Dosage de l`acide acétique dans les vins par méthode

RESOLUCIÓN OIV/OENO 391/2010
LÍNEAS DIRECTRICES
ENOLOGÍA
SOBRE
LOS
AUTOANALIZADORES
COLORIMÉTRICOS
EN
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2 apartado 2 iv del acuerdo del 3 de abril 2001 relativo a la creación
de la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis,
CONSIDERANDO la resolución Oeno 10/2005 «Guía práctica para la validación, el
control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis
enológico alternativo», que permite a los laboratorios efectuar el trabajo de enlace del
método interno automatizado con el método de referencia OIV.
CONSIDERANDO que esta guía incluye también procedimientos de control de la
calidad de los resultados obtenidos por estos métodos automatizados, que garantizan
una utilización segura.
CONSIDERANDO que sólo los métodos publicados en la Recopilación de los métodos
internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación de los
métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen vitivinícola de la
OIV tienen un carácter oficial de referencia y son aplicables para el control y
reglamento de discrepancias.
DECIDE publicar independientemente las directrices relativas a los autoanalizadores
colorimétricos en enología adjuntas.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
1/46
DIRECTRICES SOBRE LOS ANALIZADORES AUTOMÁTICOS EN ENOLOGÍA
La primera evolución del análisis automático en enología apareció a principios de los
años setenta. Se realizaron a partir de analizadores de flujo continuo, utilizados hasta
entonces esencialmente en biología médica.
Los principales parámetros accesibles eran entonces la acidez volátil, los azúcares
reductores, el dióxido de azufre libre y total. Más tarde, se adquirieron algunas
técnicas enzimáticas, autorizando, en particular, la dosificación de la glucosa y la
fructosa y de los ácidos málico y láctico.
En 1980, los analizadores de infrarrojo cercano (PIR) permitieron una medida rápida
del grado alcoholico volumétrico en los vinos y de los azúcares en los mostos.
Los primeros analizadores secuenciales, resultantes del análisis médico, aparecieron a
principios de los años noventa. Permitieron rápidamente el acceso a numerosas
determinaciones basadas en reacciones químicas (compuestos fenólicos totales,
dióxido de azufre libre y total, de ácido tartárico, ácido acético, o enzimáticos (glucosa
y fructosa, ácido málico y láctico, ácido cítrico,…)
Más tarde, al final de los años noventa, la técnica a infrarrojos por transformada de
Fourrier (IRTF) vino a completar los procesos automáticos a disposición de los
laboratorios de enología.
Todas estas técnicas automáticas están actualmente ampliamente extendidas en todo
el mundo. Permitieron una disminución muy significativa del coste del análisis
enológico que se tradujo en la posibilidad, no de disminuir éste para los usuarios sino
de permitirles acceder, para un coste dado, a muchos más parámetros y en
consecuencia a más información. Esta situación permitió acompañar mediante el
análisis todas las etapas de la vida del vino de una manera mucho más eficaz.
El análisis automático también rápidamente resultó fiable y repetible, a condición de
aplicar técnicas de control de calidad interna (CQI)adecuadas.
Una característica fundamental de todas las técnicas automáticas es que son
estrictamente comparativas. Los analizadores automáticos deben, en efecto, ser
objeto de calibraciones iniciales con patrones de valor conocido. Estas calibraciones
pueden ser permanentes, semipermanentes, diarias o incluso estar
asociadas a cada serie de muestras. La calidad de los resultados obtenidos ,depende
por tanto directamente de la de los patrones de calibración aplicados. Estos patrones
pueden ser vinos o mostos que presentan valores conocidos para los parámetros
buscados. Pueden también ser soluciones sintéticas.
Los métodos automáticos siguen siendo, generalmente, métodos internos para los
cuales cada laboratorio debe poder asegurar la calidad de los resultados utilizando
distintos enfoques:
- validación inicial del método
- calidad de los patrones de calibración y control utilizados
- participación regular en cadenas de comparación entre laboratorios
- comparación regular de los resultados con los obtenidos por los métodos de
referencia, etc…
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
2/46
La amplia utilización de las técnicas automáticas en el mundo del vino vuelve su papel
tecnológico, comercial y de control, innegable y fundamental para la economía y los
intercambios vitivinícolas. Ello justifica la publicación de esta guía que no constituye
un documento de referencia pero solamente de información. Los objetivos de este
documento son solamente:
- describir el principio de las técnicas aplicadas, la práctica de su aplicación y
los límites de su utilización.
- enumerar los métodos aplicados más corrientes, sabiendo que estos son a
menudo adaptados parcialmente por los laboratorios en función del aparato
utilizado o las matrices aplicadas. La lista propuesta no es, en ningún caso,
restrictiva y son posible otras aplicaciones. Regularmente se proponen nuevas
aplicaciones..
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
3/46
DIRECTRICES SOBRE LOS AUTOANALIZADORES COLORIMÉTRICOS
EN ENOLOGÍA
Advertencia: Esta guía no constituye un documento de referencia sino sólo de
información. Los métodos que figuran en las líneas directrices no pueden ser
considerados como métodos de referencia de la misma manera que los que figuran en
la Recopilación de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV
o en la recopilación de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas
de origen vitivinícola de la OIV. Sólo los métodos publicados en la Recopilación de los
métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación
de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen
vitivinícola de la OIV tienen carácter oficial y son aplicables para el control y la
solución de controversias..
Estos analizadores automatizan las diferentes etapas de un análisis químico o
enzimático, y utilizan una detección colorimétrica. Existen dos grandes familias de
analizadores en enología:


Los analizadores de flujo continuo;
Los analizadores secuenciales.
1 LOS ANALIZADORES DE FLUJO CONTINUO
Los primeros trabajos sobre la automatización del análisis químico en enología por flujo continuo
fueron realizados por MORFAUX, SARRIS et al. entre 1969 y 1972. Sin embargo, hasta 1974
esta técnica no empezó a llegar a los laboratorios de enología de campo, con la puesta a punto
de métodos fiables y repetibles.
1.1
Composición y principio de una cadena de análisis automático de flujo continuo
Las cadenas de análisis automático de flujo continuo se componen de módulos independientes,
cada uno de los cuales cumple una función especifica (figura 1).
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
4/46
1.2 El distribuidor de muestra
Está formado por una bandeja que puede contener de 20 a 60 vasos de muestra de un volumen
de entre 1 y 3 ml.
Un brazo pivotante provisto de una aguja toma las muestras unas tras otra
. Entre cada
muestra, la aguja se sumerge en un líquido de lavado. La aguja está unida al resto del circuito
analítico por un tubo de PVC. Así se aspira por la aguja hacia el circuito analítico el líquido de
lavado, una muestra, de nuevo el líquido de lavado y una nueva muestra, etc.. La cadencia del
análisis se regula a nivel del distribuidor de muestra. Si la aguja toma una muestra durante un
minuto y se sumerge en el líquido de lavado durante otro minuto, la cadencia será de 30
muestras por hora. Es posible ajustar a voluntad esta cadencia, así como la relación del tiempo
de lavado y el tiempo de toma de la muestra, que no tiene por qué ser de 1 como en el ejemplo
anterior, sino de 2, 1/2, 1/3, 1/4, etc.
1.3 La bomba peristáltica
Es el corazón de la cadena de análisis automático. La bomba regula todos los movimientos del
líquido en el circuito analítico.
Suele estar formada por entre 20 y 30 canales. Cada uno de ellos está formado por un tubo,
generalmente de PVC, presionado contra un soporte por una serie de rodillos. El avance de
estos rodillos hace circular el líquido dentro del tubo de bomba. El caudal de cada uno de los
tubos depende de su diámetro interior. Así, utilizando tubos de diámetros diferentes (de 0,005 a
0,110 cm) y aun manteniendo la velocidad de avance de los rodillos de la bomba rigurosamente
constante, puede crearse una gama muy amplia de caudales.
Esto permite regular de forma precisa los caudales de admisión de la muestra y de los
diferentes reactivos en el circuito analítico.
1.4 Un casete analítico
Incluye todos los elementos del circuito analítico. En él, la muestra puede someterse a
diferentes tratamientos en función del análisis a realizar:
dilución;
diálisis;
adición de reactivo;
mezcla;
destilación;
Transferencia al baño de agua termostático (temperatura y duración variables).
Una parte del circuito puede termorregularse.
Al salir de la bomba, las burbujas de aire segmentan todos los flujos líquidos que circulan por el
circuito analítico cada 1 ó 2 centímetros. Estas burbujas de aire, gracias a las fuerzas de tensión
superficial, impiden la difusión de un compuesto en solución de una sección de columna líquida
tomada entre dos burbujas hacia la que le precede o le sigue. Además, la burbuja de aire seca
la pared del tubo de vidrio o PVC por el que circula.
De este modo, es imposible la contaminación de una muestra a otra, así como la dilución de una
muestra por el líquido de lavado que le precede y le sigue.
Este principio fundamental de la separación de los líquidos por una burbuja de aire se utiliza
empezando desde el del distribuidor de muestra. A nivel de la aguja de mustreo , la aspiración
es constante; cuando la aguja pasa del baño de lavado a la cubeta de muestra, se toma una
pequeña cantidad de aire, que crea una burbuja que, en el tubo de toma, separa el líquido de
lavado de la muestra.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
5/46
Existe una segunda generación de material de flujo continuo, que utiliza la técnica del
microflujo, que permite evitar la segmentación. Este tipo de material, debido a problemas de
obstrucción difíciles de resolver, goza de poca difusión. Los principios analíticos siguen siendo
los mismos que para los equipos de segmentación.
1.5 Un detector
La detección más habitual se hace por colorimetría. La mayoría de los análisis químicos
automatizados se basan en un método colorimétrico, en particular en el ámbito enológico. Sin
embargo, pueden utilizarse otros detectores:
-
espectrofotómetro UV;
fotómetro de llama;
fluoroscímetro;
nefelómetro;
contador de células;
refractómetro;
electrodos específicos;
1.6 Un registrador
La presencia del compuesto buscado en la muestra tomada se traduce, en el detector, por una
señal cuya la intensidad es proporcional a la concentración de dicho compuesto. Esta señal se
registra en forma de picos (fig. 2).
Entre cada pico, el retorno hacia la línea de base corresponde a la extracción del líquido de
lavado.
La fiabilidad del método de análisis de flujo continuo depende de la lectura del registrador,
según los principios siguientes:
1° La creación de un estado de equilibrio en el circuito analítico tal que el retorno a la línea de
base se obtiene
siempre que se extraiga líquido de lavado y por el hecho que
una
concentración determinada en la muestra del compuesto analizado dé un pico de una altura
constante.
2° El método de dosificación es un método comparativo. Todas las mediciones se realizan
respecto a una gama patrón cuyas concentraciones son perfectamente conocidas.
Cualquier disfunción del circuito se traduce en una perturbación del registro (desviación de la
línea de base, variación de la forma de los picos, variación de la altura de los picos de calibrado,
etc.), lo que limita los errores de análisis.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
6/46
Fig. 2
Modelo de registro obtenido en el caso de la dosificación de la acidez volátil en los vinos
para una cadencia de 30 muestras por hora.
(los valores indicados se expresan en g/l de ácido sulfúrico)
1.7 Una interfase digital
Permite convertir la señal analógica procedente del colorímetro en un valor numérico que puede
expresarse directamente en concentración del compuesto dosificado. Generalmente incluye un
sistema de control que permite garantizar que la dosificación no se ha visto perturbada.
2
LOS ANALIZADORES SECUENCIALES
2.1 Principio y organización de un analizador secuencial
Estos analizadores son casi siempre multiparamétricos. Así, pueden realizar varias
dosificaciones sobre una misma muestra y dichas dosificaciones pueden programarse para cada
muestra. Cada muestra a analizar se toma y se coloca en una cubeta de medición transparente,
donde recibe el o los reactivo(s). Se realiza una medición colorimétrica directamente en esa
cubeta. Las cadencias están comprendidas entre 50 y 1.000 dosificaciones por hora. Las
principales aplicaciones se efectúan en el ámbito del análisis químico o del análisis enzimático.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
7/46
Los volúmenes de reactivo necesarios son bajos, lo que limita los costes, en particular para las
dosificaciones enzimáticas. Un analizador secuencial se compone de varios elementos.
2.1.1 Composición de un analizador secuencial
2.1.1.1 Una bandeja de toma de muestras
Puede contener un número variable de cubetas
en los que se colocan las muestras a analizar.
2.1.1.2 Una bandeja de reacción
Se compone de cubetas transparentes que reciben la toma de muestra de la muestra a analizar
y el o los reactivos necesarios. Se mantienen en un baño térmico a temperatura constante y
permiten obtener una lectura colorimétrica. Las cubetas pueden ser de un solo uso o bien
limpiadas mediante un sistema de lavado antes de una nueva utilización.
2.1.1.3 Una bandeja de reactivos
Soporta los depósitos de los reactivos para realizar las dosificaciones deseadas. Se colocan en
un recinto refrigerado, lo que permite utilizar reactivos sensibles en el caso de los métodos
enzimáticos.
2.1.1.4 Uno o varios brazos de toma de muestra
Mediante un sistema de jeringa automática, permiten tomar las muestras de la bandeja de toma
y los reactivos de la bandeja de reactivos, y colocarlos sucesivamente en la cubeta de reacción .
2.1.1.5 Un lector óptico
Permite una medición colorimétrica de las diferentes cubetas reactivas, ya sea en momentos
precisos (inicio y fin de la reacción, por ejemplo), o de forma dinámica para poder trazar una
curva de reacción para cada una de ellas. En este segundo caso, la medición de la velocidad
inicial de reacción puede evaluarse y utilizarse para el cálculo de la concentración del compuesto
buscado.
2.1.1.6 Un módulo electrónico-informático
Permite controlar el sistema y realizar los cálculos necesarios para obtener el resultado buscado.
2.1.2 Esquema analítico
El esquema analítico puede ser variable. El ejemplo descrito a continuación corresponde a los
casos más clásicos. Consta de las etapas siguientes:
Toma de muestra
La muestra de vino cuyo volumen se determina para cada dosificación se toma de la bandeja de
muestra y se coloca en una cubeta de reacción.
2.1.2.1 Adición del primer reactivo
El primer reactivo (R1) se toma de la bandeja de reactivos, para un volumen específico, y se
añade a la cubeta de reacción. El conjunto suele homogeneizarse mediante un sistema de
agitador.
2.1.2.2 Tiempo de reaación 1
La mezcla de reacción se deja en el estado actual durante un tiempo determinado (en general,
de 4 a 6 minutos).
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
8/46
2.1.2.3 Medición de la absorbancia
Se efectúa una primera medición de absorbancia a la longitud de onda requerida. Corresponde
al punto cero de la reacción ejecutada y permite tener en cuenta una eventual influencia del
color del vino.
2.1.2.4 Adición del segundo reactivo
El segundo reactivo (R2) se agrega a la cubeta de reacción. Éste es el que desencadena la
reacción colorimétrica buscada.
2.1.2.5 Tiempo de reacción 2
La mezcla de reacción se deja en el estado actual durante un tiempo determinado (en general,
de 4 a 6 minutos).
2.1.2.6 Medición de la absorbancia
Se efectúa una segunda medición de absorbancia a la longitud de onda requerida. Permite
medir la variación de absorbancia debida a la reacción en sí.
Este esquema básico puede variar. Así, con los equipos
absorbancia puede realizarse de forma dinámica con una
ejemplo. Esto permite trazar una curva de reacción y medir la
en condiciones analíticas precisas, puede ser proporcional a
buscado.
más potentes, la medición de
lectura cada 12 segundos, por
velocidad inicial de reacción que,
la concentración del compuesto
2.1.2.7 Cálculo de las concentraciones
Para las aplicaciones enológicas, siempre se realiza por calibrado con vinos de concentración
conocida de analito o soluciones sintéticas del mismo. El número de patrones de calibrado
puede ser variable y más elevado si la curva de reacción no es lineal.
Ciertos materiales sólo pueden utilizar un reactivo, lo que elimina la posibilidad de realización de
ciertas dosificaciones para las cuales se necesitan dos reactivos distintos. Por el contrario, los
equipos que permiten emplear dos reactivos pueden utilizar fácilmente uno solo si ello basta
para el método considerado.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
9/46
ANEXO 1
EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DOSIFICACIÓN HABITUALES EN ENOLOGÍA MEDIANTE
ANALIZADORES AUTOMÁTICOS DE FLUJO CONTINUO
Los métodos descritos a continuación sólo se describen a modo de ejemplo, pueden utilizarse
otros métodos.
1 Determinación del contenido de acidez volátil en los vinos y
los mostos
1.1 Principio
La acidez volátil está formada por los ácidos grasos pertenecientes a la serie acética. Los ácidos
láctico, succínico, carbónico, así como el dióxido de azufre, están excluido de la acidez volátil.
Los ácidos de la serie acética se separan de los constituyentes del vino por microdestilación a 98
°C bajo corriente de nitrógeno. El ácido láctico se rectifica durante la destilación. El dióxido de
azufre es oxidado en ácido sulfúrico por el peróxido de hidrógeno y se elimina antes de la etapa
de destilación. El gas carbónico no interfiere. El destilado de los ácidos de la serie acética se
pone en presencia de un reactivo de óxido-reducción, cuyas variaciones de intensidad colorante
son proporcionales al contenido de acidez volátil: yoduro de potasio o azul de bromofenol.
1.2 Material
Cadena de flujos segmentada.
1.3 Reactivos y soluciones
1.3.1 Solución de peróxido de hidrógeno

Peróxido de hidrógeno (N° CAS [7722-84-1]) del 30 al 35 % (o 110 vol.)

Agua desmineralizada hasta alcanzar 200 ml.
Conservación: 1 día.
0,5 ml
1.3.2 Solución de ácido tartárico al 5 %

Acido tartárico (L, D o DL) cristalizado puro
50 g

Agua desmineralizada hasta alcanzar 1.000 ml.
Conservación en vial opaco: 1 mes a + 4 °C.
1.3.3 Yoduro y yodato de potasio

Solución de KI (N° CAS [7681-11-0]) al 10 % (p/v)

Solución de KIO3 (N° CAS [7758-05-6]) al 0,2% (p/v)
Conservación en vial opaco: 1 mes.
Se puede comprobar la neutralidad de las soluciones de KI y KIO3 mezclando pequeñas
cantidades en un tubo. La mezcla debe permanecer incolora.
1.3.4 Azul de bromofenol
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
10/46

Indicador con color
- Azul de bromofenol (N° CAS [115-39-9])
- Fosfato de potasio (N° CAS [7758-1-4]) 0.1 M
- Tetrahidroborato de sodio (N° CAS [16940-66-2]) 0,1 M
- Agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml.
Agitar y deje reposar durante 3 días protegido de la luz.
330 mg
100 ml
5 ml
Antes de la utilización, filtrar y ajustar el pH a 4,9 con la solución de tetrahidroborato de sodio.
1.3.5 Soluciones de calibrado (a elegir)
1.3.5.1 Soluciones de ácido acético (N° CAS [64-19-7]) de 0,2 a 1 g.l-1 expresado en H2SO4 (de
4 a 20 meq o de 0,28 a 1,40 g.l-1 de ácido acético)
Conservación: 1 día.
1.3.5.2 Vinos de referencia de contenido de acidez volátil conocido.
1.4 Método de trabajo
El diagrama de flujos. esta indicado en el anexo
Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. La cadencia de análisis puede variar
de 30 a 60 muestras por hora según el montaje utilizado.
1.5 Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,05 g.l-1 de H2SO4 (0,07 g.L-1 en acide acétique)
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,10 g.l-1 de H2SO4 (0,14 g.L-1 en acide acétique)
1.6 Bibliografía
DUBERNET M. Dosage automatique de l’acidité volatile dans les vins. Connaiss. Vigne et Vin,
1976,10,3, 297-309.
PILONE G.J. Effect of lactic acid on volatile acid determination of wine. J. of Oenol. 1967,18,
149-156.
SARIS J., MORFAUX J.N., DERVIN L. Détermination automatique de l’acidité volatile du vin. Ind.
Alim. Agric., 1970, 87, 115-121.
1.7 Anexos: Ejemplos de diagramas de flujo
1.7.1 Azul de bromofenol
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
11/46
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
12/46
1.7.2 Yoduro de potasio
2 Determinación del contenido de ácidos L-málico y L-láctico en
los vinos y los mostos
2.1 Principio
En presencia de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD), el ácido es oxidado en una reacción
catalizada por su enzima específica:


la malato-deshidrogenasa (MDH) en el caso del ácido málico,
la lactato-deshidrogenasa (LDH) en el caso del ácido láctico.
Es una reacción de equilibrio que se desplaza en el sentido de la formación de NADH mediante
un tampón de hidrazina básica y un exceso de NAD.
MDH
L-malato + NAD+ <==> oxaloacetato de hidrazona + NADH + H+
LDH
L-lactato + NAD+ <==> piruvato de hidrazona + NADH + H+
La cantidad de NADH producida es proporcional a la concentración de ácido de la muestra. Su
absorbancia se mide a 340 nm.
2.2 Material
Cadena de flujo continuo segmentado.
2.3 Reactivos
2.3.1 Brij 35 (N° CAS [9002-92-0]) 30% (p/v)
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
13/46
2.3.2 Tampón pH 9,5 aprox.
Para 500 ml:

Glicina pura
(N° CAS [56-40-6])

Sulfato de hidrazina (N° CAS [10034-93-2])

EDTA (N° CAS [60-00-1])

Hidróxido de sodio (N° CAS [1310-73-2])

Brij 35(N° CAS[9002-92-0]) 30 %

Agua bidestilada hasta alcanzar 500 ml.
Filtrar si es preciso. Conservación máxima 2 meses a +4°C.
38
26
l,0
20
g
g
g
g
5 gotas
+
2.3.3 NAD , MDH y LHD

β Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) (NAD) (N° CAS [53-84-9]) de
pureza ≥ 98%

MDH suspensión en sulfato de amonio (N° CAS [9001-64-3])

LDH suspensión en sulfato de amonio (N° CAS [9001-60-9])
Conservación:

Vial MDH o LDH no abierto a -20 °C hasta a la fecha de caducidad.

Vial abierto +4 °C como máximo 6 meses o hasta la fecha de caducidad.

El polvo de NAD se conserva en seco a +4 °C hasta la fecha de caducidad.
2.3.4 Soluciones enzimáticas para el análisis


Solución NAD a 100 mg para 10 ml de agua bidestilada.
Solución de MDH o LDH: 100 µl en 10 ml de agua bidestilada. Las cantidades a preparar
dependen de la duración del análisis.
Conservación: una semana a +4 °C.
2.3.4.1 Soluciones de referencia de ácido L-málico (N° CAS [97-67-6]) o L-láctico (N° CAS [7933-4]) de 0,5 a 5 g/l
2.4 Método de trabajo
El diagrama de flujos aparece en el anexo.
Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. En el caso de muestras que
contengan materiales en suspensión, es indispensable realizar un centrifugado.
La cadencia analítica es de 30 muestras por hora, al menos con tiempo de toma de muestra /
tiempo de lavado = 1/1.
Nota: para los vinos tintos de color intenso, debe restarse a la absorbancia medida la debida a
la coloración del vino a 340 nm por tratamiento de las muestras con los reactivos sin la enzima,
pero manteniendo la coenzima NAD.
2.5 Expresión de los resultados
Los resultados se expresan en gramos por litro con un decimal.
2.6 Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,15 g.L-1
2.7 Bibliografía
Battle, J.-L. y Bouvier, J.C., Automatisation de dosages enzimatiques pour l’analyse
oenologique, Revue Française d’Oenologie (Cahier Scientifique), 1986, 26, (101) : 38-43.
Battle, J.-L., Joubert, R., Collon, Y. y Jouret, C., Dosage enzimatique en flux continu du Lmalate et du L-lactate dans les moûts de raisin et les vins, Ann. Fais. Exp. Chim., 1978,
71(766) : 223-228.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
14/46
Curvelo-Garcia, A. S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées à l’analyse
des vins et des moûts, Feuillet Vert de 1’OIV n° 941 (1993).
2.8 Anexo: Ejemplo de diagrama de flujo
ml/mn
3 Determinación del contenido de ácido tartárico en los vinos y los mostos
3.1 Principio.
El método de Rebelein se aplica a muestras de vino dializadas para desarrollar un color rojo
anaranjado en caliente (37 °C) con el metavanadato de sodio en medio alcalino. La absorbancia
se mide a 520 nm. Pueden producirse interferencias en caso de altos contenidos de ácido málico
y azúcares.
3.2 Material.
Cadena de flujo continuo segmentado.
3.3
Reactivos.
3.3.1
Brij 35 (N° CAS [9002-92-0]) 30% p/v
3.3.2
Ácido acético (CH3COOH) (N° CAS [64-19-7]) puro.
3.3.3
Solución de acetato de sodio (NaCH3COO) (N° CAS [127-09-3]) al 27 %.
3.3.4
Vanadato de amonio (NH4 VO3) (N° CAS [7803-55-6])
3.3.5
Solución N de hidróxido de sodio (NaOH) (N° CAS [1310-73-2])
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
15/46
3.3.6
Solución ácida de acetato de sodio

ácido acético
80 ml

acetato de sodio 27 %
320 ml

Brij 30 %
1 ml

agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml
Conservación: 1 semana.
3.3.7
Solución de metavanadato de sodio.

vanadato de amonio
4g

solución NaOH M
150 ml

acetato de sodio 27%
200 ml

agua destilada hasta alcanzar 500 ml.
Conservación: 1 semana.
3.3.8 Soluciones de referencia de ácido D(+)-tartárico (N° CAS [147-71-7]) de 1 a 8 g/l.
3.4
Método de trabajo.
El diagrama de flujos aparece en el anexo.
Las muestras no se someten a ningún tratamiento previo. En el caso de los mostos u otras
muestras que contengan materiales en suspensión, es indispensable realizar un centrifugado.
La cadencia analítica es de 30 muestras por hora (tiempo de toma / tiempo de lavado = 1/1).
3.5
Expresión de los resultados.
Los resultados se expresan en gramos por litro con un decimal.
3.6
Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,7 g.l-1
3.7
Bibliografía
Battle, J.-L., Joubert, R., Colion, Y. y Jouret, C., Utilisation du flux continu pour le dosage
colorimétrique de l’acide tartrique dans les moûts de raisin et les vins par la méthode de
Rebelein, Ann. Fals. Exp. Chim., 1978, 71(764), 155-158.
Curvelo-Garcia, A.S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées àl’analyse
des vins et des moûts, Feuillet Vert de l’OIV N°941 (1993).
Trossais J. y Asselin C. Influence des teneurs en acide malique des moûts sur le dosage de
l’acide tartrique par analyse en flux continu par colorimétrie avec le métavanadate. Conn. Vigne
Vin. 1985, 19, 4, 249-259.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
16/46
3.8
Anexo: Ejemplo de diagrama de flujos
4
Determinación del contenido de ácido cítrico en los vinos y los
mostos
4.1 Principio
El método automático para la determinación fluorimétrica del ácido cítrico se basa en el
método de la diciclohexilcarbodimida (DCC). La muestra reacciona con la DCC en
presencia de ácido acético en medio anhidro, lo que da lugar a la formación de aconitina.
La longitud de onda de transmisión de la aconitina es de 490 nm y la longitud de onda de
excitación es de 400 nm. La señal dada por el fluorímetro se envía a una interfase que
está conectada al sistema software.
4.2 Material
Cadena de flujo segmentada.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
17/46
4.3 Reactivos y soluciones
4.3.1 Solución de cloruro de sodio (NaCl)
Cloruro de sodio (NaCl) N° CAS [7647-14-5], 4,0 g
Ácido acético (CH3COOH) (N° CAS [64-19-7]) 180 cm3
Etanol (CH3CH2OH) N° CAS [64-17-5], 20 cm3
Solución de ácido cítrico 10,0 g/dm3, 30 cm3
Agua tipo I (Norma ISO 3696) o equivalente hasta alcanzar 2.000 cm3
Brij 35 (30%) N °CAS [9002-92-0], 6 cm3
Preparación:
En un frasco graduado de 2.000 cm3, diluir el cloruro de sodio en aprox. 1.600 cm3 de
agua. Agregar delicadamente el ácido y dejar reposar hasta alcanzar la temperatura
ambiente. Agregar el etanol y la solución de ácido cítrico y mezclar. Ajustar a la marca
con agua desmineralizada, agregar el brij y mezclar.
Conservación: 6 meses
4.3.2 1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]
4.3.3 Solución de ácido acético al 1,7% (v/v)
Ácido acético (CH3COOH) (N° CAS [64-19-7]) 17 cm3
1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] hasta alcanzar, 1000 cm3
Preparación:
En el matraz de 1-butanol (1 litro), agregar el ácido con precaución. Mezclar
bien.
Conservación: 1 año
4.3.4 Solución Diciclohexilcarbodimida (DCC)
Diciclohexilcarbodimida (C13H22N2) N° CAS [538-75-0], 41 g
1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] hasta alcanzar, 1000 cm3
Preparación:
Pesar la diciclohexilcarbodimida en un Erlenmeyer de 1.000 cm3 y agregar el 1butanol. Mezclar bien.
Conservación: 1 año
4.3.5 Brij 35 (N° CAS [9002-92-0])
4.3.6 Solución de descontaminación
1-butanol (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]
4.4 Preparación de la muestra
desgasificar la muestra
para eliminar la mayor cantidad posible de dióxido de
carbono utilizando vacío, al menos 2 minutos con agitación.. Si la muestra está
turbia debe ser filtrada.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
18/46
4.5 Soluciones de calibrado.
4.5.1 Soluciones de ácido cítrico (C6H8O7) N° CAS[77-92-9], de 0,07 a 1,00
g/dm3 en ácido cítrico
Conservación: la estabilidad depende del control interno del calibrado.
4.5.2 Patrones de control de concentración conocida de ácido cítrico.
Conservación: 1 mes o según el control interno
4.6 Método de trabajo
El diagrama de flujo aparece en el anexo. La cadencia de análisis es de aprox. 18
muestras por hora según el montaje utilizado.
4.7 Resultados
1
Los resultados se presentan con dos decimales y se expresan en g (ácido cítrico) .L .
4.8 Características del método descrito
Repetibilidad: 0,03 g (ácido cítrico) .L-1
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,03 g (ácido cítrico) .L -1
Incertidumbre : uexp= 0.20 x concentración de la muestra en g (ácido cítrico) .L-1
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
19/46
4.9 Anexo: Ejemplo de diagrama de flujo
Bomba Debitos
Fregadero
ml/min
Fluorometro
Emisión 490 nm
extinción à 400 nm
2 mm d'épaisseur celular
Acido acético
DCC
aire
n-butanol
aire
cloruro de sodio
muestra
Catador
fregadero
fregadero
o
* Membrana de dialysis, Ref SA5283
** Tubo bomb en aciflex
5 Determinación del contenido de glucosa y fructosa en los vinos y los
mostos
5.1
Principio.
El método de dosificación permite determinar la concentración de glucosa y fructosa por
separado o la suma de estas dos concentraciones en los vinos o los mostos.
5.1.1
Fosforilación de la glucosa y la fructosa.
Esta reacción se catalizada por hexoquinasa (HK):
HK
glucosa + ATP <==> glucosa-6-fosfato + ADP (1)
HK
fructosa + ATP <=> fructosa-6-fosfato +ADP
ATP:
ADP:
adenosina trifosfato.
adenosina difosfato.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
20/46
5.1.2
Oxidación de la glucosa-6-fosfato(G-6-P).
Se realiza por la acción de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), en presencia de
su enzima específica glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH).
G6PDH
G-6-P + NADP+ <==> gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ (2)
La reacción de equilibrio se desplaza en el sentido de la formación de NADPH, gracias a la
elección de unas condiciones adecuadas (tampón pH 7,6 y exceso de NADP). El NADPH
proporcional a la concentración de glucosa en la muestra se dosifica midiendo su absorción a
340 nm.
5.1.3
Isomerización de la fructosa-6-fosfato.
Esta reacción permite dosificar la suma glucosa + fructosa.
La enzima utilizada es la fosfoglucosa-isomerasa (PGI).
PGI
fructosa-6-fosfato <==> glucosa-6-fosfato (3)
La glucosa-6-fosfato formada reacciona la NADP según (2) para formar NADPH, que se dosifica
a 340 nm.
5.2
Material.
Cadena de flujo continuo segmentada.
5.3
Reactivos y soluciones.
En el mercado existen numerosos proveedores de kits con los reactivos preparados. A
continuación presentamos un ejemplo cualquiera de los mismos.
5.3.1
Vial 1:
Liofilizado compuesto de:





5.3.2
Tampón trietanolamina pH = 7,6
NADP (N° CAS [53-59-8])
64 mg
ATP (N° CAS [987-65-5])
16O mg
Sulfato de magnesio MgSO4 (N° CAS [7487-88-9])
Estabilizadores.
Vial 2:
0,7 ml de suspensión enzimática compuesta de:


5.3.3
Hexoquinasa (N° CAS [9001-51-8]) aprox. 200 U
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (N° CAS [9001-40-5]) 100 U en solución en sulfato
de amonio.
Vial 3:
0,7 ml de fosfoglucosa-isomerasa (N° CAS [9001-41-6]) (aprox. 490 U) en suspensión en
sulfato de amonio.
5.3.4
Vial 4:
7 ml de solución estándar de D-glucosa (N° CAS [50-97-7]) a 0,5 g-1. Conservación del estuche
no abierto a -20 °C hasta la fecha de caducidad.
5.3.5
Solución tampón NAD/ATP.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
21/46
Se prepara a partir del kit enzimático:
Disuelva el contenido del vial 1 en 90 ml de agua bidestilada.
Conserve el tampón diluido a -20 °C durante 3 meses como máximo.
5.3.6
Preparación de las soluciones de enzimas para la dosificación.
Ejemplo de volúmenes que deben prepararse para el montaje propuesto:
Dosificaciones
Fructosa y glucosa + fructosa
Duración del análisis
1 hora
4 horas
8 horas
Glucosa
tampón NAD/ATP
15 ml
60 ml
120 ml
HK/G6PDH
100 µl
500 µl
1.000 µl
PGI
100 µl
500 µl
1.000 µl
La dosificación de la fructosa precisa pasar dos veces de los patrones y las muestras,
duplicándose así el tiempo de análisis respecto a la dosificación de la glucosa.
Conservación de las soluciones de enzimas para la dosificación: una semana a +4°C.
5.3.7
Soluciones patrón.
5.3.7.1 Solución madre a 10,0 g/l
Basta utilizar glucosa sola para el calibrado: la isomerización de la fructosa se hará únicamente
para las muestras.



D-glucosa anhidro
2,50 g
Agua destilada asta alcanzar 250 ml
Isotiocianato de alilo (conservante) (N° CAS [57-06-7])
2 gotas.
5.3.7.2 Soluciones hijas de glucosa:

Patrón a 3 g/l: 15 ml de solución madre en un matraz de 50 ml

Patrón a 2 g/l: 10 ml de solución madre en un matraz de 50 ml

Patrón a 1 g/l: 10 ml de solución madre en un matraz de 100 ml
A continuación, estas soluciones se completan hasta la línea de nivel con agua destilada.

Patrón a 0,50 g/l: solución estándar del estuche enzimático
Conservación: a + 4 °C durante 1 mes.
5.4
Método de trabajo.
El diagrama de flujos aparece en el anexo.
La cadencia analítica es de 60 muestras por hora con un tiempo de toma / lavado = 1/1.
Las muestras de vino no se someten a ningún tratamiento previo. En el caso de los mostos o de
otras muestras que contengan de materias en suspensión, es indispensable una filtración
previa.
5.5
Expresión de los resultados.
La concentración de glucosa, fructosa o glucosa + fructosa se indica en g.L-1 con un decimal.
5.6
Bibliografía
Battle J.L., Bouvier J.C. Rev. Fr. Oenol., 1986, 101, 38-43.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
22/46
5.7
Anexo: ejemplo de diagrama de flujo
6
Determinación del contenido de dióxido de azufre libre y total en los
vinos y los mostos después de diálisis
6.1
Principio.
Tras acidificación del vino, el dióxido de azufre libre se difunde a través de una membrana de
diálisis. El dióxido de azufre combinado se libera mediante una hidrólisis alcalina. Las dos
dosificaciones se efectúan a 560 nm en presencia de p-rosanilina (o fuschina básica). La
segmentación se realiza con nitrógeno para de evitar la oxidación.
SO2 + rosanilina ŕ> complejo incoloro + formaldehído ŕ> complejo con color.
El método es aplicable para una gama LOQ a 200 mg.l-1.
6.2
Material.
Cadena de flujos segmentada.
6.3
Reactivos y soluciones.
6.3.1
Reactivo específico para la dosificación del dióxido de azufre libre.
6.3.1.1 Solución al 10 % de ácido sulfúrico (pureza 98%)

H2SO4 (N° CAS [57-06-7])
20 ml
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
23/46
agua destilada hasta alcanzar
6.3.2
200 ml.
Reactivos específicos para la dosificación del dióxido de azufre total.
6.3.2.1 Solución de hidróxido de sodio 4 M

NaOH (N° CAS [1310-73-2]) 40 g

agua destilada hasta alcanzar 250 ml.
Conservación: 1 semana.
6.3.2.2 Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 1/2 (v/v)
Conservación: 1 mes.
6.3.3
Reactivos comunes
6.3.3.1
Nitrógeno tipo R (N° CAS [7727-37-9])
6.3.3.2 Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 1% (v/v)
Conservación: 1 mes.
6.3.3.3 Solución de formaldehído al 6 % (v/v)

formaldehído al 37 % mínimo (N° CAS [50-00-0])

agua destilada hasta alcanzar 200 ml.
Conservación: 1 día en vial cerrado.
1,2 ml
6.3.3.4 Rosanilina (reactivo coloreado).

Solución madre: 2 g/l de fuschina básica (o clorhidrato de rosanilina) (N° CAS [632-995])
Agite y deje reposar 3 días y conserve protegido de la luz.
Conservación: 3 meses en vial opaco.

Solución de trabajo
solución madre 40 ml
ácido ortofosfórico (N° CAS [7664-38-2])
62 ml
agua destilada hasta alcanzar 500 ml.
Conservación: 2 semanas en vial opaco.
Nota: Esta preparación es fuertemente exotérmica. Tome las precauciones correspondientes.
6.3.4 Soluciones patrón sintéticas.
6.3.4.1

Solución ácida de pH 3, aproximadamente.
H2SO4 1 % (N° CAS [57-06-7])
5m1
 agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml.
Esta solución servirá para completar los matraces patrón de SO2.
Conservación: 1 día.
-1
6.3.4.2 Solución madre de 300 mg.l de SO2

disulfito de sodio puro (N° CAS [7681-57-4])

solución pH 3 hasta alcanzar 500 ml.
227 mg
Conservación: 1 día.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
24/46
6.3.4.3 Soluciones patrón hijas.
Ejemplo de preparación de una solución patrón de 120 mg.l-1:

solución madre de 300 mg.l-1

solución pH3

agua destilada hasta alcanzar 125 ml.
6.3.5
50 ml
40 ml
Patrones de vinos.
Vinos de referencia o controlados por el método de referencia.
6.4
Método de trabajo.
En el anexo aparecen los diagramas de flujos. Las muestras no se someten a ningún
tratamiento previo. La cadencia analítica puede alcanzar las 60 muestras por hora con un
tiempo de lavado / toma de muestra = 2/1
Nota:
Al término del análisis, enjuagar el circuito analítico con agua durante al menos 10 min.
Cada vez que sea necesario, lavar el circuito con agua y lejía a 1/20 durante 30 min como
mínimo. Aclarar con agua durante 2 h, como mínimo.
6.5
Expresión de los resultados.
Los valores de dióxido de azufre se expresan en mg por litro sin decimal.
6.6
Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre libre: 7 mg.L-1
Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre total: 27 mg.L-1
6.7
Bibliografía
DUBERNET M., 1997. L’automatisation de l’analyse chimique en œnologie. Revue Française
d’Œnologie, 66, 45-61.
Scholten G., Woller R., Holbach B. Automatisierte weinanalyse, 2. Mittteilung. Die Wein. Wiss.,
1982, 38, 397-426.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
25/46
6.8
Anexo: ejemplos de diagrama de flujo
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
26/46
7
Determinación del contenido de dióxido de azufre libre y total en los
vinos y los mostos por destilación
7.1
Principio
Existe una alternativa ampliamente aplicada al método anterior. Consiste en sustituir la diálisis
por una destilación en una microcolumna. En el caso del dióxido de azufre total, deja de
realizarse la hidrólisis alcalina, y la liberación de la totalidad del dióxido de azufre se logra
mediante una acidificación más potente y por una temperatura de destilación superior.
7.2
Reactivos y soluciones.
7.2.1
Reactivo específico para la dosificación del dióxido de azufre libre.
7.2.1.1 Solución al 1 % de ácido sulfúrico (pureza 98%)


H2SO4 (N° CAS [57-06-7])
2 ml
agua destilada hasta alcanzar 200 ml.
7.2.2
Reactivo específico para la dosificación del dióxido de azufre total.
7.2.2.1
Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 20 % (v/v)
Conservación: 1 mes.
7.2.3
Reactivos comunes
7.2.3.1
Nitrógeno tipo R (N° CAS [7727-37-9])
7.2.3.2 Solución de ácido sulfúrico (N° CAS [57-06-7]) al 1% (v/v) con adición de 4 gotas por litro de
humectante Brij 35 (N° CAS [9002-92-0])
Conservación: 1 mes.
7.2.3.3
Solución de formaldehído

formaldehído al 40 % (N° CAS [50-00-0])

agua destilada hasta alcanzar 1.000 ml.
Conservación: 1 día en vial cerrado .
7.2.3.4
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,2 M

Hidróxido de sodio (N° CAS [1310-73-2])

Brij 35 (N° CAS [9002-92-0])

agua destilada hasta alcanzar 500 ml.
7.2.3.5
10 ml
4g
2 gotas
Rosanilina (reactivo coloreado).

Solución madre: 2 g/l de fuschina básica (o clorhidrato de rosanilina) (N° CAS [632-995])
Agite y deje reposar 3 días y conserve protegido de la luz.
Conservación: 3 meses en vial opaco.

Solución de trabajo
solución madre
70 ml
ácido ortofosfórico H3PO4 (N° CAS [7664-38-2])
70 ml
agua destilada hasta alcanzar
500 ml.
Conservación: 2 semanas en vial opaco.
Nota: esta dilución es muy exotérmica. Tome las precauciones correspondientes.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
27/46
7.2.4
Soluciones patrón sintéticas.
7.2.4.1 Solución ácida de pH 3, aprox.

H2SO4 1 % (N° CAS [57-06-7])
5 ml
 agua destilada hasta alcanzar
1.000 ml.
Esta solución servirá para completar los matraces patrón de SO2.
Conservación: 1 día.
7.2.4.2
-1
Solución madre de 300 mg.l de SO2

disulfito de sodio puro Na2S2O5 (N° CAS [7681-57-4])

solución pH 3 hasta alcanzar
227 mg
500 ml.
Conservación: 1 día.
7.2.4.3
Soluciones patrón hijas.
Ejemplo de preparación de una solución patrón a 120 mg.l-1:

solución madre de 300 mg.l-1
50 ml

solución pH3
40 ml

agua destilada hasta alcanzar
125 ml.
7.2.5
Patrones de vinos.
Vinos de referencia o controlados por el método de referencia.
7.3
Expresión de los resultados.
Los valores de dióxido de azufre se expresan en mg por litro sin decimal.
7.4
Características del método descrito
Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre libre: 7 mg.l-1
Reproducibilidad interlaboratorio dióxido de azufre total: 27 mg.l-1
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
28/46
7.5
Anexo: ejemplos de diagrama de flujo
Dosificación del dióxido de azufre libre
Cadencia: 90 mues./hora
Relación toma/aclarado:
1/1
Columna de
destilación
5 veces
Nitrógeno para
arrastre
Caudal: 40 ml/min
Refrigerante
(agua fría)
Bomba
ml/min
0,16
Muestra
1,40
H2SO4 1%
0,05
20 veces
1,60
0,05
Desagüe
5 veces
5 veces
Colorímetro
560 nm
5 veces
2,50
NaOH 0,2 M
Nitrógeno para burbujeo
0,60
1,20
0,32
0,32
Baño maaría
48° C ± 5° C
Nitrógeno para burbujeo
H2SO4 1% + Brij
Formaldehído
Para-rosanilina
0,80
Reinicio colorímetro
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
29/46
Dosificación del dióxido de azufre total
Columna de
destilación
Refrigerante
(agua fría)
Nitrógeno de
arrastre
Caudal: 40 ml/min
Baño
maría
105° C ± 5° C
Cadencia: 90 mues./hora
Relación toma/aclarado:
1/1
Bomba
ml/min
20 veces
0,16
Muestra
1,40
H2SO4 10%
0,05
1,40
0,05
Desagüe
Colorímetro
560 nm
3 x 20 veces
5 veces
2,00
Nitrógeno para burbujeo
bullage
NaOH 0,2
N
Nitrógeno para burbujeo
0,60
1,20
0,32
0,32
H2SO4 1% + Brij
Formaldehído
Para-rosanilina
0,80
Reinicio colorímetro
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
30/46
ANEXO 2
EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DOSIFICACIÓN HABITUALES EN
ENOLOGÍA MEDIANTE ANALIZADORES SECUENCIALES
Los métodos descritos a continuación sólo se describen a modo de ejemplo, pueden utilizarse
otros métodos.
1
1.1
Dosificación del ácido acético en los vinos y los mostos
Principio
Método enzimático.
En presencia de ATP, el ácido acético se transforma en acetil-fosfato en una reacción catalizada
por el acetato quinasa.
(1) Acetato + ATP —Acetato quinasa Acetil-fosfato + ADP
La ADP formada por esta reacción se retransforma en ATP por reacción con fosfenolpiruvato en
presencia de piruvato quinasa.
(2) ADP + Fosfenolpiruvato —Piruvato quinasa Piruvato + ATP
El piruvato se reduce a L-lactato por la nicotinamida-adenina-nucleótido reducido (NADH) en
presencia de lactato-deshidrogenasa.
(3) Piruvato + NADH + H+ —Lactato deshidrogenasa Lactato + NAD+ + H2O
La cantidad de NADH oxidada en la reacción (3) se determina midiendo la absorbancia a 340
nm, y es proporcional a la concentración de ácido acético del vino.
Una cuarta reacción permite mantener el equilibrio de la reacción 1 en el sentido de formación
de acetilfosfato por eliminación de este último.
(4) Acetil-fosfato + CoA —Fosfotransacetilasa Acetil-CoA + Fosfato inorgánico
Se añade polivinilpirrolidona (PVP) al medio reactivo para eliminar las interferencias debidas a
los compuestos fenólicos del vino.
1.2
Reactivos
1.2.1
Preparación del tampón MOPS
Añadir :
13 g de MOPS (Ácido N-morfolino-3-propano sulfónico) CAS [1132-61-2]
500 mg de cloruro de magnesio, 6H2O - CAS [7791-18-6]
1,5 g de cloruro de potasio (KCl) - CAS [7447-40-7]
250 ml de agua bidestilada
Ajustar el pH a 4,75 con una solución 1,5 M de hidróxido de potasio (KOH) - CAS [1310-58-3].
Esperar 5 minutos y reajuste de nuevo el pH a 7,45.
Completar hasta 300 ml con agua bidestilada.
Estabilidad del tampón: 60 días a ± 4 °C.
1.2.2
Preparacion de los reactivos
1.2.2.1 Reactivo 1 (R1):
Añadir a 100 ml de tampón MOPS 400 mg de polivinilpirrolidona (PVP) - CAS [9003-39-8].
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
31/46
1.2.2.2 Reactivo 2 (R2)
Añadir a 100 ml de tampón MOPS:
De 300 a 350 mg de adenosina-5-trifosfato, sal disódica (ATP) - CAS [987-65-5]
50 mg de fosfo-enolpiruvato de triciclohexilamonio (PEP) - CAS [35556-70-8]
38 mg de β nicotinamida adenina dinucleótida (forma reducida) (NADH) - CAS [606-68-8] Pureza ≥ 98%
25 mg de sal de trilitio de coenzima A - CAS [18439-24-2] -pureza 2
400 unidades aprox. de piruvato quinasa (PK) - CAS [9001-60-9] y lactato deshidrogenasa
(LDH) - CAS [9001-60-9]
600 unidades aprox. de fosfotransacetilasa (PTA) - CAS [9029-91-8]
230 unidades de acetato quinasa (AK) - CAS [9027-42-5]
Estabilidad del reactivo: unas 12 horas a + 4 °C.
1.3
Preparación de las muestras
Las muestras de vinos se diluyen previamente a 1/10.
1.4
Procedimiento analítico
Puede variar en función del material utilizado. La descripción siguiente debe considerarse un
ejemplo.
El volumen de las cubetas de reacción es de 300 µl. El ciclo analítico es de 10 minutos, esto es,
50 ciclos de la bandeja reactiva. Se efectúa una lectura colorimétrica cada 12 segundos, esto
es, cada ciclo de la bandeja reactiva, para poder trazar la curva de reacción
1.4.1
Programación
La longitud
El volumen
El volumen
El volumen
El volumen
1.4.2
de onda de lectura es de 340 nm.
de muestra diluido al 1/10, añadido en el momento cero, es de 20 µl.
de reactivo R1 añadido en el momento cero es de 111 µl.
de reactivo R2 añadido al cabo de 5 minutos es de 125 µl.
reactivo total es de 256 µl.
Calibrado
El calibrado se realiza en 4 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución al 9 ‰ de
cloruro de sodio - CAS [7647-14-15]. Los otros tres calibradores son soluciones de
concentraciones crecientes de ácido acético puro - CAS [64-19-7] (0,25 g.l-1; 0,50 g.l-1; 1 g.l-1)
o vinos patrón con una concentración conocida de ácido acético.
1.4.3
Resultados
La figura siguiente muestra la curva de reacción obtenida.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
32/46
En las condiciones de medición utilizadas, la curva de reacción observada tras la adición del
reactivo R2 es una recta, en la escala de trabajo elegida (de 0 a 1 g/l). Traduce la velocidad
inicial de reacción, proporcional a la concentración de ácido acético. La medición de la pendiente
de esta recta puede realizarse leyendo dos puntos en las vueltas N° 27 y 50. El valor de la
concentración de ácido acético vendrá dado por la fórmula:
C = K (L1-L2)
En la que K es un factor de reacción calculado por el equipo tras cada calibración según la
fórmula siguiente:
K
CEt  CB
AEt  AB
en la que:
AB = absorbancia del blanco
CB = concentración del blanco
AEt = absorbancia del patrón
CEt = concentración del patrón
Los resultados se indican en g.l-1 de ácido acético.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
33/46
1.5
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,04 g.L-1
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,10 g.L-1
1.6
Bibliografía
DONECHE B., y SANCHEZ P.J., 1985 : Automatisation en flux continu du dosage enzymatique
de l’acide acétique dans les vins, Connaissance de la vigne et du vin, 1985 ; n°3, 161-169.
DUBERNET M., PENNEQUIN F. y GRASSET F., 1997 Adaptation du dosage de l’acide acétique
dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717, Feuillet vert OIV N°1001
McCLOSKEY Leo P., 1980 : An improved enzymatic assay for acetate in juice and wine, Am. J.
Enol. Vitic. Vol 31, N° 2, 1980, pp 170-173.
2
2.1
Dosificación del dióxido de azufre total en los vinos y los mostos
Principio
Método químico.
La muestra a dosificar se diluye en una solución tampón fosfato de pH 8. Tras estabilización, se
añade al medio de reacción una solución tamponada de ácido DTNB (5,5’-ditio-bis(2-ácido
nitrobenzoico) (3,3’-6)) o BIS (3-carboxi-4-nitrofenil) disulfido, conocido con la expresión
«reactivo de Ellman». Se trata de un reactivo específico que permite la modificación y la
detección cuantitativa de los enlaces disulfuros, cuya fórmula desarrollada es:
O
OH
O2N
S
S
NO2
O
OH
La reacción desarrolla una coloración amarilla medible a una longitud de onda de 405 nm.
2.2
Protocolo de medición
2.2.1
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita la utilización de dos
reactivos y permita una medición a 405 nm.
2.2.2
Reactivos
Se utilizan dos reactivos:

Reactivo 1
K2HPO4 (CAS [7758-11-4])
17,4 g
Agua bidestilada
hasta alcanzar 1.000 ml
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
34/46
El pH de la solución tampón preparada de este modo se ajusta por adición de H3PO4 puro (CAS
nº [7664-38-2]) para obtener una valor de 8 (diferencia máxima tolerable: ± 0,2 unidad pH).

Reactivo 2
DNTB (CAS [69-78-3])
760 mg
Reactivo 1
900 ml
Etanol puro
100 ml
2.2.3
Aplicación
El cuadro siguiente resume las diferentes cantidades de muestra de vino y de reactivos que
deben añadirse en la cubeta de reacción a lo largo del tiempo:
Tiempo en
minutos
0
5
Muestra en µl
Reactivo 1 en
µl
80
8
Reactivo 2 en
µl
Agua bidestilada
en µl
170
80
La lectura de la absorbancia a 405 nm se efectúa periódicamente a lo largo del tiempo, con una
duración total de 10 minutos, pero que puede acortarse habida cuenta de la rapidez de la
reacción, prácticamente instantánea. El gráfico siguiente muestra el tipo de curva de reacción
obtenida:
Curva reactiva
8000
7000
Do (Valeurs
relatives)
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
228
252
276
300
324
348
372
396
420
444
468
492
516
540
564
588
Tiempo en segundos
Tras la adición del reactivo N° 1, la estabilización es rápida. Tras la adición del reactivo N° 2,
que contiene el DNTB, se produce una reacción coloreada inmediata, cuya meseta se alcanza en
algunos segundos. A continuación se estabiliza. La lectura se realiza por diferencia entre la
absorbancia DO 1 leída tras la estabilización del reactivo N° 1 y la absorbancia DO 2 leída en la
meseta. Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido en SO2 total de la muestra
utilizada.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
35/46
El calibrado se realiza con vinos patrón con valores de SO2 total conocidos y que cubren la gama
de medición considerada, o bien mediante soluciones de metabisulfito de potasio (N°
CAS[16731-55-8]) estabilizadas en medio sulfúrico al 1 % y de concentración conocida. En
general, al no ser totalmente lineal la curva de calibración, se precisan de 4 a 5 puntos de
calibración. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [764714-5]) al 9 ‰.
2.3
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 12 mg.L-1
Reproducibilidad interlaboratorio: 20 mg.L-1
2.4
Bibliografía
ELLMAN G.L., 1959. For the modification and quantitative detection of sulfhydryl groups ; Arch.
Biochem. Biophys. 82,70.
DUBERNET M., LEBOEUF J.P. y GRASSET F., 1998. Méthode automatisée de dosage
colorimétrique du dioxyde de soufre total dans les vins. FV N° 1068 OIV.
DUBERNET M., PENNEQUIN F. y GRASSET F., 1995. Adaptation du dosage du dioxyde de soufre
total dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 997 OIV.
3
3.1
Dosificación del dióxido de azufre libre en los vinos y los mostos
Principio
Método químico.
El dióxido de azufre libre se estabiliza en medio ácido. Su dosificación se efectúa por el
desarrollo, en presencia de formaldehído, de una coloración rosa por combinación con la
fuschina previamente decolorada en medio fosfórico. Se corrige una reacción parasitaria en la
dosificación debida a los compuestos fenólicos presentes en el vino.
3.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar dos reactivos y una
medición a 570 nm.
3.3
Reactivos
Se emplean dos reactivos:
3.3.1
Reactivo 1
3.3.1.1
Solución madre de fuschina básica (clorhidrato de rosanilina)
Clorhidrato de rosanilina (N° CAS [632-99-5]) 2g
Agua bidestilada
hasta alcanzar
1.000 ml
Conservación: 6 meses en la nevera
3.3.1.2
Solución de trabajo (R1)
Solución madre de fuschina básica
Ácido fosfórico (CAS [7664-38-2]) al 10%
Agua bidestilada
3 ml
77 ml
20 ml
Conservación: 5 días a 4° C y protegido de la luz.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
36/46
3.3.2
Reactivo 2
Formaldehído (N° CAS [50-00-0])
5 ml
Agua bidestilada
hasta alcanzar
1.000 ml
Conservación: 1 semana a temperatura ambiente.
3.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino no se diluyen. Se recomienda proceder al análisis lo más rápidamente
posible tras la toma de mustra para evitar pérdidas de dióxido de azufre libre.
3.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 570 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
3.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 20 µl
1 (12 segundos): adición de 250 µl de reactivo R1
24 (288 segundos): lectura DO1 a 570 nm
25 (300 segundos): adición de 106 µl de reactivo R2
28 (336 segundos): lectura DO2 a 570 nm
Calibrado
Se realiza en dos puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio
(N° CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. El valor estándar viene dado por una solución periódicamente
valorada de metabisulfito de potasio (N° CAS [16731-55-8]), estabilizada en medio sulfúrico al
1 % y de concentración de 50 mg.l-1, aprox.
3.7
Lectura de los resultados
El esquema siguiente muestra la evolución de la absorbancia a 570 nm.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
37/46
Se constata que la mezcla del vino con la solución de fuschina provoca una primera reacción
coloreada que genera un aumento de la absorbancia (reacción N°1). La importancia de la misma
es proporcional a la riqueza del vino en compuestos fenólicos y constituye un efecto parasitario.
La reacción N° 2 ocurre tras la adición del reactivo R2 y corresponde estrictamente a la
combinación del dióxido de azufre libre y la fuschina. Sólo debe tenerse en cuenta ésta última.
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia de base DO 1 y la absorbancia DO 2.
Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido en SO2 libre de la muestra utilizada.
3.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 6 mg.L-1
Reproducibilidad interlaboratorio: 12 mg.L-1
3.9
Bibliografía
DUBERNET M., PENNEQUIN F. y GRASSET F., 1995. Dosage du dioxyde de soufre libre dans les
vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 998 OIV.
4
4.1
Dosificación de la glucosa y la fructosa en los vinos y los mostos
Principio
Método enzimático.
La glucosa y la fructosa se fosforilan en presencia de adenosina trifosfato (ATP). La reacción es
catalizada por hexoquinasa (HK) y produce respectivamente glucosa-6-fosfato (G6P) y fructosa6-fosfato (F6P).
HK
1) Glucosa + ATP ------> G6P + ADP
HK
2) Fructosa + ATP ------> F6P + ADP
La glucosa-6-fosfato se oxida a gluconato-6-fosfato en presencia de nicotinamida-adenosinadinucleótido (NAD+). La reacción es catalizada por glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH).
G6PDH
3) G6P + NAD -----> gluconato-6-fosfato + NADH + H+
La fructosa-6-fosfato se transforma en glucosa-6-fosfato en presencia de fosfoglucosa
isomerasa (PGI)
PGI
4) F6P -----> G6P
El aumento de la absorbancia a la longitud de onda 340 nm es proporcional a la cantidad de Dglucosa y D-fructosa presente.
4.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar reactivos y realizar
una medición a 340 nm.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
38/46
4.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de kit enzimático, lo que facilita
su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo:

Reactivo 1 (30 ml)
Solución tampón pH 7,5
NAD (N° CAS [53-84-9])
ATP (N° CAS [987-65-5])

70 mg
90 mg
Reactivo 2 (0,6 ml)
HK (N° CAS [9001-51-8]) 160 U y G6PDH (N° CAS [9001-40-5]) 200 U

Reactivo 3 (0,6 ml)
PGI (N° CAS [9001-41-6]) 380 U
El reactivo único utilizado en el equipo se prepara añadiendo los 3 reactivos del estuche, a los
que se incorporan 900 mg de PVP (Polivinilpirolidona) (N° CAS [9003-39-8]). En el caso citado,
permite realizar unos 600 tests. Su conservación es de 1 mes a +8 °C.
4.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino se diluyen 10 veces. Las muestras de mostos se diluyen de manera que se
obtenga una concentración inicial inferior a 1 g.l-1.
4.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
4.6

Ciclo 1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl

Ciclo 1 (12 segundos): adición de 50 µl de reactivo y 200 µl de agua
desmineralizada

Ciclo 1: lectura de absorbancia DO1 a 340 nm

Ciclo 50 (600 segundos): lectura de absorbancia DO2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 4 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N°
CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los valores estándar vienen dados por soluciones de glucosa (N°
CAS [50-99-7]) y fructosa (N° CAS [57-48-7]) (50/50) que cubren la gama de 0 a 10 g.l-1
diluidas 10 veces en el momento de su utilización., El calibrado puede efectuarse tambien con
vinos de concentraciones conocidas.
4.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1.
Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de glucosa y fructosa de la muestra
utilizada. El resultado se expresa en g de glucosa + fructosa por litro.
4.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,3 g.L-1 de 0 a 5 g.L-1 y 0,6 L-1 por encima de 5 g.L-1.
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,35 g.L-1 de 0 a 2 g.L-1
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
39/46
5
5.1
Dosificación del ácido L-málico en los vinos y los mostos
Principio
En presencia de nicotinamida-adenosinaŔdinucleótido (NAD+), el ácido L-málico se oxida a
oxaloacetato en una reacción catalizada con L-malato deshidrogenasa (L-MDH). El equilibrio de
la reacción es favorable al malato. El desplazamiento del equilibrio de la reacción en el sentido
de la formación de oxaloacetato se realiza por eliminación del oxaloacetato que, en presencia de
L-glutamato, se transforma en L-aspartato. Esta reacción es catalizada por glutamatooxaloacetato-transaminasa (GOT).
1) L-malato + NAD+ -> oxaloacetato + NADH + H+ (en presencia de L-malato
deshidrogenasa)
2) Oxaloacetato + L-glutamato -> L-aspartato + 2-oxoglutarato (en presencia de
GOT)
La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda 340 nm,
es proporcional a la cantidad de L-malato presente.
5.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita realizar una medición a
340 nm.
5.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de estuche enzimático, lo que
facilita su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo.


Reactivo 1 (30 ml)
Solución tampón pH 10 / ácido glutámico (N° CAS [56-86-0]) 440 mg
Reactivo 2 (6 ml)
NAD (N° CAS [53-84-9]) 210 mg

Reactivo 3 (0,6 ml)
L-MDH (N° CAS [9001-64-3]) 2400 U / GOT (N° CAS [9000-97-9]) 160 U
El reactivo único utilizado en el equipo se prepara por adición de los 3 reactivos del estuche, a
los que se incorporan 300 mg de PVP (polivinilpirolidona) (N° CAS [9003-39-8]). Su
conservación es de 1 mes a 8 °C.
5.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o mosto se diluyen 10 veces.
5.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
5.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl
1 (12 segundos): adición de 20 µl de reactivo y 200 µl de agua desmineralizada
1: lectura absorbancia DO1 a 340 nm
50 (600 segundos): lectura absorbancia DO2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 3 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N°
CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los valores estándar vienen dados por soluciones de ácido L-málico
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
40/46
(N° CAS [97-67-6]) que cubren la gama de 0 a 3,5 g.l-1 diluidas 10 veces en el momento de su
utilización. , El calibrado puede efectuarse tambien con vinos con concentraciones conocidas.
5.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1.
Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de ácido L-málico de la muestra
utilizada. El resultado se expresa en g de ácido L-málico por litro.
5.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,4 g.l-1.
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,6 g.l-1
6
6.1
Dosificación del ácido L-láctico en los vinos y los mostos
Principio
Método enzimático.
En presencia de nicotinamida-adenosina-dinucleótido (NAD), el ácido L-láctico se oxida a
piruvato en una reacción catalizada con L-lactato deshidrogenasa (L-LDH). El equilibrio de la
reacción es favorable al lactato. La eliminación del piruvato del medio reactivo desplaza el
equilibrio de la reacción en el sentido de la formación de piruvato. En presencia de L-glutamato,
el piruvato se transforma en L-alanina. Esta reacción es catalizada con glutamato-piruvatotransaminasa (GPT).
1) L-lactato + NAD+ -> piruvato + NADH + H+ (en presencia de L-lactato
deshidrogenasa)
2) Piruvato + L-glutamato -> L-alanina + 2-oxoglutarato (en presencia de GPT)
La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda 340 nm,
es proporcional a la cantidad de lactato presente.
6.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita realizar una medición a
340 nm.
6.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de kit enzimático, lo que facilita
su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo:


Reactivo 1 (30 ml)
Solución tampón pH 10 / ácido glutámico (N° CAS [56-86-0]) 440 mg
Reactivo 2 (6 ml)
NAD (N° CAS [53-84-9]) 210 mg


Reactivo 3 (0,6 ml)
GPT (N° CAS [9000-86-6]) 1100 U
Reactivo 4 (0,6 ml)
L-LDH (N° CAS [9001-60-9]) 3800 U
El reactivo único utilizado en el equipo se prepara por adición de los 4 reactivos del estuche, a
los que se incorporan 300 mg de PVP (Polivinilpirolidona) (N° CAS [9003-39-8]). Su
conservación es de 1 mes a 8°C.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
41/46
6.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto se diluyen 10 veces.
6.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
6.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl
1 (12 segundos): adición de 20 µl de reactivo y 200 µl de agua desmineralizada
1: lectura absorbancia DO1 a 340 nm
50 (600 segundos): lectura absorbancia DO2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 3 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de Cloruro de sodio (N°
CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los valores estándar vienen dados por soluciones de ácido L-láctico
(N° CAS [79-33-4]) que cubren la gama de 0 a 1,2 g.l-1 diluidas 10 veces en el momento de su
utilización. , El calibrado puede efectuarse también con vinos con concentraciones conocidas.
6.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1.
Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de ácido L-láctico de la muestra
utilizada. El resultado se expresa en g de ácido L-láctico por litro.
6.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 0,2 g.L-1.
Reproducibilidad interlaboratorio: 0,5 g.L-1
7
7.1
Dosificación de los compuestos fenólicos totales en los vinos por
índice de Folin-Ciocalteu
Principio
Método químico.
El reactivo de Folin-Ciocalteu oxida el conjunto de los compuestos fenólicos presentes en el
vino. Dicho reactivo está formado por una mezcla de ácido fosfotúngstico y de ácido
fosfomolíbdico, que durante la oxidación de los fenoles se reduce en una mezcla de óxidos
azules de tungsteno y molibdeno. La coloración azul producida posee una absorción máxima
próxima a los 750 nm. Es proporcional al nivel de compuestos fenólicos presentes en el vino. El
método propuesto es una automatización directa del método manual.
7.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar 2 reactivos y
realizar una medición a 750 nm.
7.3
Reactivos


Reactivo 1
Reactivo de Folin-Ciocalteu
Reactivo 2
Carbonato de sodio (CAS [497-19-8]) 20 g
Agua desmineralizada hasta alcanzar 100 ml.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
42/46
7.4
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto no se diluyen.
7.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 750 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino o de mosto de 2 µl
1 (12 segundos): adición de 50 µl de reactivo 1 y 40 µl de agua desmineralizada.
25 (300 segundos): adición de 200 µl de reactivo 2
50 (600 segundos): lectura absorbancia Do a 750 nm
7.6
Calibrado
Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N° CAS [7647-14-5]) al 9
‰. Se utiliza un valor estándar obtenido por un vino dosificado por el método manual de
referencia.
7.7
Lectura de los resultados
El valor del índice de Folin-Ciocalteu es directamente proporcional a la absorbancia medida DO.
7.8
Características del método descrito
Reproducibilidad intralaboratorio: 4,5
Reproducibilidad interlaboratorio: 8,5
Dosificación del nitrógeno -aminado en los vinos y los mostos
8
8.1
Principio
Método químico.
La cantidad de nitrógeno -aminico se determina por reacción con el o-ftaldialdehído. La
intensidad de la absorbancia a 340 nm se compara con las obtenidas para patrones de
concentraciones conocidas de isoleucina.
8.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar 2 reactivos y
realizar una medición 340 nm.
8.3
Reactivos

Reactivo 1
NaOH (N°CAS [1310-73-2])
Ácido bórico (N° CAS[10043-35-3])
Agua desmineralizada hasta alcanzar

Reactivo 2
o-ftaldialdehído 99 % (N°CAS[643-79-8])
N-acetilŔcisteína (N°CAS [616-91-1])
Etanol (N° CAS [64-17-5]) al 1/2
8.4
3,837 g
8,468 g
1.000 ml
0,671 g
0,0816 g
qsp 100 ml
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto no se diluyen.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
43/46
8.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino de 5 µl
1 (12 segundos): adición de 200 µl de reactivo 1
24 (294 segundos): lectura absorbancia DO1 a 340 nm
25 (300 segundos): adición de 200 µl de reactivo 2
50 (600 segundos): lectura absorbancia DO2 a 340 nm
8.6
Calibrado
Se realiza en 6 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N°
CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los otros 5 valores se obtienen con una gama de soluciones de Lisoleucina.

Solución madre de L-isoleucina

Soluciones de calibrado
L-isoleucina (N°CAS [73-32-5])
0,936 g
Agua desmineralizada hasta alcanzar
100 ml
Agite bien hasta completar la disolución. Esta solución contiene 1 g de nitrógeno -aminado por
litro. Es estable 3 meses.
Se preparan según el cuadro siguiente:
Cantidad en ml de solución
madre para 100 ml de agua
desmineralizada
Concentración de nitrógeno
aminico en mg/l
Vida útil: 3 meses
8.7
1
5
10
15
20
10
50
100
150
200
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1.
Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de nitrógeno -aminado de la
muestra utilizada. El resultado se expresa en mg de nitrógeno -aminado por litro.
9
9.1
Dosificación del nitrógeno amoniacal en los vinos y los mostos
Principio
Método enzimático.
En presencia de nicotinamida-adenosina-dinucleótido reducida (NADH), en una reacción
catalizada por el glutamato deshidrogenasa (GLDH), los iones NH4+ y el 2- oxoglutarato forman
L-glutamato.
NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH -> L-glutamato + NAD+ + H2O (en presencia de GLDH)
La cantidad de NADH oxidada en NAD+ es proporcional a la cantidad de nitrógeno amoniacal
presente.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
44/46
9.2
Material
Puede utilizarse cualquier material de análisis secuencial que permita utilizar 2 reactivos y
realizar una medición a 340 nm.
9.3
Reactivos
Los fabricantes suelen ofrecer los reactivos utilizados en forma de kit enzimático, lo que facilita
su utilización por parte de los laboratorios. Ejemplo:

Reactivo 1 (30 ml)
Tampón TRIS, 2-oxoglutarato pH 8


Reactivo 2 (6 ml)
NADH (N° CAS [606-68-8])
14 mg
Reactivo 3 (0,6 ml)
GLDH (N° CAS [9029-11-2])
9.4
550 U
Preparación de las muestras
Las muestras de vino o de mosto se diluyen 10 veces.
9.5
Procedimiento analítico
La longitud de onda de lectura es de 340 nm.
La secuencia analítica es la siguiente:
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
Ciclo
9.6
1 (6 segundos): toma de la muestra de vino o de mosto de 5 µl
1 (12 segundos): adición de 100 µl de reactivo y 100µl de agua desmineralizada
24 (294 segundos): lectura absorbancia Do1 a 340 nm
25 (300 segundos): adición de 20 µl de reactivo 2
50 (600 segundos): lectura absorbancia Do2 a 340 nm
Calibrado
Se realiza en 6 puntos. Se obtiene un valor cero utilizando una solución de cloruro de sodio (N°
CAS [7647-14-5]) al 9 ‰. Los otros 5 valores se obtienen con una gama de soluciones de
sulfato de amonio.

Solución madre de sulfato de amonio

Soluciones de calibrado
(NH4)2SO4 (N°CAS [7783-20-2])
4,8563 g
Agua desmineralizada hasta alcanzar
100 ml
Agite bien hasta completar la disolución. Esta solución contiene 12,5 g de nitrógeno amoniacal
por litro. Es estable 3 meses.
Se preparan según el cuadro siguiente:
Cantidad en ml de solución
madre diluida al 1/10 para
100 ml de agua
desmineralizada
Concentración de nitrógeno
amoniacal en mg.L-1
Vida útil: 3 meses
1
5
10
15
20
12,5
62,5
125
187,5
250
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
45/46
9.7
Lectura de los resultados
La lectura se realiza por diferencia entre la absorbancia DO 2 y la absorbancia de base DO 1.
Esta diferencia de absorbancia es proporcional al contenido de nitrógeno amoniacal de la
muestra utilizada. El resultado se expresa en mg de nitrógeno amoniacal por litro.
Certificado conforme
Tiblisi, 25 de junio de 2010
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
46/46