DIVERSIDAD Y OPTIMIZACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DEL FITOPLASMA ASOCIADO AL AMARILLAMIENTO LETAL DEL COCOTERO EN CUBA R. Llauger 1 ∗, E.L. Peralta González 4. 2 , M. Dollet 3, J. Cueto 1 , M. Rodríguez 1 , D. Fajardo 1 y V. 1 : Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT), Ave. 7ma, # 3005 e/ 30 y 32, Playa, C. de la 2 Habana, Cuba; : Centro Nacional de Sanidad Vegetal (CENSA), Autopista Nacional y Carretera de Tapaste, Apdo 10, San José de la Lajas, Cuba; 3 CIRAD, TA 30/G, Campus International de Baillarguet, 4 344398, Montpellier Cedes 5, Francia; : Empresa del Coco, Carretera del Toa Km 3.5, Mabujabo, Baracoa, Cuba. ∗ Autor para correspondencia: Tel: 2025526, Fax: 204 6794, email: iicit@ceniai.inf.cu Resumen Entre los aspectos de mayor interés en el ámbito internacional con respecto al Amarillamiento Letal del Cocotero (LY) se encuentran el estudio de la variabilidad genética del fitoplasma asociado a la enfermedad y el perfeccionamiento de los métodos para su diagnóstico, los que constituyen objetivos de este trabajo. Para la optimización del diagnóstico, se ensayaron diferentes parejas de cebadores empleadas para la detección de la enfermedad en otras regiones del Caribe (LY1F/LY1R y MMR/MMF); distintas concentraciones de MgCl2 y diluciones de las muestras. Se seleccionaron 23 de los aislados positivos procedentes de cinco provincias cubanas y se analizaron por PCR-RFLP empleando los cebadores universales P1 y P6 (Deng and Hiruki, 1991) y las enzimas de restricción EcoRI, RsaI y BamHI. La concentración de 2.5mM de MgCl2 y la dilución de 1/100 resultaron las óptimas para el diagnóstico con los cebadores LY1F/LY1R. Los cebadores MMR/MMF no reconocieron los aislados cubanos. La comparación de los perfiles de restricción, evidenció la diversidad de los aislamientos cubanos, la presencia de entre 5 y 7 patrones con cada enzima, así como los perfiles mayoritarios en cada caso. Palabras Claves: Amarillamiento letal del cocotero, Diversidad genética, diagnóstico PCR, Mollicutes. DIVERSITY AND DIAGNOSIS OPTIMIZATION OF THE PHYTOPLASMA ASSOCIATED TO THE COCONUT LETHAL YELLOWING IN CUBA Abstract Among the aspects of greater interest in the international scope with respect to the Coconut Lethal Yellowing (LY) are the study of the genetic variability of phytoplasmas associated to the disease and the improvement of the methods for their diagnosis, which constitute objectives of this paper. For the optimization of the diagnosis, different primers pairs used for the detection of the disease in other Caribbean regions were tried (LY1F/LY1R and MMR/MMF), as well as different concentrations from MgCl2 and dilutions of the samples. Twenty-three positives isolated coming from five Cuban provinces were selected and they were analyzed by PCRRFLP, using universal primers P1 and P6 (Deng and Hiruki, 1991) and restriction enzymes EcoRI, RsaI and BamHI. The concentration of 2.5mM of MgCl2 and the sample dilution of 1/100 were optimal for the diagnosis with primers LY1F/LY1R. No amplification was obtained when MMR/MMF primers were used. Comparison between restriction patterns evidenced the diversity of Cuban isolates, the presence of 5-7 profiles and the main ones with each enzyme. Key words: coconut Lethal Yellowing, genetic diversity PCR diagnosis, Mollicutes Introducción EL cultivo del cocotero (Cocos nucifera L) es afectado por varias enfermedades de diferente etiología. Entre estas, la enfermedad de Amarillamiento Letal (LY) representa una de las más importantes para la región del Caribe por las pérdidas económicas ocasionadas (Roca de Doyle, 2001) y se asocia a la presencia de fitoplasmas. En Cuba, se han registrado epifitias de esta enfermedad en diferentes décadas de los siglos XIX y XX (Cueto J. Comunicación personal; Waters et al., 1978). A pesar de los resultados alcanzados por autores como Rohde et al., (1993), Martínez Soriano et al., (1994), Harrison et al., (1994) y Tymon et al., (1998), el conocimiento de la variabilidad genética de los fitoplasmas asociados al LY es aún limitado y no se ha trabajado profundamente en la optimización de los ensayos de PCR para su diagnóstico. Los objetivos de este trabajo han sido abordar ambos como parte del estudio del LY en Cuba. Optimización del diagnóstico mediante PCR Para la optimización del diagnóstico se ensayaron los protocolos y las parejas de cebadores descritos por Harrison, (1992) (LY1F/LY1R) y Martínez-Soriano, (1994) (MMR/MMF). Se utilizaron dos controles positivos y uno negativo previamente comprobados (Llauger et al.,2002). Se evaluó la influencia en los resultados de la PCR de las concentraciones finales de MgCl2 (1.5mM, 2.5mM y 3.5mM) y de la dilución del ADN (1/10 y 1/100), seleccionándose las condiciones óptimas de realización. Estas fueron empleadas posteriormente para el análisis de 68 muestras con y sin síntomas de la enfermedad, seleccionadas en diferentes localidades de las provincia Pinar del Río, Ciudad de la Habana, Holguín, Granma y Guantánamo. El ADN total de todas la muestras trabajadas fue obtenido y cuantificado según lo descrito por Doyle and Doyle (1990) modificado por Rohde et al. (1995). Al emplear los cebadores LY1F/LY1R se obtuvieron amplificaciones de la talla esperada (1,1 kb) en los controles positivos, no así en el negativo. Al emplear 2.5mM y 3.5mM de MgCl2 se obtuvieron resultados positivos con las dos diluciones de ADN evaluadas. Sin embargo, con la concentración de 1.5mM, la intensidad del producto amplificado fue muy débil y los resultados no fueron repetibles. Se seleccionó la concentración de 2.5 mM de MgCl2 y la dilución de la muestra 1/100 como óptimas, teniendo en cuenta la homogeneidad de los resultados con respecto al tamaño de la banda, su nitidez e intensidad, así como la reproducibilidad en los diferentes ensayos. La importancia de la concentración de MgCl2 en la PCR ha sido previamente discutida por varios autores (Saiki, 1989; Mahony, et al., 1994) y se confirman con los resultados obtenidos en este trabajo. La evaluación de muestras de campo con y sin síntomas, demostró la factibilidad del ensayo bajo las condiciones seleccionadas. En la Fig. 1 pueden apreciarse las diferencias obtenidas al evaluar las tres concentraciones de MgCl2, así como los resultados del análisis de algunas de las muestras de campo colectadas. Los resultados de la amplificación con los cebadores descritos por Martínez Soriano et al., (1994),fueron negativos, lo que evidencia que no pueden ser empleados para el diagnóstico en nuestro caso, ya que no reconocen los aislados de las regiones de Cuba analizadas. Comparación de los patrones de restricción de aislamientos cubanos de LY Se emplearon 23 de los aislados con resultados positivos (epígrafe anterior), representativos de las cinco provincias muestreadas. La amplificación del ADN para su posterior análisis por RFLP se realizó a partir de los cebadores P1 y P6 (Deng and Hiruki, 1991) con el protocolo utilizado por Tymon et al., (1998). El volumen final de la mezcla de reacción fue de 50µl conteniendo:1 µl de la muestra de ADN (50ng), 1µl de cada cebador (10pmol/µl), 2µl de la mezcla de los dNTPs (8mM), 2µl de MgCl2 (2.5mM), 5µl del tampón de PCR 10X, y 0.25 µl de Taq Polimerasa (5 unidades/reacción). Los productos de PCR (10µl) fueron digeridos con las enzimas de restricción EcoRI, RsaI, BamHI según lo establecido por el productor (Boehringer & Mannheim, UK). Las amplificaciones realizadas dieron como producto una banda de 1,5kb en todos los aislamientos estudiados, no así en los controles negativos. Resultados similares fueron obtenidos por Tymon et al., (1998) con diferentes aislados africanos. La Tabla 1 resume los resultados obtenidos al digerir los productos de PCR con las tres enzimas de restricción. Estos resultados sugieren la existencia de variabilidad entre los aislados estudiados. Se identificó un patrón mayoritario en el 70% de las muestras al ser digeridas con la enzima BamHI, evidenciándose diferencias en las restantes, entre las que se destaca la 18 de Ciudad de la Habana, que también pudo distinguirse del resto mediante la digestión con EcoRI. El perfil mayoritario con RsaI agrupó sólo el 39% de los aislamientos y el 49% en el caso de EcoRI. Este último patrón coincide con el obtenido por Harrison et al., (1994) para aislamientos procedentes de la Florida, Jamaica y Tanzania y en general, son comparables a los obtenidos en este trabajo. Por otra parte llama la atención que con EcoRI, todos los aislamientos estudiados procedentes de Holguín se agrupan en un mismo perfil, al igual que la mayoría de los colectados en Ciudad Habana. Por otra parte, más del 50% de los aislamientos de Guantánamo presentaron un mismo patrón al ser digeridos con esta enzima, a diferencia de lo observado con las restantes. Trabajos similares han sido realizados por otros autores (Tymon et al., 1997 y 1998; Cronjé, 1998) empleando productos amplificados a partir de diferentes parejas de cebadores diseñadas para las regiones 16S rADN y 16-23S de los fitoplasmas. Aunque no es posible comparar los perfiles obtenidos por haberse empleado condiciones diferentes, se confirma la utilidad de esta metodología para la diferenciación de aislados de fitoplasmas. Los resultados presentados son los primeros que sugieren la diversidad de aislamientos cubanos de fitoplasmas asociados al LY. Sin embargo, nuevas investigaciones se encaminan a la utilización de una mayor cantidad de enzimas y la secuenciación de diferentes aislados, como criterio conclusivo para la determinación de la variabilidad y relaciones filogenéticas entre los aislamientos, teniendo en cuenta que los análisis RFLP de las regiones del ARN ribosomal 16S o la intergénica, por sí solos, no reflejan completamente la variabilidad de los fitoplasmas (Seemüller et al, 1998). Agradecimientos: Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el CIRAD, Montpellier donde se realizó una parte de las investigaciones aquí incluidas. Al Prof. Dr. Wolfgang Rohde del MPIZ por el aporte de reactivos y materiales de Laboratorio. Referencias 1. Cronjé P. 1998. Final report on a Rothamsted-International Fellowship. 2. Deng S & Hiruki C.1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and nonculturable Mollicutes. Journal of microbiological methods 14:53-61. 3. Doyle J.J & Doyle J.L 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus (Life Technologies Inc.) 12: 13-15. 4. Harrison, N.A., Bourne, C.M., Cox, R.L Tsai, J.H. and Richardson, P.A.1992. ADN probes for detection of mycoplasma-like organisms associated with lethal yellowing of palms in Florida. Phytopathology , 82: 216-244. 5. Harrison, N.A., Richardson, P.A.,Jones P.,Tymon A M., Eden green S J & Mpunami A A.1994. Comparative investigation of MLOs associated with Caribbean and African Coconut Lethal Decline Diseases by DNA hybridisation and PCR assays.Plant Diseases, 78 : 507511. 6. Llauger R., Becker D., Cueto J.,Rohde W., Peralta E., González & Rodríguez M. 2002. Detection and characterization of phytoplasma associated with Letal Yellowing disease of coconut palms in Cuba. J.Phytopathology. 62: 298-299 7. Mahony, J.B. & Chernesky, M.A. 1994. Multiplex Polymerase Chain Reaction, en Molecular methods for virus detection, Eds: D.L. Wiedbrauk & D.H. Farkas. Academic Press, NY: 219-236. 8. Martínez-Soriano,J.P, Almeyda-León I.H, Rocha Peña, M.R & Byerly Murphy, K.F.1994. Detection of Phytoplasma sp. Associated with Lethal Yellowing of coconut palms using polymerase chain reaction. Revista Mexicana de Fitopatología, Vol 12, No1:75-79 9. Roca de Doyle M., Bustamente M., Aguilar E., Castillo M., García A., Sabio C.2001.La epidemia del Amarillamiento Letal del cocotero: Situación actual y retos futuros para Honduras y otros países centros. Libro Resumen IV Seminario Científico Internacional de Sanidad vegetal:77 10. Rohde, W., Kullaya, A., Mpunami, A. & Becker, D. 1993. Rapid and sensitive diagnosis of mycoplasma-like organisms associated with lethal disease of coconut palm by specifically primed polymerase chain reaction for the amplification of 16S r ADN. Oléagineaux, 48 : 319-322. 11. Rohde W., Kullaya A., Rodríguez J. & Ritter E. 1995. Genetic análisis of Cocos nucifera L. By PCR amplification of spacer sequences separating a subset of copia-like EcoR I repetitive elements. J.Genet.& Breed., 49: 179-186. 12. Saiki, R.K. 1989. The design and optimization of the PCR, en PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification. Ed: H.A. Erlich. Stockton Press, NY: 7-16 13. Seemüller, E.; Marcone, C.; Ragozzino, A. & Göschl, M. (1998): Current status of molecular classification of the phytoplasmas. J. Plant. Pathol. 80 (1): 3-26. 14. Tymon, A., Jones, P. & Harrison, N. (1997). Detection and differentiation of African coconut phytoplasmas: RFLP analysis of PCR-amplified 16S rDNA and DNA hybridisation. Ann. Appl. Biol. 131: 91-102 15. Tymon, A.; Jones, P. & Harrison, N. (1998): Phylogenetic relationships of coconut phytoplasmas and the development of specific oligonucleotide PCR primers. Ann. Appl. Biol.. 132: 437-452. 16. Waters, H.,Romney,D.H & Harries., H.C.1978. Nuevos Focos de enfermedades y Plagas. Cuba. Boletín de la FAO :139-141. A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 1314 1516 1.1 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 14 1516171819 20 1.1 kb D C Figura 1 : Resultados del PCR con los cebadores LY1F/LY1R en la detección del fitoplasma causante del amarillamiento letal del cocotero : A (1.5mM de MgCl2), B : (2.5mM de MgCl2), C : (3.5mM de MgCl2 ). Pocillos 2 y10 : Holg 2 dilución 1/10, Pocillos 3 y 11 : Holg 2 dilución 1/100, Pocillos 4 y 12 : RCH-I dilución 1/10, Pocillos 5 y 13 : RCH-I dilución 1/100, Pocillos 6 y 14: MYD (Sano) dilución 1/10, Pocillos 7 y 15 : MYD (Sano) dilución 1/100, Pocillos 8 y 16: H2O. Pocillo 1 :marcador 100bp DNA Ladder y Pocillo 9 : Φ X174 RF DNA/Hae III Fragments. D : Detección del fitoplasma en muestras foliares de cocotero con síntomas de Amarillamiento Letal con los cebadores LY1F/LY1R. Pocillo 2: Nibujón1, Pocillo 3: Navas 1, Pocillo 4: Duaba 3, Pocillo 5: Duaba 2, Pocillo 6: BOD-BAR 2, Pocillo 7 : P-BAR 1, Pocillo 8: EV-Piedra 2, Pocillos del 9-15 plantas asintomáticas, Pocillo 16: Control Positivo, Pocillo 17: Control negativo MYD, Pocillo 18: Control negativo 110, Pocillo 19: H2O. Pocillo 1 :marcador 100bp DNA Ladder y Pocillo 20 : Φ X174 RF DNA/Hae III Fragments. Diferentes perfiles de restricción determinados en los aislados cubanos de LY con las enzimas EcoRI, RsaI, BamHI. Tabla 1. • PERFILES (talla de las bandas, bp) 900 y 600 • • • • • • • • • • • • • • • • • 900, 600 y 100 1650, 1600, 900, 600 y 100 1600, 900 y 600 1600 500 y 400 500, 400, 150 y 100 500, 400 y 100 600, 500, 400, 150 y 100 600, 500, 400 y 100 600, 500 y 400 600, 500 y 100 900 y 700 900, 700 y 100 1650, 900, 700, 100 1650,900 y 700 1650 • • • • • • • • • • • • • • • • ENZIMAS BamHI RsaI EcoRI *Procedencia de las muestras: Guantánamo PR: MUESTRAS* 1, 3 y 4 (H);2(CH); 5-7,9-11, 20 (Gu); 12, 16 y 23 (Gr);17 y 22 (CH) 8 (Gu) 13 (Gu); 19(CH) 15 (Gu); 21(PR) 18 (CH) 1(H); 2, 17 y 22 (CH); 9,10,11 y 20 (Gu); 16 (Gr) 3 (H) 4 (H); 5 y8 (Gu) 6,7 y 15 (Gu) 13,14 (Gu) 21(PR); 23 (Gr) 18 y 19 (CH) 1,3 y 4 (H); ,5 y 15 (Gu): ,12 y 23 (Gr); 21 (PR) 2, 17, 19 y 22 (CH); 6,7,8,9,10 y 11 (Gu) 13 y 14 (Gu); 16 (Gr) 20 (Gu) 18 (CH) Pinar del Río; CH: Ciudad de la Habana; H: Holguín; Gr: Granma; Gu: