Evaluación de la viabilidad, maduración y efecto genotóxico en

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
MAESTRÍA EN BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN ANIMAL
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD, MADURACIÓN Y EFECTO GENOTÓXICO EN
OVOCITOS Y CÉLULAS DEL CÚMULO PORCINOS EXPUESTOS A SULFONATO
DE PERFLUOROOCTANO (PFOS) IN VITRO.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN ANIMAL
PRESENTA
BIÓLOGO EXPERIMENTAL: MARIO TETELTITLA SILVESTRE
DIRECTORA
DRA. YVONNE CLAUDINE DUCOLOMB RAMÍREZ
ASESORES
DR. JOSÉ MIGUEL BETANCOURT RULE
DR. MARIO ALTAMIRANO LOZANO
México D.F., 5 de Diciembre de 2014
MIEMBROS DEL COMITÉ DE TUTORES
DIRECTORA:
Dra. Yvonne Claudine Ducolomb Ramírez
Profesor Titular “C”
Laboratorio de Biología Celular
Departamento Ciencias de la Salud. División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Universidad Autónoma Metropolitana–Iztapalapa
Correo: duco@xanum.uam.mx
ASESORES:
Dr. José Miguel Betancourt Rule
Profesor Titular “C”
Laboratorio de Biología Celular
Departamento Ciencias de la Salud. División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Universidad Autónoma Metropolitana–Iztapalapa
Correo: bet@xanum.uam.mx
Dr. Mario Agustín Altamirano Lozano
Profesor Titular “C”
Unidad de Investigación en Genética y Toxicología Ambiental
Facultad de Estudios Superiores, Zaragoza. UNAM.
Correo: maal@unam.mx
ii
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Biología Celular S-252 de la
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa y el laboratorio de Genética
Toxicológica de la Facultad de estudios Superiores-Zaragoza campus II de la
Universidad Nacional Autónoma de México.
Este estudio fue apoyado por el CONACYT. Proyecto: CB-2012-01-180043; y beca
Otorgada por el CONACYT a Mario Teteltitla Silvestre (Num: 302939 CVU: 509499).
“El programa de la Maestría en Biología de la Reproducción Animal de la Universidad
Autónoma Metropolitana está incluido en el Programa Nacional de Posgrados de
Excelencia del CONACyT (PNPC) registro 003797”
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iv
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer enormemente a todas las personas que siempre me han apoyado.
A todas esas personas que me impulsaron a continuar con mis estudios y sobre todo
a las personas que jamás creyeron en mí y siempre me pusieron obstáculos en el
camino, ya que lejos de desanimarme me impulsaron a seguir adelante. Quiero
expresar mi gratitud a las siguientes personas:
Agradezco a la Dra. Yvonne Claudine Ducolomb Ramírez por dirigir el presente
trabajo de Maestría, el apoyo y la confianza depositada en mí, sus consejos y
paciencia.
Agradezco al Dr. José Miguel Betancourt R. por la confianza, el apoyo incondicional,
sus valiosos y sabios consejos en mi vida de estudiante y personal.
Agradecimiento a la Dra. María de los Ángeles Aguilar Santamaría
Agradezco a mi familia: a mis padres: la Sra. Virginia Silvestre Medina y el Sr. Mario
Teteltitla Anacleto por su apoyo incondicional, a mis hermanos: Nicolás, Cesáreo,
Josefina, Inés, José Luis y Jazmín que siempre creen en mí, a todos mis sobrinos y
sobrinas que me alegran la vida con sus pláticas los fines de semana.
Agradezco a mis compañeras y amigas de laboratorio, ya que su apoyo
incondicional, las pláticas, los consejos y sus críticas fueron importantes para la
realización de este trabajo, especialmente a la hoy Maestra Diana L. Flores M. por el
apoyo brindado en el laboratorio y visitas al rastro.
A mis mejores amigos con los aún tengo el privilegio de convivir y a los que se
encuentran lejos; gracias a todos por su apoyo, sus consejos, sus regaños y sus
reconocimientos por los logros obtenidos en mi vida académica y personal.
v
Agradezco al MVZ. Trinidad Sierra Guzmán, técnico de laboratorio por el apoyo
brindado en las visitas semanales al rastro para colectar los ovarios porcinos y al
Biol. Heriberto Hernández de la Cruz por el apoyo brindado con la técnica del ensayo
cometa.
Finalmente agradezco al rastro frigorífico los Arcos por la donación de los ovarios de
cerdas, material primordial para la realización de este trabajo.
vi
El tiempo jamás se detiene
Una tarde de verano se pierde como agua entre las manos
La inmensidad del universo me asusta
La tristeza del corazón me limita
El miedo a lo desconocido me detiene.
Sólo el movimiento de las flores me alegra la vida
La brisa de la mañana me alienta a seguir adelante
El viento impulsa mis sueños, mientras que sus ojos me intimidan
Espero que los recuerdos no se vuelvan jeroglíficos en una pared
olvidada.
El tiempo jamás se detendrá
Los sueños de una nueva aventura alimentan mi espíritu
La luz de su sonrisa no me permiten miran atrás
Los anhelos de una nueva vida emocionan mi corazón.
El ayer se fue y no existe más
El mañana siempre será el objetivo a conseguir
Hoy sólo queda aprovechar el momento de dicha
Sólo existe el presente, nada más importa.
MTS.
vii
RESUMEN
El PFOS es un producto sintético, su bioacumulación en los seres humanos altera el
metabolismo y la homeostasis del colesterol; en mujeres con altas concentraciones
plasmáticas de PFOS disminuyó la tasa de embarazos y en hombres, se relaciona
con problemas en la calidad del semen. Estudios recientes indican que el PFOS
puede
causar
daño
en
la
integridad
del
ADN de
células
somáticas
y
espermatozoides, pero no existen estudios que demuestren este efecto en gametos
femeninos. Por consiguiente, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto del
PFOS en la viabilidad, la maduración in vitro (MIV) y la integridad del ADN mediante
el ensayo cometa, tanto en ovocitos como en células del cúmulo (CC) expuestos a
este compuesto durante la MIV. Los complejos ovocitos-células del cúmulo (COCs)
se obtuvieron por punción folicular de ovarios de cerdas prepúberes. La MIV se llevó
a cabo en medio TCM-199 suplementado con diferentes concentraciones (0, 12.5,
25, 50, 100, 150 y 200 µM) de PFOS durante 44 h. La viabilidad de los ovocitos, se
determinó mediante la tinción con MTT y la de las CC con azul tripano. Para evaluar
la MIV, los ovocitos se tiñeron con Bisbenzamide (Hoechst 33258), observando la
presencia de la metafase II y el primer cuerpo polar. Para detectar el efecto
genotóxico, se realizó el ensayo cometa con una concentración subletal del
compuesto (23 µM) utilizando como control positivo H2O2 (200 µM). Previamente se
descartó el efecto del diluyente (DMSO 1%). En este estudio se determinó que la
concentración letal 50 (CL50) para los ovocitos fue de 31 µM y para las células del
cúmulo fue de 90 µM. La concentración de inhibición de la maduración 50 (CIM50) fue
de 11 µM. Para determinar el efecto genotóxico se evaluaros tres parámetros:
número de céluas con daño, longitud de las caudas y el porcentaje de ADN en
caudas. Los resultados indican que en las CC un ¼ de la CL50 (23 µM) presentó un
efecto genotóxico significativo en dos parámetros evaluados: mayor número de
células con daño y longitud de caudas de las mismas. En los ovocitos no se pudo
determinar el efecto genotóxico. Los datos obtenidos muestran el efecto adverso del
PFOS en la maduración, la viabilidad y la integrdad del ADN. Las concentraciones
viii
empleadas en este estudio están dentro del rango reportado en condiciones
fisiológicas en trabajadores laboralmente expuestos (26 µM de PFOS). Se requiere
modificar las técnicas del ensayo cometa en ovocitos que permitan evaluar el efecto
genotóxico.
ix
ABSTRACT
PFOS is a synthetic product; its bioaccumulation in humans alters metabolism and
cholesterol homeostasis. In women with high plasma concentrations of PFOS,
pregnancy rates are decreased and in men, are related to problems in semen quality.
Recent studies indicate that PFOS can damage DNA integrity in somatic cells and
sperm, but there are no studies that demonstrate this effect in female gametes.
Therefore the aim of the present study was to determine the effect of PFOS on
viability, in vitro maturation (IVM) and DNA integrity by the comet assay in oocytes
and cumulus cells (CC) exposed to this compound during IVM. Complex oocytecumulus cells (COCs) were obtained by puncturing ovarian follicles of prepubertal
sows. IVM was performed in TCM-199 medium supplemented with different
concentrations of PFOS (0, 12.5, 25, 50, 100, 150 and 200 µM) for 44 h. The oocyte
viability was determined by MTT staining and CC by trypan blue. To evaluate IVM,
oocytes were stained with Bisbenzamide (Hoechst 33258) to observe oocytes in
metaphase II and the first polar body. Before all evaluations, the effect of diluent (1%
DMSO) was discarded. To evaluate the genotoxic effect, the comet assay was
performed. It was used a sublethal concentration of the compound (23 µM) and as a
positive control H2O2 (200 µM). In this study it was determined that the lethal
concentration 50 (LC50) for oocytes was 31 µM and for CC was 90 µM. The
concentration of maturation inhibition 50 (MIC50) was 11 µM. To determine the
genotoxic effect three parameters were evaluated: number of damaged cells, length
tails and percentage of DNA in tails. The results indicate that in CC, ¼ of the LC50 (23
µM) showed a significant genotoxic effect in two parameters: increased number of
damaged cells and length tails. In oocytes, the use of the comet assay was unable to
determine the genotoxic effect. Therefore, results obtained demonstrate the adverse
effects of PFOS in viability, oocytes maturation and DNA integrity in CC. The
concentrations used in this study are within the range reported in physiological
conditions in occupationally exposed workers (26 µM PFOS). As perspective some
adjustments are necessary to improve the comet assay in order to assess the
genotoxic effect in oocytes.
x
Índice
1. Introducción…………………………….……………………………………………..1
1.1 Importancia Reproducción ……….……………………………………………..1
1.2 Gametogénesis…………………….……………………………………………..2
1.3 Foliculogénesis……………………….………………………………………..…2
1.4 Maduración del ovocito……………….………………………………………....4
1.5 Toxicología………………………………….………………………………….....6
1.6 Toxicología reproductiva………………………….……………………………..7
1.7 Métodos de evaluación de toxicidad…………….……………………………..7
1.8 Importancia del modelo porcino ……………………………………………...10
1.9 Daño al ADN………………………………………………………… ………….11
1.10 Técnicas de evaluación de genotóxicidad….………………………………12
2. Antecedentes………………………………………………………………….…….12
2.1 Compuestos perfluorados (PFCS)……………………………………..……..12
2.2 Efecto de los PFCS en la reproducción……………………………………....16
3. Justificación………………………………………………………………………….17
4. Preguntas de investigación………………………………………………………...17
5. Hipótesis…………………………………………………………………………......18
6. Objetivo general………………………………………………………………….....18
6.1 Objetivos particulares…………………………………………………………..18
7. Metodología……………………………………………………………...……….....19
7.1 Colecta de los complejos ovocitos-células de cúmulo (COCs)…………....19
7.2 Maduración in vitro (MIV) ………………………………………….………….20
7.3 Evaluación de la viabilidad y maduración …………………………..……....21
7.4 Evaluación del daño al ADN ….……….............................................…......24
7.4.1 Preparación de laminillas con ovocitos y CC para el ensayo
cometa……………………………………………………………… ...........…..24
7.4.2 Lisis de los ovocitos y las células del cúmulo.…………....................25
7.4.3 Electroforesis unicelular en gel (ensayo cometa)…………….…..…..26
xi
7.5 Tratamiento con PFOS…………………………………………………………27
8. Análisis estadístico………………………………………………………………….28
9. Resultados………………………………………………………………… ………..29
9.1 Efecto del diluyente (DMSO) en la viabilidad de los ovocitos…… ………..29
9.2 Efecto del PFOs en la viabilidad de los ovocitos…………………………....32
9.3 Efecto del diluyente (DMSO) en la maduración de los ovocitos… ………..36
9.4 Efecto del PFOs en la MIV…………………………………………….……....39
9.5 Efecto del diluyente (DMSO) en la viabilidad de las CC………….. ……….43
9.6 Efecto del PFOs en la viabilidad de las CC…………………………..……...44
9.7 Efecto del PFOS sobre el ADN después de la MIV mediante la prueba de
cometa…………………………………………………………… ……………...48
9.7.1 Daño al ADN en las CC………………………………………………….48
9.7.2 Daño al ADN en los ovocitos……………………………………...…….52
10. Discusión..…………………………………………………………………….…….53
11. Conclusiones………………………………………………………….……...…….61
12. Perspectivas……………………………………………………………………..….62
13. Bibliografía……………………………………………………………………….....63
14. Anexo……………………………………………………………………….…....…75
14.1 Metodología……………..………………… …………………….………..75
14.2 Resultados………………….…………………………………………......76
14.3 Medios de cultivo……………………..……………….…………….…….79
14.3.1 Preparación de las hormonas…………………………...……..81
14.3.2 Preparación del factor de crecimiento epidérmico (EGF) …..81
14.4 Soluciones para la electroforesis unicelular en gel (ensayo cometa).82
xii
ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ATSDR: Agencia para sustancias tóxicas y el registro de enfermedades.
CGP: Células germinales primordiales.
CCOs: Complejo ovocito-células del cúmulo.
CG: Células de la granulosa
GC: Gránulos corticales
CL50: Concentración letal 50
CIM50: Concentración de inhibición de la maduración 50
DMSO: Dimetilsulfóxido
EGF: Factor de crecimiento epidermal
EPA: Agencia de Protección Ambiental
FSH: Hormona Folículo Estimulante
LH: Hormona Luteinizante
PFCs: Compuestos perfluorados
PFOA: Ácido perfluorooctanoico
PFNA: Ácido perfluorononanoico
PFHxS: Perfluorohexano sulfónico
PFOs: Sulfonato de perfluorooctano
PVA: Polyvinyl alcohol
SEMARNAT: Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (México)
MIV: Maduración in vitro
MI: Metafase I
MII: Metafase II
VG: Vesícula germinal
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“Evaluación de la viabilidad, maduración y efecto genotóxico en ovocitos y
células del cúmulo porcinos expuestos a sulfonato de perfluorooctano (PFOS)
in vitro”
1. Introducción.
1.1 Importancia de la reproducción.
Los seres vivos se caracterizan por presentar un ciclo de vida bien definido, nacen,
crecen, se reproducen y mueren. Cada una de las etapas anteriores involucra una
serie de cambios fisiológicos y conductuales, entre otros. Todos los seres vivos
poseen la capacidad de reproducirse, y pueden hacerlo mediante dos tipos de
reproducción; la asexual y la sexual. La reproducción asexual consiste en la
producción de crías sin la necesidad de la unión de dos gametos, este tipo de
reproducción es común en microorganismos, plantas y animales de organización
simple como las planarias y estrellas de mar. La reproducción sexual, involucra la
unión de los gametos masculino y femenino. Generalmente los gametos provienen
de dos progenitores de la misma especie, dando origen a una recombinación
genética. Antes de la unión de los gametos se requieren de varios procesos como la
gametogénesis y maduración de los mismos, estos procesos son altamente
especializados con la formación de gametos de buena calidad como objetivo final
(Bachtrog et al., 2014).
1
1.2 Gametogénesis.
La gametogénesis es un proceso mediante el cual se forman los gametos masculinos
y femeninos. La ovogénesis es el proceso de formación de los ovocitos, este proceso
es discontinuo y se inicia en la vida intrauterina, después de los primeros días post
fecundación. Las células germinales primordiales (CGP) se encuentran en el
epiblasto (capa externa principal del blastocisto o blástula) de donde posteriormente
migran al endodermo del saco vitelino y se multiplican por mitosis. Finalmente las
CGP del endodermo del saco vitelino pasan a la futura gónada indiferenciada, donde
se van a diferenciar en ovogonias en los ovarios y espermatogonias en el testículo
(Werven y Amon, 2011). En los humanos, al final del tercer mes de gestación, las
ovogonias ya se encuentran rodeadas de una capa de células epiteliales planas
precedentes de la superficie del ovario. Varios millones de ovogonias inician la
primera división meiótica y aproximadamente en el 7o mes, cada célula se encuentra
en la etapa de diploteno. En esta etapa los ovocitos primarios entran en una fase de
detención de la primera división meiótica hasta alcanzar la pubertad, donde por la
acción de las hormonas luteinizante (LH) y folículo estimulante (FSH) se reanuda la
meiosis, hasta su maduración (Gilbert, 2005).
1.3 Foliculogénesis.
Las hembras adultas de los mamíferos poseen ovarios con una reserva de folículos
mayoritariamente inactivos que se desarrollaron durante la vida fetal o poco tiempo
después del nacimiento. Algunos de estos folículos iniciarán su crecimiento
continuamente hasta que esta reserva se agote (Hatzirodos et al., 2014). El
crecimiento del folículo primordial culmina con la ovulación o su degeneración, como
ocurre con la mayoría. Dependiendo de la especie, los folículos de mayor tamaño
son los encargados de la mayor producción de hormonas como los estrógenos, que
2
son sintetizados por los ovarios, hasta el momento en el cual el pico preovulatorio de
LH aumenta, con lo cual los estrógenos disminuyen (Hafez et al., 2002).
Durante la foliculogénesis el ovocito mantiene una estrecha relación con las células
de la granulosa (CG), también llamadas células del cúmulo (CC), que lo rodean
formando una estructura denominada complejo ovocito células de cúmulo (CCOs).
Las CG mantienen una estrecha comunicación bidireccional con el ovocito, esta
comunicación es crucial para la maduración y la calidad del ovocito (Devjak et al.,
2012). Las CG juegan un papel importante en el desarrollo del ovocito y el aporte de
nutrientes, también participan en el mantenimiento del arresto meiótico, la supresión
de la actividad transcripcional y la inducción de la maduración meiótica y
citoplasmática del ovocito. El ovocito por su parte regula el desarrollo y actividad de
las CG durante todo el curso de la foliculogénesis (Su et al., 2009).
De manera particular en las hembras de cerdo, el reclutamiento de los folículos es
continuo, el desarrollo de los folículos pequeños es promovido por los folículos
grandes o dominantes, y el crecimiento final ocurre en un lapso que varía entre los
12 y 34 días, la duración total del crecimiento folicular de más de 20 días y quizás
hasta de 6 meses. Los diversos fenómenos que están implicados en el crecimiento,
maduración y luteinización del folículo de Graff (folículo ovárico maduro) son
dependientes de diversos patrones específicos de secreción de hormonas como la
FSH y LH, además de otras hormonas como las prostaglandinas. El papel de la
hormona FSH es muy amplio, ya que participa en la formación del antro, estimula la
mitosis de las CC y la formación del líquido folicular, y además induce la sensibilidad
de las CC hacia la LH al incrementar el número de receptores para esta hormona.
(Hafez et al., 2002). En el porcino los receptores para la LH aumentan de 300 en los
folículos pequeños a 10 000 en los folículos preovulatorios grandes; este incremento
de los receptores para LH preparan la luteinización de las CC en respuesta a la
oleada de LH para que se estimule la ovulación (Hafez et al., 2002).
3
1.4 Maduración del ovocito.
La maduración de los ovocitos se divide en dos etapas: la primera, incluye un periodo
de crecimiento, durante el cual el ovocito sintetiza y almacena grandes cantidades de
ARNm latentes importantes para que el ovocito reinicie la meiosis I, aumenta el
citoplasma, se forma la zona pelúcida y ocurre la proliferación del epitelio folicular y
tejido adyacente. Al final del periodo de crecimiento tiene lugar la segunda etapa en
la que ocurren la maduración nuclear (compuesta de dos divisiones meióticas) y la
maduración citoplasmática, las cuales son prerrequisitos fundamentales para que se
lleve a cabo la fecundación y el desarrollo embrionario (Hafez et al., 2002).
En la mayoría de los mamíferos, la ovogénesis se inicia en la etapa embrionaria
cuando las ovogonias después de proliferar por mitosis, originan al ovocito primario
en el cual se lleva a cabo la primera división meiótica hasta la profase en el estadio
de diploteno, en esta etapa los ovocitos quedan detenidos hasta el inicio de la
pubertad. En esta etapa al núcleo del ovocito se le denomina vesícula germinal (VG).
Durante la infancia esta etapa se mantiene hasta llegar a pubertad cuando por la
influencia de las hormonas gonadotropicas, FSH y LH, se reanuda la primera división
meiótica. Durante este evento se produce la ruptura de la VG y la cromatina que se
encontraba difusa se condensa para formar los cromosomas y proseguir a la
metafase I (MI). Al final de esta división se origina el primer cuerpo polar, que se
expulsa y se inicia la segunda división meiótica hasta la metafase II (MII); en esta
etapa los ovocitos quedan detenidos por segunda vez y es hasta la fecundación
cuando se concluye la segunda división meiótica (Betancourt et al., 2003) La
maduración de los ovocitos se produce en ausencia de transcripción y es totalmente
dependiente de cascadas de cinasas/fosfatasas y la activación secuencial de la
traducción de los mRNAs maternos acumulados durante la profase I (Verlhac et al.,
2010).
4
La maduración citoplasmática, es un proceso muy complejo que implica una serie de
acontecimientos no relacionados directamente con el progreso de la meiosis, pero
que preparan al ovocito para la fecundación y el desarrollo embrionario. Durante la
maduración citoplasmática se produce una redistribución de las mitocondrias a una
posición perinuclear, que es necesaria para el progreso de la maduración (De los
Reyes, 2011). Por su parte los gránulos corticales (GC) que se forman a partir del
complejo de Golgi y del retículo endoplásmico, y que están constituidos
principalmente por glicoproteínas y enzimas hidrolíticas, migran hacia la periferia del
ovocito, aumentan en número y se sitúan debajo de la membrana plasmática en
forma de monocapa, circunstancia que será fundamental para el bloqueo de la
polispermia (Yanagimachi, 1994). La maduración citoplasmática implica además,
reprogramación de la síntesis proteica. Parte del ARNm que había sido almacenado
durante la fase de crecimiento comienza a transcribirse, sintetizándose nuevas
proteínas que serán esenciales en el avance de la meiosis, la regulación de la
penetración espermática y la descondensación de la cabeza del espermatozoide.
Entre estas proteínas, se encuentra el factor de crecimiento del pronúcleo masculino,
que será esencial para la formación del pronúcleo masculino tras la penetración del
espermatozoide (Yanagimachi, 1994; Martínez, 2002).
Los procesos anteriormente descritos son esenciales para la formación de los
gametos de buena calidad, cualquier alteración de ellos por acción de algún agente
externo podría alterar los procesos involucrados en la reproducción de los individuos.
5
1.5 Toxicología.
La palabra Toxicología desde el punto de vista etimológico deriva de dos palabras
griegas: toxikon (veneno) y logos (tratado), que quiere decir “Ciencia de los
venenos”. Hoy en día el concepto se ha modificado, ya que esta ciencia se extiende
a un campo mucho más amplio, y actualmente podemos encontrar algunas
definiciones más exactas como: “Ciencia centrada en el estudio, descripción y
comprensión de las interrelaciones entre las sustancias químicas y los organismos,
así como de sus efectos sobre los seres vivos” o “Ciencia que estudia los efectos
nocivos originados por agentes químicos sobre los seres vivos, los mecanismos que
dan lugar a tales perturbaciones, los medios y modos de contrarrestarlas, así como
los procedimientos para detectar e identificar dichos agentes y valorar su toxicidad”
(Bello et al., 2001).En la actualidad la toxicología se define como la ciencia que se
ocupa del estudio integral de las sustancias tóxicas, esto incluye el origen y
propiedades, actividad tóxica y características de las intoxicaciones, relaciones entre
estructura química y actividad tóxica, así como aspectos cualitativos y cuantitativos
de la actividad tóxica. Entre los aspectos cualitativos se toman en cuenta la
exposición al tóxico, (toxicocinética y toxicodinámica), la biotransformación del tóxico,
sus consecuencias inmediatas y, las interacciones entre el tóxico y el receptor. Por
otra parte, dentro de los aspectos cuantitativos de la actividad tóxica es importante:
a) considerar si los efectos presentan un comportamiento relacionado con la dosis o
relacionado con el tiempo de exposición (efectos agudos y efectos crónicos), b)
establecer los umbrales sin efecto, suma de efectos, sinergismos, y c) encontrar
selectividad de acción, terapia antitóxica y protección general ante la intoxicación
(Bello et al., 2001).
6
1.6 Toxicología reproductiva.
La toxicología reproductiva es la rama de la toxicología que estudia los efectos
deletéreos producidos por xenobióticos en la reproducción, esto incluye el estudio de
los transtornos sobre la fertilidad de los padres y sobre el desarrollo de los hijos
(Repetto, 1997). Los xenobióticos pueden ser agentes químicos naturales o
sintéticos, biológicos y físicos (Bonilla et al., 2001). Los trastornos tóxicos en la
fertilidad abarcan efectos en la libido, comportamiento sexual, espermatogénesis,
ovogénesis, actividad hormonal, el proceso de fertilización y el desarrollo del huevo
fecundado hasta la fase de implantación (Caméan y Repetto, 2006).
1.7 Métodos de evaluación de toxicidad.
Actualmente los seres humanos estamos expuestos a un gran número de sustancias
que se encuentran en productos de uso cotidiano como los conservadores de
productos no perecederos, cosméticos, partículas en el aire, residuos de plaguicidas
en los productos del campo, por mencionar algunos. Hasta el momento se tiene
documentada la existencia de más de 89 millones de sustancias químicas orgánicas
e inorgánicas únicas, tales como aleaciones, compuestos de coordinación,
minerales, mezclas, polímeros y sales, entre otros (CAS, 2014). Los organismos
expuestos a dichas sustancias pueden presentar diferentes respuestas fisiológicas,
respuestas que están en función de la solubilidad, biodisponibilidad y concentración
del agente químico, así como del potencial tóxico, duración de la exposición y la
sensibilidad del organismo (Connon et al., 2012).
En la actualidad existen métodos que permiten evaluar el efecto de un tóxico en los
organismos. Los estudios in vivo son modelos ampliamente utilizados observando
directamente a los animales y a los humanos ocupacionalmente expuestos, además
de éstos existen algunas alternativas a la experimentación con animales, estos son
7
los modelos in vitro en los cuales se aíslan tejidos o células en condiciones de
laboratorio, se incuban y sirven para estudiar los mecanismos de acción de un
determinado agente (Vinardell, 2007).
En general, los métodos que se aplican para la evaluación de toxicidad de una
sustancia química se pueden clasificar en dos grandes grupos.
Primer
grupo:
ensayos
para
evaluar
efectos
globales
en
animales
de
experimentación. Dentro de este grupo se incluyen los siguientes tipos (Bello et al.,
2001)
A) Pruebas de toxicidad aguda: esta prueba permite determinar parámetros
toxicológicos como la dosis mínima mortal o las dosis letal 100 (DL100) y la 50
(DL50). El compuesto se administra una sola vez, con un periodo de
observación generalmente bastante corto y los resultados sirven de punto de
partida para fijar las dosis a utilizar en pruebas posteriores.
B) Ensayos de toxicidad prolongada o subcrónica: la prueba abarca la décima
parte del tiempo de vida del organismo. El compuesto se administra en varias
dosis de forma regular o bien de manera irregular con la alimentación, el
objetivo es evaluar el efecto de una posible acumulación del agente tóxico.
C) Estudios crónicos de toxicidad a largo plazo: la prueba abarca al menos dos
tercios de vida del animal y permite evaluar la forma de toxicidad,
regularmente es acompañada por otras pruebas como la detección de una
actividad cancerígena potencial.
D) Estudios bioquímicos: esta prueba proporciona información sobre las
transformaciones metabólicas y la identificación de metabolitos, esto
contribuyen a explicar los mecanismos de toxicidad.
8
Segundo grupo: resulta como complemento del grupo anterior, ya que esos
estudios no necesariamente son suficientes para evaluar el conjunto de efectos
tóxicos derivados de la actividad biológica de una sustancia. Los estudios de este
grupo responden a la necesidad surgida por los distintos usos que se hacen de
algunos compuestos y pueden requerir la estimación de los márgenes de seguridad
vinculados con su empleo.
A) Estudios de los efectos sobre las funciones de reproducción: comprende los
estudios sobre efectos embriotóxicos, no sólo dentro de una etapa fetal
teratogénica, sino también en estadios anteriores y posteriores.
B) Estudios sobre potencialidades mutagénicas: investiga la posible incidencia
sobre el genoma.
C) Estudios sobre carcinogenicidad: valora la capacidad de algunas sustancias
para promover el desarrollo de tumores.
D) Estudios sobre comportamiento: hacen referencia a posibles manifestaciones
neurotóxicas propias de algunas sustancias.
E) Estudios inmunológicos: ponen de manifiesto posibles alteraciones en el
funcionamiento del sistema inmune.
F) Estudios sobre los efectos de potencialización: son pruebas que ponen de
manifiesto la potencialización de los efectos tóxicos de ciertas sustancias,
cuando la ingestión de las mismas coincide con determinados estados
fisiológicos de salud.
La finalidad de estas pruebas es la de obtener los criterios mínimos de seguridad
para el manejo de los productos químicos. (Bello et al., 2001).
9
1.8 Importancia del modelo porcino.
A principios del siglo XX se empezaron a desarrollar numerosos modelos
experimentales, siendo el perro, la rata y ratón los más utilizados; a partir de
entonces los modelos experimentales han contribuido enormemente al desarrollo de
la ciencia. Hoy en día se pueden encontrar otros modelos de investigación como son
los lagomorfos, primates y porcinos. El modelo porcino es ampliamente utilizado en
investigación científica por ventajas crecimiento rápido y reproducción numerosa y
por su anatomía y fisiología muy similares a las del ser humano (Medina et al., 2008).
En los cerdos hembra la pubertad inicia cuando se presenta el primer ciclo estral y
ocurre la primera ovulación, aproximadamente a los 7 meses de edad, con un peso
alrededor de 77 kg. La ovulación inicia con el proceso del desarrollo folicular, y
comprende un primer proceso de selección o reclutamiento de algunos folículos de
la población total que se encuentra en el ovario y que potencialmente pueden ser
ovulados, y un
segundo proceso en el que se elige a aquellos folículos que
culminarán con la ovulación (Williams et al., 2010).
La especie porcina se caracteriza por tener un gran número de folículos ováricos en
comparación con otras especies. Durante la fase lútea, se pueden observar de 30 a
90 folículos de 1 a 2 mm y de 30 a 50 de 2 a 7 mm de diámetro respectivamente.
Durante la fase folicular, el número de folículos medianos y pequeños disminuye
considerablemente, quedando aproximadamente 20 folículos, de los cuales la
mayoría ovularán. Los folículos en los que se presentará la ovulación aumentan su
desarrollo entre los 14 y 16 días del ciclo estral (Hafez et al., 2002).
Los folículos ovulatorios son reclutados a partir de la reserva de los antrales que se
desarrollan durante la fase lútea del ciclo, en la cual se observan folículos de
aproximadamente 5 mm. Hacia el final de la fase lútea, los niveles de progesterona
10
descienden y los niveles crecientes de FSH y LH producen el reclutamiento de estos
folículos. Los de tamaño pequeño no reaccionan ante este reclutamiento por no
presentar suficientes receptores a FSH y LH, y
por consiguiente, terminan en
atresia. (Williams et al., 2010). En la cerda en el primer estro se ovulan de 8 a 10
ovocitos, en el tercer estro de 12 a 24 ovocitos y en adultas de 17 a 44 ovocitos,
siendo este un modelo adecuado para la colecta de ovocitos.
1.9 Daño al ADN.
El daño a nivel genético se define como la alteración, a distintos niveles, de la
información contenida en el ADN. Este deterioro implica cambios o eliminación de
bases nitrogenadas, incluyendo modificaciones en genes o grupos de genes,
también puede implicar la pérdida de fragmentos de cromosomas (deleciones) o la
eliminación de cromosomas completos (aneuploidias) o grupos de cromosomas en
las células somáticas o germinales. Estas alteraciones, también llamadas
mutaciones, provocan efectos importantes en los organismos. Cuando las
mutaciones ocurren en las células germinales se relacionan principalmente con
diversos trastornos durante el desarrollo fetal, los cuales derivan en defectos al
nacimiento o en casos extremos muerte del embrión en diversas etapas del
desarrollo. El efecto genotóxico en los organismos puede ser causado por la
exposición a sustancias contaminantes. Las células eucariotas de manera natural
pueden reparar algunos daños al ADN, mediante mecanismos entre los que se
encuentran: la reparación de apareamientos incorrectos de bases nitrogenadas,
reparación por escisión de base o de nucleótido, reparación de roturas bicatenarias y
síntesis de ADN de translesión (Watson et al., 2008). En las células donde no se
repara el daño pueden ocurrir procesos como la senescencia y la apoptosis. Sin
embargo si las células somáticas dañadas se siguen dividiendo, pueden ocurrir
alteraciones en las funciones metabólicas o bien proliferación celular desmesurada y
desordenada produciendo transformaciones malignas. Si el daño es irreversible y se
11
presenta en células germinales las alteraciones son heredadas a la siguiente
generación y son causa de padecimientos genéticos (SEMARNAT, 2012).
1.10 Técnicas de evaluación de genotoxicidad.
Actualmente existen varias técnicas para medir el daño genético, entre las cuales se
encuentran pruebas bioquímicas, moleculares, espectrofotométricas y pruebas
citogenéticas, basadas en la sedimentación del ADN dañado. Sin embargo estas
técnicas pueden ser costosas o poco sensibles. Las pruebas como el ensayo de
micronúcleos por bloqueo de la citocinesis y el ensayo cometa son dos alternativas,
ya que cada vez más se utilizan de manera cotidiana por su sencillez y excelentes
resultados (SEMARNAT, 2012).
El ensayo cometa es considerado una técnica altamente sensible para evaluar el
daño y la reparación del ADN en cualquier tipo celular eucariota. Esta técnica permite
detectar rupturas de cadena simple y sitios sensibles al álcali que se originan durante
la reparación por escisión de bases y de nucleótidos dando lugar a la formación de la
cola del cometa constituida por los fragmentos de ADN dañados (Cossio et al.,
2004).
2. Antecedentes.
2.1 Compuestos perfluorados (PFCS).
Los PFCS son un grupo de productos químicos que no se encuentran naturalmente
en el medio ambiente y se han utilizado desde la década de 1950. La estructura de
estos productos químicos está constituida por una cadena de carbonos rodeados por
átomos de flúor y un grupo ácido o amida situado en el extremo de la cadena de
12
carbonos. Son compuestos muy estables, hidrófobos y oleófobos
(Agencia para
Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades: ATSDR, 2009). Estas
propiedades únicas han dado lugar a un uso amplio de los PFCS, por ejemplo: en
formulaciones protectoras de cartón, alfombras y productos de cuero, en la industria
textil como repelente de agua y grasa. Los PFCS se han utilizado también en las
espumas contra incendios y en la producción de recubrimientos antiadherentes en
utensilios de cocina y algunas prendas de vestir (DRAFT, 2011).
Los PFCS con mayor volumen de producción son el sulfonato de perfluorooctano
(PFOS) y el ácido perfluorooctanoico (PFOA). Dentro de las mismas familias los
compuestos con más alta producción son el sulfonato de perfluorohexano (PFHxS),
un miembro de la misma clase química que PFOS, y el ácido perfluorononanoico
(PFNA), que es un miembro de la misma clase química que PFOA. Sólo en EUA la
producción reportada de PFOS y PFOA en 2002 fue de 15.000 y 500.000 libras
respectivamente (DRAFT, 2011).
El PFOS tiene una formula molecular C8F17SO3, comúnmente se encuentra como
una sal de potasio; está constituido por una cadena carbonada totalmente fluorada,
que se utiliza como una sal o se incorpora a polímeros más grandes. PFOS y sus
compuestos más cercanos, son miembros de la gran familia de sustancias del
sulfonato de perfluoroalquilo (PFAS). La persistencia en condiciones extremas de
esta substancia la hace adecuada para aplicaciones en utensilios que resisten alta
temperatura y para aplicaciones en contacto con ácidos o bases fuertes. Los enlaces
carbono-flúor son muy fuertes, lo que causa la persistencia de esta sustancia en el
ambiente (ATSDR, 2009). Se descomponen muy lentamente en el aire y suelo;
pueden pasar del suelo al agua subterránea y pueden transportarse a grandes
distancias por las corrientes oceánicas hasta los lugares más remotos. Se han
detectado niveles importantes de PFCS en lugares abiertos como el Atlántico Norte,
en donde las concentraciones reportadas van de 130-650 pg/L. En el Mar de
13
Groenlandia, las concentraciones de PFCS oscilaron entre 45 y 280 pg/L (Zhao et al.,
2012).
En los últimos años se han incrementado los estudios en animales y humanos
expuestos a los PFCS ya que existen evidencias sobre una acumulación de estos
compuestos en los organismos (Cassone et al., 2012). Los PFCS pueden ingresar al
cuerpo a través de los pulmones cuando se respira aire que contiene estos
compuestos, hay poca información sobre la velocidad, la cantidad y el PFCS que
más entra por esta vía. Puede ingresar a través del tracto digestivo, mediante el
consumo de alimentos o agua contaminada, o bien por la piel cuando se tiene
contacto con polvos, aerosoles o líquidos. En la figura 1 se ilustran las posibles vías
de absorción de algunos tóxicos. Es posible que cantidades pequeñas ingresen al
cuerpo a través de la piel, una vez dentro del organismo, el PFOS se transporta
unido a la albumina y se bioacumula en órganos como; hígado, riñón, por mencionar
algunos (Governini et al., 2011; Kato et al., 2011). Los PFCS tienden a permanecer
sin cambios durante largos periodos; en los humanos se reportan hasta 4 años para
el descenso de las concentraciones en el plasma sanguíneo. En los EUA los PFCS
encontrados en plasma sanguíneo en la mayoría de los ciudadanos son el PFOA y el
PFOS (Shankar et al., 2011). Las vías de eliminación de los PFCS son
principalmente por la orina, también se ha observado que la leche materna puede ser
otra vía de eliminación y a su vez puede contribuir a la exposición de los lactantes a
los PFCS, ya que se han detectado concentraciones importantes de estos
compuestos (Goosey et al., 2012).
14
Figura 1. Posibles rutas de penetración de algunos compuestos tóxicos y su
distribución en un organismo (Bello et al., 2001).
Las altas concentraciones de PFCS encontradas en plasma de animales y humanos
se han relacionado con diversos fenómenos que afectan a los individuos expuestos.
En roedores estudios recientes han mostrado posibles efectos sobre el desarrollo, la
reproducción, la neuroendocrinología y aparición de tumores en el hígado de rata
(EPA, 2012). En los humanos las altas concentraciones de PFCS se han relacionado
con diversos fenómenos adversos ya que la bioacumulación de PFOS puede alterar
el metabolismo del colesterol o la homeostasis (Nelson et al., 2010).
15
2.2 Efecto de los PFCS en la reproducción.
En mujeres, el PFOS, produce alteraciones en el ciclo menstrual (Fei et al., 2009), y
una disminución en la tasa de embarazos (Jacquet et al., 2012). Governini et al.,
(2011), reportaron la presencia de PFCS en fluido folicular con una concentración de
aproximadamente 13 ng/mL (0.026 µM), que disminuyó la tasa de fertilización.
En los hombres el PFOS se ha relacionado con problemas en la calidad de semen,
como defectos en la morfología de los espermatozoides (Toft et al., 2012), además
de daños a la integridad del ADN (Joensen et al., 2009).
Estudios realizado con embriones de hámster demostraron que los PFCS afectaron
la morfología cuando las hembras fueron expuestas a éstos durante la gestación,
observándose una disminución en la masa corporal al nacimiento (Jacquet et al.,
2012), y un descenso en el crecimiento de los órganos y el esqueleto de los fetos de
roedores expuestos (Fei et al., 2008).
16
3. Justificación.
El uso indiscriminado de los PFCS ha provocado una amplia distribución de estos
compuestos en todo el mundo; hay reportes que indican que se pueden encontrar en
mar abierto y bioacumularse en los organismos de vida libre y humanos.
En las mujeres la exposición a los PFCS se ha relacionado con abortos e infertilidad.
La maduración de los ovocitos es un evento necesario para que se lleve a cabo la
fertilización y el subsecuente desarrollo embrionario y cualquier alteración en este
proceso podría interferir en la gestación, por lo que es de importancia determinar el
efecto que estos compuestos puedan tener en la viabilidad y la maduración del
COCs
Se ha observado que los PFCS dañan la integridad del ADN de los espermatozoides,
por lo que es importante evaluar si estos compuestos inducen este tipo de efecto en
los ovocitos y las CC.
4. Preguntas de investigación.
¿El PFOS afectará la viabilidad y la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos
porcinos?
¿El PFOS tendrá efecto genotóxico en los ovocitos y las CC?
17
5. Hipótesis.
La exposición de los COCs al PFOS durante la MIV afectará la viabilidad, la
maduración y provocará daño en el ADN en los ovocitos y las CC.
6. Objetivo general.
Evaluar el efecto del PFOS en la viabilidad, la maduración y la integridad del ADN de
los ovocitos y las CC expuestos a este compuesto durante 44 h de MIV.
6.1 Objetivos particulares.
 Determinar la concentración letal 50 (CL50) en ovocitos y CC expuestos a
PFOs durante la MIV.
 Determinar la concentración de inhibición de la maduración 50 (CIM50) en
ovocitos expuestos a PFOS durante la MIV.
 Evaluación de daño en el ADN en ovocitos y CC en concentraciones
subletales.
18
7. Metodología.
Todos los compuestos empleados fueron de marca Sigma (St. Louis, MO), a menos
que se indique otra diferente. La MIV de los COCs porcinos y los medios de cultivo
se realizaron de acuerdo con el método de Abeydeera et al., (1998).
7.1 Colecta de los Complejos Ovocitos-Células del Cúmulo (COCs).
Los ovarios se colectaron de cerdas prepúberes recién sacrificadas en el rastro (los
Arcos, los Reyes, Edo. de México) y se transportaron en un tiempo no mayor a 2 h al
laboratorio a una temperatura de 25 oC, en solución de Na Cl al 0.9% a un pH de 7.3
a 7.4. Una vez en el laboratorio se lavaron tres veces con la misma solución. Se
puncionaron los folículos que midieron de 3 a 6 mm de diámetro (anexo 14.1 a), el
fluido folicular se depositó en un tubo de 50 mL y se dejó sedimentar por 20 min para
favorecer la formación del paquete celular. El sobrenadante se desechó y al paquete
celular se le adicionaron 15 mL de medio modificado de Tyrode suplementado con
lactato de sodio, HEPES (2.38 g/L) y PVA (0.29 g/L) (TL-HEPES-PVA) a un pH de
7.3 a 7.4 y se dejó sedimentar durante 15 minutos; este procedimiento se repitió dos
veces. Finalmente el paquete celular se depositó en una caja Petri de 90 mm de
diámetro y se agregaron 20 mL del mismo medio.
Utilizando un microscopio estereoscópico (Olympus SZ60, Olympus Optical, Japón)
se aspiraron los COCs con una pipeta Pasteur de vidrio estéril, adelgazada de forma
manual mediante la exposición a la flama de mechero, de tal manera que los COCs
pasaran libremente a través del diámetro de ésta. Se tomaron únicamente los COCs
constituidos por ovocitos con citoplasma uniforme y granular y rodeados por más de
tres capas de CC (Anexo 14.1 b). La selección de los COCs se muestra en la figura
2.
19
Figura 2. Imagen del COCs de buena calidad antes de la MIV. Los ovocitos
presentan citoplasma con color uniforme y están rodeados de manera regular por
más de tres capas de CC.
7.2 Maduración in vitro (MIV).
Los COCs seleccionados se lavaron 3 veces en 3 diferentes gotas de de 500 µL de
medio de maduración TCM-199 con sales de Earle, bicarbonato de Sodio (2.2 g/L) y
rojo fenol (In vitro, México) suplementado con PVA al 0.1%, D-glucosa 3.05 mM,
piruvato de sodio 0.91 mM, cisteína 0.57 mM y 10 ng/mL de EGF (Wang y Niwa,
1995) cubiertas con aceite mineral en cajas Petri estériles de 35 mm de diámetro
(Nunc, Dinamarca).
La MIV se llevó a cabo en una caja estéril de 4 pozos (Nunc, Dinamarca) en donde
se depositaron 50 COCs por cada pozo en una gota de 500 µL de medio de
maduración adicionado con 0, 12.5, 25, 50, 100, 150 y 200 µM de PFOs grado
reactivo, antes de la incubación se agregaron 0.5 µg/mL de FSH y LH a cada pozo.
Los COCs se incubaron durante 44 h en una atmósfera a 38.5 oC con 5% de CO2 y
humedad a saturación (Ducolomb et al., 2009; Casas et al., 2010). Después de 44 h
de maduración, bajo el microscopio estereoscópico (Olympus SZ60, Olympus
Optical, Japón), se observó la expansión de las CC como un indicador indirecto de
20
maduración (Anexo 14.2 a). En la figura 3 se muestra la expansión de las CC
después de 44 h de maduración.
Figura 3. Expansión de las CC. En A antes de la maduración y en B después de 44 h
de la MIV.
7.3 Evaluación de la viabilidad y maduración.
Después de las 44 h de iniciada la MIV, se realizó la denudación de los ovocitos
desprendiendo las CC por acción mecánica, utilizando una micropipeta de 2-200 µL.
La viabilidad y la maduración para cada tipo celular se evaluaron de manera
independiente. La evaluación de la viabilidad y la maduración se realizaron en el
mismo ovocito mediante una técnica de doble tinción utilizando MTT para determinar
la actividad mitocondrial en los ovocitos vivos y Bisbenzmide (Hoechst 33258) para
determinar la etapa de maduración (Casas et al., 2010), anexo 14.2 b.
Para evaluar la viabilidad los ovocitos se incubaron en 0.5 mg/mL de Bromuro de 3(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) durante 90 min. Se lavaron y se
incubaron posteriormente con 45 μg/mL de Bisbenzamida (Hoechst 33258) por 45
21
min y finalmente se fijaron con una solución de glutaraldehido al 0.5 %
(glutaraldehido/PBS) durante 20 min. Posteriormente se colocaron en portaobjetos y
se les agregó una gota de solución de montaje glicerol/PBS (9:1). Las muestras se
guardaron en un lugar obscuro dentro del refrigerador hasta el momento de la
evaluación.
La viabilidad se analizó en microscopio de campo claro (OLYMPUS CX31) a 400 X,
considerando a los ovocitos incoloros como muertos y a los de color purpura como
vivos (Figura 4). La evaluación de la MIV se realizó en un
microscopio de
Epiflorescencia (Zeiss Axiostar plus), λ=460 nm; los ovocitos se clasificaron con los
siguientes criterios: vesícula germinal (VG): inmaduros; metafase I (MI): en vías de
maduración; metafase II + cuerpo polar (MII): ovocitos maduros (Casas et al., 2010).
Los criterios de evaluación se muestran en la figura 5 y anexo 14.2 c.
Figura 4: Tinción con MTT para evaluar la viabilidad de los ovocitos de cerdo. En A
se muestra un ovocito vivo y en B un ovocito muerto.
22
Figura 5. Ovocitos en diferentes etapas de maduración.
A: vesícula germinal (VG); B: ovocito madurando en metafase I (MI); C: ovocito
madurado en metafase MII (MII).
La viabilidad de las CC, se cuantificó en los COCs completos mediante una tinción
con azul tripano (ácido (3Z,3'Z)-3,3'-[(3,3'-dimetilbifenil-4,4‘ diil)di(1Z)hidracin-2-il-1ilideno]bis(5-amino-4-oxo-3,4-dihidronaftaleno-2,7-disulfónico) al 0.5 % agregando el
mismo volumen de colorante que en el que se encontraban las CC. Inmediatamente
en microscopio de campo claro a (OLYMPUS 31) 400 X se evaluó el porcentaje de
células teñidas considerando las azules como muertas y las incoloras como vivas.
Los criterios de evaluación se muestran en la figura 6 y anexo 14.2 d.
23
Figura 6. Criterios de evaluación de la viabilidad de las CC. En A las células incoloras
se consideraron como vivas y en B las teñidas se consideraron como muertas.
7.4 Evaluación del daño al ADN.
Después de la MIV se separaron los ovocitos de las CC por la acción mecánica antes
descrita. En el caso de los ovocitos, para la eliminación de la zona pelúcida, antes
del ensayo cometa se transfirieron a gotas de 50 uL de una solución de pronasa al
1% (W:V) en PBS durante 30 a 40 seg, una vez que se observó al microscopio
estereoscópico la disgregación de la zona pelúcida se lavaron tres veces en gotas de
500 uL de PBS.
7.4.1 Preparación de laminillas con ovocitos y CC para el ensayo
cometa.
Los dos tipos celulares se transfirieron de manera independiente (50 ovocitos por
tubo y el total de CC obtenidas) a tubos Eppendorf, el volumen se llevó con PBS (1X)
a 500 µL y se centrifugó a 6 000 rpm x 5 min en una microcentrífuga (Thermo Fisher
Scientific). Posteriormente se descartó el sobrenadante dejando sólo el paquete
celular en 10 µL de PBS (1X) y las muestras se conservaron a 4 oC.
24
Para su procesamiento tanto a los ovocitos como a las CC se les añadieron 75 µL
agarosa de bajo punto de fusión al 0.75% en PBS. El volumen total de la mezcla se
colocó de forma homogénea sobre un portaobjeto previamente tratado con una capa
de agarosa de punto de fusión normal (1% en PBS) y se cubrieron con un
cubreobjetos. La muestra se colocó en una cama fría durante 10 min para solidificar
más rápidamente la agarosa. Posteriormente se retiró el cubreobjetos y al
portaobjetos se agregaron nuevamente 75 µL de agarosa de bajo punto de fusión
para evitar la pérdida de células durante la electroforesis, nuevamente se colocó un
portaobjetos y se repitió la incubación en la cama fría por 10 min, transcurrido este
tiempo se retiró el cubreobjetos y se procedió a realizar la lisis de las células
(Tatemoto et al., 2000).
7.4.2 Lisis de los ovocitos y CC.
Los pasos siguientes se realizaron bajo luz amarilla para impedir el daño adicional al
ADN. La lisis de los ovocitos y de las CC se realizó por separado. A cada muestra se
le añadió una solución compuesta por NaCl 2.5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM,
DMSO 0.16 M, Triton X-100 0.016 mM, a un pH de 10, al menos por 24 h.
Posteriormente los portaobjetos se equilibraron dentro de la cámara de electroforesis
horizontal (BIO RAD, México) durante 15 min en una solución amortiguadora alcalina
(NaOH 0.3 M, EDTA 1 mM, a pH >13), para provocar la desnaturalización del ADN.
Al termino de este paso se prosiguió con la electroforesis (Novotná et al., 2009).
25
7.4.3 Electroforesis unicelular en gel (ensayo cometa).
La electroforesis se realizó en una cámara horizontal (BIO RAD, México) con un
amortiguador alcalino a pH>13, con un voltaje de 25 V/cm y 300 mA durante 15 min.
Posteriormente los portaobjetos se transfirieron a un vaso de Coplin con una solución
de Tris 0.4 M (pH 7.5) por 5 min; este paso se realizó dos veces. Posteriormente las
laminillas se deshidrataron en una solución de alcohol etílico frío al 96% por 10 min
(deshidratación de las preparaciones) y se guardaron hasta el momento de realizar la
evaluación.
La tinción del ADN se realizó aplicando 45 µL de red gel al 0.005 % a las laminillas,
dejándolas rehidratar en una cámara húmeda por 10 min.
La evaluación de las muestras se realizó en un microscopio de epifluorescencia
(Zeiss, Axiostar plus) a una longitud de onda de (264-366 nm) (Urrego et al., 2005;
Novotná et al., 2009). Los parámetros de genotoxicidad que se evaluaron utilizando
el software llamado “Cromegen” (ODP, México) fueron la longitud y el porcentaje de
ADN de la cauda, tomando como referencia el área total del cometa (100%) como se
muestra en la figura 7.
Figura 7. Parámetros evaluados en el ensayo cometa en CC.
26
El tamaño del cometa (100% de ADN) se toma como referencia para calcular el
porcentaje de ADN contenido en la cauda y el grado de fragmentación da como
resultado la longitud de la cauda.
7.5 Tratamiento con PFOS.
Para evaluar el efecto de PFOS en la maduración, viabilidad e integridad del ADN en
los ovocitos y CC se utilizó el PFOS grado reactivo (heptadecafluorooctanesulfonic
acid potasium salt. Sigma Número de catálogo 77282-10G).
Se preparó una solución patrón 20 mM de PFOS (utilizando como diluyente DMSO
puro), a partir de la cual se preparó una solución de trabajo 2 mM (utilizando como
diluyente TCM-199 suplementado), a partir de la última se obtuvieron las
concentraciones finales para cada tratamiento. Para evaluar el efecto del diluyente se
realizaron
experimentos
independientes
utilizando
el
porcentaje
de
DMSO
correspondiente al que estaba presente en cada una de las concentraciones del
PFOS.
Para la evaluación del daño al ADN por el PFOS en los ovocitos y CC se utilizó una
concentración subletal correspondiente a 23 µM (1/4 de la CL50 observada en las
CC). Para el análisis de la integridad del ADN se incluyó un control positivo de
peróxido de hidrógeno (H2O2) 200 µM. Las concentraciones de PFOS y los
porcentajes de DMSO utilizados se muestran en el cuadro 1.
27
Cuadro 1. Concentraciones de PFOS y porcentajes de DMSO utilizadas en cada
tratamiento.
Tratamientos
Concentraciones (µM) de PFOS por
Porcentajes (%) de DMSO (diluyente)
cada tratamiento
por cada tratamiento
0 (Control)
0 (Control)
12.5
0.06
25
0.125
50
0.25
100
0.5
150
1
8. Análisis estadístico
Para la evaluación cuantitativa de cada uno de los parámetros (maduración,
viabilidad e integridad del ADN) se realizó un análisis estadístico de comparación
multiple de Tukey-Kramer y una correlación de Spearman. Además se realizó una
prueba de Ji-cuadrada (X2) para comparar los porcentajes de células con daño en el
ADN. Cada tratamiento se realizó al menos por triplicado con un nivel de confianza
p<0.05.
También se realizó la prueba estadística cuantal PROBIT que se caracteriza por la
respuesta a un estímulo de n unidades experimentales, donde r unidades responden
y (n- r) no lo hacen.
28
9. Resultados.
9.1 Efecto del diluyente (DMSO) sobre la viabilidad de los ovocitos.
Para probar el posible efecto del diluyente en la viabilidad de los ovocitos se
realizaron 5 experimentos en los cuales se utilizaron un total de 335 ovocitos con un
promedio de 84 ovocitos por cada tratamiento. En la figura 8 se muestra la viabilidad
de los distintos tratamientos de DMSO y el grupo control, al comparar los grupos la
prueba estadística de Tukey-Kramer no muestra diferencias significativas. En la
figura 9 y cuadro 2 se muestran los porcentajes de viabilidad obtenidos por cada
experimento. Para cada tratamiento sólo se consideró el valor de la mediana para la
prueba estadística.
29
Cuadro 2. Porcentajes de viabilidad de los ovocitos en presencia de DMSO
(diluyente) durante la MIV.
Porcentaje de DMSO
0 (Control)
0.06
0.125
0.250
Ovocitos vivos/ Total
(%)
7/7
5/5
6/7
6/6
(100)
(100)
(86)
(100)
6/8
7/7
6/6
7/7
(75)
(100)
(100)
(100)
6/6
6/6
6/6
7/7
(100)
(100)
(100)
(100)
27/28
24/25
17/19
28/30
(96)
(96)
(89)
(93)
37/38
41/43
33/35
35/39
(97)
(95)
(94)
(90)
97 %
100 %
94 %
100 %
Mediana
Con 5 experimentos por tratamiento y 84 ovocitos evaluados en cada tratamiento
30
Figura 8. Porcentajes de viabilidad con distintos tratamientos con DMSO
Figura 9. Porcentajes de viabilidad en ovocitos madurados en presencia de distintas
concentraciones de DMSO (los datos no muestran correlación).
31
9.2 Efecto del PFOS sobre la viabilidad en los ovocitos.
Las concentraciones empleadas inicialmente fueron de 0, 12.5, 25, 50, 100, 150,
300, 500 y 1000 µM. Los resultados en la viabilidad de los ovocitos, evaluado
después de las 44 h de MIV mostraron disminución dependiente de la concentración,
además la viabilidad se abatió totalmente cuando se utilizaron altas concentraciones
de PFOS (50, 100, 150, 300, 500 y 1000 µM). Por lo que para obtener la
concentración letal 50 (CL50) se incluyeron concentraciones menores a 50 µM, estos
datos se muestran en la figura 10.
Figura 10. Viabilidad de los ovocitos expuestos a distintas concentraciones de PFOS
durante la MIV.
Se realizaron 10 experimentos utilizando un total de 1,310 ovocitos, en promedio 328
ovocitos por cada tratamiento. Los datos obtenidos en viabilidad presentaron
correlación
negativa
con
respecto
a
las
concentraciones
probadas.
Las
concentraciones de 12.5 y 25 µM no afectaron considerablemente la viabilidad de los
ovocitos. La prueba estadística de Tukey-Kramer mostró una diferencia significativa
entre el grupo control y la concentración de 50 µM (P<0.05) (figura 11). Los
32
porcentajes se muestran en el cuadro 3 y la figura 12 muestra la correlación entre la
viabilidad y la concentración (R2 = 0.8095). Con estos resultados se calculó la
concentración letal 50 (CL50) en 31 µM de PFOS (Cuadro 4). La CL50 que mostró
PROBIT fue de 26.1 µM.
33
Cuadro 3. Porcentajes de viabilidad de los ovocitos expuestos a PFOS durante la
MIV.
Concentración de PFOS (µM)
Control
12.5
25
50
Ovocitos vivos/Total
(%)
8/8
7/7
0/6
0/5
(100)
(100)
(0)
(0)
6/7
2/7
6/7
6/8)
(86)
(29)
(86)
(75)
5/5
6/6
5/5
0/5
(100)
(100)
(100)
(0)
34/38
26/ 30
33/40
35/41
(89)
(87)
(83)
(85)
39/40
41/43
42/44
3/43
(98)
(95)
(95)
(7)
37/37
39/41
35/38
3/40
(100)
(95)
(92)
(8)
27/35
33/42
30/41
2/42
(77)
(79)
(75)
(4)
36/42
28/29
25/38
0/38
(86)
(97)
(66)
(0)
31/32
32/33
25/31
1/34
(97)
(97)
(81)
(3)
28/33
34/43
28/32
1/35
(85)
(79)
(88)
(3)
36/41
38/45
25/44
1/49
(88)
(84)
(57)
(2)
89 %
95 %
83 %
3%*
Mediana
Con 11 experimentos por tratamiento y 328 ovocitos evaluados en cada tratamiento
(*P<0.05).
34
Figura 11. Viabilidad de los ovocitos expuestos a distintas concentraciones de PFOS.
*. Diferencia significativa (P<0.05)
Figura 12. Viabilidad de los ovocitos expuestos a distintas concentraciones de PFOS
durante la MIV. Se muestra una correlación negativa en relación a las
concentraciones probadas.
35
Cuadro 4. CL50 de los ovocitos calculada mediante la prueba estadística de Probit.
Percentil
Probit
Log(Dosis)
Error Est.
Dosis
Log(Dosis)
Error Est.
Dosis
1
2.6737
2.0578
0.0392
114.2267
10.3075
5
3.3551
1.8700
0.0301
74.1361
5.1318
10
3.7184
1.7699
0.0256
58.8773
3.4728
20
4.1584
1.6488
0.0210
44.5406
2.1506
25
4.3255
1.6027
0.0195
40.0603
1.8014
30
4.4756
1.5614
0.0184
36.4224
1.5468
40
4.7467
1.4867
0.0171
30.6689
1.2082
50
5.0000
1.4169
0.0167
26.1160
1.0056
60
5.2533
1.3471
0.0172
22.2390
0.8822
70
5.5244
1.2724
0.0187
18.7260
0.8051
75
5.6745
1.2311
0.0198
17.0254
0.7764
La CL50 calculada es 26 µM (N= 11experimentos)
9.3 Efecto del diluyente (DMSO) en la maduración de los ovocitos.
Para evaluar el posible efecto del diluyente DMSO en la maduración de los ovocitos
se realizaron 6 experimentos con un total de 467 ovocitos, 117 por cada tratamiento
con los porcentajes del diluyente indicados anteriormente.
Los resultados obtenidos mostraron que el diluyente no tuvo efecto sobre la
maduración con respecto al grupo control (Cuadro 5). La prueba estadística de
Tukey-Kramer no mostró diferencia significativa entre las diferentes concentraciones
de DMSO utilizadas para cada tratamiento y el grupo control (Figura 13). En la figura
14 se muestran el cálculo de la correlación entre el porcentaje MIV y la concentración
de DMSO.
36
Cuadro 5. Porcentajes de MIV de los ovocitos en presencia de DMSO (diluyente).
Efecto del DMSO en la MIV de los ovocitos
0 % (Control)
0.06 %
0.125 %
0.25 %
(Ovocitos madurados/total)
%
12/19
12/21
4/15
3/21
(63)
(57)
(27)
(14)
15/27
10/17
13/17
10/16
(56)
(59)
(76)
(63)
10/18
20/23
14/20
9/15
(56)
(87)
(70)
(60)
9/17
7/17
12/20
11/19
( 53)
(41)
(60)
(58)
11/14
13/16
7/15
10/14
(79)
(81)
(47)
(72)
15/20
19/30
18/28
16/28
(75)
(63)
(64)
(57)
56 %
63 %
64 %
63 %
Mediana
Con 6 experimentos por tratamiento y 117 ovocitos evaluados en cada tratamiento.
37
Figura 13. Maduración de los ovocitos en las distintas concentraciones de DMSO con
respecto al grupo control.
Figura 14. Porcentajes de MIV de los ovocitos en diferentes concentraciones de
DMSO. (los datos no muestran correlación o los datos no están correlacionados).
38
9.4 Efecto del PFOS en la MIV.
Para evaluar el efecto del PFOS en la MIV se realizaron 9 experimentos, 196
ovocitos por cada tratamiento con un total de 784 (Cuadro 6). La prueba estadística
de Tukey-Kramer mostró diferencias significativas (P<0.05) entre las concentraciones
de 25 y 50 µM con respecto al grupo control (Figura 15). Los porcentajes de
maduración muestran una correlación negativa dependiente de la concentración. La
regresión lineal indica que la CIM50 es de 11 µM (Figura 16), mientas que la prueba
estadística PROBIT lo marca con un valor de 12.35 µM (Cuadro 7).
39
Cuadro 6. Porcentajes MIV de ovocitos expuestos a diferentes concentraciones de
PFOS.
Maduración con diferentes concentraciones de PFOS
Control (0 µM)
12.5 µM
25 µM
50 µM
Ovocitos en MII/totales
(%)
19/24
15/22
0/13
1/17
(79)
(68)
(0)
(6)
16/21
9/20
0/15
1/19
(76)
(45)
(0)
(5)
13/23
10/17
0/20
2/19
(56)
(59)
(0)
(10)
11/15
2/13
0/13
0/9
(73)
(15)
(0)
(0)
10/14
0/15
1/21
0/25
(71)
(0)
(5)
(0)
10/26
23/34
7/28
0/34
(38)
(68)
(25)
(0)
11/27
14/27
6/28
0/26
(41)
(52)
(21)
(0)
16/25
8/21
10/26
0/27
(64)
(38)
(38)
(0)
15/23
13/23
6/23
0/31
(65)
(57)
(26)
(0)
65 %
52 %
5%*
0%*
Medianas
Con 9 experimentos por tratamiento y 196 ovocitos evaluados en cada tratamiento
(*P<0.05).
40
Figura 15. Efecto del PFOS sobre la MIV. (*P< 0.05).
Figura 16. Porcentajes de maduración de los ovocitos expuestos a PFOS durante la
MIV, donde se aprecia correlación negativa entre ambos parámetros.
.
41
Cuadro 7. CIM50 calculada mediante la prueba estadística de Probit.
Percentil
Probit
Log(Dosis)
Error Est.
Dosis
Log(Dosis)
Error Est.
Dosis
1
2.6737
1.7900
0.0535
61.6574
7.6005
5
3.3551
1.5855
0.0360
38.5000
3.1958
10
3.7184
1.4764
0.0279
29.9522
1.9251
20
4.1584
1.3444
0.0210
22.1004
1.0697
25
4.3255
1.2942
0.0199
19.6899
0.9043
30
4.4756
1.2492
0.0199
17.7500
0.8152
40
4.7467
1.1679
0.0222
14.7181
0.7519
50
5.0000
1.0918
0.0263
12.3544
0.7476
60
5.2533
1.0158
0.0316
10.3702
0.7534
70
5.5244
0.9344
0.0379
8.5989
0.75124
75
5.6745
0.8894
0.0417
7.7517
0.7441
80
5.8416
0.8392
0.0460
6.9062
0.7311
90
6.2816
0.7072
0.0577
5.0958
0.6766
95
6.6449
0.5982
0.0676
3.9644
0.6169
99
7.3263
0.3937
0.0865
2.4755
0.4932
El programa estadístico muestra que la CIM50 se encuentra en los 12.35 µM (N=9
experimentos).
42
9.5 Efecto del diluyente (DMSO) en la viabilidad de las CC.
Para descartar un posible efecto del diluyente sobre la viabilidad de las CC se evaluó
la concentración más alta de DMSO que correspondió al 1% en el medio de cultivo.
Los porcentajes de viabilidad entre el control y el DMSO fueron muy similares con
valores de 94% contra 95% respectivamente, (Figura 17). Estos datos indican que el
diluyente no afectó la viabilidad de las CC y se descarta un posible efecto en el
parámetro evaluado.
Figura 17. Porcentajes de viabilidad en CC expuestas a 1% de DMSO durante 44 h
de MIV.
43
9.6 Efecto del PFOS en la viabilidad de las CC.
Debido a que las concentraciones de PFOS empleadas en la evaluación de la
viabilidad de los ovocitos no afectaron la viabilidad de las CC se aumentaron las
concentraciones del perfluorado a 100,150 y 200 µM;
y del diluyente hasta 1%
(Cuadro 8).
Se realizaron tres repeticiones por cada tratamiento. Los resultados se muestran en
el cuadro 9. La prueba estadística de Tukey-Kramer revela disminución significativa
de la viabilidad en 100 µM con una caída de hasta el 0% de células viables en la
concentración 150 µM (P<0.05; Figura 18). Los porcentajes de viabilidad de las CC
presentaron una correlación negativa, con un comportamiento dependiente de la
concentración y una CL50 de 90 µM (Figura 19). Por otro lado, la prueba estadística
de PROBIT muestra que la CL50 se encuentra en 80.44 µM (Cuadro 10).
Cuadro 8. Concentraciones de PFOS y de DMSO utilizadas.
PFOS
0 µM
12.5 µM
25 µM
50 µM
100 µM
150 µM
200 µM
DMSO
0%
0.06%
0.12%
0.25%
0.50%
0.75%
1%
44
Cuadro 9. Porcentajes de viabilidad de las CC expuestas a diferentes
concentraciones de PFOS
Porcentajes de viabilidad de las CC expuestas a PFOS
Control
12.5 µM
25 µM
50 µM
100 µM
150 µM
CC vivas /Total
(%)
48/51
48/50
42/50
40/50
25/50
0/50
(95)
(95)
(85)
(80)
(50)
(0)
47/50
48/52
48/50
45/50
33/50
0/51
(94)
(95)
(95)
(90)
(65)
(0)
49/50
49/50
49/50
46/51
25/50
0/50
(98)
(97)
(97)
(90)
(50)
(0)
95 %
95 %
95 %
90 %
50 %*
0 %*
Mediana
Con 3 experimentos por tratamiento y 150 ovocitos evaluados en cada tratamiento
(*P<0.05).
45
Figura 18. Porcentajes de viabilidad correspondientes a distintas concentraciones de
PFOS (*P< 0.05).
Figura 19. Porcentajes de viabilidad de las CC expuestas a PFOS durante 44 h de
MIV. La concentración 200 µM no se muestra debido a que la viabilidad se abatío
totalmente en 150 µM
46
Cuadro 10. CL50 para las CC calculada mediante la prueba estadística de Probit.
Percentil
Probit
Log(Dosis)
Error Est.
Dosis
Log(Dosis)
Error Est.
Dosis
1
2.6737
1.1806
0.0492
15.1575
1.7164
5
3.3551
1.3930
0.0365
24.7159
2.0765
10
3.7184
1.5062
0.0302
32.0758
2.2331
20
4.1584
1.6433
0.0237
43.9800
2.3969
25
4.3255
1.6953
0.0217
49.5829
2.4728
30
4.4756
1.7421
0.0202
55.2202
2.5672
40
4.7467
1.8266
0.0186
67.0743
2.8709
50
5.0000
1.9055
0.0186
80.4445
3.4368
60
5.2533
1.9844
0.0199
96.4799
4.4315
70
5.5244
2.0689
0.0227
117.1911
6.1303
75
5.6745
2.1157
0.0247
130.5152
7.4137
80
5.8416
2.1677
0.0271
147.1424
9.1806
90
6.2816
2.3048
0.0343
201.7511
15.9525
95
6.6449
2.4180
0.0409
261.8288
24.6483
99
7.3263
2.6304
0.0538
426.9378
52.9347
El programa estadístico muestra que la CL50 se encuentra en 80.44 µM (N=3 experimentos).
47
9.7 Efecto del PFOS sobre el ADN después de la MIV mediante la
prueba de cometa.
9.7.1 Daño al ADN en las CC.
Para la evaluación del daño al ADN en las CC se evaluaron 150 cometas para cada
tratamiento: PFOS 0 µM (control negativo); PFOS 23 µM; DMSO 0.06% y H2O2 200
µM (control positivo). Se compararon tres parámetros de daño al ADN. El primero,
evaluado al microscopio de epifluorescencia a 400 X, fue el número de células con
daño. Las células se clasificaron sin daño cuando las caudas tuvieron un diámetro
menor o igual a la longitud de la cabeza y con daño cuando éstas presentaron un
diámetro mayor al de la cabeza. El segundo y tercer parámetros se evaluaron
mediante el programa computarizado Cromagen. En el segundo se determinó la
longitud de las caudas de los cometas y en el tercero, el porcentaje de ADN en las
caudas (Figura 21 y 22 respectivamente).
El grupo tratado con PFOS, tuvo un mayor porcentaje de células con daño respecto
al control 61 y 34.5% respectivamente (Figura 20). En el grupo del control positivo
tratado con H2O2, todas las células presentaron daño; mientras que el grupo tratado
con DMSO presentó un porcentaje de células dañadas similar al grupo control. La
prueba estadística de X2 para dos muestras independientes mostró diferencia
significativa tanto del grupo tratado con PFOS como del tratado con H2O2, al
compararse con el grupo control. El DMSO no
presentó
diferencia significativa
respecto al grupo control. Los resultados se muestran en la figura 20.
48
Figura 20. Porcentajes de células que presentaron daño al ADN por efecto de los
diferentes tratamientos (*P< 0.05).
Los datos indicados mediante el programa Cromagen permitieron realizar la
comparación múltiple de Tukey-Kramer, mostrando diferencia significativa entre las
longitudes (en µm) de las caudas del grupo tratado con PFOS (23 µM) contra el
grupo control (Figura 21) (P< 0.05).
49
Figura 21. Longitud de las caudas en las CC expuestas a PFOS vs control. El grupo
tratado con PFOS muestra caudas más grandes con respecto grupo control (*P<
0.05).
El porcentaje de ADN en las caudas definido como la cantidad de fragmentos de
ADN desplazados mediante la electroforesis. no mostró diferencias significativas
entre el grupo tratado con PFOS (23 µM) contra el grupo control al realizar la
comparación múltiple de Tukey-Kramer, la comparación entre los tratamientos se
muestra en la figura 22.
50
Figura 22. Porcentaje de ADN en las caudas de los cometas del grupo control contra
PFOS (23 µM). Los porcentajes de ADN en las caudas fueron iguales en el grupo
tratado con PFOS y el grupo control.
51
9.7.2 Daño al ADN en los ovocitos.
Los ovocitos se procesaron utilizando la misma metodología que las CC. Se
realizaron al menos 6 ensayos, utilizando las mismas concentraciones de PFOS,
DMSO y H2O2 (Figura 23). En algunos ensayos se observaron algunos cometas en
los distintos tratamientos, sin embargo los resultados no fueron reproducibles en
cada experimento y el efecto genotóxico del PFOS no se pudo evaluar.
Figura 23. Cometa en un ovocito a 100 X. En la figura se observa claramente una
cauda.
52
10. Discusión
Los PFCS son compuestos sintéticos, ubicuos y altamente persistentes en el medio
ambiente. Entre estos se encuentra el PFOS el cual es utilizado en una amplia
variedad de productos entre los que se encuentran espumas contra incendios,
aerosoles, revestimientos para telas, alfombras, ropa y plaguicidas (Kissa, 2001;
Prevedouros et al., 2006). Además de los productos anteriores existen reportes sobre
la presencia de PFOS en el aire, ya que este compuesto se adhiere a las partículas
de polvo, que circula en el interior de las oficinas, vehículos y hogares (Fraser et al.,
2013). Las principales fuentes de exposición en la población en general aún no están
completamente claras. Domingo (2011) y Falandysz et al., 2006 concluyen que la
principal fuente de exposición a los PFCS es la dieta; el consumo de carnes rojas,
grasas animales, pescado, y botanas (ejemplo: palomitas de maíz, papas fritas, etc.)
(Ericson et al., 2008; Tittlemier et al., 2007).
En un estudio en el que se determinó la presencia de sustancias perfluoroalquiladas
en regiones tropicales y subtropicales de los Océanos Atlántico, Pacífico e Índico se
reportó que el PFOS fue el compuesto más abundante, constituyendo el 33% del
total de éstos (González- Gaya et al., 2014). Los PFCS pueden ingresar al organismo
por medio del consumo de productos del mar contaminados como pescado magro,
hígado de pescado, mariscos, contribuyen con la mayor parte en la ingesta de los
PFCS. Se considera que por esta vía ingresa el 81% del PFOS a los humanos
(Haug et al., 2010), a pesar de esto, aún se desconoce el mecanismo exacto por el
cual el PFOS pasa a través de las membranas celulares. Una vez dentro del
organismo el perfluorado se transporta unido a la albumina, esta proteína
básicamente se encuentra en todo el organismo y es considerada la proteína más
abundante en el plasma sanguíneo, la unión PFOS-albumina, es mediante múltiples
interacciones no covalentes como las hidrofóbicas, las fuerzas de Van der Waals y
los puentes de hidrogeno (Zhang et al., 2009). En individuos no ocupacionalmente
53
expuestos se ha detectado el PFOS en diferentes órganos como hígado, riñón, tejido
adiposo, cerebro, ganglios, hipófisis, tiroides, pulmón, páncreas, gónadas, tejido
esquelético, sangre y fluido folicular (Governini et al., 2011; Kato et al., 2011). Debido
a que el PFOS se ha relacionado con diversas alteraciones en la salud reproductiva
tanto en animales como en el humano, en el presente estudio se evaluó el efecto del
PFOS en la viabilidad, la maduración y el efecto genotóxico en ovocitos y células
cúmulo después de la MIV.
Los resultados de la evaluación de los tratamientos controles con diferentes
porcentajes del diluyente, no mostraron efectos adversos en ninguno de los
parámetros evaluados, estos datos coinciden con los resultados de trabajos
publicados sobre criopreservación de células madre e injertos osteocondrales, en los
que se utilizaron diferentes concentraciones de DMSO (<2 hasta 10 %) (Thirumala et
al., 2010; Álvarez et al., 2002). De esta manera se puede concluir que los resultados
obtenidos en el presente estudio se debieron al efecto del PFOS y no del diluyente.
Actualmente no existen reportes sobre concentraciones letales y subletales del
PFOS en la viabilidad de ovocitos y CC, por lo cual,
se evaluaron distintas
concentraciones de este compuesto. Las concentraciones evaluadas fueron 0, 12.5,
25, 50, 100, 150, 300, 500, 1000 µM, aquellas que mostraron efecto letal fueron 150
a 1000 µM, mientras que las concentraciones de 12.5 a 100 µM mostraron un efecto
moderado, por lo que a partir de éstas se realizaron experimentos con el objetivo de
encontrar la CL50 en los ovocitos y las CC que son similares a las de estudios
realizados en una línea celular de fibroblastos COS-1 en los cuales se utilizaron
concentraciones de 1 a 250 µM de PFOS para medir la proliferación de peroxisomas
(Wolf et al., 2008).Estidios in vivo realizados con ratas preñadas, se utilizaron
concentraciones de 2.0 mg/Kg, los resultados mostraron severas histopatologías
pulmonares en las crías recién nacidas,ya que las células presentaban lesiones por
oxidación y muerte por apoptosis (Chen et al., 2012; Yang et al., 2014).
54
La disminución en la viabilidad y la MIV observada en el presente trabajo, se
encuentra en concentraciones de 11, 31 y 90 µM (CIM50, CL50 en ovocitos y CL50 en
CC, respectivamente). En los ovocitos las concentraciones de PFOS utilizadas para
calcular la CL50 estuvieron dentro de en un intervalo de 0 a 50 µM. La CL50 fue de 31
µM, esta concentración es una referencia muy importante, debido a que existen
reportes de individuos laboralmente expuestos con una concentración de 26 µM de
PFOS en plasma sanguíneo (Olsen et al., 2003). Un estudio de fertilidad en mujeres
sometidas a programas de FIV y transferencia embrionaria reportó una disminución
en la tasa de fertilización hasta el 70%; esta disminución se relacionó con la
presencia 13 ng/mL (0.026 µM) de PFCS en el fluido folicular (Governini et al., 2011).
La inhibición de la maduración de los ovocitos observada en el presente trabajo
podría deberse a la alteración de la funcionalidad de las CC, donde el PFOS podría
alterar las funciones de transporte de iones, nutrientes y otros factores hacia el
ovocito; las CC poseen receptores hormonales para LH y FSH, estas hormonas van
a reactivar la maduración del ovocito, rompiendo la VG, hasta alcanzar la MII. Este
proceso puede alterarse por la presencia de xenobióticos (Scaglia et al., 2009).
Algunos estudios consideran al PFOS como un disruptor endocrino (Caserta et al.,
2013), debido a esta característica el compuesto perfluorado podría competir por los
receptores hormonales e inhibir la estimulación de la maduración de los gametos
expuestos.
En relación con los gametos masculinos, en un estudio en el que se relacionó la
presencia de PFCS y la función testicular se observó que la concentración
espermática del eyaculado disminuyó de 15.5 a 6.2 millones cuando los hombres
tenían concentraciones plasmáticas de 24.5 ng/mL (0.049 µM) (Joensen et al., 2009),
a pesar de ello no existen reportes de muerte en los gametos masculinos.
55
Estos antecedentes junto con otros datos (Campagna et al., 2001; Casas et al.,
2010) y los resultados a aquí presentados permiten suponer que los gametos
femeninos son más susceptibles a los efectos adversos del PFOS en comparación
con las células somáticas e inclusive los gametos masculinos.
En el caso de las CC la CL50 fue 90 µM. Las CC por su posición son las primeras en
estar en contacto con el compuesto perfluorado. Las CC presentan características
particulares, su función es proveer de nutrientes, iones, además de poseer
receptores hormonales, entre otros aspectos que son necesarios para la maduración
del ovocito.
Estudios in vitro demuestran que las CC además tienen efectos
benéficos en los cocultivos, ya que ayudan a eliminar sustancias nocivas,
en
particular metales pesados, amonio y formación de radicales libres, por lo tanto
también participan en la desintoxicación de los medios de cultivo (Cihangir et al.,
2010). Otros estudios in vitro indican que las CC tiene un papel importante en la
estimulación de la síntesis de glutatión (GSH) en los ovocitos, lo cual ayuda a
contrarrestar los efectos de los radicales libres (Tatemoto et al., 2000).
Se eligió evaluar el daño sobre el ADN del PFOS exponiendo los COCs a una
concentración de 23 µM durante 44 h de MIV, esta concentración correspondió a ¼
de la CL50 de las CC y a la de inhibición del 100% de la maduración de los ovocitos
(22 µM). Dicha concentración permitió evaluar el efecto en el ADN provocado por la
exposición al perfluorado y no a la muerte celular, ya que con esta concentración el
porcentaje de viabilidad fue del 90 y 60 % en las CC y los ovocitos respectivamente.
En las CC con la concentración de 23 µM (1/4 CL50) no se detectó diferencia en el
contenido de ADN en las caudas. Sin embargo se observó un efecto genotóxico al
tomarse en cuenta la longitud de las caudas indicando que el PFCS produce
fragmentos ADN significativamente más pequeños en el grupo tratado que los
producidos en el grupo control. Estos datos difieren de lo observado en otras células
56
somáticas, ya que en un trabajo realizado en células de hepatoma humano
cultivadas en presencia de PFOS con concentraciones de 5 a 300 µM, (Florentin et
al., 2011) y en la línea celular hepática HepG2 con 0.4 a 2000 µM (Eriksen et al.,
2010), no se detectó efecto genotóxico.
Un estudio realizado por Governini et al., 2011, reportó la presencia de PFCS en
fluido folicular a una concentración de aproximadamente 13 ng/ml (0.026 µM), a
pesar de ser concentraciones muy bajas la presencia de estos compuestos debe
tomarse en cuenta, ya que se ha indicado que estos compuestos son capaces de
unirse al ADN, esta unión se lleva a cabo por interacción de la parte hodrofóbica del
PFOS (cadena carbonada) con las bases adenina y guanina en una de las cadenas y
en la complementaria se unen a las bases pirimídicas, timina y citosina. Cuando
algunos xenobióticos interactúan con el ADN, los enlaces no covalentes de la
molécula pueden romperse y originar un cambio conformacional e incluso conducir a
la pérdida de la función (Zhang et al., 2009).
Los mecanismos de acción del PFOS en gametos no están descritos; existen
reportes sobre el uso de biomarcadores ambientales que pueden ayudar a
comprender los mecanismos de acción de los PFCS. Un estudio realizado en
lombrices de tierra expuestas a un suelo contaminado con PFOS indicó que este
compuesto fue capaz retrasar su crecimiento e inducir estrés oxidante (EO) mediante
la inhibición de la actividad de las enzimas antioxidantes como son la superóxido
dismutasa, peroxidasa, catalasa y glutatión peroxidasa, los efectos del estrés
oxidante, detectado por producción de malondialdehído, el cual produjo daño en las
membranas celulares y genotoxicidad (Xu et al., 2013). Por otra parte, estudios con
modelos murinos reportaron efectos similares, donde el PFOS fue causante de
neurotoxicidad provocada por especies reactivas de oxígeno (EROS), la muerte de
las células neuronales se debió a un incremento de EROS cuando se expusieron a
una concentración de 30 µM de dicho perfluorado.
57
Las EROS causan la fragmentación del ADN y provocan un incremento de la
actividad de la caspasa 3, dando origen a la muerte neuronal por apoptosis mediante
la vía de señalización de la proteína cinasa C (PKC) (Lee et al., 2012; Reistad et al.,
2013). En la línea de células cancerosas de pulmón humano A549 expuestas a
PFOS indujo la muerte celular manera dependiente de la concentración. La apoptosis
fue caracterizada por el incremento de la sub-G1, la activación de la caspasa 3 y 9 y
la expresión de mRNA de Bax/Bcl-2; además, se detectó una disminución en los
niveles basales de GSH, un aumento del malondialdehido y de la actividad de la
enzimatica de la superóxido dismutasa. Estos parámetros indican una producción
EROS que dañan las membranas biológicas provocando la muerte celular por
apoptosis (Mao et al., 2012).
Los estudios de los mecanismos de acción del PFOS en células somáticas se ha
enfocado a describir la muerte celular por apoptosis Wang et al., (2013) describieron
este mecanismo utilizando células híbridas de humano-hámster y se concluyó que la
muerte celular y la generación de EO estaba mediado por una vía dependiente de la
mitocondria.
La muerte de las CC y del ovocito por exposición a PFOS no está completamente
descrita, en gametos no se conoce el mecanismo de acción del perfluorado, es claro
que los gametos son tipos celulares muy susceptibles a cualquier xenobiotico, por lo
tanto, en el presente trabajo, las concentraciones que se requirieron para alterar su
viabilidad y maduración fueron concentraciones relativamente bajas (CL50 31 µM y
CIM50 11 µM respectivamente) en comparación con las células somáticas (CC CL50
90 µM).
El efecto genotóxico del PFOS en las CC se evaluó mediante la cuantificación de
número de células con daño en el ADN, el análisis del porcentaje de ADN y longitud
de las caudas de los cometas. Con respecto al parámetro de porcentaje de ADN en
58
las caudas, no se observó diferencia entre el grupo incubado con el compuesto
perfluorado durante la MIV y el control. Sin embargo los resultados sugieren efecto
genotóxico, ya que los parámetros de porcentaje de células con daño al ADN y la
longitud de las caudas de los cometas fueron mayores en el grupo tratado con PFOS
en comparación con el control. Éste es un indicador de aumento de la fragmentación
del ADN, por lo tanto una mayor migración de los fragmentos. En el caso de los
ovocitos expuestos al perfluorado no se pudo evaluar el efecto genotóxico, trabajos
previos con este tipo celular, sugieren la eliminación de la zona pelúcida con
proteasa al 0.1% (w:v) ya que dicha estructura no se rompe con la solución de lisis,
además también se sugiere el uso de acetona para la eliminación de los lípidos
(Tatemoto et al. 2000; Yuan et al., 2008).
La fragmentación del ADN puede indicar la presencia de EROS y podría ser uno de
los mecanismos de muerte celular en los ovocitos y CC. Esto ya fue demostrado en
trabajos con células somáticas en donde se presentó un efecto genotóxico y la
generación de EO (Mao et al., 2012; Xu et al., 2013). Sin embargo, se requieren
evaluar algunos parámetros de EO para corroborar si es este el mecanismo de
acción en los gametos femeninos; algunos de los parámetros que se podría evaluar
serían la generación y fuente de EROS, lipoperoxidación, expresión de enzimas
antioxidantes y otro parámetro de gentoxicidad como
la cuantificación de la 8-
hidroxiguanina.
Para que se lleve a cabo la reproducción es necesario
que procesos como la
maduración de los gametos, la fertilización, el desarrollo embrionario temprano,
gestación
y finalmente el nacimiento, se efectúen sin contratiempos,retrasos o
alteraciones Cualquier cambio en alguno de estos procesos puede alterar la fertilidad
de los individuos o causar efectos dañinos en la descendencia. El efecto de diversos
xenobióticos ambientales sobre la MIV de los ovocitos porcinos ha sido reportado
en diferentes estudios (Campagna et al., 2001; Casas et al., 2010) Insecticidas como
59
diazinón y malatión, y hebicidas como atrazina y fenoxaprop-etil mostraron que su
presencia durante la MIV fue capaz de afectar la maduración induciendo un bloqueo
del paso de los ovocitos de la VG a la MI (Casas et al., 2010). El empleo de
compuestos organoclorados produjo una maduración incompleta y la disminución en
la producción de blastocistos. (Campagna et al., 2001).
El efecto del PFOS en los COCs puede alterar la maduración y la viabilidad del
ovocito ya sea actuando directamente sobre el gameto o a través de las CC que
rodean al ovocito.
60
11. Conclusiones.
 Los resultados de este trabajo muestran que el PFOS puede afectar
reproducción ya que mostró un efecto negativo en los parámetros de viabilidad
y maduración de los ovocitos porcinos así como en la viabilidad de las CC.
 El PFOS en el medio de MIV disminuyó la viabilidad y la maduración de los
ovocitos a medida que aumentó la concentración. La CL50 determinada fue de
31 µM y la CIM50 de 11 µM.
 La maduración de los ovocitos mostró una gran sensibilidad al PFOS ya que
comparando la CL50 con la CIM50 se requirió una concentración tres veces
menor para inhibir la maduración que la requerida para inducir la muerte.
 En las CC, el PFOS disminuyó la viabilidad de manera dependiente de la
concentración, donde se requirió 90 µM para disminuir al 50% la viabilidad de
las células.
 Los ovocitos fueron más susceptibles que las CC al efecto adverso del PFOS,
ya que la concentración requerida para inhibir el 50 % de la viabilidad fue tres
veces menor que en el caso de las CC (33 µM contra 90 µM respectivamente).
 En las CC la concentración subletal 23 µM de PFOS incrementó el porcentaje
de células con daño al ADN; el aumento en la longitud de las caudas en el
ensayo cometa sugiere mayor fragmentación del ADN, lo anterior permite
considerar a este compuesto perfluorado como un agente genotóxico.
61
12. Perspectivas.
 Continuar con la evaluación del efecto genotóxico en ovocitos mediante el
ensayo cometa incluyendo algunas modificaciones, como la eliminación de la
ZP y/o eliminación del contenido lipídico por tratamiento con acetona o
centrifugación, empleando concentraciones subletales.
 Determinar si la muerte celular observada en el presente trabajo es debida a
un proceso apoptótico.
 Evaluar otros mecanismos de daño del PFOS durante la MIV en ovocitos y CC
como la generación de EO.
 Estudiar si el efecto producido por el PFOS durante la MIV puede tener
implicaciones en la fertilización y/o el desarrollo embrionario temprano.
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74
14. Anexo.
14.1 Metodología.
a) Criterios de selección de los folículos ováricos para la punción.
b) Criterios de selección de los COCs para la MIV.
1. El ovocito debe tener mínimo 2 o 3 capas de CC.
2. El citoplasma de ovocito debe ser uniforme.
3. Los ovocitos seleccionados deben tener un tamaño uniforme.
75
14.2 Resultados.
a) Expansión de las CC expuestas a diferentes concentraciones de PFOs
después de 44 h de MIV.
76
b) Criterios de evaluación de la maduración de los ovocitos después de 44 h de
MIV utilizando la tinción de Hoechst 33258
c) Criterios de evaluación de la viabilidad de los ovocitos después de 44 h de
MIV utilizando una doble tinción con MTT (viabilidad) y Hoechst 33258 (etapa
de maduración).
77
d) Criterios de evaluación de la viabilidad de las CC teñidas con azul tripano al
0.5%. Las CC incoloras se consideraron vivas y las teñidas como muertas.
78
14.3 Medios de cultivo.
Medio TL-HEPES-PVA
componente
PM
mM
g/1000 mL
g/500 mL
g/250 mL
Na Cl
58.45
114.00
6.6633
3.3316
1.6658
KCl
74.55
3.20
0.2386
0.1193
0.0596
NaH2PO4
120.00
0.34
0.0408
0.0204
0.0102
Lactato de Na*
112.10
10.00
1.4 ml
0.7
0.35
MgCl2. 6H2O
203.30
0.50
0.1017
0.0508
0.0254
HEPES
238.30
10.0
2.3830
1.1915
0.5957
Piruvato de Na
110.00
0.20
0.0220
0.011
0.0055
Sorbitol
182.20
12.00
2.1860
1.093
0.5465
NaHCO3
84.00
2.00
0.1680
0.084
0.042
Gentamicina
575.67
0.0250
0.0125
0.0062
Penicilina G
372.5
0.0650
0.0325
0.0162
0.1000
0.05
0.025
0.2940
0.147
0.0735
PVA
CaCl2. 2H2O**
147.00
2.00
*Solución al 60% (v/v)
**Agregar al final
Ajustar pH a 7.3 - 7.4 con “Na OH” o “HCl” 1N
79
Medio para maduración (TCM-199 in vitro, México) libre de proteínas para
ovocitos porcinos.
TCM-199 suplementado con:
PVA
0.1%
10 g/L
D-Glucosa
3.05 mM
0.5496 g/L
Piruvato de sodio
0.91 mM
0.1 g/L
Penicilina
75 µg/mL
Estreptomicina
50 µg/mL
Medio TCM-199 se suplementa con:
EGF
10 ng/mL
Cisteína
0.57 mM
LH
0.5 µg/mL
FSH
0.5 µg/mL
Nota: todos los medios anteriormente descritos se esterilizan mediante filtración, las
membranas recomendadas para este procedimiento son de un diámetro de 0.22 µm
y el almacenaje recomendado es por 3 semanas a una temperatura de 4o C.
80
14.3.1 Preparación de las hormonas
LH (SIGMA L 5269) 50 µg/mL. 100X
FSH (SIGMA F-2293) 50 µg/mL. 100X
a) Pesar 0.005g de la hormona liofilizada y disolver en 10 mL de medio TCM199, de esta manera tendremos una solución hormonal de 10X.
b) De la solución anterior tomar 1 mL y diluir en 9 mL de medio TCM-199,
finalmente tendremos una solución hormonal de 1X.
c) De la solución anterior realizar alícuotas de 100 µL.
d) Guardar alícuotas a -70o C.
14.3.2 Preparación del factor de crecimiento epidérmico (EGF).
EGF (SIGMA E 4127) vial con 0.1 mg.
a) Realizar una dilución en TCM-199 suplementado con BSA al 0.1 % para
obtener una concentración de 100 µg/mL.
b) De la solución anterior tomar 10 µL y diluirla en 990 µL de TCM-199 para
tener una concentración de 1 µg/mL en un volumen final de 1000 µL.
c) De la solución anterior hacer alícuotas de 200 µL
d) Guardar alícuotas a -70 oC.
81
14.4 soluciones de la electroforesis unicelular en gel (ensayo
cometa).
Solución de lisis (1 litro).
Na OH
8 grs.
EDTA
100 mM
37.2 grs.
TRIS
10 mM
1.2 grs.
Na Cl
2.5 M
146.1 grs.
Notas:
a) Na OH. Agregar 5 grs. Al inicio de la solución y 3 grs. Al final para ayudar a
que se disuelvan los reactivos restantes.
b) Ajustar la solución a pH: 10
c) Aforar y guardar a 4 oC.
d) Importante: antes de utilizar la solución suplementar con 1 % de tritón
X-100 y 10 % de DMSO.
Buffer de neutralización (1 litro)
Tris (0.4 M) (48.5 grs./1 L)
Nota: ajustar pH con H Cl concentrado (>10 M), aforar a 1 litro, utilizar
campana de extracción en el momento de trabajar con H Cl.
82
Buffer de electroforesis (300 mM Na OH/ 1mM EDTA)
Soluciones.
A) Na OH (10 N) (200 grs/ 500 mL H2O destilada)
Nota: usar baño frio, agregar aproximadamente 10 grs al vaso hasta que se
disuelva totalmente y repetir el procedimiento anterior hasta disolver los
200 grs durante la preparación de la solución se recomienda tapar con
papel aluminio (papel aluminio con perforaciones) el recipiente.
B) EDTA (200 mM) ( 14.89grs/200 mL dH2O, pH: 10)
Nota: se recomienda utilizar agua destilada (dH2O), ajustar pH: 10 y aforar
a 200 mL.
Agarosas.
A) Agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) 0.5%
250 mg………………….50 mL de PBS (estéril)
B) Agarosa de punto de fusión normal (NMA) 1 %
500 mg………………….50 mL de PBS (estéril)
Nota: calentar en el horno de microondas hasta que la solución tome una
apariencia transparente.
83
Portaobjetos
Los portaobjetos esmerilados se limpian con etanol al 70 %. Los
portaobjetos no esmerilados se dejan 3 días en una solución de:
50/50 (V/V) de etanol/metanol, se limpian con gasas estériles y se dejan
secar a temperatura ambiente.
Nota: utilizar guantes libre de talco.
84