Preparación de ACTH 125I ó 131l

AG ISSN 0020-0867
CNEA 387
126
Preparación de Acth l ó
Su utilización en radioinmunoensayo
O. D. Bruno
E. L. Quihillalt
Comisión
Nacional
de Energía
Atómica
República Argentina
Buenos Aires, 1975
A. E. A. Mitta
131
1
INIS C L A S S I F I C A T I O N
AND
B13
ACTH
I O D I N E 125
I O D I N E 131
CHEMICAL PREPARATION
LABELLING
RADIOIMMUNOASSAY
KEYWORDS
COMISIÓN N A C I O N A L
DEPENDIENTE
DEENERGÍA
ATÓMICA
DE LA PRESIDENCIA DE LA NACIÓN
l 2 5
PREPARACIÓN DE ACTH
I
ó
1 3 1
]
Su utilización en radioinmunoensayo*
O.D.
Bruno**, E . L . Quihillalt y A . E . A , Mitta
RESUMEN
Se d e s c r i b e ia preparación de hormona a d r e n o c o r t i c o t r ó f i c a marcada con
1-125 6 1- 1 3 1 . Se d e s c r i b e n l o s m é t o d o s que demuestran el comportamiento
inmunoreactivo de l a hormona.
SUMMARY
Preparation of ACTH
^25/
OT
13])• i¡
s
u
s
e
¿
n
radioimmunoassay.
T h e preparation o f adrenocorticotropin hormone ( A C T H ) l a b e l l e d with
1 2 5
1 and
is described.
T e s t for the determination o f the immunoreactive behaviour o f the hormone are a c c o m p l i s h e d .
INTRODUCCIÓN
L a preparación de adrenocorticotrofina ( A C T H ) marcada c o n
1 ? 5
I ó
1 2 5
1
apta para su u s o en radioinmunoensayo del ACTH p l a s m á t i c o debe reunir ciertas c o n d i c i o n e s que dependen en parte del i s ó t o p o e m p l e a d o . A s i , si se utili1
za el ^ M , d e b e o b t e n e r s e una actividad e s p e c í f i c a ( A E e l e v a d a dado el cor*
Este trabajo s e realizó con apoyo del Contrato 8 1 4 / R B del O . L E . A .
** Instituto de Investigaciones Médicas, Universidad de Buenos Aires. Miembro de la
Carrera de Investigador Científico (CONICET).
-4to p e r í o d o d e s e r n i d e s i n t e g r a c i ó n ( 8 , 0 4 d ) de e s t e i s ó t o p o ; e s t o e s n e c e s a r i o
para a s e g u r a r c o n d i c i o n e s de s e n s i b i l i d a d d e l d o s a j e a d e c u a d o s o s e a : p e queña c o n c e n t r a c i ó n del trazador en el m e d i o pero s u f i c i e n t e número de c u e n tas que f a c i l i t e l a s o p e r a c i o n e s d e c o n t a j e al fin del p e r í o d o de i n c u b a c i ó n .
Si el i s ó t o p o u t i l i z a d o e s el
1 _ 5
I la s i t u a c i ó n difiere en c u a n t o a que l a A E
podrá s e r m á s baja d a d o su p e r í o d o d e s e r n i d e s i n t e g r a c i ó n más p r o l o n g a d o
(60 d ) . En c u a l q u i e r a de l o s d o s c a s o s (
l 9
M ó
1
5
" I ) , otras c o n d i c i o n e s indis-
p e n s a b l e s para la buena c a l i d a d d e la p r e p a r a c i ó n son la d e o b t e n e r un d a ñ o
o d e g r a d a c i ó n bajo y un alto n i v e l d e p u r i f i c a c i ó n .
Con la finalidad de o b t e n e r un A C T H marcado p r e s e n t a n d o l a s
caracterís-
t i c a s antes c i t a d a s , s e u t i l i z ó la t é c n i c a d e Hunter y G r e e n w o o d ( 1 ) c o n algun a s m o d i f i c a c i o n e s : e s t a t é c n i c a ha s i d o ya e m p l e a d a para la m a r c a c i ó n d e o tras h o r m o n a s p r o t e i c a s t a l e s c o m o insulina ( 2 ) HCH ( 3 ) TSH ( 4 ) HCG ( 5 ) L H
( 6 ) P T H ( 7 ) , en la D i v i s i ó n M o l é c u l a s M a r c a d a s de la G e r e n c i a d e I n v e s t i g a c i o n e s de la C o m i s i ó n N a c i o n a l d e E n e r g í a A t ó m i c a .
PARTE
EXPERIMENTAL
T o d a s l a s o p e r a c i o n e s son r e a l i z a d a s e m p l e a n d o material de v i d r i o s i l i c o nado y / o de p l á s t i c o l l e v á n d o l a s a c a b o , en lo p o s i b l e , a 4 ° C a fin d e reducir
l a s pérdidas por adsorción o degradación del ACTH ( 8 ) .
MARCACIÓN
En un p e q u e ñ o tubo d e vidrio s i l i c o n a d o c o n t e n i e n d o 2 m C i d e
c l a y , F r a n c i a ) o 0 , 7 - 1 , 0 mCi de
1 2
1 ? 1
I N a (Sa-
5 I _ \ ( N e \ v E n g l a n d N u c l e a r , USA) d i s u e l t o s
a
en 25 ¡ú de s o l u c i ó n de f o s f a t o s 0,5 M, pH 7 , ó , s e agregan s u c e s i v a m e n t e y c o n
gran r a p i d e z ( s e
e m p l e a una jeringa d e p o i i e t i l e n o de 1 mi a la que s e adapta
un fino c a t é t e r del mismo material): 3 7 , 5 ¡ig d e Cloramina T (en 25 ¡J.1 de s o l u c i ó n d e f o s f a t o s 0 , 5 M , pH 7 , 6 ) ; 10-15 /¿l d e s o l u c i ó n de f o s f a t o s 0 , 5 M , pH 7 , 6 )
2 ¡ig d e h-1-39 A C T H ( g e n t i l m e n t e p r o p o r c i o n a d a por el Dr. Gy F e k e t e , M e d i m p e x ,
B u d a p e s t , Hungría) d e s í n t e s i s .
L u e g o d e una rápida m e z c l a , s e transfiere el p r o d u c t o d e r e a c c i ó n a un tubo
c o n t e n i e n d o 125 g ( e n 25 ,.1 d e s o l u c i ó n de f o s f a t o s 0,5 M, pH 7 , 6 ) de m e t a b i s u l fito d e s o d i o a fin de detener la r e a c c i ó n .
M
- 5 PUR1F1C ACIÓN
Se c o m i e n z a inmediatamente d e s p u é s d e la m a r c a c i ó n d i l u y e n d o e l pro­
d u c t o en 1 mi d e p l a s m a humano normal f r e s c o a l o que s e a g r e g a 7 mg d e
Q U S O - G 3 2 ( g r a n u l o s d e s í l i c e m i c r o p r e c i p i t a d o s ; P h i l a d e l p h i a Quartz C o . ,
U S A ) ; l u e g o d e una b r e v e h o m o g e n e i z a c i ó n s o b r e V o r t e x , s e centrifuga 10
m i n u t o s a 3.000 rpm y s e d e s c a r t a el s o b r e n a d a n t e . E l p r e c i p i t a d o e s l a v a d o
c o n 2 mi d e agua d e s t i l a d a v o l v i e n d o a h o m o g e n e i z a r , centrifugar y d e s c a r t a r
el s o b r e n a d a n t e y repitiendo e s t a s o p e r s c i o n e s d o s v e c e s . F i n a l m e n t e e l
A C T H m a r c a d o e s extraído del QUSO c o n 2 mi de a c e t o n a al 4 0 % en á c i d o
a c é t i c o al 1 % y d i l u i d o en 4 mi de s o l u c i ó n d e v e r o n a l s ó d i c o 0 , 0 2 M , pH 8 , 4 ,
albúmina humana ( C N T S , F r a n c i a ) al 0 , 3 % .
Control de la marcación y
purificación
Se r e a l i z a mediante c o r r i d a c r o m a t o e l e c t r o f o r é t i c a de a l í c u o t a s de l o s
p r o d u c t o s de m a r c a c i ó n y p u r i f i c a c i ó n ( d i l u i d a s en plasma humano c o n azul
b r o m o f e n o l ; p r o p o r c i ó n 1:5), r e s p e c t i v a m e n t e , s o b r e papel Whatman 3 MM du­
rante 9 0 minutos a temperatura ambiente y c o n una d i f e r e n c i a de p o t e n c i a l d e
500 V . L u e g o d e s e c a d a s , l a s tiras son a n a l i z a d a s en un r a d i o c r o m a t ó g r a f o
P a r c k a r d y la importancia relativa de l o s p i c o s c u a n t i f i c a d a por s i m p l e r e c o r ­
te d e l a s m i s m a s y p e s a d a en una b a l a n z a d e p r e c i s i ó n .
Control de la
inmunoreactividad
F u e l l e v a d a a c a b o mediante i n c u b a c i ó n del A C T H m a r c a d o en l a s c o n d i ­
c i o n e s h a b i t u a l e s d e una curva de r e f e r e n c i a para d o s a j e de A C T H p l a s m á t i c o .
E s t a curva s e e s t a b l e c e r e a l i z a n d o l a s s i g u i e n t e s m e z c l a s : a) 0 , 5 mi d e p l a s ­
ma humano p e r t e n e c i e n t e a un s u j e t o previamente tratado c o n g l u c o c o r t i c o i d e s
( c a r e n t e por lo tanto d e A C T H e n d ó g e n o c o n t e n i e n d o c a n t i d a d e s p r o g r e s i v a m e n c r e c i e n t e s de A C T H humano d e e x t r a c c i ó n ( g e n t i l m e n t e p r o p o r c i o n a d o por el
Dr. C . H . L i , U n i v e r s i d a d de C a l i f o r n i a , U S A ) : 0 , 4 , 10, 2 0 , 4 0 , 6 0 , 100, 2 0 0 y
400 p g / t u b o ; b) 2 mi de una m e z c l a (preparada inmediatamente a n t e s de su u s o )
conteniendo ACTH -
1 3 1
1 ó ACTH-
1 2 5
I y antisuero a n t i - A C T H (Dr. R . D e p i e d s ,
M a r s e l l a , F r a n c i a ) en s o l u c i ó n reguladora de veronal s ó d i c o 0 , 0 2 M , pH 8 , 4 , c o n ­
t e n i e n d o m e r c a p t o e t a n o l 0 , 2 % , t r a s y l o l ( R ) 1.000 U / m l y albúmina humana 0 , 3 % .
L a m e z c l a e s d i s t r i b u i d a c o n una j e r i n g a C o m w a l l de p i p e t e o c o n t i n u o y e s t á
preparada d e manera a o b t e n e r una d i l u c i ó n final del antisuero d e 1:450.000 y
una c o n c e n t r a c i ó n final de A C T H m a r c a d o d e 10 p g / t u b o (= 4 - 5 . 0 0 0 c p m / t u b o ) .
El volumen final de i n c u b a c i ó n e s de 2 , 5 mi.
P a r a e l d o s a j e d e A C T H en m u e s t r a s p l a s m á t i c a s s e r e a l i z a n o p e r a c i o n e s
a n á l o g a s s a l v o que el A C T H d e r e f e r e n c i a d i s u e l t o en p l a s m a c a r e n t e de A C T H
- 6 endógeno e s r e e m p l a z a d o por 0 , 5 mi del plasma d e s c o n o c i d o a determinar.
C a d a muestra e s a n a l i z a d a por d u p l i c a d o . L a d e g r a d a c i ó n del trazador durante l a i n c u b a c i ó n e s determinada para la c u r v a de r e f e r e n c i a y para c a d a
muestra a d o s a r por i n c u b a c i ó n de un tubo c o n t r o l c o n t e n i e n d o t o d o s l o s r e a c t i v o s e n u n c i a d o s s a l v o el antisuero y el A C T H frío.
*
L u e g o d e i n c u b a c i ó n a 4 ° C durante 5-7 d í a s s e p r o c e d e a la s e p a r a c i ó n
d e la f r a c c i ó n d e A C T H libre ( L ) de a q u e l l a unida al antisuero ( B ) m e d i a n t e
una p a s t i l l a de 50 mg de t a l c o ( L o u i s Dreyfus & R e r s c h t e l , P a r í s ,
Francia).
D e s p u é s de c e n t r i f u g a c i ó n a 2 . 0 0 0 rpm. durante 30 minutos a 4 ° C , s e s e p a ra el p r e c i p i t a d o (fracción L ) del s o b r e n a d a n t e ( f r a c c i ó n U) por s i m p l e d e c a n t a c i ó n y a m b o s son c o n t a d o s durante 10 m i n u t o s en un c o n t a d o r P a c k a r d . El
valor porcentual de (U) con r e s p e c t o al total ( T ) e s c o r r e g i d o por s u b s t r a c c i ó n d e l por c i e n t o d e trazador d e g r a d a d o ( n o fijado en el t a l c o en a u s e n c i a
de a n t i s u e r o ) . L a curva d e r e f e r e n c i a e s trazada y l o s v a l o r e s o b s e r v a d o s para l o s p l a s m a s a d o s a r s o n t r a n s p o r t a d o s a la misma d e d u c i é n d o s e así la c o n c e n t r a c i ó n de A C T H en e s o s p l a s m a s .
RESULTADOS
Marcación y
purificación
L a figura 1 muestra un e j e m p l o del c o n t r o l de m a r c a c i ó n y p u r i f i c a c i ó n
r e a l i z a d o por c r o m a t o e l e c t r o f o r e s i s . P u e d e n c l a r a m e n t e i n d i v i d u a l i z a r s e tres
p i c o s c o r r e s p o n d i e n d o r e s p e c t i v a m e n t e al A C T H r a d i o i o d a d o que p e r m a n e c e
en el lugar d e la siembra, a la f r a c c i ó n de A C T H d e g r a d a d o que migra al c e n tro de la tira junto a l a s p r o t e í n a s p l a s m á t i c a s y, finalmente, el ioduro radioa c t i v o no fijado que migra más allá del c e n t r o d e l a tira. En el g r á f i c o inferior s e o b s e r v a el p i c o c o r r e s p o n d i e n t e al A C T H
1
3
1
1 , l u e g o d e purificar l a
hormona u t i l i z a n d o Q U S O - 6 3 2 .
L a tabla 1 s i n t e t i z a l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s u t i l i z a n d o
1 3 1
1 . D e b e seña-
l a r s e que la A E fue superior a 600 ^ C i / u g en 9 d e l a s 11 m a r c a c i o n e s y que
en 7 de l a s m i s m a s el daño de m a r c a c i ó n s e c o n s i d e r ó d e 0 % s i e n d o en l a s 4
r e s t a n t e s d e 9 , 1 1 , 15 y 1 6 % r e s p e c t i v a m e n t e . P o r p u r i f i c a c i ó n pudo eliminars e totalmente el daño e y o d u r o s .
En la tabla 2 s e o b s e r v a n l o s r e s u l t a d o s c o r r e s p o n d i e n t e s a l a s m a r c a c i o nes realizadas con
I . S ó l o en d o s de l a s s e i s m a r c a c i o n e s s e r e v e l ó l a e x i s t e n c i a de daño (7 y 9 % ) . C o m o en e l c a s o anterior, la p u r i f i c a c i ó n fue s a t i s f a c toria.
1 2 5
E s de señalar que s o b r e el total de 17 m a r c a c i o n e s e f e c t u a d a s u t i l i z a n d o
l o s d o s i s ó t o p o s , no s e o b s e r v ó ningún tipo de c o r r e l a c i ó n entre la A E o b t e n i da y el p o r c e n t a j e de daño de m a r c a c i ó n .
Control
de la
inmunoreactividad
En la figura 2 s e representan l o s v a l o r e s o b t e n i d o s para l a curva de re­
f e r e n c i a . P u e d e v e r s e que en a u s e n c i a de A C T H d e r e f e r e n c i a ,
aproximada­
mente 30 % del trazador e s l i g a d o por e l antisuero anti- A C T H y que e l agre­
g a d o de c o n c e n t r a c i o n e s p r o g r e s i v a m e n t e c r e c i e n t e de A C T H L i i n d u c e una
c a í d a de U, e s t a c a í d a e s más a c e n t u a d a para l o s primeros puntos d e la cur­
va l o que s e traduce en una p e n d i e n t e i n i c i a l pronunciada que o t o r g a gran
s e n s i b i l i d a d al s i s t e m a , p u d i e n d o l e e r s e v a l o r e s de A C T H i n f e r i o r e s a l O p g .
T
El valor d e L para el punto O d e la c u r v a e s de 2 8 , 5 ± 0 , 4 1 ( m e d i a ± ES); el
v a l o r c o r r e s p o n d i e n t e al c o n t r o l de d e g r a d a c i ó n del trazador durante la i n c u ­
b a c i ó n e s d e 15,4 + 1,2 ( m e d i a ± E S ) . No s e e v i d e n c i ó ninguna d i f e r e n c i a en
e l c o m p o r t a m i e n t o i n m u n o r e a c t i v o de l o s d o s t i p o s de A C T H marcado que fue­
ron u t i l i z a d o s .
Resultados
obtenidos
en el dosaje
de muestras
plasmáticas
L a t a b l a 3 muestra l o s r e s u l t a d o s preliminares o b t e n i d o s en un grupo d e
s u j e t o s n o r m a l e s y en p a c i e n t e s c o n d i v e r s o s trastornos del e j e h i p o t á l a m o h i p ó f i s o - a d r e n a l , mediante d e t e r m i n a c i ó n de A C T H s o b r e una muestra de p l a s ­
ma o b t e n i d a entre 8 y 9 h o r a s , ( l a s m u e s t r a s fueron o b t e n i d a s en t u b o s d e vi­
drio s i l i c o n a d o m a n t e n i d o s en h i e l o , c o n t e n i e n d o E D T A 1,0 m g / m l d e s a n g r e ,
centrifugadas
a 4
o
C, separadas y c o n g e l a d a s de inmediato a - 20° C ) . Tanto
l o s v a l o r e s en s u j e t o s n o r m a l e s c o m o l o s o b t e n i d o s en p a c i e n t e s a f e c t a d o s de
síndrome de C u s h i n g de diferente e t i o l o g í a , p o s t - s u p r a r r e n a l e c t o m í a
o en la
enfermedad d e A d d i s o n , c o n c u e r d a n c o n l o s p u b l i c a d o s por o t r o s autores ( 1 0 ,
11).
L a figura 3 e v i d e n c i a el e f e c t o de una s i t u a c i ó n de " s t r e s s " ( c i r u g í a ) s o ­
bre la c o n c e n t r a c i ó n p l a s m á t i c a d e A C T H en d o s i n d i v i d u o s n o r m a l e s d e l pun­
to de v i s t a e n d o c r i n o ; l o s v a l o r e s b á s a l e s , n o r m a l e s en el p r e - o p e r a t o r i o inme­
diato (58 y 32 p g / m l , s e encontraron claramente e l e v a d o s a 480 y 3 0 2 p g / m l
r e s p e c t i v a m e n t e en el p o s t - o p e r a t o r i o i n m e d i a t o para r e t o m a r a c i f r a s
básales
n o r m a l e s ( 2 3 y 13 p g / m l ) 24 h o r a s d e s p u é s d e la i n t e r v e n c i ó n .
L a figura 4 r e p r e s e n t a el e f e c t o de un e s t í m u l o bien c o n o c i d o , la h i p o g l u c e mia i n d u c i d a por i n s u l i n a , s o b r e l a s c o n e n t r a c i o n e s p l a s m á t i c a s de g l u c o s a , c o r t i s o i y A C T H : s i g u i e n d o al medir g l u c é m i c o ( 2 3 mg/lOQ mi a l o s 30 minutos) s e
o b s e r v a una e l e v a c i ó n de A C T H p l a s m á t i c o de 53 p g / m l ( b a s a l ) a 224 p g / m l
( 4 5 m i n u t o s ) , q u e e s s e g u i d a por un aumento d e la c o r t i s o l e m i a p l a s m á t i c a a 8,0
í / g / 1 0 0 mi ( b a s a l ) a 17,0 ug/100
ul ( 9 0 m i n u t o s ) .
E s t o s r e s u l t a d o s e v i d e n c i a n l a e s p e c i f i c i d a d de! d o s a j e al d e m o s t r a r l a s
v a r i a c i o n e s e s p e r a d a s en la c o n c e n t r a c i ó n d e A C T U en d i f e r e n t e s s i t u a c i o n e s
fisiológicas o fisiopatológicas.
-8RESUUEN
Y
CONCLUSIONES
Se e m p l e ó l a t é c n i c a de Hunter y G r e e n w o o d para la m a r c a c i ó n de A C T H
con
1 3 1
1
e
1 2 5
1 o b t e n i é n d o s e r e s u l t a d o s altamente s a t i s f a c t o r i o s en l o refe­
rente a a c t i v i d a d e s p e c í f i c a , b a j o p o r c e n t a j e de d e g r a d a c i ó n y alto g r a d o d e
pureza d e la m o l é c u l a marcada. El c o n t r o l i n m u n o r e a c t i v o d e m o s t r ó que l a
m o l é c u l a asi marcada c o n s e r v a su c a p a c i d a d d e s e r l i g a d a por un a n t i - s u e ­
ro e s p e c í f i c o . F i n a l m e n t e , l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s en la d e t e r m i n a c i ó n d e
m u e s t r a s b á s a l e s en s u j e t o s n o r m a l e s o c o n trastornos del e j e h i p o t á l a m o h i p o f i s o - a d r e n a l asi c o m o en e s t u d i o s d i n á m i c o s en s i t u a c i ó n de " s t r e s s " ,
demuestran la e s p e c i f i c i d a d del s i s t e m a d e d o s a j e . L a s p r e p a r a c i o n e s d e
ACTH
1 2 < i
I ó
según la t é c n i c a d e s c r i p t a son p e r f e c t a m e n t e a p t a s para
su u s o en un s i s t e m a de d o s a j e r a d i o i n m u n o i ó g i c o d e a d r e n o c o t i c o t r o f i n a
plasmática.
-9TABLA
1
A.C.T.H.
A.E.
3
1
l
= 487-860
DAÑO
U)
fjCi/fig
= 0 - 1 6 %
PURIFICACIÓN = No
se observa
TABLA
A.C.T.H.
1 2 5
l
A.E.
= 335-471
DAÑO
= 0 - 9 %
PURIFICACIÓN
= No
2
fíCi/fíg
0-160
NORMALES:
.- ACTH
ADDISON:
_J"l_L.
FIGURA
p g / m ! ( n = 20)
1)
270 - 5 8 0
p g / m l ( n =~- 5 )
1500
p g / m l ( n = 1^
2324
p g / m ! ( n = 1)
POR
CUSHING:
DE
ioduro
18 p g / m l ( n
ADENOMA:
S U P RA R R E N A L E C T O M 1 A T O T A L
ENFERMEDAD
d a ñ o ni
3
S . D E C U S H I N G P O R H l P E R P L ASI A :
S, D E
loduro
preliminares obtenidos
Resultados
S. D E C U S H I N G P O R
daño ni
(n = 6)
se o b s e r v o
TABLA
SUJETOS
1
(n =
1
o
-
1
!
1—
i
-
i
í
•:
i
10-
i
i'
:
1
i
¡
!
i
!
1
i-
!
:
I - I
—,—¡—,
j——!
J_-i1—1-1
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:
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1
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J..-U4T
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-
i .
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B
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^—
!
.
*^
__.
— : — r ~r—•= - *
i
, —-
I
—
^
-
FIGURA 1 b
ACTH Li, p g / t u b o
FIGURA 2
C u r v a de r e f e r a n c i a
: *-
/
« \ .
;
-11 STRESS" QUIRÚRGICO (colecistectomía)
500 r
• SUJETO A
o SUJETO e
400
300 r
200 h
100h
PdCDKUTOftla
i»H£Dijro
POSTOfER»TO*IO
IUHEPUTO
POSTOMSATOÍIO
ALEJADO
FIGURA 3
E f e c t o d e l " s t r e s s " q j i r ú r g i c o s o b r e la c o n c e n t r a c i ó n p l o s m á t i c a d e A C T H .
INSULINA, 0.1 U/Xg,«.v.
200
100
FIGURA 4
E f e c t o de la h i p o g l u c e m i a i n s u K n i c a sobre la c o n c e n t r a c i ó n p l a s m á t i c a de A C T H .
-12-
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