Técnicas en Bioquímica y Biología Molecular • Técnicas para la separación e identificación f de proteínas • Aproximaciones A i i bi bioinformáticas i f áti para ell análisis áli i d de d datos t d de espectrometría de masas • Construcción de librerías genómicas • Determinación de interacciones proteína-proteína mediante la técnica del doble híbrido • Técnicas de secuenciación paralela masiva Electroforesis SDS-PAGE • • • Tinción con Coomassie (100 ng) o Plata (1 ng) Fácil, económico, reproducible y rápido (3 h) Poca resolución en muestras complejas Valoración de la Glicina Glicina pI = (pK1 + pK2)/2 • Aparición de distintas p iónicas de la Gly y especies dependiendo del pH OH- (equivalentes) Isoelectroenfoque • • Primera dimensión (isoelectroenfoque) separa proteínas por pI en gradientes de pH inmobilizados (IPGs) IPG formados IPGs f d por dos d titipos de d acrilamida il id con pIs I muy distintos Migración de proteínas por carga pH 3.0 pH 10.0 Varias horas a 8.000V Proteínas enfocadas Isoelectroenfoque Segunda dimensión • • Una vez enfocadas las proteínas de acuerdo a su pI, se separan por tamaño en un gel de SDS-PAGE E ilib Equilibrar titira IPG con tampón t ó de d SDS SDS: m/z / constante t t P t í Proteínas enfocadas f d Electroforesis Bidimensional (2D) kDa 97 67 45 30 20 14 Ventajas e inconvenientes de 2D • R Resolución l ió tteórica ói d de 15 15.000 000 proteínas. t í P Práctica á ti 5 5.000 000 • Detección de nanogramos de proteína • Detección de cambios por cantidad de proteína proteína, o cambios por modificación post-traduccional • Problemas de detección de proteínas transmembrana o de solubilización difícil • Proteínas con pIs extremos se pierden en 1ªD Proteómica: comparación geles 2D Cerebro ratón KO Cerebro ratón normal 2D DIGE : Differential in gel electrophoresis • • • Marcaje de muestras con fluorocromos y separación en el mismo gel Vi Visualización li ió en escáner á confocal f l y análisis áli i automático t áti Se elimina variabilidad entre geles DIGE: differential in gel electrophoresis • • Análisis fácil Pérdida de resolución, incremento linearidad (103-105) Identificación de proteínas • 2D permite identificar manchas diferenciales entre 2 muestras, pero no proporciona la identidad de la proteína sólo tamaño y pI proteína, Análisis de péptidos trípticos • • • Extracción de proteína del gel Digestión con tripsina Análisis de péptidos trípticos por MALDI-ToF tripsina Digestión con tripsina proteína péptidos MSQTGSHPGRGLAGRWLWGAQPCLLLPIVPLSWLVWLLLLLLASLLPSARLASPLPREEEIVFPEKLNGSV MSQTGSHPGR GLAGR WLWGAQPCLLLPIVPLSWLVWLLLLLLAS LLPSAR LASPLPREEEIVFPEK LNGSV Ejercicio • http://us.expasy.org/ • PeptideMass • ALB (Human) • Determinar en cuántos péptidos se digiere por Tripsina, y en cuántos por Quimotripsina Espectrometría de masas • • • Determinación de la masa exacta de un ión (relación carga/masa) M ti A i t dL Matrix-Assisted Laser-Desorption/Ionization D ti /I i ti (MALDI) Time of Flight (ToF) Péptidos Pé tid cargados d positivamente Diferencia de potencial (30.000 V) + detector + + ++ Tiempo de vuelo (ToF) P l d Pulso de Lá Láser Análisis MALDI-ToF 30.000V + + WLWGAQPCLLLPIVPLSWLVWLLLLLLAS LLPSAR + + + + + + + H lá Haz láser GLA AGR • LNG GSVAC • A pH ácido los péptidos tienen carga positiva La energía de un haz láser en una matriz separa los péptidos é tid y permite it que vuelen l La masa molecular (m/z) se determina a partir del tiempo de vuelo (EK=1/2mv2) LASPLPREEEIVFP PEK • + + + Espectro de masas Detalle espectro de masas • Resolución de formas isotópicas p Bases de datos • El patrón de masas de los péptidos trípticos es único para cada proteína • Existen bases de datos con el patrón de masas esperado de los péptidos trípticos de cada proteína • 4 ó 5 péptidos son suficientes para identificar una proteína ICAT: Espectrometría cuantitativa • La espectrometría de masas no es cuantitativa • Sólo un 30-40% de los péptidos vuelan, unos dando más señal que otros: diferencias en secuencia facilitan ionización y/o vuelo • La modificación de péptidos permite ver diferencias cuantitativas entre muestras • ICAT: Isotope-coded affinity tag Resolución de isótopos • • La espectrometría permite diferenciar mezclas isotópicas (D, 13C,…) ICAT marcaje ICAT: j de d dos d muestras t con mismo i compuesto, t pero de composición isotópica distinta Marcaje ICAT o iTRAQ • • • • • Reactivo: pesado y ligero Marcaje y combinación Separación por afinidad Cromatografía fase reversa Análisis espectrométrico Reactivo ICAT Secuenciación péptidos MS • Espectrometría de masas en tándem Separación péptidos Fragmentación péptidos Separación péptidos Secuenciación péptidos MS Péptidos fragmentados A-M-L-Q-S-R A M L Q S R+ M-L-Q-S-R+ Péptido original (m/z=687) L-Q-S-R L Q S R+ A-M-L-Q-S-R+ Q-S-R+ Fragmentación por colisión S-R S R+ A-M-L-Q-S-R+ R+ 485 687 157 616 372 R+ S 244 Q L m/z M A Identificación de péptidos por ICAT o iTRAQ • • • Identificación por MS de pares de picos separados 8 Da Cuantificación por altura y área Selección péptidos diferenciales, secuenciación MS/MS Aplicaciones: Perfil de péptidos • Las muestras L t biológicas bi ló i contienen ti numerosos péptidos é tid de bajo peso molecular • La espectrometría de masas directa permite obtener patrones de p p péptidos p específicos p de cada muestra • La prepurificación en chips de proteínas con distintas afinididades fi idid d permite i obtener b gran iinformación f ió d de una muestra biológica • SELDI: Surphace-enhanced laser-desorption/ionization Perfil de péptidos SELDI + microcaptura MALDI Imaging