limón previene el escorbuto debido a que es una excelente fuente de vitamina C (28). Las plantas son ampliamente utilizadas para curar enfermedades y son estos conocimientos empíricos los que han impulsado a la comunidad científica a investigar los compuestos responsables de la actividad biológica. En este sentido, C. aurantifolia ha sido objeto de estudios químicos para identificar los compuestos presentes en la planta, así como para evaluar la actividad farmacológica de algunos de sus extractos o compuestos, como se muestra a continuación. En 1945, Caldwell y colaboradores obtuvieron el aceite por presión del fruto de C. aurantifolia, el cual fue cromatografiado sobre Al2O3 y eluido con C6H6 dando limetina C, isopimpenillina y 7-metoxi-5-geranoxicumarina (29). De igual manera en 1967, Stanley y colaboradores lograron aislar diez compuestos del aceite obtenido por presión del fruto de C. aurantifolia. Los autores usaron cromatografía en gel de sílice y lograron identificar compuestos como: 5-geraniloxy-7-metoxicumarina, 5,7dimetoxicumarina, 5,8-dimetoxipsoraleno (isopimpenillina), 5-geraniloxi-psoraleno (bergamotina), psoraleno, 5-γ,γ-dimetilaliloxi-psoraleno 8-γ,γ-dimetilaliloxi-psoraleno ~ 13 ~ (isoimperatorin), (imperatorina), 8-geraniloxi5-metoxi-8-γ,γ- dimetilaliloxi-psoraleno (felopterina), 5-geraniloxi-8-metoxi-psoraleno e hidrato de oxipeucedanina (30). Tapanes y colaboradores realizaron dos trabajos relacionados con la preparación de aceite esencial por destilación del fruto de C. aurantifolia. En el primer trabajo publicado en 1971 analizaron la fracción terpénica de dicho aceite usando Cromatografía de Gases (CG) logrando identificar y cuantificar γ-terpineol, terpinoleno, limoneno y p-cimeno (31). En el segundo trabajo publicado en 1974, los investigadores lograron identificar en el aceite, citral A, citral B, heptanal, octanal, decanal, nonanal, undecanal, metilheptanona y metil nonil cetona usando cromatografía de gases y espectrometría de masas. Además fueron identificados compuestos que anteriormente no habían sido reportados en la planta como: formaldehído, acetaldehído, propanal, butanal, pentanal, hexanal, piperitona, pmetilacetofenona y carvona (32). En 1971, Balbaa y colaboradores sometieron a destilación por vapor y prensado en frío la cáscara de C. aurantifolia para la obtención del aceite. Los compuestos identificados por CG fueron: limoneno, α- y β-pineno, sabineno, mirceno, camfeno, β-felandreno, ocimeno, terpineno, p-cimeno, terpineol, linalol, geraniol, nerol y/o farnesol, α- y β-citral, citronelal, acetato de linalilo, acetato de geranilo y antranilato de metilo (33). En 1974, Pérez y colaboradores obtuvieron el aceite esencial de C. aurantifolia por el método de centrifugación del cual lograron identificar los siguientes compuestos: α-pineno, camfeno, β-pineno, sabineno, mirceno, limoneno, γ-terpineno ~ 14 ~ y terpinoleno. En el aceite obtenido por destilación fueron identificados los siguientes compuestos: α-felandreno, α-terpineno, p-cimeno y α-p-dimetilestireno. En ambos aceites se identificaron como compuestos mayoritarios: α-bergamoteno, βcariofileno y β-bisaboleno. De acuerdo a este análisis, las fracciones terpénicas y sesquiterpénicas del aceite esencial centrifugado y del obtenido por destilación constituyen un 86 y 14% respectivamente. Cabe mencionar que, los compuestos fueron analizados usando cromatografía en columna, cromatografía de gases preparativa, infrarrojo (IR) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (34). En 1980, Alexander y colaboradores obtuvieron 15-17% de pectina de la cáscara de C. aurantifolia por medio de extracción ácida (35). En 1987, Clark y colaboradores lograron aislar por HPLC un sesquiterpeno lábil de una fracción hidrocarbonada del aceite de la cáscara de C. aurantifolia, el cual fue identificado por técnicas espectroscópicas y confirmado por síntesis como el germacreno B. El análisis del aceite por CG indicó que el germacreno B representa un 0.35% del aceite (36). En 1989, Park y colaboradores determinaron por Cromatografía en Capa Fina (CCF) la presencia de limonina en el fruto maduro de C. aurantifolia, la cual se encontró en una concentración de 5-24 ppm y cabe mencionar que este compuesto es el responsable de la amargura del fruto en los cítricos (37). En 1993, Nigg y colaboradores hicieron una cuantificación de las cumarinas presentes en cáscara y pulpa de C. aurantifolia. En la cáscara y en la pulpa se ~ 15 ~ encontraron limetina, bergapteno e isopimpinellina. Los investigadores encontraron que las cumarinas presentes en la pulpa son menos concentradas que en la cáscara, además demostraron que el bergapteno es el principal componente responsable de la fitofotodermatitis, sin embargo recomiendan que debe de llevarse a cabo ensayos de interacción dermatológica con psoraleno, bergapteno y limetina (38). En 1996, Jantan y colaboradores analizaron la composición química de la cáscara y las hojas de C. aurantifolia, las cuales fueron examinadas por co-cromatografía, dos columnas de diferente polaridad y Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (CG-EM). En la cáscara, el β-pineno y el limoneno fueron los constituyentes mayoritarios; por otro lado, en las hojas el geranial, limoneno y neral fueron los compuestos encontrados en mayor porcentaje de abundancia (39). En 1998, Haggag y colaboradores prepararon el aceite volátil a partir de las hojas y cáscara de C. aurantifolia por medio de destilación a vapor, la cáscara de la fruta fue sometida a prensado en frío. En este estudio se lograron identificar 19 compuestos por medio de CCF y CG (40). Chisholm y colaboradores llevaron a cabo dos estudios acerca de la composición de C. aurantifolia en diferentes años. El primero de ellos fue en 1998 en donde describieron las diferencias entre la composición aromática entre C. aurantifolia y C. latifolia por los métodos de prensado en frío y el aceite esencial destilado, cada uno de los aceites fue analizado por CG-EM. En el estudio se encontró que el linalol es el compuesto más odorante en todas las muestras; sin embargo, el neral, geranial y sus correspondientes ésteres y aldehídos contribuyen más al olor en los aceites obtenidos por el método de prensado en frío, por otro lado, la concentración de α-terpineol y ~ 16 ~ otros isómeros de terpineol incrementan significativamente con la destilación (41). En el 2003, este grupo de investigadores caracterizaron los compuestos volátiles de la cáscara de C. aurantifolia por medio de cromatografía de gases acoplado a olfatometría (CG-O) y CG-EM. Aproximadamente 50 compuestos aromáticos fueron detectados en el extracto del aceite y aproximadamente 60 en el aceite destilado. En este estudio destacaron que el geranial, neral y linalol dominan en ambos aceites y representan olor característico de los cítricos; además, encontraron que la 7metoxicumarina es uno de los más intensos odorantes en el extracto del aceite y el óxido de cariofileno y óxido de humuleno en el aceite destilado (42). En 2000, Venkateshwarlu y colaboradores sometieron a hidro-destilación la cáscara de C. aurantifolia en seis estados de maduración, posteriormente realizaron un análisis por CG logrando identificar 19 compuestos, identificaron compuestos responsables del aroma a altas concentraciones como: neral, geranial, geraniol y citronelol, los cuales han sido reportados particularmente en la fruta verde (43). En 2000, Feger y colaboradores estudiaron el aceite esencial obtenido del prensado en frío de las frutas de dos variedades de lima, la lima Key (C. aurantifolia) y lima Persa (C. latifolia), encontrando α-santaleno, γ-curcumeno, β-selineno, βsesquifelandreno y 7-epi-α-salineno. Además encontraron la presencia de compuestos termolábiles como los germacrenos A y B (44). En 2002, Lota y colaboradores analizaron por CG capilar, CG-EM y RMN 13C los aceites de la cáscara y hojas de limas. Se identificaron limoneno, γ-terpineno y βpineno en la cáscara. En las hojas se identificaron β-pineno, limoneno, geranial, neral, linalol, citronelal y sabineno (25). ~ 17 ~ En 2002, Shivashankara y colaboradores estudiaron la composición volátil de la cáscara de C. aurantifolia, la cual fue extraída en seis estados de madurez por medio de la técnica de headspace con CG-EM, lográndose indentificar 31 compuestos que representaron el 85% de los compuestos volátiles totales. Algunos de los compuestos mayoritarios identificados fueron: limoneno, β-pineno, γ-terpineno, geraniol y peral. También fueron identificados sesquiterpenos en menor proporción elemeno, β-farnesano, β-cariofileno, δ-cardineno y α-humuleno. como: β- El total de los compuestos organolépticos totales disminuyeron del verde oscuro (19.24%) al estado amarillo (8.91%), en los cuales el peral, geranial y geraniol estaban en alta concentración en el limón verde y disminuyen durante la cosecha (45). En 2003, Nickavar y colaboradores sometieron a hidro-destilación la fruta seca de C. aurantifolia dando como producto un aceite amarillo. Dicho aceite fue analizado por CG-EM y se lograron identificar 32 compuestos, siendo los de mayor proporción: limoneno, α-terpineol y β-pineno (46). En 2005 Ubando-Rivera y colaboradores encontraron que C. aurantifolia mexicana tenía un 66.7% de fibra en la cáscara. Dicha fibra contenía polifenoles y éstos eran responsables de su actividad antioxidante (47). En 2005, Craske y colaboradores realizaron la comparación del aceite de la cáscara de la lima Australiana (Microcitrus australe) y la lima Mexicana (C. aurantifolia Swingle) por medio del análisis en CG-EM. En dicho análisis fueron identificados 34 compuestos en la lima Mexicana, entre los más abundantes se ~ 18 ~ encuentran los siguientes: limoneno, γ-terpineno, β-pineno, geranial, neral, acetato de nerilo y geranil acetato (48). En 2006, Chowdhury y colaboradores analizaron por CG-EM el aceite esencial de las hojas y la cáscara de C.aurantifolia, identificando 33 y 44 compuestos, respectivamente. Citral y limoneno fueron los compuestos mayoritarios en ambos aceites; otros compuestos mayoritarios encontrados en las hojas fueron el acetato de nerilo y citronelal, y en la cáscara; β-pineno (18.7%) y sabineno (5.1%) (49). En 2006, Phi y colaboradores obtuvieron el aceite esencial de C. aurantifolia Persa por el método de prensado. El aceite se analizó por CG, CG-EM, CG-O y AEDA, donde se lograron identificar 92 compuestos de los cuales el limoneno fué componente mayoritario, seguido de geranial, neral, mirceno y β-bisaboleno (50). En 2007, Agocs y colaboradores encontraron por HPLC dos carotenoides: βcaroteno y luteína en la cáscara y pulpa de C. aurantifolia (51). En 2007, Johann y colaboradores obtuvieron dos flavonoles del extracto hexánico de las cáscara de C. aurantifolia: 8-hidroxi-3,4’,5,6,7-pentametoxiflavona y 8hidroxi-3,3’,4’,5,6,7-hexametoxiflavona. También evaluaron su actividad antifúngica en contra de hongos patogénicos de plantas y humanos (52). En 2008, Afolayan y colaboradores realizaron un estudio comparativo de la composición de los compuestos volátiles del aceite esencial del fruto de C. aurantifolia maduro y podrido proveniente de Nigeria. Dicho aceite fue aislado por ~ 19 ~ hidro-destilación y analizado por CG-EM, ambos aceites fueron ricos en limoneno (21.0%, limón maduro; 21.3% limón podrido), α-terpineol (11.7%, maduro; 14.1% podrido), γ-terpineno (8.3%, maduro; 8.9% podrido), α-terpinoleno (2.5%, maduro; 8.5, podrido) y (E)-α-farnesano (6.3%, maduro; 4.8% podrido). El α-pineno (11.1%) y linalol (5.5%) fueron encontrados únicamente en el limón maduro. Adicionalmente, citral, decanal también fueron encontrados en el aceite esencial del limón maduro y podrido. trans-β-Ocimeno, linalool, myrcenol, dodecanal, trans-βbergamoteno y trans--bisaboleno estuvieron ausentes en el aceite esencial del fruto del limón podrido (53). En 2009, Green y colaboradores caracterizaron polimetoxiflavonas de la cáscara de cítricos jamaiquinos y mexicanos por medio de HPLC, con la visión de convertir los desechos de cítricos en productos de valor agregado para uso en la industria farmacéutica y nutracéutica (54). En 1985, Subbarao y colaboradores encontraron que el aceite esencial de C. aurantifolia mostraba actividad inhibitoria en Bacillus anthracis y Vibrio cholerae (55). En 1991, Ebana y colaboradores evaluaron la actividad antimicrobiana de C. aurantifolia y otras plantas medicinales. Los extractos demostraron inhibir Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroginosa, Streptococci β-hemolítico, Escherichia coli y Neisseria gonorrhoeae (56). ~ 20 ~ En 1997, Ulate-Rodríguez y colaboradores sometieron la cáscara de lima a prensado en frío y destilación y analizaron la concentración de furanocumarinas lineales: psoraleno, 5-metoxipsoraleno (5-MOP) y 8-metoxipasoraleno (8-MOP) por medio de Cromatografía en Capa Fina (CCF) y CG-EM. El aceite de lima obtenido por prensado en frío obtuvo el más alto contenido de furanocumarinas lineales; psoraleno, 5-MOP, y 8-MOP. Asimismo el extracto de la cáscara de lima, el aceite obtenido de la lima prensada en frío y el estándar de 5-MOP inhibieron el crecimiento de L. monocytogenes, pero no en E. coli O157:H7; en tanto que, M. luteus fue únicamente inhibida por la lima prensada en frío. Además, el aceite prensado en frío inhibió L. monocytogenes; sin embargo, el estándar correspondiente a furanocumarinas lineales no lo hizo; por lo que el grupo de investigación sugiere la presencia de otros agentes antimicrobianos en el aceite (57). En 2006, Aibinu y colaboradores evaluaron la propiedad antimicrobiana del fruto de C. aurantifolia en las diferentes formas en las que es usado en la localidad de Nigeria (jugo, cáscara quemada comúnmente llamada “epa-ijebu” así como también el aceite obtenido por el método de destilación a vapor. Cabe mencionar que, la actividad de “epa-ijebu” fue llevada a cabo en diferentes solventes. En cuanto a la actividad antimicrobiana, ésta fue realizada por el método de difusión en agar incluyendo aislados clínicos de bacterias anaerobias facultativas: S. aureus ATCC 25213, S. aureus, Salmonella paratyphi, Shigella flexnerii, Streptococcus faecalis, Citrobacter spp, Serratia spp, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli ATCC 25922 y E. coli; hongos: Aspergillus niger y Candida albicans; y bacterias anaerobias: Porphyromonas spp y Clostridium spp. En este estudio las bacterias anaerobias y gram-positivas fueron susceptibles a todos los extractos con un rango de CMI de 32 ~ 21 ~ mg/mL-128 mg/mL. En el caso de la actividad en contra de los hongos solo el extracto del aceite fue activo en contra de A. niger; por el contrario, C. albicans fue susceptible a todos los extractos con un rango de CMI de 256 mg/mL- 512 mg/mL. Asimismo, las bacterias gram-negativas exhibieron un rango de CMI de 64 mg/mL512 mg/mL. Un hallazgo importante en esta investigación fue la alta actividad que presentaron el aceite y el extracto con vino de palma de “epa-ijebu” en comparación con los otros extractos (58). En 2008, Camacho y colaboradores probaron la actividad antituberculosa de plantas usadas en la medicina tradicional Mexicana, donde el extracto hexánico de C. aurantifolia presentó una CMI de 200 μg/mL para la cepa H37Rv, este mismo extracto presentó una CMI de 25 μg/mL en una cepa resistente a isoniazida (22). En 2009, Patil y colaboradores publicaron tres trabajos de investigación relacionados con el fruto de C. aurantifolia. En su primer trabajo sometieron el fruto de C. aurantifolia a hidro-destilación con un aparato tipo Clevenger para la obtención de aceite esencial, el cual fue analizado por CG-EM. Se encontraron 22 compuestos, de los cuales el limoneno y la dihidrocarvona se presentaron en mayor porcentaje de abundancia. Asimismo, el aceite esencial mostró 78% de inhibición en un cultivo de células SW-480 de cáncer de colon a 100 μg/mL en 48 horas. Adicionalmente, encontraron que el aceite esencial producía apoptosis de las células cancerígenas lo que demostró con esto su mecanismo de acción en contra de las células ensayadas (59). En otro trabajo de este grupo de investigadores, se prepararon el extracto de semillas secas, cáscara y jugo de C. aurantifolia con solventes de distinta polaridad (acetato de etilo, cloroformo, acetona, metanol y metanol:agua), ~ 22 ~ dichos extractos fueron sometidos al ensayo de MTT para medir la inhibición de la proliferación celular en un cultivo de células Panc-28. Las CI50 de los extractos metanol:agua de las semillas, cáscara y jugo fueron los siguientes: 4.1 μg/mL, 1.04 μg/mL, 3.4 μg/mL, respectivamente. Además, este grupo de investigación llevó a cabo el análisis por HPLC de los extractos de distintas polaridades (AcOEt, CHCl 3, acetona, MeOH, MeOH:agua) de la semilla, cáscara y jugo de C. aurantifolia en donde encontraron hesperidina y neohesperidina como flavonoides mayoritarios así como rutina en menor proporción. Asimismo, fueron reportados limonoides como: limonina, glucósido de limonina, ácido limonéxico, ácido isolimonéico y obacunona (60). En su tercera publicación aislaron e identificaron tres cumarinas del extracto hexánico de C. aurantifolia: 5-geraniloxi-7-metoxicumarina, limetin e isopimpinellina. Dichos compuestos inhiben en un 74, 52 y 62% respectivamente, células del cáncer de colon SW-480 (61). En 2009, Razzaghi-Abyaheh y colaboradores encontraron que el aceite esencial de C. aurantifolia inhibe el crecimiento de Aspergillus parasiticus e inhibe la producción de aflatoxinas; el valor de CI50 para la inhibición de aflatoxinas fue de 285.6 μg/mL. Los resultados indicaron que el aceite esencial del limón puede ser considerado como un potente candidato para proteger los alimentos de hongos toxigénicos y contaminación con aflatoxinas (62). En 2010, Guimaraes y colaboradores hicieron un estudio comparativo de las propiedades antioxidantes de la cáscara y el jugo de C. aurantifolia y otros cítricos aplicando las técnica de DFPH, e inhibición de lípido piridoxina usando β-carotenolinoleato en liposomas y ácido tiobarbitúrico en cerebros homogeneizados. Dichas ~ 23 ~ técnicas fueron aplicadas a las fracciones volátiles y polares de la cáscara. Se encontró en este estudio que los azúcares reductores y los compuestos fenólicos fueron los responsables de la actividad antioxidante. Las fracciones polares de las cáscaras presentaron un alto contenido de compuestos fenólicos, flavonoides, ácido ascórbico, carotenoides y azúcares reductores que contribuyeron a la alta actividad antioxidante de estas fracciones. En contraste, las fracciones volátiles de las cáscaras tuvieron baja actividad antioxidante (63). En 2010, Asnaashari y colaboradores analizaron por CG/EM el aceite esencial de C. aurantifolia encontrando 22 compuestos mayoritarios, entre ellos el limoneno (28.27%). Asimismo en esta investigación analizaron la actividad de reducción de peso del aceite esencial de C. aurantifolia administrado individualmente y en coadministración con cetotifeno (antihistamínico que causa ganancia de peso) utilizando un modelo de ratón. Los hallazgos de esta investigación fueron que los grupos tratados con el aceite esencial tuvieron pérdida de peso y pérdida de consumo de alimento en ratones, posiblemente debido a la promoción de anorexia. Interesantemente, el aceite esencial co-administrado con cetotifeno causó significativamente supresión en la ganancia de peso, así como un decremento en peso de los ratones (64). En 2010, Lakshmi y colaboradores, evaluaron la eficacia antimicrobiana del aceite esencial de C. aurantifolia en contra de fitopatógenos comunes (65). En 2010, Lee y colaboradores, publicaron que el aceite esencial de C. aurantifolia fue activo en contra de Malassezia furfur, un hongo causante de la dermatitis ~ 24 ~ seborréica, la actividad anti-malassezial fue alta al igual que la de itraconazol a 2 mg/mL. Adicionalmente, el aceite de C. aurantifolia fue analizado por CG/EM, siendo los constituyentes mayoritarios el limoneno, γ-terpineno y terpinoleno. En este estudio concluyeron que el aceite esencial de C. aurantifolia tiene aplicaciones interesantes en el control de enfermedades derivadas de hongos (66). En 2011, Ojiezeh y colaboradores evaluaron la actividad antimicrobiana del jugo de C.aurantifolia donde los microorganismos P. aeruginosa, S. aureus, E. coli, Klebseilla spp y Proteus mirabilis fueron susceptibles al extracto crudo del jugo de limón (67). De acuerdo a la literatura revisada se observa que el fruto de C. aurantifolia ha sido sometido a diferentes métodos de extracción para la obtención de compuestos. Los métodos más utilizados para la obtención del aceite esencial son el prensado en frío, destilación por arrastre con vapor o hidro-destilación y centrifugación. Algunos autores han concluido que existe diferencia en la composición química del aceite ya que observaron que el uso de calor descompone algunos metabolitos secundarios. Para la separación e identificación de los componentes de los aceites obtenidos de la cáscara y hojas se han empleado técnicas que van desde cromatografía en columna con Al2O3, CCF en gel de sílice hasta CG-EM, CG-O, HPLC, IR y RMN, siendo la CG-EM la técnica más utilizada para la identificación de los compuestos volátiles. Cabe mencionar que, algunos autores han evaluado la actividad antibacteriana, antioxidante y anticancerígena de los aceites esenciales, donde existe un amplio campo de investigación en la búsqueda de moléculas bio-activas. Sin embargo, el trabajo que marca la realización de esta investigación es el llevado a cabo por ~ 25 ~ Camacho-Corona y colaboradores en el 2008, quienes evaluaron la actividad antituberculosa de los extractos clorofórmico, hexánico, metanólico y acuoso, siendo el extracto hexánico activo en contra de M. tuberculosis. ~ 26 ~ CAPÍTULO II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 2.1 Hipótesis Algunos compuestos aislados, purificados y caracterizados de las fracciones activas del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia pueden ser nuevos agentes con actividad antituberculosa. 2.2 Objetivo General Aislar, caracterizar y evaluar biológicamente los compuestos antituberculosos del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia. 2.2.1 Objetivos Específicos 1) Realizar la revisión bibliográfica de C. aurantifolia. 2) Preparar el extracto hexánico. 3) Fraccionar el extracto hexánico. 4) Aislar y purificar los compuestos de C. aurantifolia. 5) Determinar la estructura química de los compuestos aislados. 6) Evaluar la actividad antituberculosa de los compuestos aislados y caracterizados. ~ 27 ~ CAPÍTULO III METODOLOGÍA 3.1 Estudio fitoquímico En este estudio la parte fitoquímica fue realizada en la Facultad de Ciencias Químicas en el Laboratorio de Química de Productos Naturales. 3.1.1 Recolección del material vegetal El fruto de C. aurantifolia fue obtenido de un supermercado el 23 de noviembre de 2009 en la Ciudad de Monterrey. 3.1.2 Obtención del extracto hexánico La cáscara de 7.8 kg de limones fue removida y cortada en trozos pequeños obteniéndose 1.4 kg de cáscara. La cáscara fue macerada con 6 L de hexano por 72 h y el material fue filtrado por gravedad y concentrado en un rota-evaporador. Las cáscaras fueron maceradas por otras 72 h y se siguieron los pasos anteriores, lo que permitió obtener 16. 0584 g de extracto hexánico. 3.1.3 Fraccionamiento del extracto El fraccionamiento del extracto se llevó a cabo por cromatografía en columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un gradiente de hexano/acetato de ~ 28 ~ etilo como fase móvil. Se obtuvieron 326 fracciones de 100 mL cada una, las cuales fueron analizadas por cromatografía en capa fina y observadas bajo luz ultravioleta. Las 326 fracciones fueron reunidas en 24 fracciones de acuerdo a su similitud cromatográfica. En la Tabla 3 se resume el fraccionamiento del extracto hexánico y los compuestos mayoritarios aislados en las fracciones obtenidas. TABLA 3 Fraccionamiento del extracto hexánico y compuestos mayoritarios aislados y purificados Fracciones Obtenidas Fracción reunida Polaridad Hex:AcOEt 1-14 15-32 33-37 38-39 40-45 46-53 54-63 64-72 73-76 77-80 81-85 86-92 93-98 99-100 101-109 110-124 125-156 157-196 197-220 221-230 231-260 261-284 285-325 326 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Hexano 95:5 y 90:10 90:10 90:10 90:10 90:10 90:10 85:15 85:15 85:15 85:15 85:15 85:15 80:20 80:20 80:20 75:25 75:25 y 70:30 70:30 y 60:40 60:40 y 50:50 50:50 y 40:60 40:60 30:70, 20:80 y 10:90 AcOEt ~ 29 ~ Compuesto mayoritario aislado Ca4 Ca6 Ca7 Ca8 Ca9 3.1.4 Aislamiento y purificación de los principios antituberculosos Los compuestos Ca4, Ca6, Ca7, Ca8 y Ca9 se lograron aislar y purificar para su posterior caracterización estructural. Las demás fracciones no se sometieron a cromatografía en columna debido a que se presentan mezclas complejas en su análisis por cromatografía en capa fina. Adicionalmente, en un estudio previo realizado por Elizabeth Elizondo en el 2008 se encontró que todas las fracciones presentaban actividad en contra de M. tuberculosis por lo que el extracto hexánico total se analizó por cromatografía de gases acoplado a masas (CG-EM) para identificar los compuestos volátiles presentes en todo el extracto. 3.1.4.1 Compuesto Ca4 (5-Geranoxi-psoraleno) De la fracción 3 (ver Tabla 3) se obtuvo el compuesto Ca4 impuro, este compuesto fue sometido a varias columnas cromatográficas usando como fase estacionaria sílica gel y fase móvil un gradiente de hexano/acetato de etilo. El compuesto puro se observó en las sub-fracciones de polaridad hexano/acetato de etilo 98:2 como una mancha de color amarillo fluorescente a 365 nm. El compuesto se obtuvo como un aceite con un rendimiento total de 24.8 mg (0.017%). ~ 30 ~ 3.1.4.2 Compuesto Ca6 (5-Genanoxi-7-metoxi-cumarina) De la fracción 5 (ver Tabla 3) precipitó un sólido blanco brillante, el cual en cromatografía en capa fina y bajo luz ultravioleta muestra una mancha de color azul fluorescente a 365 nm. El sólido fue purificado por una re-cristalización con hexano/acetato de etilo en relación 97:3. Se obtuvo un total de 17.6 mg (0.0012%) de cristales planos de color blanco brillante de punto de fusión (pf) 74-75 oC. 3.1.4.3 Compuesto Ca7 (5,7-Dimetoxi-cumarina o limetina) En las fracciones 9-10 (Tabla 3) precipitó un sólido que en cromatografía en capa fina reveló como una mancha de color azul fluorescente bajo luz ultravioleta a 254 nm. El sólido fue purificado por re-cristalización con cloroformo, los cristales se obtuvieron en forma de agujas transparentes (10.7 mg) con rendimiento de 0.00076 % y de pf 132-135oC. 3.1.4.4 Compuesto Ca8 (Bergapteno o 5-metoxipsoraleno) Las fracciones 11-12 (Tabla 3) fueron sometidas a una cromatografía en columna con sílica gel como fase estacionaria y eluída con gradiente de hexano/acetato de etilo. De las sub-fracciones 61-120 (hexano/acetato de etilo 96:4) fue obtenido un sólido de color amarillo con un rendimiento de 0.004 % (56.2 mg) siendo una mezcla del compuesto Ca7 y Ca8 que revela amarillo fluorescente a 365 nm. ~ 31 ~ 3.1.4.5 Compuesto Ca9 (Isopimpinellina o 5,8-dimetoxipsoraleno) Las fracciones 13-15 (Tabla 3) fueron sometidas a una cromatografía en columna con sílica gel como fase estacionaria y un gradiente de hexano/acetato de etilo como fase móvil, de las sub-fracciones de polaridad 95:5 hexano/acetato de etilo precipitó un sólido. Este sólido fue purificado por una re-cristalización (hexano/acetato de etilo 95:5) rindiendo un sólido de color amarillo claro, el cual revela en cromatografía en capa fina y bajo luz ultravioleta como una mancha de color amarillo fluorescente a 365 nm. Del compuesto puro con pf 126-127oC se obtuvo un total de 0.004 mg (4.07 %). 3.1.5 Separación e identificación de los componentes volátiles del extracto hexánico por CG/EM El extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia fue analizado por cromatografía de gases acoplado a masas (CG/EM) para la identificación de los compuestos volátiles. Las condiciones empleadas fueron las siguientes: Técnica de ionización: Impacto Electrónico (IE) 70eV; columna: HP 5MS de 25 m, 0.2 mm de diámetro interno y 0.33 μm de tamaño de partícula, gas acarreador: helio a un velocidad de flujo de 39 cm/seg, rampa de temperatura: 40°C durante 2min, 10°C/min hasta 260°C durante 20 minutos; inyector: 250°C, splitless; cantidad inyectada: 1μL, detector: MSD 280°C línea de transferencia. La identificación de los analitos volátiles del extracto hexánico fue realizada por medio de la biblioteca NIST versión 1.7a. ~ 32 ~ 3.1.6 Identificación de los compuestos aislados y purificados La identificación y caracterización de los compuestos Ca4, Ca6, Ca7, Ca8 y Ca9 se llevó a cabo por Resonancia Magnética Nuclear de una y dos dimensiones. 3.2 Ensayo Biológico Los ensayos biológicos fueron realizados en el departamento de Microbiología, de la Facultad de Medicina 3.2.1 Preparación de las muestras a evaluar Las soluciones stock fueron preparadas disolviendo 1 mg de cada una de las muestras en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta alcanzar una concentración de 20 mg/ml. Las soluciones stock se mantuvieron a -20°C hasta antes de su uso. Posteriormente las soluciones de trabajo fueron preparadas a partir de una alícuota tomada de cada una de las soluciones stock y diluyéndolas con medio Middelbrook 7H9-OADC (ácido oléico, albúmina, dextrosa y catalasa) a una concentración cuatro veces mayor de concentración más alta ensayada. 3.2.2 Preparación del inóculo bacteriano Las cepas fueron cultivadas en medio Middelbrook 7H9-OADC a 37°C durante 2 semanas, tiempo durante el cual la bacteria alcanza la fase logarítmica de crecimiento. El inóculo bacteriano fue preparado diluyendo el cultivo en fase ~ 33 ~ logarítmica hasta ajustar la turbidez al estándar No.1 de McFarland, posteriormente se diluyó a 1:20 con medio Middelbrook 7H9-OADC. 3.2.3 Desarrollo del ensayo biológico La actividad antituberculosa fue determinada de acuerdo al método descrito en la literatura (68,69); dicho método se basa en la propiedad que tienen las bacterias en crecimiento de liberar deshidrogenasas (DH) al medio, las cuales reducen la resazurina (azul y sin fluorescencia) a resurfina (rosa y fluorescente), en la figura 4 se muestra la reacción de reducción de la resazurina. Resofurina (fluorescente) λabs/λem= 571/585 nm Resazurina (no fluorescente) λabs= 604 nm Figura 4. Reducción de resazurina a resofurina El ensayo se llevó a cabo en micro placas de 96 pocillos en los cuales se ensayaron seis muestras y cada concentración fue ensayada por duplicado. En la placa de 96 pocillos se colocaron 200 μl de agua estéril en los pozos de la periferia, en los demás pocillos se añadieron 100 μl de medio Middelbrook 7H9. Posteriormente se añadieron 100 μl de la solución de trabajo en los pocillos de mayor concentración (50 μg/ml), con lo que se obtuvo una concentración de DMSO ‹ 1% ~ 34 ~ v/v en los pozos. Enseguida se realizó una serie de diluciones 1:2 a lo ancho de la placa y posteriormente se añadieron 100 μl del inóculo bacteriano previamente preparado. Asimismo se prepararon tres controles a) 100:100, b) 10:100 y c) 1:100; los cuales representan el 100%, 10% y 1% de la población bacteriana a ensayar. Las placas fueron incubadas por 5 días, posteriormente se adicionó 20 μl del reactivo Alamar azul y 12 μl de Tween 80 al 10% a todos los pozos. Las placas se reincubaron a 37°C por 24 h. Si después de esta incubación se observó cambio de color del reactivo de azul a rosa, se interpretó como presencia de crecimiento bacteriano. Posteriormente, se adicionó el reactivo de Alamar azul (20 μl) y tween 80 al 10% (12 μl) a los demás pocillos, interpretando el cambio de color del reactivo de la misma forma que los controles, después de 24 h de incubación a 37°C (Figura 5). 3.3 Disposición de residuos: parte fitoquímica y ensayos biológicos La disposición de los residuos de la parte experimental se realizó en base a las normas establecidas por el departamento de manejo y control de residuos de la Facultad de Ciencias Químicas y de la Facultad de Medicina de la UANL. ~ 35 ~ Micro placa de 96 pocillos a) 200 μl de agua destilada estéril en la fila A y la fila H a los primero y últimos pocillos. b) 100 μl de medio Middlebrook 7H9 de la fila B a G c) 100 μl de la muestra a la concentración deseada en la fila B d) Realizar las diluciones 1:2 en los siguientes pocillos (BG) e) 100 μl de suspensión de M. tuberculosis en los pocillos de las filas B a G f) Preparar los controles (100:100, 100:10 y 1:100) Incubar a 37°C por 5 días Adicionar 20 μl de Alamar azul y 12 μl de Tween 80 al 10% a todos los pocillos. Rosa: Crecimiento bacteriano Azul: Inhibición de crecimiento Figura 5. Diagrama del desarrollo del ensayo biológico ~ 36 ~ Incubar a 37°C por 24 h. Interpretación de resultados CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Caracterización estructural de los compuestos aislados y purificados del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia Del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia se lograron aislar y caracterizar estructuralmente cinco compuestos por medio del análisis de sus espectros de RMN de una dimensión (RMN 1H, RMN 13 C, DEPT) y de dos dimensiones (COSY, NOESY, HMBC y HMQC, HSQC). 4.1.1 Elucidación estructural del compuesto 5-geranoxi-psoraleno (Ca4) El analisis del espectro de RMN 1H (Figura 6) del compuesto Ca4 muestra señales para 22 protones, de los cuales cinco protones eran característicos de una furanocumarina monosustituida, de acuerdo a las siguientes señales: un doblete a un desplazamiento químico () de 8.17 ppm con una constante de acoplamiento (J) de 9.8 Hz correspondiente a H-4, este protón se acopla con H-3 que se observa a 6.27 ppm como un doblete con una J = 9.8 Hz. Asimismo el protón H-2’ que aparece en 7.59 ppm como un doblete (J= 2.8 Hz) se acopla con el protón H-3’ que se encuentra en 6.96 ppm como un doblete con una J= 2.8 Hz. Adicionalmente se observa un singulete en 7.16 ppm que corresponde a un protón aromático sin acoplar. En el espectro de RMN 1 H (Figura 6) se observaron las señales características de un grupo geranoxi de acuerdo a lo siguiente: en 5.53 un triplete hexaplete y en 5.06 ppm un triplete heptaplete con ~ 37 ~ J= 1.4, 6.3 Hz, cada uno correspondientes a H-2’’ y H-6’’, respectivamente. Los dos protones de H-1’’ se observan a 4.95 ppm como un doblete con una J= 6.3 Hz, también presenta a 2.09 ppm un multiplete que integra para 4 protones correspondientes a dos protones de H-4’’ y dos de H-5’’. Finalmente, se observan tres singuletes en 1.69, 1.68 y 1.60 ppm correspondientes a los metilos en posición H-9’’, H-10’’ y H-8’’. En el espectro de RMN 13 C (Figura 7), se observan 21 señales correspondientes a cada uno de los carbonos de una geranoxi-furanocumarina. En este sentido, se muestra una señal característica del grupo carbonilo de la lactona cumarínica en 161.57 ppm correspondiente a C-2. En la Tabla 4 se resumen las constantes espectroscópicas del compuesto Ca4 y es importante mencionar que cada una de las señales de protón y de carbono trece coincidieron con las señales de 5geranoxi-psoraleno (Figura 8) reportadas por Kawaii y colaboradores (70). Para confirmar la estructura se realizaron experimentos de doble dimensión. El espectro de COSY (Figura 9) muestra las siguientes correlaciones: H-4 y H-3; H-2’ y H-3’; H-2’’ y H-1’’ y, H-6’’ y H-5’’. En el espectro de HMBC (Figura 10) se observaron las correlaciones que existen a larga distancia entre los carbonos y protones, como se indica en la Tabla 4. En este sentido se concluye que el grupo geraniloxi se encuentra sustituido en posición 5, debido a la correlación de larga distancia entre el C-5 y los protones H-1’’. ~ 38 ~ Figura 8. Estructura del compuesto 5-geranoxi psoraleno TABLA 4 Constantes espectroscópicas de RMN de 1H y 13C y HMBC de 5-geranoxi-psoraleno Posición 2 3 4 H (J en Hz)a 700 MHz CDCl3 H (J en Hz)b 400 MHz, CDCl3 6.25, d (9.8) Ca 176 MHz, CDCl3 161.57 112.77 Cb 100 MHz, CDCl3 161.3 112.6 6.27, dd (9.8, 0.7) 8.17,dd (9.8, 0.7) H-3/161.57, 107.73 8.14,d (9.8) 139.86 139.6 H-4/C-2, C-8a 107.6 149.0 114.3 158.2 94.3 4a 5 6 7 8 7.16, t (0.7) 7.13, s 107.73 149.5 114.27 158.34 94.45 8a 2’ 7.59, d (2.8) 7.57, d (2.5) 152.86 145.18 152.7 144.9 6.96, dd (0.7, 2.8) 4.95, d (6.3) 6.94, dd (0.9, 2.5) 4.93, d (6.8) 105.28 105.0 69.95 69.8 5.53, tsext (6,3, 1.4) 5.51, m 119.05 118.9 2.09, m 2.08, m 5.06, tsept (6.3, 1.4) 5.05, m 143.27 39.71 26.40 123.69 143.0 39.5 26.2 123.5 3’ 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 7’’ 8’’ 9’’ 10’’ 132.27 1.68, d (0.7) 1.66 s 25.90 1.69, d (0.7) 1.67 s 17.94 1.60, d (0.7) 1.58 s 16.90 a Datos obtenidos experimentalmente. ~ 39 ~ 132.0 25.7 17.7 16.7 b Kawaii y col. HMBC H-8/C-6, C-7, C8a, C-4a H-2´/C-6, C-3´, C7 H-3´/C-6, C-7, C2´ H-1´´/C-5, C-2´´, C-3´´ Figura 6. Espectro de RMN 1H (700 MHz, CDCl3) de 5-geranoxi-psoraleno ~ 40 ~ Figura 7. Espectro de RMN 13C (176 MHz, CDCl3) de 5-geranoxi-psoraleno ~ 41 ~ Figura 9. Espectro de COSY de 5-geranoxi-psoraleno ~ 42 ~ Figura 10. Espectro de HMBC de 5-geranoxi-psoraleno ~ 43 ~ 4.1.2 Elucidación estructural del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina (Ca6) En el espectro de RMN 1H (Figura 11) del compuesto Ca6 se observan señales para 24 protones característicos de una cumarina sustituida con un grupo geranoxi y un grupo metoxilo por las señales siguientes: en δ 8.00 ppm se observa un doblete con una J= 9.8 Hz correspondiente al protón H-4, el cual se acopla con el protón H-3 ubicado en δ 6.15 ppm como un doblete con una J= 9.6 Hz. También, se observan dos protones metarrelacionados uno a δ 6.41 ppm (d, J= 2.2 Hz) y otro en δ 6.28 ppm (d, J= 2 Hz). Adicionalmente, se observan las señales características del grupo geraniloxi de acuerdo a lo siguiente: en δ 5.47 ppm (J= 6.4, 1.2 Hz) y 5.09 ppm (J= 6.4, 1.6 Hz) resuenan un triplete sextaplete y un triplete septaplete, correspondientes a H-2’ y H-6’, respectivamente. En δ 4.60 ppm se observa un doblete (J= 6.4 Hz) que corresponde al protón de H-1’ y en δ 2.11 ppm un multiplete correspondiente a dos protones de H-4’ y dos protones de H-5’. Por otro lado se observan tres dobletes (J= 0.8 Hz) en δ 1.74, 1.67 y 1.61 ppm que corresponden a los protones H-9’, H-10’ y H8’, respectivamente. Finalmente, se observa un singulete en δ 3.85 ppm con una integral para tres protones y que pude ser atribuido a un grupo metoxilo. El espectro de RMN 13C (Figura 12) muestra 20 señales de carbonos de los cuales es importante mencionar al grupo carbonilo de una lactona cumarínica en δ 161.8 ppm; así como, la señal del metoxilo en 55.9 ppm. En la Tabla 5 se resumen las constantes espectroscópicas del compuesto Ca6. La comparación de las contantes físicas y espectroscópicas de Ca6 con las cumarinas previamente reportadas por Miyake y colaboradores (71) permitieron identificar al compuesto como la 5geranoxi-7-metoxi-cumarina (Figura 13). ~ 44 ~ Figura 13. Estructura del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina Para confirmar la elucidación estructural de 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina se corrió el espectro COSY (Figura 14) el cual mostró la correlación que hay entre H-4 y H-3, H-6 y H-8, H-2’ y H-1’, H-6’ y H-5’. Cabe mencionar que se observan correlaciones a larga distancia entre H6’ y H-8’, H6’ y H-10’; y por último H-2’ y H9’. Así mismo en el espectro HSQC (Figura 15) se pueden observar las correlaciones que existen entre el protón con su correspondiente carbono. Adicionalmente se llevó a cabo un experimento HMBC (Figura 16) para observar la correlación existente a larga distancia entre protones y carbonos (Tabla 5). ~ 45 ~ TABLA 5 Constantes espectroscópicas de RMN de 1H y 13C y HMBC de 5-geranoxi-7-metoxicumarina H (J en Hz)a 400 MHz, CDCl3 H (J en Hz)b 400 MHz, dDMSO 6.15, d (9.6) 8.00, d (9.8, 0.4) 6.15, d (9.5) 8.01, dd (9.5, 0.5) 6.28, d (2) 7 8 8a 1’ Posición 2 3 4 4a 5 6 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 10’ 7-OMe Cb 100 MHz, dDMSO 6.29, d (2.0) Ca 100 MHz, CDCl3 161.88 111.01 139.28 104.48 156.48 96.0 6.41, dd (2, 0.4) 6.41, dd (2.9, 0.5) 163.81 92.88 158.10 94.19 4.6, d (6.4) 4.6, d (6.5) 157.06 65.89 152.63 69.73 5.47, tsext (6.4, 1.2) 5.48, tq (6.5, 1.0) 118.68 118.84 2.11, m 2.12, m 5.09, tsept (6.4, 1.6) 5.09, m 142.36 39.7 26.42 123.78 143.02 39.47 26.19 123.47 112.52 139.59 107.48 148.95 114.17 132.20 130.00 1.61,d (0.8) 1.61, s 17.93 17.68 1.74,d (0.8) 1.75, s 16.94 16.65 1.67, d (0.8) 1.68, s 25.88 25.65 3.85, s 3.85, s 55.99 55.74 a Datos obtenidos experimentalmente. bMiyake y col. ~ 46 ~ HMBC H-6/C-5, C-7, C8, C-4a H-8/C-6, C-7, C4a, C-8a H-1´/C-5, C-2´´, C-3´ Figura 11. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) del compuesto 5-geranoxi-7-metoxicumarina ~ 47 ~ Figura 12. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) del compuesto 5-geranoxi-7-metoxicumarina ~ 48 ~ Figura 14. Espectro COSY del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina ~ 49 ~ Figura 15. Espectro HSQC del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina ~ 50 ~ Figura 16. Espectro HMBC del compuesto 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina ~ 51 ~ 4.1.3 Elucidación estructural del compuesto 5,7-dimetoxi cumarina o limetina (Ca7) El punto de fusión, el Rf y el espectro de RMN 1H de Ca7 nos permitieron concluir se trata de la 5,7-dimetoxi cumarina (Figura 17). Esta cumarina fue la misma que la obtenida previamente del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia en forma de cristales por Elizondo-Treviño en el 2008. El espectro de RMN 1H (Figura 18) muestra en δ 7.97 ppm un doblete con una J= 9.6 Hz correspondiente a H-4, este protón se acopla con H-3 el cual se observa como un doblete en δ 6.16 ppm (J= 9.6 Hz). Asimismo en δ 6.28 y 6.42 ppm se observan dos dobletes (J= 2Hz) metarrelacionados correspondientes a H-6 y H-8, respectivamente. Por último en δ 3.89 y 3.85 ppm se observan dos singuletes que integran para tres protones cada uno y que corresponden a 7-OCH3 y 5-OCH3, respectivamente. En la Tabla 6 se muestran las constantes espectroscópicas de la 5,7-dimetoxi-cumarina. Figura 17. Estructura del compuesto 5,7-dimetoxi cumarina TABLA 6 Constantes espectroscópicas de RNM 1H del compuesto 5,7-dimetoxi cumarina Posición 3 4 6 8 5-OMe 7-OMe H (J en Hz)a 400 MHz, CDCl3 6.16, d (9.6) 7.97, d (9.6) 6.28, d (2.4) 6.42, d (2) 3.85, s 3.89, s a Datos obtenidos experimentalmente. ~ 52 ~ H (J en Hz)b 400 MHz, CDCl3 6.16, d (9.6) 7.97, d (9.5) 6.28, d (2.1) 6.41, d (2.3) 3.85, s 3.89, s b Elizondo- Treviño Figura 18. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) del compuesto 5,7-dimetoxi cumarina ~ 53 ~ 4.1.4 Elucidación estructural del compuesto 5-metoxi-psoraleno o Bergapteno (Ca8) El espectro RMN 1H (Figura 19) muestra seis señales equivalentes a ocho protones característicos de una furanocumarina metoxilada. A continuación se describen las señales características: en δ 8.16 ppm se observa un doblete con una J= 9.8 Hz, correspondiente a H-4, el cual se acopla con H-3 localizado en 6.28 ppm como un doblete (J= 9.8 Hz). En δ 7.14 ppm se observa un singulete que integra para un protón. Adicionalmente en δ 7.6 ppm se observa H-2’ como un doblete con una J= 2.8 Hz, el cual se acopla con H-3’ ( 7.02, J= 2.1 Hz). Finalmente en δ 4.27 ppm se observa un singulete correspondiente a un grupo metoxilo. El espectro de RMN 13 C (Figura 20) muestra 12 señales, de las cuales la señal a 161.5 ppm corresponde al grupo carbonilo de una lactona cumarínica y en 60.3 ppm un grupo metoxilo, además se observan 10 carbonos aromáticos. En la Tabla 7 se resumen las constantes espectroscópicas de Ca8. De acuerdo al análisis del espectro de RMN 1H y de 13 C el compuesto podría ser el 5-metoxi-psoraleno o el 8-metoxi- psoraleno, por lo que se buscó en la literatura las constantes espectroscópicas de ambos compuestos y se encontró que el compuesto Ca8 corresponde al 5-metoxipsoraleno (Figura 21) reportado previamente por Yu Hongwei y colaboradores (72). Lo anterior fue confirmado por el análisis de RMN doble dimensión. En el espectro COSY (Figura 22) se observa la correlación que existe entre el protón H-4 y H-3, así como también entre los protones H-2’ y H-3’. Adicionalmente fue realizado el experimento de HMBC (figura 23) en donde se observan las correlaciones que existen entre protones y carbonos a larga distancia, cada una de las correlaciones se muestran en la Tabla 7. ~ 54 ~ Figura 21. Estructura química del compuesto 5-metoxi-psoraleno TABLA 7 Constantes espectroscópicas de RMN de 1H y 13C y HMBC de 5-metoxi-psoraleno Posición 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 2’ 3’ 5-OMe H (J en Hz)a 700 MHz, CDCl3 H (J en Hz)b 600 MHz, CDCl3 6.28, d (9.8) 8.16, dd (9.8, 0.7) 7.14, dd (1.4, 0.7) 6.26, d (9.6) 8.15, d (9.6) Ca 176 MHz, CDCl3 161.53 112.76 139.53 Cb 150 MHz, CDCl3 161.2 112.5 139.2 7.13, s 152.90 149.78 112.87 158.59 94.07 152.7 149.5 112.7 158.3 93.8 HMBC H-3/C-2, C-8a H-4/C-2, C-4a H-8/C-4a, C-6, C-8a, C-8 106.61 106.4 7.6, d (2.8) 7.59, d (2.5) 145.01 144.7 H-2´/C-7, C-6 7.02, dd (2.1, 7.02, d (2.5) 105.26 105.2 H-3´/C-7, C-2´, 1.4) C-6 4.27, s 4.26, s 60.3 60.0 a Datos obtenidos experimentalmente. bYu Hongwei y col. ~ 55 ~ Figura 19. Espectro de RMN 1H (700 MHz, CDCl3) del compuesto 5-metoxi-psoraleno ~ 56 ~ Figura 20. Espectro de RMN 13C (176 MHz, CDCl3) del compuesto 5-metoxi-psoraleno ~ 57 ~ Figura 22. Espectro COSY del compuesto 5-metoxi-psoraleno ~ 58 ~ Figura 23. Espectro HMBC del compuesto 5-metoxi-psoraleno ~ 59 ~ 4.1.5 Elucidación estructural del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno o Isopimpinellina (Ca9) El espectro de RMN 1H (Figura 24) del compuesto Ca9 muestra señales para cuatro protones aromáticos característicos de una furanocumarina doblemente metoxilada de acuerdo a la siguiente discusión: para el anillo de la lactona se observa un doblete (J= 10 Hz ) en δ 8.12 ppm correspondiente a H-4, el cual se acopla con H-3 ( 6.29, d, J= 10 Hz). Por otra parte, se observan dos dobletes, uno en δ 7.63 ppm (d, J= 1.6 Hz) y el otro en 7.00 ppm (d, J= 1.2 Hz) los cuales corresponden a los protones H-2’ y H-3’ del anillo de furano. Finalmente, se observa un singulete en δ 4.16 ppm que integra para seis protones y que corresponde a los protones de los metoxilos 5 y 8. El espectro de RMN 13 C (Figura 25) se observan 13 señales, de las cuales se puede destacar la señal en δ 160.72 ppm característica del C-2 de una lactona α,βinsaturada. También, se observan las señales para dos metoxilos en δ 61.95 y 61.06 ppm y para los carbonos de benceno y furano (Tabla 8). En la Tabla 8 se resumen los datos espectroscópicos de Ca9, el cual se caracterizó como la 5,8-dimetoxipsoraleno o isopimpinellina (Figura 26) por comparación de sus datos espectroscópicos con los previamente reportados para este compuesto por Miyazawa y colaboradores en el 2004 (73). Cabe mencionar que para confirmar la elucidación estructural del 5,8-dimetoxi psoraleno fueron realizados estudios de DEPT 45, 90 y 135, aunado a experimentos de doble dimensión. En el caso de DEPT 45 (Figura 27) se observan seis señales correspondientes al C-3’ (δ 105.32), C-3 (δ 113.10), C-4 (δ 139.64), C-2’ (δ 145.35) y dos –OCH3 (δ 61.06 y 61.96). Asimismo en el espectro de RMN DEPT 90 (Figura ~ 60 ~ 28) se observan cuatro señales correspondientes a los metinos (C-3, C-4, C-2’ y C3’). Cabe mencionar que, el espectro de RMN DEPT 135 es igual al espectro de DEPT 45 ya que la molécula no presenta en su estructura metilenos, apareciendo únicamente los metilos y metinos. En el experimento de doble dimensión COSY (Figura 29) se puede observar la correlación entre los protones H-3 y H-4 así como entre los protones H-2’ y H-3’. Lo anterior pudo ser confirmado por la interacción que existe entre estos protones en el espacio por medio de espectro de NOESY mostrado en la Figura 30. Por otro lado, en la Figura 31 se muestra el espectro de HETCOR, el cual muestra la correlación entre los carbonos C-3, C-4, C-2’ y C-3’ con sus respectivos protones. Figura 26. Estructura del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno ~ 61 ~ TABLA 8 Constantes espectroscópicas de RMN 1H y 13C del compuesto 5,8-dimetoxi psoraleno Posición 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 2’ 3’ 5-OMe 8-OMe H (J en Hz)a 400 MHz, CDCl3 H (J en Hz)b 500 MHz, CDCl3 Ca 100 MHz, CDCl3 Cb 125 MHz, CDCl3 160.72 113.10 139.64 107.87 144.52 115.03 150.24 128.45 143.92 7.63, d (1.6) 7.63, d (2.3 ) 145.35 7.00, d (1.2) 7.00, d (2.3) 105.32 4.16, s 61.96 4.16, s 4.17, s 61.06 a Datos obtenidos experimentalmente. bMiyazawa y col. 6.29, d (10) 8.12, d (10) 6.29, d (9.7) 8.12, d (9.7) ~ 62 ~ 160.6 112.9 139.1 107.7 144.4 114.9 150.1 128.3 143.8 145.2 105.2 61.8 60.9 Figura 24. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno. ~ 63 ~ Figura 25. RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno. ~ 64 ~ Figura 27. Espectro de DEPT 45 del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno Figura 28. Espectro de DEPT 90 del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno ~ 65 ~ Figura 29. Espectro de COSY del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno ~ 66 ~ Figura 30. Espectro de NOESY del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno ~ 67 ~ Figura 31. Espectro HETCOR del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno ~ 68 ~ 4.2 Compuestos identificados por CG/EM Para identificar los compuestos volátiles del extracto hexánico de C. aurantifolia se realizó un análisis por CG/EM del mismo y lográndose identificar 40 compuestos, los cuales se enlistan en la Tabla 9 y se ubican en las siguientes clases de compuestos: nueve monoterpenos, cinco sesquiterpenos, cinco cetonas, cuatro alcanos, cuatro cumarinas, tres ácidos grasos, tres alcoholes, dos ésteres, dos éteres, un fenol, un aldehído y una hidroxiacetona. En la Figuras 32 y 33 se muestran las estructuras químicas de los compuestos identificados. TABLA 9 Compuestos separados e identificados por CG/EM del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia. Compuesto Tiempo de retención (min) Porcentaje de abundancia Tetrahidro-2-metil2H-pirano 5.241 0.556 4-Hexen-3-ona 5.541 0.339 3-Metil-3-penten-2ona 5.665 0.382 3-Hexen-2-ona 5.665 0.382 Pinacol 6.290 1.313 Resorcinol 8.349 2.848 p-Cimeno 8.851 0.275 1-Metoxiciclohexeno 9.600 6.243 Óxido de linalol 9.965 0.915 Acetato de crisantenilo 10.604 0.310 ~ 69 ~ Fórmula molecular C6 H12 O C6 H10 O C6 H10 O C6 H10 O C6 H16 O2 C6 H6 O2 C10 H14 C7 H12 O C10 H18 O2 C12 H18 O2 Peso molecular g/mol 100.06 98.06 98.06 98.06 120.06 110.06 148.11 112.07 170.10 194.13 CONTINÚA Compuesto Tiempo de retención (min) Porcentaje de abundancia Corilon 10.916 5.406 Terpinen-4-ol 11.464 1.300 α-Terpineol 11.737 4.663 3-Metil-1,2ciclopentanediona 12.115 6.460 Carvona 12.487 0.689 Geraniol 12.597 0.895 Citral 12.773 1.725 1,8-Dimetil-4-(1metiletil)-spiro [4,5]dec-6-en-8-ona 12.956 0.439 Formato de geranilo 13.106 0.551 Ácido oléico 13.933 0.538 Acetato de (2)-7metil-8-tetradecenilo 14.200 2.213 α-Bergamoteno 14.963 0.779 Trans-α -Bisaboleno 15.894 0.800 Óxido de cariofileno 17.048 2.355 Espatulenol 17.595 1.519 Umbelliferona; 7metoxicumarina 19.061 3.377 1-Heptatriaconanol 19.367 0.150 Trans-Fitol 19.530 0.169 Versálido 20.077 0.398 Palmitato de metilo 20.449 0.228 Ácido palmítico 21.178 5.381 Fórmula molecular C6H8O2 C10H18O C10H18O C6 H8 O2 C10H14O C10 H18 O C10H16O Peso molecular g/mol 112.06 154.25 154.25 112.06 136.09 154.10 152.1 C15 H24 O ~ 70 ~ 220.16 C11 H18 O2 C18 H34 O2 C17H32O2 C15H24 C15H24 C15H24O C15H24O C10 H8 O3 C37 H76 O C20 H40 O C18 H26 O C17 H34 O2 C16 H32 O2 182.11 282.19 268.18 268.18 204.35 220.36 220.35 176.10 536.40 296.21 258.19 270.18 256.17 CONTINÚA Compuesto Tiempo de retención (min) Porcentaje de abundancia 5,7Dimetoxicumarina 21.823 12.326 5-Metoxi-psoraleno 22.768 0.752 Ácido linoléico 22.768 0.752 23.876 0.244 24.117 4.745 25.857 0.360 27.798 0.546 28.776 0.307 33.408 0.389 Tricosano 5,8-Dimetoxipsoraleno Pentacosano Tetracosanal Octacosano Nonacosano ~ 71 ~ Fórmula molecular C11H10O4 C12 H8 O4 C18 H32 O2 Peso molecular g/mol 206.19 280.19 280.19 C23 H62 338.2 C13H10O5 246.13 C25 H52 352.27 C24 H48 O 352.26 C28 H58 394.30 C29H60 408.31 4-Hexen-3-ona Tetrahidro-2-metil-2H-pirano Pinacol Óxido de linalol linalol α-Terpineol 3-Metil-3-penten-2-ona Resorcinol Acetato de crisantenilo crisantenilo crisantenilo 3-Metil-1,2-ciclopentanediona 3-Hexen-2-ona p-Cymeno 1-Metoxi-ciclohexeno Corilon Terpinen-4-ol Carvona Geraniol Formato de geranilo Citral 1,8-Dimetil-4-(1-metiletil)spiro[4.5]dec-6-en-8-ona Ácido oléico Figura 32. Estructura química de los compuestos identificados del extracto hexánico de C. aurantifolia ~ 72 ~ Acetato de (2)-7-metil-8-tetradecenilo α-Bergamoteno Trans-α -bisaboleno 7-Metoxicumarina Espatulenol Óxido de cariofileno CH (CH ) OH 3 2 36 1-Heptatriacontanol Trans-Fitol Palmitato de metilo Versálido Ácido linoléico Ácido palmítico 5,7-Dimetoxicumarina CH (CH ) CH 3 2 21 3 Tricosano 5,8-Dimetoxi-psoraleno 5-Metoxi-psoraleno CH (CH ) CH 3 2 23 CH (CH ) CHO 3 3 2 22 3 2 26 3 Octacosano Tetracosanal Pentacosano CH (CH ) CH CH (CH ) CH 3 2 27 3 Nonacosano Figura 33. Estructura química de los compuestos identificados del extracto hexánico de C. aurantifolia ~ 73 ~ De acuerdo a lo revisado en la literatura en cuanto a la composición química de la cáscara de C. aurantifolia (ver antececentes), nos podemos percatar que está constituida principalmente de terpenos, cumarinas, furanocumarinas, flavonoides, compuestos fenólicos, pectinas, entre otros. También, pudimos observar que la composición química que reportan los investigadores varía de acuerdo a la región donde se recolecta el material vegetal, la estación de colecta, las condiciones en la que se obtienen los aceites esenciales (por presión, destilación, hidro-destilación, etc) o por las condiciones en que se analizan las muestras en el CG-EM (rampas de temperatura, fases estacionarias empledas, bases de datos). Asimismo, en este proyecto se lograron identificar 22 metabolitos secundarios que anteriormente no habían sido identificados en la cáscara de C. aurantifolia y que se describen por primera vez en esta planta, estos compuestos se enlistan en la Tabla 10. Otro aspecto importante a mencionar es que hay solo un reporte previo del estudio químico del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia donde lograron obtener dos flavonoides (53); mientras que en el presente proyecto de investigación encontramos cumarinas, furanocumarinas, terpenos, compuestos fenólicos, cetonas, entre otros. La diferencia en el contenido de metabolitos secundarios entre ambos estudios puede ser debido probablemente a lo mencionado anteriormente. ~ 74 ~ TABLA 10 Compuestos identificados por primera vez en la cáscara de C. aurantifolia Compuestos Acetato de (2)-7-metil-8Tetrahidro-2-metil-2H-pirano tetradecenilo 4-Hexen-3-ona Pinacol Resorcinol 1-Metoxi-ciclohexeno Acetato de crisantenilo Corilon 3-Metil-1,2-cliclopentenediona Formato de geranilo Ácido oléico 3-Metil-3-penten-2-ona Espatulenol 1-Heptatriacotanol Trans-fitol Versálido Palmitato de metilo Pentacosano Tetracosanal Octacosano Nonacosano 3-hexen-2-ona Entre los compuestos que se lograron aislar, purificar y caracterizar, en este estudio, a partir de la cáscara de C. aurantifolia, son: las furanocumarinas y cumarinas, lo cual coincide con la literatura consultada. En el caso de las furanocumarinas se ha observado que algunas plantas las acumulan gracias a que tienen rutas biosintéticas altamente inducibles; sin embargo, Ruta graveolens y posiblemente otras especies de Rutaceae no responden al estrés y sintetizan constitutivamente furanocumarinas en todos los tejidos, por lo que es posible que C. aurantifolia (Rutaceae) se comporte de manera similar y sintetice este tipo de compuestos a pesar de las condiciones en las que se encuentre (74). ~ 75 ~ 4.4 Actividad Antituberculosa de los Compuestos Identificados y Caracterizados del Extracto Hexánico de la cáscara C. aurantifolia Cuatro de los cinco compuestos aislados, purificados y caracterizados del extracto hexánico de C. aurantifolia; así como, 16 de los compuestos identificados por CGEM fueron ensayados en contra de una cepa sensible (H37Rv) de M. tuberculosis, los resultados se muestran en la Tabla 11. Una vez probados con la cepa sensible, los compuestos con actividad antituberculosa fueron ensayados contra tres cepas resistes a isoniazida y rifampicina, los resultados se muestran en la Tabla 12. Cabe mencionar que los ensayos tanto en la cepa sensible como en las cepas resistentes se realizaron en un rango de concentración de 6.25-200 μg/mL. TABLA 11 Actividad en contra de M. tuberculosis H37Rv de los compuestos identificados en el extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia Compuesto 5-Geranoxi-psoraleno (Ca4) 5-Geranoxi-7-metoxi cumarina (Ca6) 5,7-Dimetoxi-cumarina (Ca7) 5,8-Dimetoxi-psoraleno (Ca9)† CMI (μg/mL) H37Rv 100-50 Compuesto 4-Hexen-3-ona >200 3-Metil-3-penten-2-ona >200 >200 Óxido de linalol >200 50-25 Terpinen-4-ol 200 200 Carvona 200 Geraniol p-Cimeno >200 Citral Ácido linoléico CMI (μg/mL) H37Rv 100-50 100-50 100-50 Formato de geranilo >200 Pinacol >200 Ácido oleico 100 Resorcinol 200 Palmitato de metilo >200 3-Metil-1,2-ciclopentenediona >200 Ácido palmítico† 50-25 † El compuesto fue ensayado a una concentración inicial de 50 μg/mL ~ 76 ~ TABLA 12 Actividad en contra de cepas resistente de M. tuberculosis de los compuestos identificados en el extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia Compuesto 5-Geranoxi-psoraleno H10 200 CMI (μg/mL) M15 100 M26 100 5,8-Dimetoxi-psoraleno† 25* >50 50 Carvona >200 >200 >200 Ácido linoléico 100 100 100 Resorcinol 200 100 100 4-Hexen-3-ona >200 >200 >200 Terpinen-4-ol >200 >200 >200 Geraniol >200 >200 >200 Citral >200 >200 200 Ácido oléico 100 100 100 Ácido palmítico† 50* 50 50 *El ensayo del compuesto fue realizado con cepa resistente M20 †El compuesto fue ensayado a una concentración inicial de 50 μg/mL En cuanto a la actividad antituberculosa y de acuerdo a los resultados observados en las Tablas 11 y 12 podemos decir que la clase de metabolitos secundarios con actividad en contra de M. tuberculosis H37Rv son principalmente: furanocumarinas: 5-geranoxi-psoraleno (CMI 100-50 μg/mL), 5,8-dimetoxi-psoraleno (CMI 50-25 μg/mL); ácidos grasos: ácido linoléico (CMI 50-100 μg/mL), ácido oléico (CMI 100 μg/mL), ácido palmítico (CMI 50-25 μg/mL); los terpenos: carvona, terpinen-4-ol y geraniol con valores de CMI de 200 μg/mL, cada uno; 4-hexen-3-ona y citral con valores de CMI 100-50 μg/mL y el compuesto fenólico: resorcinol (CMI 200 μg/mL). Sin embargo, solo las furanocumarinas: 5-geranoxi-psoraleno (CMI 100200 µg/ml) y 5,8-metoxi-psoraleno (CMI 25 µg/ml) y los ácidos grasos: ácido linoléico (CMI 100 µg/ml), ácido oléico (CMI 100 µg/ml) y el ácido palmítico (CMI ~ 77 ~ 50 µg/ml) son los que presentan actividad en contra de las cepas de M. tuberculosis resistentes. Esto es de gran importancia debido a la presencia que existe hoy en día de cepas multi-fármaco-resistentes, de tal manera que estos compuestos pueden ser modificados químicamente para que presenten una mayor actividad en contra de la bacteria. En este proyecto fueron ensayados dos psoralenos y dos cumarinas, siendo los psoralenos (5-geranoxi-psoraleno y 5,8-dimetoxi-psoraleno) activos en contra de la cepa sensible y las cepas multifármaco-resistentes de M. tuberculosis. Probablemente el anillo furánico sea indispensable para la actividad de estos compuestos ya que en las cumarinas este anillo no se encuentra presente. Es pertinente mencionar que los psoralenos o furanocumarinas se encuentran distribuidas en distintas familias de plantas como Apiaceae, Moraceae, Rutaceae y Leguminosae; asimismo, presentan diferentes actividades biológicas entre las que destacan la capacidad de inactivar enzimas del citocromo P450 y además la habilidad de intercalarse en el ADN y crear uniones covalentes con los residuos de timina (74). En este sentido, es posible que éste sea el mecanismo por el cual el 5-geranoxi- y 5,8-dimetoxi-psoraleno inhiban el crecimiento de M. tuberculosis. Por otro lado los ácidos grasos también presentaron una buena actividad, el ácido palmítico, un ácido graso saturado con 16 carbonos en su estructura, resultó ser el doble de activo que los ácidos linoléico y oléico tanto en la cepa sensible como en las resistentes. Por lo que podemos inferir que posiblemente las insaturaciones presentes en los ácidos linoléico y oléico disminuyan la actividad en contra de M. tuberculosis, ~ 78 ~ así como también la longitud de la cadena de los ácidos, ya que tanto el ácido oléico como el linoléico tienen en su estructura 18 carbonos y diferente grado de instauración. Cabe mencionar que existen reportes donde los ácidos grasos presentan actividad en contra de bacterias como, E. coli, P. aeruginosa y S. aureus (75,76), en este sentido existe un reporte donde el ácido exocárpico, aislado de Exocarpus latifolius, presentó actividad en contra de M. tuberculosis con una CMI 20 μg/mL (77). Como pudimos ver en las figuras 2 y 3 en el Capítulo I, los fármacos antituberculosos tienen estructuras muy distintas a los metabolitos secundarios activos en este proyecto, en este sentido existen reportes de moléculas aisladas de plantas con actividad antituberculosa. Un ejemplo es el trabajo de Camacho y colaboradores en el 2009, quienes reportaron la actividad antituberculosa de diversos metabolitos secundarios aislados de diferentes plantas: el alcaloide 6- metoxidihidrochelirubina, aislado de Bocconia arbórea, presentó una CMI de 12.5 μg/mL contra la cepa H37Rv y tres cepas resistentes. Asimismo, el alcaloide “liriodenina”, aislado de Stephania dinklagei, presentó una CMI de 3.125 μg/mL en contra de H37Rv y de 100 μg/mL contra una cepa resistente (78). Por otro lado, Gordien y colaboradores encontraron que la actividad antituberculosa del extracto hexánico de Juniperus communis L es debida a un sesquiterpeno identificado como “longifoleno” y a dos sesquiterpenos caracterizados como “totarol” y ácido “transcomúnico”; sin embargo el “totarol” mostró una mejor actividad en contra de M. tuberculosis H37Rv (CMI de 73.7 μM) y contra cepas resistentes (79). Asimismo, Murillo y colaboradores realizaron un estudio biodirigido del extracto crudo de Haplopappus sonorensis en donde los flavonoides 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona ~ 79 ~ y 5,7-dihidroxi-3,4’-dimetoxiflavona resultaron ser los constituyentes antituberculosos de Haplopappus sonorensis (80). Lo anterior nos indica que las plantas son una fuente rica de moléculas que pueden ser utilizadas como modelos moleculares para la síntesis de análogos más activos en contra de M. tuberculosis y otras enfermedades. Es importante mencionar que esta es la primera vez que se reporta la actividad antituberculosa para los compuestos ensayados en este proyecto. Encontrando un gran interés en el 5,8-dimetoxi psoraleno y el ácido palmítico, ya que el primero presentó actividad de 50-25 μg/mL contra la cepa H37Rv y de 50 y 25 μg/mL contra dos cepas resistentes; asimismo, el ácido palmítico mostró actividad de 50-25 μg/mL contra la cepa H37Rv y de 50 μg/mL en contra de tres cepas resistentes. Los resultados encontrados en este proyecto son de gran interés ya que estas moléculas pueden servir de base para la síntesis de análogos con mayor actividad, de manera tal que se tendrían mejores fármacos para el tratamiento de la tuberculosis, siendo ideal una molécula que disminuya el tiempo de tratamiento, disminuya los efectos adversos, fácil administración y sobre todo que sea eficaz contra las cepas de M. tuberculosis resistentes a los fármacos ya existentes. ~ 80 ~ CAPÍTULO V CONCLUSIONES A partir del extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia, se lograron aislar, purificar y caracterizar estructuralmente por RMN los siguientes compuestos: 5geranoxi-psoraleno, 5-geranoxi-7-metoxi-cumarina, 5,7-dimetoxi-cumarina y 5,8dimetoxi-psoraleno, y 5-metoxi- psoraleno. En el extracto hexánico de la cáscara de C. aurantifolia se lograron identificar por CG/EM, 40 compuestos volátiles, de los cuales nueve son monoterpenos, cinco sesquiterpenos, cinco cetonas, cuatro alcanos, cuatro cumarinas, tres ácidos grasos, tres alcoholes, dos ésteres, dos éteres, un fenol, un aldehído y una hidroxiacetona. De los compuestos identificados por CG/EM 22 no han sido reportados en C. aurantifolia de los cuales el resorcinol, la 4-hexen-3-ona y el ácido oléico presentaron actividad en contra de M. tuberculosis. Los compuestos que presentaron actividad en contra de M. tubercolosis H37Rv fueron el ácido palmítico (CMI 50-25 μg/mL), 5,8-metoxi-psoraleno (CMI 50-25 μg/mL), 5-geranoxi-psoraleno (CMI 100-50 μg/mL), ácido linoléico (CMI 100-50 μg/mL), 4-hexen-3-ona (CMI 100-50 μg/mL), citral (CMI 100-50 μg/mL) y ácido oléico (CMI 100 μg/mL). Los compuestos que resultaron más activos en contra de las tres cepas multifármaco resistentes fueron el 5-geranoxi-psoraleno (CMI 100-200 μg/mL), el ~ 81 ~ ácido linoléico (CMI 100 µg/mL), el ácido oléico (CMI 100 µg/mL) y el ácido palmítico (CMI 50 μg/mL). Los compuestos 5-geranoxi-psoraleno, ácido palmítico, ácido oléico y ácido linoléico, son moléculas prometedoras para el tratamiento de la tuberculosis ya que fueron los compuestos activos en contra de M. tuberculosis sensible y tres multifarmacorresistente. ~ 82 ~ CAPÍTULO VI FUTURAS INVESTIGACIONES 1. Evaluar en contra de M. tuberculosis los compuestos que no fueron evaludos y que se identificaron por CG/EM. 2. Establecer el mecanismo de acción de los compuestos que tuvieron actividad en contra de M. tuberculosis. 3. Sintetizar análogos de los compuestos activos con el fin de obtener moléculas con mayor actividad antituberculosa. ~ 83 ~ BIBLIOGRAFÍA 1. Murray, P., et.al. Microbiología Médica. Harcourt Brace. 2ª Edición. p.p 320322. España. (1997). 2. Alsteens D., Verbelen C., et.al. Organization of the mycobacterial cell wall: a nanoscale view. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 456: 117-125. (2008). 3. Robbins, S., Kumar, V. Patología Humana. Interamericana McGraw-Hill. 4a Edición. p.p 444. (1987). 4. Lozano, J. Tuberculosis. Patogenia, diagnóstico y Tratamiento. OFFARM. Vol 21, Núm 8. (2002). Consultado el 08/09/10 en: http://external.doyma.es/pdf/4/4v21n08a13035870pdf001.pdf. 5. Brogolia, B., Bonifachich, E., et.al. Criterios de Diagnóstico y Tratamiento de la tuberculosis infantil. Archivos Argentinos de Pediatría. 100(2). p.p 162163.(2002). Recuperado el día 08/09/10 en: http://www.sap.org.ar/docs/profesionales/consensos/159(1).pdf 6. Joklik, W.,Willet, H., Amos, D. Zinsser Microbiología. 17a Edición. p.p 611631. (1983). 7. Organización Mundial de la Salud. La vacuna antituberculosa. Recuperado el día 13/09/10 en: http://www.who.int/immunization/wer7904BCG_Jan04_position_paper_SP.pdf 8. Mudd, S. Infectious agents and host reactions. W.B. Saunders Company. p.p 230. (1970). 9. Coll, P. Fármacos con actividad frente a Mycobacterium tuberculosis. 21(6): 299-308. (2003). ~ 84 ~ 10. Brunton, L, B., Lazo, J, S., Parker, K, L. Goodman y Gilman. Las bases de la farmacología de la terapéutica. McGraw-Hill – Interamericana. Edición11. p.p 1203-1215. México. (2007). 11. World Health Organization. Global Tuberculosis Control: 2010. (2010). 12. Secretaria de Salud. Situación actual de la Tuberculosis en México… Avances y Desafíos. Recuperado 27/04/11 en: http://www.cenave.gob.mx/tuberculosis/diamundial/Presentación%20oficial%20 TB%202010%20México.pdf 13. Organización Mundial de la Salud. Tuberculosis. Recuperado el día 15/09/09 en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/es/index.html. 14. Organización Mundial de la Salud. Prevención y control de la tuberculosis multirresistente y ultrarresistente. 62ª Asamblea Mundial de la Salud. 16 de abril de 2009. Recuperado el día 15/09/09 en: http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/A62/A62_20-sp.pdf. 15. Organización Mundial de la Salud. La tuberculosis farmacorresistente alcanza niveles desconocidos hasta ahora. Recuperado el día 23/09/10 en: http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2010/drug_resistant_tb_2010031 8/es/. 16. Organización Mundial de la Salud. Información en tratamiento. Recuperado el día 15/09/09 en: http://www.who.int/whr/2004/chapter5/es/index3.html. 17. Organización Mundial de la Salud. Medicina Tradicional. Recuperado el día 23 de septiembre de 2010 en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/es/. 18. Lozoya, X,. Zolla, C. Medicina Tradicional en México. Boletín de la oficina sanitaria Panamericana, Abril 1984. Recuperado el día 23/09/10 en: http://hist.library.paho.org/Spanish/BOL/v96n4p360.pdf. ~ 85 ~ 19. Organización Panamericana de la Salud. Sistemas de Salud Tradicionales en América Latina y el Caribe: Información de base. Recuperado el día 15/09/09 en: http://www.paho.org/Spanish/AD/THS/OS/indi13_esp.pdf. 20. Medicina Tradicional Indígena 22/02/2006. Recuperado el día 23/09/10 en: http://emexico.gob.mx/index.php?option=com_flexicontent&view=items&id=10697. 21. Química Viva. Plantas sanadoras: pasado, presente y futuro. (Agosto 2007). Recuperado el día 15/09/09 en: http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v6n2/barquero.pdf. 22. Camacho-Corona M del R., et.al. Activity against drug resistant-tuberculosis strains of plants used in Mexican traditional medicine to treat tuberculosis and other respiratory diseases. Phytotherapy Research. 22(1):82-5 (2008). 23. Francis, J. Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle. Recuperado el día 27/09/10 en: http://www.fs.fed.us/global/iitf/pdf/shrubs/Citrus%20aurantiifolia.pdf. 24. SAGARPA. Plan Rector Sistema Nacional Limón Mexicano. (2005). Recuperado el día 24 de septiembre de 2010 en: http://w4.siap.gob.mx/sispro/IndModelos/PRector/00_NAC/LMexicano.pdf. 25. Lota, M., De Roca, D., Camille, F., Casanova, J. Volatile components of peel and leaf oils of lemon and lime species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50: 796-805. (2002). 26. Frutos Tropicales. Lima (Citrus aurantifolia. Familia. Rutáceas). Recuperado el día 24/09/10 en: http://www.mercadosmunicipales.es/uploads/frutas/Lima.pdf. 27. Piccinelli, A., Mesa, M., Armenteros, D. et.al. HPLC-PDA-MS and NMR characterization of C-glycosyl flavones in a hydroalcoholic extract of Citrus ~ 86 ~ aurantifolia leaves with antiplatelet activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56: 1574-1581. (2008). 28. Remedios populares. Limón. Recuperado el día 30/09/09 en: http://www.remediospopulares.com/limon.html 29. Caldwell, A., Jones, E. Constituents of expressed West Indian lime oil. Journal of the Chemical Society. 540-3. (1945). 30. Stanley, W., Vannier, S. Psoralens and substituted coumarins from expressed oil of lime. Phytochemistry. 6 (4): 585-96. (1967). 31. Tapanes, R., Perez, Z., Fanghaenel, E. Analysis of the terpene fraction of the distilled essential oil from the lime (Citrus aurantifolia) produced in Cuba. Revista CENIC, Ciencias Físicas. 3(1): 99-110. (1971). 32. Tapanes, R., Perez, Z. Identification of carbonyl compounds in the distilled lime essential oil produced in Cuba. Revista CENIC, Ciencias Físicas. 5(1):13-27. (1974). 33. Balbaa, S., Karawya, M., Hifnawy, M. Peel oils lemon, lime, and mandarin growing in Egypt. American Perfumer and Cosmetics. 86(6): 53-6. (1971). 34. Perez, Z., Tapanes, R. Analysis of the terpene and sesquiterpene hydrocarbon fractions of the centrifuged lime (Citrus aurantifolia) essential oil produced in Cuba. Revista CENIC, Ciencias Físiscas. 5(1): 1-11. (1974). 35. Alexander, M., Sulebele, G. Characterization of pectins from Indian citrus peels. Journal of Food Science and Technology. 14(4):180-2. (1980). 36. Clark, B., Chamblee, T., Lacobucci, G. HPLC isolation of the sesquiterpene hydrocarbon germacrene B from lime peel oil and its characterization as an important flavor impact constituent. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 35(4):514-18. (1987). ~ 87 ~ 37. Park, Y., Pastore, G. Determination of limonin in citrus fruits of the Campinas region. Ciencia e Tecnologia de Alimentos. 9(1):12-20. (1989). 38. Nigg, H., Nordby, H., Beier, R., Dillman, A., Macias, C., Hensen, R. Phototoxic coumarins in limes. Food and Chemical Toxicology. 31(5):331-5. (1993). 39. Jantan, I., Ahmad, A., Ahmad, A., Ali, N., Ayop, N. Chemical composition of some citrus oils from Malaysia. Journal of Essential Oil Research. 8(6):627-32. (1996). 40. Haggag, E., Abdel, W., El-Zalabany, S., Moustafa, E., El-Kherasy, E., Mabry T. Volatile oil and pectins from Citrus aurantifolia (lime) and Citrus limonia (lemon). Asian Journal of Chemistry. 10(4):828-833. (1998). 41. Chisholm, M., Wilson, M., Taylor, N., Mitchell, A. Differences in the aroma composition of cold pressed and distilled essential oils of key and persian limes. Book of abstracts, 216th ACS national Meeting. 23-27. (1998). 42. Chisholm, M., Wilson, M., Gaskey, G. Characterization of aroma volatiles in key lime essential oils (Citrus aurantifolia Swingle). Flavor and Fragrance Journal. 18(2):106-115. (2003). 43. Venkateshwarlu, G., Selvaraj, Y. Changes in the peel oil composition if Kagzi lime (Citrus aurantifolia Swingle) during ripening. Journal of Essential Oil Research. 12(1):50-52. (2000). 44. Feger, W., Brandauer, H., Ziegler, H. Sesquiterpene hydrocarbons of coldpressed lime oils. Flavour and Fragance Journal. 15(4):281-284. (2000). 45. Shivashankara, K., Roy, T., Rao, V. A study of volatile composition of Indian “Kagzi” lime (Citrus aurantifolia Swingle) peel by SPME, during ripening. Indian Perfumer. 46(4):315-319. (2002). ~ 88 ~ 46. Nickavar, B., Mojab, F. Volatile constituents of the dried fruit of Citrus aurantifolia from Iran. Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences. 25(2):400-401. (2003). 47. Ubando, J., Navarro, A., Valdivia, M. Mexican lime peel: comparative study on contents of dietary fibre and associated antioxidant activity. Food Chemistry. 89(1):57-61. (2004). 48. Craske, J., Suryadi, N., Wootton, M. A comparison of the peel oil components of Australian native lime (Microcitrus australe) and Mexican lime (Citrus aurantifolia Swingle). Journal of the Science of Food and Agriculture. 85(2):522-525. (2005). 49. Chowdhury, J., Nandi, N., Uddin, M. Aromatic plants of Bangladesh: chemical constituents of the leaf and peel oil of Citrus aurantifolia (christ.) swingle. Essential Oil Association of India. 50(2):54-55. (2006). 50. Phi, N., Tu, N., Nishiyama, C., Sawamura, M. Characterization of the odour volatiles in Citrus aurantifolia Persa lime oil from Vietnam. Developments in Food Science. 43:193-196. (2006). 51. Agocs, A., Nagy, V., Szabo, Z., Mark, L., Ohmacht, R., Deli, J. Comparative study on the carotenoid composition of the peel and the pulp of different citrus species. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 8(3):390-394. (2007). 52. Johann, S., Smania, A., Pizzolatti, M., Schripsema, J., Braz, R., Branco, A. Complete 1H and 13 C NMR assignments and antifungal activity of two 8- hydroxy-flavonoids in mixture. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 79(2):215-222. (2007). ~ 89 ~ 53. Afolayan, A., Asekun, O. Comparative study chemical profiles of the essential oils of ripe and rotten fruits of Citrus aurantifolia Swingle. Natural Products Communications. 3(7):1133-1136. (2008). 54. Green, C., Whwatley, A., Osagie, A., Dilworth, L., Morrison, E., Asemota, H. Characterization of health-promoting polymethoxylated flavones from Jamaican and Mexican citrus peels. Acta Horticulturae. 841:511-514. (2009). 55. Subbarao, M., Satyanarayana, T. Antibacterial activity of some plant essential oils. Indian Drugs. 23(3):140-1. (1985). 56. Ebana, R., Madunagu, B. Microbiological exploitation of cardiac glycosides and alkaloids from Garcinia kola, Borreria ocymoides, Kola nitida and Citrus aurantifolia. Journal of Applied Bacteriology. 71(5):398-401. (1991). 57. Ulate, J., Schafer, H., Zottola, E., Davidson, P. Inhibition of Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, and Micrococcus luteus by linear furanocoumarins in a model food system. Journal of Food Protection. 60(9):1050-1054. (1997). 58. Aibinu, I., Adenipekun, T., Adelowotan, T., Ogunsanya, T., Odugbemi, T. Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of Citrus aurantifolia (lime fruit) as used locally. African journal of traditional complementary and alternative medicines. 4(2):185-90. (2006). 59. Patil, J., Chidambara, M., Tichy, S., Chetti, M., Patil, B. Apoptosis-mediated proliferation inhibition of human colon cancer cells by volatile principles of Citrus aurantifolia. Food Chemistry. 114(4):1351-1358. (2009). 60. Patil, J., Murthy, K., Jayaprakasha, G., Chetti, M., Patil, B. Pancreatic cancer inhibitory effects of limonoids and flavonois of Citrus aurantifolia Swingle. American Chemical Society. 22-26. (2009). ~ 90 ~ 61. Patil, J., Jayaprakasha, G., Chidambara, M., Chetti, M., Patil, B. Isolation and identification of colon cancer inhibitory coumarins from Citrus aurantifolia Swingle. American Chemical Society. 16-20. (2009). 62. Razzaghi, A., Shams, G., Rezaee, M., Saberi, R., Yoshinari, T. Chemical composition and antiaflatoxigenic activity of Carum carvil L., Thymus vulgaris and Citrus aurantifolia essential oils. Food Control. 20(11):1018-1024. (2009). 63. Guimares, R., Barros, L., Barreira, J., Sousa, M., Carvalho, A., Ferreira, I. Targeting excessive free radicals with peles and juices of citrus fruits: Grapefruit, lemon and orange. Food and Chemical Toxicology. 48(1):99-106. (2010). 64. Asnaashari, S., Delazar, A., Habibi, B., Vasfi, R., Nahar, L., Hamedeyazdan, S., Sarker, S. Essential oil from Citrus aurantifolia prevents ketotifen-induced weight-gain in mice. Phytotherapy Research. 24(12):1893-1897. (2010). 65. Lakshmi, B., Naidu, K. Antimicrobial efficacy of essential oil Syzygium aromaticum against common infectants of storage cereals and fruits. Journal of Pharmacy Research. 3(10):2544-2545. (2010). 66. Lee, J., Lee, J. Chemical composition and antifungal activity of plan essential oils against Malassezia furfur. Han'guk Misaengmul-Saengmyongkong Hakhoechi. 38(3):315-321. (2010). 67. Ojiezeh, T., Nwachikwu, S., Udoh, S. Antimicrobial effect of Citrus aurantifolia juice and Veronica amygdaline on common bacteria isolates. Pharma Chemica. 3(1):1-7. (2011). 68. Franzblau, SG., Witzig RS., McLaughlin JC., Torrez P., Madico G., Hernandez A., Degnan MT., Cook MB., Quenzer VK., Ferguson RM., Gilman RH. Rapid low-technology MIC determination with clinical Mycobacterium tuberculosis ~ 91 ~ isolates by using the microplate alamar blue assay. Journal of Clinical Microbiology. 36(2)362-366. (1998). 69. Jimenez –Arellanez A., Meckes MN., Ramirez R., Torrez J., and Luna-Herrera J. Activity against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in mexican plants used to treat respiratory diseases. Phytotherapy Research.17, 903-908. (2003). 70. Kawaii, S., Tomono, Y., Katase, E., Ogawa, K., Yano, M. Isolation of furanocoumarins from bergamot fruits as HL-60 differentiation-inducing compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47(10):4073-4078. (1999). 71. Miyake, Y., Hiramitsu, M. Isolation and extraction of antimicrobial substances against oral bacteria from lemon peel. Journal of Food and Science Technology. DOI 10.1007/s13197-011-0330-3. (2011). 72. Hongwei, Y., Bogang, L., Changsong, L., Guolin, Z. Chemical Study on Evodia vestita.Chinese Journal of Applied and Environmental Biology. 16(1):72-75. (2010). 73. Miyazawa, M., Tsukamoto, T., Anzai, J., Ishikawa, Y. Insecticidal effect of phthalides and furanocoumarins from Angelica acutiloba against Drosophila melanogaster. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52:4401-4405. (2004). 74. Bourgaud, F., Hehn, A., Larbat, R., Doerper, S., Gontier, E., Kellner, S., Matern, U. Biosynthesis of coumarins in plants: a major pathway still to be unraveled form cytochrome P450 enzymes. Phytochemistry Reviews. 5:293-308. DOI 10.1007/s11101-006-9040-2. (2006). ~ 92 ~ 75. Skalicka, L., Los, R., Glowniak, K., Malm, A. Antimicrobial activity of fatty acids from fruits of Peucedanum cervaria and P. alsaticum. Chemistry & Biodiversity. 7(11):2748-54. (2010). 76. Lograda, T., Chaker, AN., Chalchat, JC., Ramdani, M., Silini, H., Figueredo, G., Chalarde, P. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of Genista ulicina and G. vepres. Natural Products Communications. 5(5):835-8. (2010). 77. Koch, M., Bugni, T., Sondossi, M., Ireland, C., Barrows, L. Exocarpic acid inhibits mycolic acid biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis. Planta Medica. 76: 1678-1682. (2010). 78. Camacho, M., Favela, J., González, O., Garza, E., Molina, G., Said, S., Delgado, G., Luna, J. Evaluation of some plant-derived secondary metabolites against sensitive and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Journal of Mexican Chmical Society. 53(2):71-75. (2009). 79. Gordien, AY., Gray, Al., Franzblau, SG., Seidel, V. Antimycobacterial terpenoids from Juniperus communis L. (Cuppressaceae). Journal Ethnopharmacology. 126(3):500-505. (2009). 80. Murillo, J., Encarnación, DR., Malmstrom. J., Christopherse, C., Franzblau, SG. Antimycobacterial flavones from Haplopappus 74(3):226-230. (2003). ~ 93 ~ sonorensis. Fitoterapia. APÉNDICE Espectros de masas de los compuestos identificados del extracto hexánico de Citrus aurantifolia ~ 94 ~ Figura 34. Espectro de masas del compuesto tetrahidro-2-metil-2H-pirano Figura 35. Espectro de masas del compuesto 4-hexen-3-ona ~ 95 ~ Figura 36. Espectro de masas del compuesto 3-metil-3-penten-2-ona Figura 37. Espectro de masas del compuesto 3-hexen-2-ona ~ 96 ~ Figura 38. Espectro de masas del compuesto pinacol Figura 39. Espectro de masas del compuesto resorcinol ~ 97 ~ Figura 40. Espectro de masas del compuesto p-cimeno Figura 41. Espectro de masas del compuesto 1-metoxi-ciclohexeno ~ 98 ~ Figura 42. Espectro de masas del compuesto óxido de linalol Figura 43. Espectro de masas del compuesto acetato de crisantenilo ~ 99 ~ Figura 44. Espectro de masas del compuesto corilon Figura 45. Espectro de masas del compuesto terpinen-4-ol ~ 100 ~ Figura 46. Espectro de masas del compuesto α-terpineol Figura 47. Espectro de masas del compuesto 3-metil-1,2-ciclopentanediona ~ 101 ~ Figura 48. Espectro de masas del compuesto carvona Figura 49. Espectro de masas del compuesto geraniol ~ 102 ~ Figura 50. Espectro de masas del compuesto citral Figura 51. Espectro de masas del compuesto 1,8-dimetil-4-(1-metiletil)-spiro[4,5]dec-6-en8-ona ~ 103 ~ Figura 52. Espectro de masas del compuesto formato de geranilo Figura 53. Espectro de masas del compuesto ácido oléico ~ 104 ~ Figura 54. Espectro de masas del compuesto Acetato de (2)-7-metil-8-tetradecenilo Figura 55. Espectro de masas del compuesto α-bergamoteno ~ 105 ~ Figura 56. Espectro de masas del compuesto trans-α-bisaboleno Figura 57. Espectro de masas del compuesto óxido de cariofileno ~ 106 ~ Figura 58. Espectro de masas del compuesto espatulenol Figura 59. Espectro de masas del compuesto 7-metoxi-cumarina ~ 107 ~ CH (CH ) OH 3 Figura 60. Espectro de masas del compuesto 1-heptatriacotanol Figura 61. Espectro de masas del compuesto trans-fitol ~ 108 ~ 2 36 Figura 62. Espectro de masas del compuesto versálido Figura 63. Espectro de masas del compuesto palmitato de metilo ~ 109 ~ Figura 64. Espectro de masas del compuesto ácido palmítico Figura 65. Espectro de masas del compuesto 5,7-dimetoxi-cumarina ~ 110 ~ Figura 66. Espectro de masas del compuesto 5-metoxi-psoraleno Figura 67. Espectro de masas del compuesto ácido linoléico ~ 111 ~ CH (CH ) CH 3 Figura 68. Espectro de masas del compuesto tricosano Figura 69. Espectro de masas del compuesto 5,8-dimetoxi-psoraleno ~ 112 ~ 2 21 3 CH (CH ) CH 3 2 23 3 Figura 70. Espectro de masas del compuesto pentacosano CH (CH ) CHO 3 Figura 71. Espectro de masas del compuesto tetracosanal ~ 113 ~ 2 22 CH (CH ) CH 3 2 26 3 Figura 72. Espectro de masas del compuesto octacosano CH (CH ) CH 3 Figura 73. Espectro de masas del compuesto nonacosano ~ 114 ~ 2 27 3 RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO Nallely Elizabeth Sandoval Montemayor Candidato para el Grado de Maestro en Ciencias con Especialidad en Farmacia Tesis: AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN BIOLÓGICALOS CONSTITUYENTES ANTITUBERCULOSOS DE Citrus aurantifolia Campo de estudio: Química y Farmacología de Productos Naturales Biografía: Datos Personales: Nacida en Monterrey, Nuevo León el 2 de Octubre de 1987, hija de Carlos Francisco Sandoval Coronado y Ludivina Montemayor Garza. Educación: Egresada de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido de Químico Farmacéutico Biólogo en 2009. Experiencia Profesional: Hospital San José Tec de Monterrey de Agosto a Octubre de 2008 y Hospital Clínica Nova de Enero a Mayo de 2009. ~ 115 ~