Ulatina - Universidad Latina de Panamá

INFORME TÉCNICO DE PROYECTO
Organismo ejecutor:
Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Latina de
Panamá.
Nombre del proyecto:
Evaluación de las Propiedades Inmunomoduladoras y
Antitumorales de Compuestos Naturales. Fase I: Estudio In Vitro.
Código del proyecto:
Código FID09-002
Nombre del investigador
principal:
Omar Ariel Dupuy Loo
Dirección y datos de
contacto:
Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Latina de Panamá.
Avenida Justo Arosemena. Ciudad de Panamá. Provincia de
Panamá. Rep. de Panamá. Apdo. 0823-00933. Tel. 207-6725
omarielsag@yahoo.com, http://www.ulat.ac.pa
José Bonilla (Univ. de Costa Rica), Peter Taylor (Instituto
Venezolano de Inv. Científicas), Renato Murillo (Univ. de Costa
Rica), Lorena González (Univ. Latina de Panamá)
Colaboradores:
Fecha de entrega de este
informe:
Etapa del proyecto:
[dd, mm, aaaa]
[Tome en cuenta que esta es la fecha de entrega del informe
completo a satisfacción]
Informe de la Etapa 1
Período cubierto en este
informe:
Diciembre 2009 - Abril 2011
Tiempo de ejecución del
proyecto:
24 meses
Monto total del proyecto:
40,000 balboas
Monto asignado a la etapa
en curso:
20,230 balboas
1
Contenido
Sección
Agradecimiento
Página
2
Resumen
3
Abstract
4
Antecedentes
5
Beneficios y principales beneficiarios
7
Impacto esperado
8
Objetivos del proyecto
8
Colaboradores del proyecto
9
Metodología
10
Productos
13
Estrategia de divulgación del proyecto
28
Conclusiones y recomendaciones
30
Bibliografía
31
Anexos
33
2
Agradecimiento
A la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) por financiar este
proyecto.
A la Junta Directiva de la Universidad Latina de Panamá por la asignación de fondos para el
acondicionamiento del Laboratorio de Investigaciones en Biotecnología y Ciencias Biomédicas de
la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Latina de Panamá.
3
Título del proyecto:
EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS Y ANTITUMORALES DE
COMPUESTOS NATURALES. FASE I: ESTUDIO IN VITRO.
ETAPA 1. ENSAYOS INMUNOLÓGICOS IN VITRO.
Palabras claves: Lupeol,
inmunomodulación.
casearina
G,
antocianina,
columbianatina,
bioprospección,
Resumen
Los procesos inflamatorios constituyen la causa directa o indirecta de varias enfermedades agudas
y crónicas. Aunque existen diversos tipos de antiinflamatorios disponibles en el mercado, es
necesario el desarrollo de nuevas drogas que modulen específicamente la respuesta inflamatoria
sin causar efectos adversos graves. Los bosques tropicales constituyen una fuente importante de
compuestos naturales con propiedades antiinflamatorias. Estos compuestos poseen grupos
funcionales que inhiben la activación de linfocitos T, la producción de interleucinas y la producción
de especies reactivas de oxígeno. Este estudio evaluó el efecto in vitro de cuatro compuestos
naturales lupeol (triterpeno), casearina G (diterpeno), una antocianina y columbianatina (una
cumarina) sobre la proliferación de linfocitos utilizando la técnica de sal tetrazolio (XTT). La
actividad de estos compuestos sobre la función fagocítica de los macrófagos fue estudiada
evaluando el porcentaje de células fagocíticas y el índice fagocítico. El efecto de estos compuestos
sobre la producción de óxido nítrico (NO) fue medido por medio de la reacción de Griess. Los
resultados muestran una disminución de la proliferación de células mononucleares de sangre
periférica (CMSP) tratadas con columbianatina (≥2.5 µg/ml) y antocianina (2.5 – 7.5 µg/ml). Por
otro lado, la exposición a ≥1 mg/ml de lupeol o 3 mg/ml de columbianatina redujo el porcentaje
de células fagocíticas y el índice fagocítico. Se observó que los macrófagos tratados con lupeol (30
µg/ml), casearina G (2.5 µg/ml), antocianina (7.5 µg/ml), columbianatina (7.5 µg/ml) disminuyeron
la producción de NO. Lupeol (<400 µg/ml), columbianatina (<100 µg/ml), antocianina (<200 µg/ml)
y casearina G (<30 µg/ml) no tuvieron efectos citotóxicos sobre linfocitos ni macrófagos. En
conjunto, estas observaciones indican que lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina
podrían ser compuestos útiles en la elaboración de drogas antiinflamatorias.
4
Abstract
The inflammatory processes constitute the direct or indirect reason of several acute and chronic
diseases. Although there are diverse types of antiinflammatory available on the market, there is
necessary the development of new drugs that specifically modulate the inflammatory response
without causing serious adverse effects. Rainforest are a important source of natural compounds
with anti-inflammatory properties. These compounds have active groups that inhibit Tlymphocytes activation, interleukin production and reactive oxygen species production. In the
present study, the in vitro effect of four natural compounds, lupeol (triterpene), casearina G
(diterpene), antocianina and columbianatina (coumarin), on lymphoproliferation was assessed by
using the tetrazolium salt (XTT) technique. The effect of these compounds on phagocytosis
(percentage of phagocytic cells and phagocytic index) was evaluated. The antioxidant activity of
these compounds was evaluated by measuring the production of nitric oxide (NO) by macrophages
using Griess reaction. The results show that treatment of peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) with columbianatina (≥2.5 µg/ml) and antocianina (2.5 – 7.5 µg/ml) decreased the
lymphocyte proliferation. Treatment of macrophages with lupeol (≥1 mg/ml) or columbianatina (3
mg/ml) resulted in reduction of the phagocytic index and percentage of phagocytic cells.
Treatment of macrophages with lupeol (30 µg/ml), casearina G (2.5 µg/ml), antocianina (7.5
µg/ml), and columbianatina (7.5 µg/ml) resulted in reduction of the production of NO. Neither
Lupeol (<400 µg/ml), columbianatina (<100 µg/ml), antocianina (<200 µg/ml), and casearina G
(<30 µg/ml) showed cytotoxic effects on lymphocytes or macrophages. In general, these
observations indicate that lupeol, casearina G, antocianina, and columbianatina might be useful
compounds in the elaboration of antiinflammatory drugs.
5
Antecedentes
Inflamación
La inflamación es un proceso fisiológico que ocurre en respuesta al daño tisular causado
por infecciones con microorganismos, irritación química, física y heridas (Philip et al., 2004). El
organismo tiene mecanismos para evitar que la respuesta inflamatoria se prolongue por
demasiado tiempo. Estos mecanismos incluyen moléculas proinflamatorias y antiinflamatorias que
permiten pasar de un tejido que presenta condiciones defensivas a un microambiente reparador
(Maiuri et al., 2004). Así pues, la prostaglandina E2, el factor de crecimiento transformante- (TGF(Levy et al., 2001) y los intermediarios reactivos del oxígeno y nitrógeno están entre las
moléculas que poseen dualidad de funciones, promueven y suprimen la inflamación (Nathan,
2002).
La resolución de la inflamación también requiere de una rápida y programada eliminación
de las células inflamatorias. Esta labor recae sobre los macrófagos circundantes, células
dendríticas y fagocitos de reserva, los cuales realizan su función induciendo la apoptosis y llevando
a acabo la fagocitosis (Savill y Fadok, 2000; Savill et al., 2002).
Sin embargo, si la resolución de la inflamación no se regula apropiadamente, la respuesta
celular puede cambiar a un patrón de inflamación crónica, en el que, el foco inflamatorio es
dominado por linfocitos, células plasmáticas y macrófagos con morfología variada (Philip et al.,
2004). Ciertamente, los macrófagos y otras células inflamatorias generan una gran cantidad de
factores de crecimiento, citocinas y especies reactivas del oxígeno y nitrógeno que pueden causar
daño al ADN (Coussens y Werb, 2002). Por tanto, si los macrófagos se activan persistentemente
pueden provocar un continuo daño tisular (Macarthur et al., 2004).
En el mercado existen una variedad de medicamentos dirigidos a controlar la respuesta
inflamatoria, sin embargo, su espectro de acción va desde una baja efectividad hasta una potente
acción que involucra la aparición de efectos adversos. Esta situación y el alto costo de algunas de
estas drogas hacen necesario continuar la búsqueda de nuevos principios activos que puedan ser
utilizados en la elaboración de nuevos medicamentos más económicos, efectivos y que no causen
los efectos adversos de las drogas que están actualmente en el mercado.
Por otro lado, el hallazgo de sustancias químicas que inhiban y/o modulen los procesos
inflamatorios aporta herramientas útiles para el estudio de los mecanismos moleculares
involucrados en los procesos fisiopatológicos de la inflamación. El entendimiento del detalle
molecular subyacente a la patología inflamatoria es esencial para el tratamiento de las
enfermedades asociadas a procesos inflamatorios descontrolados.
En este sentido, el problema que nos ocupa es que los procesos inflamatorios constituyen
una causa directa o indirecta de varias enfermedades agudas y crónicas. Aunque actualmente se
utilizan varios antiinflamatorios, es necesario el desarrollo de nuevas drogas que modulen
específicamente la respuesta inflamatoria sin causar efectos adversos graves. Nuestra hipótesis de
trabajo es que existen conpuestos naturales que poseen actividad antiinflamatoria,
potencialmente útiles desde el punto de vista terapéutico.
6
Los productos naturales son de gran potencial farmacológico debido a su amplia
diversidad estructural y su excelente adaptabilidad a estructuras biológicamente activas. En esta
investigación estudiamos el efecto in vitro de cuatro compuestos naturales (Figura 1), un
triterpeno, un diterpeno, una antocianina y una cumarina sobre la linfoproliferación y la
fagocitosis. Los resultados muestran que columbianatina y la antocianina disminuyen la
linfoproliferación mientras que lupeol y columbianatina disminuyen la fagocitosis.
Lupeol
Varias plantas utilizadas en la medicina folclórica para tratar síntomas inflamatorios
contienen lupeol como uno de sus principios activos. Lupeol disminuye la producción de
interleucina 4 (IL-4) por células Th2 y mostró una potente actividad antiinflamatoria en un modelo
alérgico inflamatorio de la vía aérea, mediante la reducción de la infiltración de eosinófilos y
citocinas asociadas a Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) (Gallo y Sarachine, 2009). Lupeol además reduce la
secreción de IL-6 inducida por el lipopolisacárido (LPS) (Ding et al., 2009). La actividad
antiinflamatoria tópica de extractos que poseen lupeol ha sido asociada con la reducción de
neutrófilos en los tejidos inflamados. Se ha reportado que lupeol posee un débil efecto
inmunoestimulador sobre los macrófagos mediante la medición de la producción de peróxido de
hidrógeno (Moreira et al., 2001). Por otro lado, se ha reportado la acción supresora de lupeol
sobre células T cooperadoras CD4+ y células T citotóxicas CD8+ y la inhibición de la producción de
IL-2, disminución de la secreción de citocinas proinflamatorias, tales como TNF-α e IFN-γ y
reducción de la fagocitosis (Bani et al., 2006; Gallo y Sarachine, 2009).
Diterpenos
Los terpenos constituyen un grupo importante de componentes vegetales que tienen un
origen biosintético común. Todos, aunque con estructuras químicas muy distintas, proceden de la
condensación, en número variable, de unidades isoprénicas. Los diterpenos constituyen un grupo
muy amplio de componentes de los vegetales cuya característica común es la de poseer una
estructura básica con 20 carbonos y proceder biosintéticamente del ácido mevalónico aunque
existan un gran número de estructuras distintas. Se ha reportado la actividad antiinflamatoria de
diterpenos extraídos de semillas de Vitex negundo (Zheng et al., 2010). El ácido abietico, un
diterpeno aislado de Pimenta racemosa exhibe actividad antiinflamatoria in vivo y tiene una
habilidad parcial para prevenir la producción de algunos mediadores inflamatorios (Fernández et
al., 2001). Hypoestoxide, un diterpeno de Hypoestes rosea, suprime la producción de citocinas
proinflamatorias (IL-1, IL-6 y TNF-) en células mononucleares de sangre periférica humana
activada con LPS, inhibe la producción de óxido nítrico por condrocitos humanos estimulados con
IL-1 (Ojo-Amaize et al., 2001). Sugiol, un diterpeno aislado de Calocedrus formosana, inhibe la
producción de IL-1, TNF- y especies reactivas de oxígeno (ROS) (Chao et al., 2005)
Antocianinas
Las antocianinas se diferencian de otros polifenoles por poseer azúcares dentro de sus
grupos funcionales y, en su mayoría, presentan varios grupos –OH (Muñoz et al., 2003). Las
7
diferencias individuales entre las antocianinas dependen del número de grupos hidroxilo, la
naturaleza y número de azúcares que están unidos a la molécula, a la posición de esa unión y la
naturaleza y número de ácidos aromáticos unidos al azúcar en la molécula (Kong et al., 2003).
Las antocianinas poseen conocidas propiedades farmacológicas utilizadas para la terapia
de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones realizadas con extractos ricos en
antocianinas, han mostrado que disminuyen la fragilidad y permeabilidad capilar; también efectos
antiinflamatorios y actividad antiedema (Wagner, 1985). El estudio de la capacidad antioxidante
de las antocianinas, muestra que son efectivas en el secuestro de especies reactivas de oxígeno y
también en la inhibición de la lipoperoxidación (Ghiselli et al., 1998; Jankowski et al., 2000). La
capacidad antioxidante se relaciona con el número de grupos –OH que presenten y el lugar de la
sustitución (Wang et al., 1997). A su vez las antocianinas son compuestos muy sensibles a cambios
de pH y temperatura debido a la deficiencia del electrón en su estructura (Satué-Gracia et al.,
1997).
Cumarinas
Las cumarinas comprenden un grupo de compuestos naturales encontrados en una
variedad de plantas. Estos compuestos tienen efectos importantes en la fisiología y bioquímica de
vegetal, actuando como antioxidantes, inhibidores enzimáticos y precursores de sustancias
tóxicas. Las cumarinas además poseen actividad antiinflamatoria, antialérgica, antitrombótica e
inhiben la biosíntesis de prostaglandinas, los sistemas enzimáticos de la ciclooxigenasa y la
lipoxigenasa y la generación de anión superóxido dependiente de neutrófilo (Fylaktakidou et al.,
2004). Las hidroxicumarinas son compuestos fenólicos típicos que actúan como potentes
quelantes de metales, captadores de radicales libres y potentes antioxidantes. Las cumarinas son
extremadamente variables en estructura, debido a los varios tipos de sustituciones en su
estructura básica, lo que puede influenciar su actividad biológica. Derivados cumarínicos inhiben el
edema y la formación de granuloma en modelos animales de inflamación (Ahmad et al., 2009) y
poseen un efecto comparable al de drogas como diclofenaco (Ahmad et al., 2009) e indametacina
(Menghini et al., 2010).
Beneficios y principales beneficiarios
Los beneficios de este proyecto incluyen: un mejor conocimiento del potencial
farmacológico de la flora de la región tropical y de la importancia de su conservación, la obtención
de nuevos compuestos inmunomoduladores con pocos efectos adversos.
Contribuir al descubrimiento de nuevos compuestos útiles desde el punto de vista
farmacológico beneficia a los países en vías de desarrollo, ya que aumenta las posibilidades de que
nuestros pueblos adquieran mejores medicamentos a precios más baratos.
8
Impacto esperado
Este proyecto aporta información sobre compuestos naturales que podrían representar
una alternativa farmacológica para el tratamiento de desórdenes inmunológicos. Esto realza el
valor ecológico de la diversidad biológica de la región tropical y aporta elementos para consolidar
las políticas de conservación de nuestros recursos naturales.
Objetivos del proyecto
Objetivo general
Evaluar las propiedades inmunomoduladoras de compuestos naturales in vitro.
Objetivos específicos
Realizar ensayos de proliferación de linfocitos tratados con compuestos naturales.
Evaluar la función fagocítica de los macrófagos en presencia de compuestos naturales.
Medir la liberación in vitro de NO por macrófagos tratados con compuestos naturales.
Establecer la utilidad de compuestos naturales en el estudio de los mecanismos moleculares
involucrados en la fisiopatología de la inflamación.
9
Colaboradores del proyecto
Omar A. Dupuy Loo y Lorena González: Compra de insumos. Cultivo de células. Cultivo de células
mononucleares de sangre periférica. Ensayos de citotoxicidad. Ensayos de linfoproliferación.
Ensayos de fagocitosis. Medición de óxido nítrico. Análisis estadístico. Elaboración de reporte y
publicaciones. omarielsag@yahoo.com, lore22_99@yahoo.com, tel. 207-6725, 207-6709, Facultad
de Ciencias de la Salud, Universidad Latina de Panamá.
José Bonilla: Revisión de reporte. Elaboración de publicaciones. JOSE.BONILLA@ucr.ac.cr, tel. (506)
2207 3204. Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica
Peter Taylor: Revisión de reporte. Elaboración de publicaciones. ptaylor@ivic.ve, tel. 58 (0)212
5041097, Laboratorio de Patología Celular y Molecular, Centro de Medicina Experimental, Instituto
Venezolano de Investigaciones Científicas, Apartado 20632, Caracas, 1020-A.
Renato Murillo: Suministro de compuestos de plantas de la región tropical. Revisión de reporte.
Elaboración de publicaciones. renato_murillo@hotmail.com, tel. (506)2207-4477, Escuela de
Química, Universidad de Costa Rica.
Porcentajes de Dedicación: Omar A. Dupuy Loo: 50%, José Bonilla: 5%, Peter Taylor: 5%, Renato
Murillo: 10%, Lorena González: 30%.
10
Metodología
1. Compra de Insumos
Los equipos, reactivos y otros insumos adquiridos con fondos de SENACYT para esta
investigación se mencionan e ilustran en los anexos 1, 2 y 3. Las facturas de dichas compras
(adjuntas a este reporte) cuentan con RUC y la descripción de que se adquirieron para el proyecto
código FID 09-002. La compra, entrega e instalación de equipo e insumos se realizó en la
Universidad Latina de Panamá, de febrero a abril de 2010.
2. Obtención de Compuestos
Los compuestos evaluados en este proyecto de investigación (Figura 1) fueron aislados y
purificados por uno de los co-investigadores de este trabajo, el Dr. Renato Murillo (Universidad de
Costa Rica, enero-agosto 2010) a partir de las plantas Zanthoxylum monophyllum y Casearia
sylvestris colectadas de la flora tropical, utilizando técnicas de extracción estándares. La estructura
química de los compuestos puros fue determinada por resonancia magnética nuclear. Un
milígramo de compuesto fue disuelto en 0.1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y luego fue diluído en
0.9 ml de medio de cultivo RPMI 1640, para obtener una solución patrón de 1 mg/ml, a partir de la
cual fueron realizadas diluciones para los diferentes ensayos.
A.
B.
C.
D.
OH
OCH3
HO
O
OH
OH
OH
Figura 1. Estructura química de A. Lupeol, un triterpeno aislado de Zanthoxylum monophyllum;
B. 18-butanoil-6--hidroxi-Casearina G, un diterpeno aislado de Casearia sylvestris; C. (2R,3S)-2(3,5-dihydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-3,5,7-triol, una antocianina aislada de Z. monophyllum;
y D. Columbianatina, una cumarina aislada de Z. monophyllum.
11
3. Cultivo de Células (mayo 2010 - abril 2011, Univ. Latina de Pmá)
Linfocitos y macrófagos fueron cultivados en medio RPMI 1640, suplementado con suero
fetal bovino (SFB) al 10%, 50 g/ml de estreptomicina, 100 UI/ml de penicilina, 2mM de glutamina,
5 mM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de solución MEM de aminoácidos esenciales, 45 mM de
bicarbonato de sodio, 0.8 mM de glucosa y 25 mM de N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2etanosulfónico) (HEPES). Los ensayos fueron realizados sembrando 1 x 105 células/pocillo en
placas de 96 pocillos de fondo plano. El volumen final agregado en cada pocillo fue de 200 l. Las
células fueron incubadas a 37oC en cámara húmeda, en una atmósfera al 5% de CO2. El número y
viabilidad celular fueron determinados por exclusión con azul tripán.
4. Cultivo de Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) (mayo - diciembre 2010, Univ.
Latina de Pmá)
Previa información y consentimiento de voluntarios aparentemente sanos, las muestras
de sangre total fueron colectadas en tubos estériles al vacío, con heparina como anticoagulante.
Las CMSP fueron separadas mediante un gradiente de Ficoll-Hypaque como lo indica el fabricante.
Brevemente, la sangre fue diluida 1:2 en tampón de fosfatos (PBS) y fue colocada sobre un
colchón de 2 ml Ficoll-Hypaque 1.044. Luego fue centrifugada a 1800 rpm por 45 minutos a 20oC.
Las células mononucleares fueron extraídas y lavadas con PBS estéril, pH 7.2. Finalmente las
células fueron resuspendidas en RPMI 1640, suplementado con SFB al 10%, 50 g/ml de
estreptomicina, 100 UI/ml de penicilina, 2mM de glutamina, 5 mM de 2-mercaptoetanol, 10 mM
de solución MEM de aminoácidos esenciales, 45 mM de bicarbonato de sodio, 0.8 mM de glucosa
y 25 mM de HEPES como tampón. La viabilidad celular fue verificada por observación
microscópica utilizando la tinción vital con azul tripán y la concentración fue ajustada a 1x106
células vivas/ml.
5. Ensayos de Citotoxicidad (mayo - noviembre 2010, Univ. Latina de Pmá)
Las células tratadas y no tratadas con los compuestos lupeol, casearina G, antocianina y
columbianatina a diferentes concentraciones fueron incubadas por quintuplicado a 37oC, en una
atmósfera al 5% de CO2 por 72 h. Posteriormente, fueron agregados 50 l por pocillo de una
solución de sal de tetrazolio 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-(fenilamino-carbonil)-2Htetrazol hidróxido (XTT) (1 mg/ml) y N-metilfenacina metasulfato (PMS) (0.01 M). Las células
fueron incubadas durante 2 h a 37 °C en oscuridad. Posteriormente, fueron transferidos 100 l del
sobrenadante de cada pocillo a otra placa de 96 pocillos y se cuantificó el cambio de color en un
lector de microplacas, a una longitud de onda de 450 nm y con un filtro de referencia de 650 nm.
Adicionalmente, la viabilidad de las células fue determinada con azul Tripán.
6. Ensayos de Linfoproliferación (junio - diciembre 2010, Univ. Latina de Pmá)
Fueron sembrados por quintuplicado 1x105 células en 100 l de medio por pozo, en placas
de 96 pozos fondo en "U". Se agregó fitohemaglutinina-M (PHA-M) como mitógeno a
concentración final de 10 g/ml. Además, fueron añadidas diferentes concentraciones de los
12
compuestos lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina. El volumen final de cada pocillo
(200 l) fue ajustado con RPMI 1640. Se incluyeron los siguientes controles: sólo CMSP,
CMSP+PHA-M, CMSP+compuesto, CMSP+DMSO. Las placas fueron incubadas a 37oC y 5% de CO2
por 72 h. La determinación de proliferación fue realizada utilizando el método de la sal de
tetrazolio. Los resultados fueron expresados como porcentaje de estimulación, en donde el 100%
de estimulación corresponde a CMSP con PHA-M sin compuestos (control).
7. Ensayos de Fagocitosis (julio 2010 – enero 2011, Univ. Latina de Pmá)
Se evaluó el efecto de los compuestos sobre la fagocitosis utilizando muestras de sangre
completa. Para ello, 125 µl de sangre venosa completa citratada fue tratada por triplicado con los
compuestos lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina a concentraciones finales de 1, 2 y
3 mg/ml durante una hora a 37oC y 5% de CO2. Luego se agregó 125 µl de suspensión de Bacillus
subtilis (1x109 UFC/ml) inactivada previamente a 80oC durante 1 hora. Las muestras fueron
incubadas a 37oC y 5% de CO2 durante 30 min. Luego se prepararon extendidos en portaobjetos y
se procedió a teñirlos con tinción de Wright. Las placas fueron observadas al microscopio para
determinar la fagocitosis (porcentaje de células fagocíticas) y el índice fagocítico (cantidad
promedio de bacterias fagocitadas por los neutrófilos).
8. Medición de Óxido Nítrico (febrero – marzo 2011, Univ. Latina de Pmá)
Macrófagos tratados y no tratados con diferentes concentraciones de los compuestos
lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina, fueron estimulados con 50 l de de extracto
bacterial no viable (1 g/ml) y fueron incubados a 37°C durante 24 h. Posteriormente, fueron
transferidos 100 l de sobrenadante de cada pocillo a otra placa similar y se determinó la cantidad
de óxido nítrico producido mediante la reacción de Griess.
9. Análisis Estadístico (noviembre 2010 – abril 2011, Univ. Latina de Pmá)
Los datos fueron evaluados por medio de un análisis de variancia (ANOVA). Los resultados
se presentan como el promedio de cada tratamiento y de los controles ± la desviación estándar
respectiva. P < 0.05 fue considerado como nivel satisfactorio de significancia estadística.
10. Elaboración de Informes y Publicaciones (noviembre 2010 – abril 2011, Univ. Latina de Pmá,
UCR, IVIC)
La elaboración del reporte técnico-financiero involucró, entre otros aspectos, objetivos,
metodología, productos, resultados, discusión, conclusiones, informe financiero, facturas, entre
otros. Parte de la información recabada durante está investigación fue presentada en el XIII
Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología, realizado del 6 al 9 de octubre de 2010, en el Centro
de Convenciones de la Ciudad del Saber. Este trabajo será presentado en el Congreso de
Estudiantes de Biotecnología de la Universidad Latina de Panamá, con el título de
Bioprospección de Compuestos Naturales con Actividad Antiinflamatoria, dicho evento se realizará
el 2, 4 y 5 de julio en la sede central de la Universidad Latina de Panamá (Avenida Ricardo J. Alfaro,
Ciudad de Panamá). Actualmente estamos elaborando dos artículos con miras a ser enviados a la
13
Revista de Biología Tropical (Costa Rica) y a la Revista Médica de Chile, ambas revistas indexadas.
Esta investigación además ha originado la tesis de maestría de uno de los co-investigadores, la Lic.
Lorena González. Dicha tesis está en etapa de redacción.
Productos
1.Compra de Insumos: Los equipos e insumos adquiridos con fondos de SENACYT para esta
investigación se muestran en los anexos 1, 2 y 3. Las facturas originales se adjuntan a este reporte.
2. Obtención de Compuestos: Los compuestos naturales estudiados son (Figura 1):
1. Lupeol, un triterpeno aislado de Zanthoxylum monophyllum.
2. 18-butanoil-6--hidroxi-Casearina G, un diterpeno aislado de Casearia sylvestris.
3. (2R,3S)-2-(3,5-dihydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-3,5,7-triol, una antocianina aislada
de Z. monophyllum.
4. Columbianatina, una cumarina aislada de Z. monophyllum.
3. Cultivo de Células: Los resultados presentados en este trabajo se obtuvieron a partir de
bioensayos realizados con:
1. Cultivo primario de células mononucleares de sangre periférica.
2. Monocitos/macrófagos de sangre completa.
3. Neutrófilos de sangre completa.
4. Macrófagos murinos.
14
Figura 3. Cultivo de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Las CMSP fueron
sembradas a una concentración de 1x105 células, en placas de 96 pocillos fondo en "U" a un
volumen final en cada pocillo de 200 l de medio RPMI 1640 suplementado. Las placas fueron
incubadas a 37oC y 5% de CO2 por 72 h y luego se les agregó XTT. Aumento 100X.
5. Ensayos de Citotoxicidad: Las CMSP fueron cultivadas para realizar los ensayos de citotoxicidad
(Figura 4).
La cantidad de CMSP vivas disminuyó (p<0.05) cuando la concentración de lupeol se
incrementó a 400 µg/ml y casearina G se incrementó a ≥30 µg/ml (Figura 5). Adicionalmente, la
15
cantidad de CMSP vivas disminuyó (p<0.05) cuando la concentración de antocianina se incrementó
a ≥200 µg/ml y columbianatina se incrementó a ≥100 µg/ml (Figura 6). Por debajo de estas
concentraciones no se observaron efectos citotóxicos sobre las CMSP. Las concentraciones de
compuestos naturales utilizadas en los ensayos inmunológicos estuvieron muy por debajo de las
concentraciones tóxicas. De manera similar a los resultados obtenidos con otros compuestos
naturales (Dupuy et al., 2008a,b), los compuestos estudiados en esta investigación sólo muestran
citotoxicidad a muy altas concentraciones, lo que respalda nuestra posición en el sentido de que
toda sustancia, inclusive las provenientes de la naturaleza, requieren un exhaustivo estudio a fin
de establecer su potencial uso farmacológico vs toxicidad.
Figura 4. Cultivo de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) tratado con lupeol (25
µg/ml). Las CMSP fueron sembradas a una concentración de 1x105 células, en placas de 96 pocillos
fondo en "U" y se les agregó el compuesto en estudio. El volumen final en cada pocillo fue de 200
l y se alcanzó agregando medio RPMI 1640 suplementado. Las placas fueron incubadas a 37oC y
5% de CO2 por 72 h y luego se les agregó XTT. Aumento 100X.
16
A.
B.
Figura 5. Efecto de los compuestos A. lupeol y B. casearina G sobre la viabilidad de CMSP. Las
células fueron cultivadas en ausencia y en presencia de lupeol (0 – 400 µg/ml) y casearina G (0 –
35 µg/ml) durante 72 h. El número de células vivas y muertas fue determinado con azul tripán. A
concentraciones de 400 µg/ml de lupeol y ≥30 µg/ml de casearina G, se observó una disminución
de la cantidad de células viables (p < 0.05). Cada barra representa el promedio ± DE de cinco
réplicas.
17
A.
B.
Figura 6. Efecto de los compuestos A. Antocianina y B. Columbianatina sobre la viabilidad de
CMSP. Las células fueron cultivadas en ausencia y en presencia de antocianina (0 – 500 µg/ml) y
columbianatina (0 – 500 µg/ml) durante 72 h. El número de células vivas y muertas fue
determinado con azul tripán. A concentraciones ≥200 µg/ml de antocianina y ≥100 µg/ml de
columbianatina, se observó una disminución de la cantidad de células viables (p < 0.05). Cada
barra representa el promedio ± DE de cinco réplicas.
6. Ensayos de Linfoproliferación: La respuesta linfoproliferativa a PHA-M disminuyó (p<0.01) en
los cultivos de CMSP tratados con antocianina (2.5 – 7.5 µg/ml) (Figuras 7 y 9A), este efecto
comenzó a disminuir a partir de concentraciones de 15 µg/ml hasta hacerse no significativo
(p>0.05) a concentraciones de 30 µg/ml (Figura 9A). Lupeol (5-200 µg/ml) y casearina G (2.5-15
µg/ml) no afectaron significativamente (p>0.05) la respuesta linfoproliferativa a PHA-M (Figura 8).
La respuesta linfoproliferativa a PHA-M disminuyó (p<0.01) en los cultivos de CMSP tratados con
columbianatina (≥2.5 µg/ml) (Figura 9B). Nuestros resultados son consistentes con los reportes de
que las antocianinas y las cumarinas tienen actividad antiinflamatoria (Wagner, 1985).
18
Figura 7. Cultivos de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), A. Control negativo, B.
CMSP tratadas con mitógeno PHA-M (10 µg/ml) y antocianina (5 µg/ml) y C. Control positivo
tratado sólo con PHA-M. Las CMSP tratadas con antocianina formaron menos agregados celulares
que el control positivo. Aumento 100X.
19
A.
B.
Figura 8. Efecto in vitro de A. Lupeol y B. Casearina G sobre la respuesta linfoproliferativa. CMSP
humanas fueron cultivadas con PHA-M (10 µg/ml), lupeol (0 – 200 µg/ml) y casearina G (0 – 15
µg/ml), durante 72 h. Las células fueron incubadas con XTT y se midió la absorbancia del
sobrenadante. Los resultados se expresan como porcentaje de estimulación. No se observó efecto
significativo (p>0.05) sobre la proliferación de linfocitos en los cultivos tratados con lupeol y
casearina G. Cada columna representa el promedio ± DE de cinco réplicas.
20
A.
B.
Figura 9. Efecto in vitro de A. Antocianina y B. Columbianatina sobre la respuesta linfoproliferativa.
CMSP humanas fueron cultivadas con PHA-M (10 µg/ml), antocianina (0 – 30 µg/ml) y
columbianatina (0 – 30 µg/ml) durante 72 h. Las células fueron incubadas con XTT y se midió la
absorbancia del sobrenadante. Los resultados se expresan como porcentaje de estimulación. La
proliferación de linfocitos disminuyó en los cultivos tratados con antocianina (2.5 – 7.5 µg/ml) y
columbianatina (≥2.5 µg/ml). Cada columna representa el promedio ± DE de cinco réplicas. Los
símbolos * y ** indican diferencia estadísticamente significativa (p<0.05 y p<0.01,
respectivamente) con respecto al grupo control 100% de estimulación (sin tratamiento).
7. Ensayos de Fagocitosis: Los bioensayos con monocitos/macrófagos y neutrófilos de muestras de
sangre completa permitieron evaluar el efecto de los compuestos naturales sobre la fagocitosis
(Figura 10). Se observó una disminución (p<0.01) de la fagocitosis en las muestras tratadas con
lupeol (≥1 mg/ml) y columbianatina (3 mg/ml) (Figura 11). Sin embargo, no se observó diferencia
significativa (p>0.05) entre casearina G y antocianina comparadas con el control en cuanto al
porcentaje de células fagocíticas (Figura 11). Además, se observó una disminución significativa
21
(p<0.05) del índice fagocítico luego del tratamiento con lupeol (≥1 mg/ml, p<0.01) y
columbianatina (3 mg/ml)(Figura 12). Sin embargo, no se observó diferencia significativa (p>0.05)
entre casearina G y antocianina comparados con el control (Figura 12). Nuestros resultados
aportan evidencia de que las cumarinas (columbianatina) y lupeol disminyen la fagocitosis, lo que
puede traducirse en un efecto antiinflamatorio. En el caso particular de lupeol, su capacidad de
reducir la fagocitosis ha sido reportada en otros modelos experimentales (Bani et al., 2006; Gallo y
Sarachine, 2009).
Figura 10. Efecto in vitro de lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina sobre la fagocitosis.
A. Neutrófilo con abundantes Bacillus subtilis en su interior (control sin tratamiento). B. Monocitomacrófago tratado con lupeol (2 mg/ml), se observan pocas bacterias en el interior de la célula. C.
Monocito-macrófago tratado con casearina G (2 mg/ml). D. Neutrófilos tratados con antocianina
(2 mg/ml). E. Neutrófilo tratado con columbianatina (3 mg/ml), se observan pocas bacterias en el
interior de la célula. F. y G. Células fagocíticas con pocas partículas en su interior. Tinción de
Wright. Aumento 100X.
22
A.
B.
Figura 11. Efecto in vitro de A. lupeol, casearina G, B. Antocianina y columbianatina sobre la
fagocitosis. Fagocitos en sangre completa tratados y no tratados con lupeol, casearina G,
antocianina y columbianatina (0 – 3 mg/ml) fueron incubados con Bacillus subtilis, se contabilizó el
número de células con bacterias en su interior. El porcentaje de células fagocíticas disminuyó en
las muestras tratadas con lupeol (≥1 mg/ml) y columbianatina (3 mg/ml). Cada columna
representa el promedio ± DE de tres réplicas. Los símbolos * y ** indican diferencia
estadísticamente significativa (p<0.05 y p<0.01, respectivamente) entre tratamiento y el grupo
control (sin tratamiento).
23
A.
B.
Figura 12. Efecto in vitro de A. lupeol, casearina G y B. Antocianina, columbianatina sobre el índice
fagocítico. Fagocitos en sangre completa tratados y no tratados con lupeol, casearina G,
antocianina y columbianatina (0 – 3 mg/ml) fueron incubados con Bacillus subtilis, se contabilizó el
número de bacterias fagocitadas por célula. El índice fagocítico disminuyó en los cultivos tratados
con lupeol (≥1 mg/ml) y columbianatina (3 mg/ml). Cada columna representa el promedio ± DE de
tres réplicas. Los símbolos * y ** indican diferencia estadísticamente significativa (p<0.05 y p<0.01,
respectivamente) entre tratamiento y el grupo control (sin tratamiento).
24
8. Medición de Óxido Nítrico: Los bioensayos con macrófagos permitieron evaluar el efecto de los
compuestos naturales sobre la producción de óxido nítrico (Figuras 13-15). Se observó una
disminución (p<0.05) de la producción de óxido nítrico en las muestras tratadas con lupeol (30
µg/ml), casearina G (2.5 µg/ml) (Figura 14), antocianina (7.5 µg/ml) y columbianatina (7.5 µg/ml)
(Figura 15). El efecto de estos compuestos naturales sobre la producción de óxido nítrico parece
reflejar su potencial antiinflamatorio (Ghiselli et al., 1998; Jankowski et al., 2000; Ding et al., 2009).
Sin embargo, más que inhibitorio, los datos sugieren un efecto modulador, en el que a
concentraciones intermedias de estos compuestos, la producción de óxido nítrico disminuye y a
concentraciones extremas no se ve afectada. Esto es particularmente cierto para el diterpeno, la
antocianina y columbianatina.
Figura 13. Los ensayos de producción de óxido nítrico se realizaron utilizando cultivos de células
fagocíticas estimuladas con extracto bacteriano no viable.
25
A.
B.
Figura 14. Efecto in vitro de A. Lupeol y B. Casearina G sobre la producción de óxido nítrico por
macrófagos activados. Los macrófagos fueron cultivados con lupeol (0 – 30 µg/ml) y casearina G (0
– 15 µg/ml), durante 72 h. A concentraciones de lupeol de 30 µg/ml y casearina G de 2.5 µg/ml, los
macrófagos disminuyeron significativamente (p<0.05) la producción de óxido nítrico. Cada barra
representa el promedio ± DE de tres réplicas. * Indica diferencia estadísticamente significativa (p <
0.05) con respecto al grupo control (0 µg/ml de compuestos naturales).
26
A.
B.
Figura 15. Efecto in vitro de A. Antocianina y B. Columbianatina sobre la producción de óxido
nítrico por macrófagos activados. Los macrófagos fueron cultivados con antocianina (0 – 30 µg/ml)
y columbianatina (0 – 30 µg/ml) durante 72 h. A concentraciones de antocianina y casearina G de
7.5 µg/ml, los macrófagos disminuyeron significativamente (p<0.05) la producción de óxido nítrico.
Cada barra representa el promedio ± DE de tres réplicas. * Indica diferencia estadísticamente
significativa (p < 0.05) con respecto al grupo control (0 µg/ml de compuestos naturales).
9. Análisis Estadístico: Reporte de las pruebas estadísticas realizadas señalando los compuestos
que tuvieron actividad inmunológica (Cuadro 1). Los datos fueron evaluados por medio de un
análisis de variancia (ANOVA). P < 0.05 fue considerado como nivel satisfactorio de significancia
estadística.
27
Cuadro 1. Reporte de Análisis Estadístico
Prueba
Concentración Valor de P
Ensayos de Citotoxicidad
Lupeol
400 µg/ml
0.0197
30 µg/ml
0.013
Casearina G
35 µg/ml
0.01
200 µg/ml
0.015
Antocianina
300 µg/ml
0.01
400 µg/ml
0.0139
100 µg/ml
0.0186
200 µg/ml
0.0029
Columbianatina
300 µg/ml
0.002
400 µg/ml
0.0025
500 µg/ml
0.0025
Ensayos de Linfoproliferación
Lupeol
200 µg/ml
0.506
Casearina G
15 µg/ml
0.1171
2.5 µg/ml
0.0034
5 µg/ml
0.001
Antocianina
7.5 µg/ml
0.0023
15 µg/ml
0.01
2.5 µg/ml
0.0015
5 µg/ml
0.0012
Columbianatina
7.5 µg/ml
0.001
15 µg/ml
0.0012
30 µg/ml
0.0013
Fagocitosis
1 mg/ml
0.005
Lupeol
2 mg/ml
0.001
Casearina G
3 mg/ml
0.052
Antocianina
3 mg/ml
0.1
1 mg/ml
0.009
Columbianatina
2 mg/ml
0.02
3 mg/ml
0.001
Índice Fagocítico
1 mg/ml
0.007
Lupeol
2 mg/ml
0.004
Casearina G
3 mg/ml
0.055
Antocianina
3 mg/ml
0.07
28
Columbianatina
Óxido Nítrico
Lupeol
Casearina G
Antocianina
Columbianatina
1 mg/ml
3 mg/ml
0.04
0.02
30 µg/ml
2.5 µg/ml
7.5 µg/ml
15 µg/ml
7.5 µg/ml
0.01
0.013
0.02
0.012
0.013
10. Utilidad de los Compuestos Naturales en el Estudio de los Mecanismos Moleculares
Involucrados en la Fisiopatología de la Inflamación.
Los resultados de este estudio in vitro muestran que los compuestos estudiados en esta
investigación afectan diferentes eventos de la respuesta inmune. Lupeol afecta la fagocitosis, la
antocianina afecta la linfoproliferación y columbianatina afecta tanto la fagocitosis como la
linfoproliferación. Estos compuestos podrían servir para disectar, al menos in vitro, diferentes
componentes inmunológicos, tal como se ilustra en la figura 16.
Desafío Antigénico
Fagocitosis
lupeol, columbianatina
lupeol, casearina G, antocianina, columbianatina
Producción de óxido nítrico
Procesamiento y Presentación Antigénica
antocianina, columbianatina
Linfoproliferación
Figura 16. Modelo propuesto para el efecto de lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina
sobre la respuesta inmune.
De esta forma, es posible constatar que las diferentes etapas de la respuesta inmune
pueden diferir en su susceptibilidad a las drogas estudiadas. Inhibiendo alguna de estas etapas se
puede estudiar el efecto sobre las otras etapas.
Estrategia de divulgación del proyecto
Elaboración de Informes y Publicaciones: Se entrega reporte (versión impresa y CD) de los
resultados obtenidos en la investigación. Parte de la información recabada durante está
investigación fue presentada en el XIII Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología, realizado del 6
al 9 de octubre de 2010, en el Centro de Convenciones de la Ciudad del Saber (Figura 17). Este
trabajo será presentado en el Congreso de Estudiantes de Biotecnología de la Universidad Latina
29
de Panamá, con el título de Bioprospección de Compuestos Naturales con Actividad
Antiinflamatoria, dicho evento se realizará el 2, 4 y 5 de julio en la sede central de la Universidad
Latina de Panamá (Avenida Ricardo J. Alfaro, Ciudad de Panamá).Actualmente estamos
elaborando dos artículos con miras a ser enviados a la Revista de Biología Tropical (Costa Rica) y a
la Revista Médica de Chile, ambas revistas indexadas. Esta investigación además ha originado la
tesis de maestría de uno de los co-investigadores, la Lic. Lorena González. Dicha tesis está en etapa
de redacción.
Figura 17. Resumen de ponencia “Evaluación de las Propiedades Inmunomoduladoras de
Compuestos Naturales. Fase I: Estudio In Vitro.” presentada en el XIII Congreso Nacional de Ciencia
y Tecnología, realizado del 6 al 9 de octubre de 2010, en el Centro de Convenciones de la Ciudad
del Saber.
30
Conclusiones y recomendaciones
Conclusiones
1. Lupeol (<400 µg/ml) no mostró citotoxicidad in vitro.
2. Lupeol causa la disminución de la fagocitosis.
3. Lupeol causa la disminución de la producción de óxido nítrico.
4. Columbianatina (<100 µg/ml) no mostró citotoxicidad in vitro.
5. Columbianatina causa la disminución de la proliferación de linfocitos.
6. Columbianatina causa la disminución de la fagocitosis.
7. Columbianatina causa la disminución de la producción de óxido nítrico.
8. Antocianina (<200 µg/ml) y casearina G (<30 µg/ml) no mostraron citotoxicidad in vitro.
9. La antocianina causa la disminución de la proliferación de linfocitos.
10. Casearina G y antocianina causan la disminución de la producción de óxido nítrico.
Recomendaciones
1. Realizar estudios en modelos animales con el fin de determinar el efecto in vivo de lupeol,
antocianina y columbianatina.
2. Realizar estudios para determinar el efecto antitumoral de lupeol, el diterpeno, la
antocianina y columbianatina, ya que existen reportes de su potencial anticáncer.
3. Realizar el estudio de estos y otros compuestos similares utilizando técnicas de biología
celular y molecular como EMSA (“Electrophoretic Mobility Shift Assay”), citometría de
flujo y TUNEL (“Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling”) que
permitan dilucidar los mecanismos de acción de estos compuestos y su relación estructura
– función.
4. Estudiar otros compuestos naturales para determinar su potencial farmacológico.
31
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33
Anexos
ANEXO 1 INFORME FINANCIERO DE PROYECTO
Detalle de gastos
Asignado por
SENACYT
3,885
4,410
Lector de ELISA
4,410
4,410
Tanque de nitrógeno
líquido
5,523
5,565
Medios de cultivo y
suero fetal bovino
2,000
1,831.2
Botellas y platos de
cultivo
2,000
1,911
Reactivos
1,562
1,560.3
Micropipeta y puntas
400
244.65
Contingencia
450
216.3
Microscopio Invertido
SUBTOTAL (en B/.)
20,230
Ejecutado
20,148.45
Saldo
81.55
Observaciones
34
ANEXO 2. EQUIPO ADQUIRIDO CON FONDOS DE SENACYT PARA
LA REALIZACIÓN DE ESTA INVESTIGACIÓN.
35
ANEXO 3. REACTIVOS E INSUMOS ADQUIRIDOS CON FONDOS DE
SENACYT PARA LA REALIZACIÓN DE ESTA INVESTIGACIÓN.