Tesis - Dirección General de Servicios Telemáticos

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
“DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL DEL PAPILOMA
HUMANO DE ALTO RIESGO (TIPOS 16 Y 18), MEDIANTE
RCP TIEMPO REAL, EN MUJERES CON NEOPLASIA
INTRAEPITELIAL CERVICAL DE BAJO RIESGO (NIC I),
DEL ESTADO DE COLIMA”.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA
Q.F.B. MARIO RAMÍREZ FLORES
ASESORES
DRA. LUZ MARGARITA BALTAZAR RODRIGUEZ
DR. IVÁN DELGADO ENCISO
COLIMA, COLIMA. NOVIEMBRE DE 2006.
AGRADECIMIENTOS
AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT), quien a
través de su Programa de Becas para la formación de Científicos y Tecnólogos me ha
facilitado la realización de la Maestría en Ciencias Médicas, así como para la
realización de la presente tesis
*
A la Maestría en Ciencias Médicas y al Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas (C.U.I.B) por el desarrollo experimental que se llevo a cabo en estas
instituciones.
*
A MIS ASESORES: Dra. Luz Margarita Baltazar Rodríguez y al Dr. Iván Delgado
Enciso por sus colaboraciones en la redacción y en la parte experimental del
desarrollo de esta tesis.
DEDICATORIAS
A mi esposa Ángeles, Por su amor y lecciones de constancia y apego al trabajo, por
sus consejos y apoyo que a diario me ofrece de manera incondicional.
A mi hija Karla por su cariño y ternura que a cada momento me da.
A cada una las mujeres Colimenses que hicieron posible el presente trabajo,
participando como pacientes.
INDICE
Pág.
I. Tablas y Figuras…………………...………………….………………………….………1
II. Resumen…………………………...………………………….…………………………2
Abstract………………………………………...……………………………..…………3
III. Introducción…………………………………………….………………….……………4
IV. Marco Teórico…………………………………….………………………………...…..6
IV.1 Cáncer…………………………………………………………………………………6
IV.2 Cáncer Cervicouterino………………………………………………………….……..7
IV.2.1 Definiciones y clasificación……………………..……………………..………..8
IV.2.2 Neoplasia Intraepitelial Cervical………………………………………...………8
IV.2.3 Epidemiología………………..………………………………...……………….9
IV.2.4 Etiología………...…………...……………………………………………..…..10
IV.2.5 Fisiopatología…………………………………………..…………………..…..11
IV.3 Papiloma Virus Humano………….………………………………………………….11
IV.3.1 Epidemiología del VPH…..…………………………………………………....12
IV.3.2 Virología…………..…….…………...………………………...………………13
IV.3.3 Configuración Genómica………..…………...…………………………..…….14
IV.4 Virus del Papiloma Humano y Cáncer Cervicouterino………………………..……15
IV.5 Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real……...………………………15
IV.6 Carga Viral y Virus del Papiloma Humano……...…….………………………...….18
V. Objetivo General……….……………………………….…………………...……...….19
V.1 Objetivos específicos…...……………………………………………………..…..19
VI. Tipo de Estudio…..……………………………………………………………......…..20
VII. Universo de Estudio...………………………………………………………………...21
VII.1 Tamaño de la Muestra…….……………………………………………………..21
VII.2 Criterios de Captación de Pacientes……...…..……………………………...…..22
VIII. Justificación…...……………………………………………………………………..23
IX. Materiales y Métodos………..……………………………….……………….……….24
X. Resultados………….…………………………………………………………………..30
XI. Discusión……...……………………………………………………………………….38
XII. Conclusión…..…………………………………………………………………..……40
XIII. Perspectivas..……………………………………………………………………..….41
XIV. Glosario………………………………………………………………………..…….42
XV. Referencias….………………………………………………………………..………49
Anexos……………………………………………………………………………………..54
I. TABLAS Y FIGURAS
Pág.
Tabla 1. Tipos de VPH asociados con lesiones en el
Tracto genital……………………………………………………….…...…………..12
Tabla 2. Secuencia de primers utilizados para la
Identificación de los VPHs………………………………………….……...……….25
Tabla 3. Secuencia de primers utilizados en la RCP en tiempo real………………….………28
Tabla 4. Sondas utilizadas en la RCP en tiempo real……………………………..…………..28
Tabla 5. Características Generales de la población
estudiada según tipo de VPH…………………………………….…...……………..30
Tabla 6. Carga viral del VPH-16 en pacientes con NIC I………………..………….………..32
Tabla 7. Carga Viral de VPH-18 en pacientes con NIC I…………….……………………....33
Tabla 8. Diferencia significativa entre carga viral del VPH-16 y VPH-18………….….……36
Tabla 9. Comparación de carga viral del VPH-16 y VPH-18
según diferentes factores de riesgo………………………………………...……….37
Figura 1. Correlación de las nomenclaturas para las
Lesiones premalignas y Cáncer in situ del cervix………………………..…………...9
Figura 2. Organización genómica del VPH…………………………………….…………….14
Figura 3. Pasos de la RCP en tiempo real…………………………………………………….17
Figura 4. Identificación del VPH-18 en gel de poliacrilamida al 6%.......................................26
Figura 5. Identificación del VPH-16 en gel de poliacrilamida al 6%.......................................27
Figura 6. Frecuencia del VPH-16 y VPH-18............................................................................31
Figura 7. Distribución General de las muestras según su carga viral………………….……..34
Figura 8. Distribución de las muestras según tipo de VPH y Carga Viral……………...……35
1
II. RESUMEN
La carga viral de los virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo (tipos 16 y 18) ha sido
asociada con la prevalencia de neoplasia cervical y algunos investigadores sugieren que una
alta carga viral en el epitelio citológicamente normal es un factor de riesgo para la progresión
neoplásica. OBJETIVO: Determinar la carga viral del Papiloma Humano de alto riesgo (tipos
16 y 18), en pacientes con neoplasia intraepitelial de bajo grado (NIC I) del Estado de
Colima. MÉTODO: Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (RCP ) en tiempo
real para cuantificación del VPH-16 y VPH-18, estos tipos de VPH se analizaron en diferentes
reacciones, permitiendo una cuantificación independiente. Una reacción separada se utilizó
para estimar el número de una sola copia de un gen nuclear, el cual se utilizó para calcular el
numero equivalente de VPH por DNA genómico de la muestra. RESULTADOS: El tipo de
ADN de VPH más común encontrado fue el VPH- 18, con una prevalencia del 23%, seguido
por el VPH-16 con una prevalencia del 22%. Encontramos que existe una diferencia
significativa entre la carga viral del VPH-16 y VPH-18 (p = 0.030).CONCLUSIONES: La
frecuencia del VPH-16 y VPH-18 en pacientes con NIC I es alta, en el estado de Colima. La
carga viral del VPH-16, es mayor significativamente con respecto al VPH-18 con un valor de
p de 0.030. Una carga viral de 102 genomas de VPH-18 es capaz de producir NIC I.
2
ABSTRACT
Viral load of high risk human papilloma virus (HPV) ‹types 16 and 18›, has been associated
with prevalent cervical intraepithelial neoplasia (CIN), and some researches suggested that
high viral load in citologically normal epithelium is a risk factor for neoplastic progression.
OBJETIVE: To determinate the viral load of human papilloma virus (types 16 and 18), in
patients with low-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN I), in Colima State.
METHODS: We made a real-time Polymerase Chain Reaction (real-time PCR) for the
quantification of HPV-16 and HPV-18, These HPV types are analyzed in different reactions,
allowing for independent quantification. A separate reaction is used for estimating the number
of a nuclear single-copy gene and is used to calculate the HPV copy number per genomic
DNA in the sample. RESULTS: The most common HPV DNA type found was the HPV-18
with a prevalence of 23%, followed by the HPV-16 with a prevalence of 22%.We found a
significant difference between the viral load of HPV-16 and HPV-18. CONCLUSIONS: The
frequency of HPV-16 and HPV-18 in patients with CIN I is high, in State of Colima. The viral
load of the HPV-16 is greater significantly with respect to the HPV-18 with a value of p of
0.030. This could reflect that a smaller viral load is needed HPV-18 than of HPV-16 to cause
CIN I.
3
III. INTRODUCCIÓN
El cáncer cervicouterino (CaCU) constituye una de las primeras causas de muerte en
mujeres mayores de 25 años de edad, siendo un problema importante de Salud Pública a
nivel mundial [1]. En la Republica Mexicana, en el 2005, se registraron 51,221 casos nuevos
de displasia leve y moderada, y 8,163 casos nuevos de displasia severa y CaCU in situ, siendo
los tumores más notificados de cervix (24%), y de mama (11%).[2]
En la actualidad y de acuerdo con las investigaciones más recientes, se acepta que el
CaCU es el tumor sólido más importante inducido por virus, [3]. El virus del papiloma
humano (VPH) se ha encontrado en el 95% de todos los casos de cáncer invasor, por lo que se
considera a la infección por este virus como el factor de riesgo más importante [4]. El VPH
(causante de verrugas genitales) es la enfermedad sexual viral más común en el mundo. Se
estima que hay un millón de casos nuevos cada año. Aunque muchas de estas infecciones son
benignas, algunas con ciertos tipos oncogénicos de VPH son fuertemente relacionadas con el
desarrollo de CaCU. Estudios epidemiológicos han demostrado que el riesgo de desarrollar
CaCU es mayor en mujeres que sufren frecuentemente infecciones con papilomavirus de tipo
oncogénico comparado con las que padecieron infecciones ocasionales. La infección puede ser
ocasionada por cualquiera de los más de 100 diferentes cepas (tipos) de VPH existentes [5]
sin embargo, sólo 35 de ellos infectan el cervix uterino, y de éstos sólo la mitad se han
asociado con lesiones precursoras o CaCU invasor.[6] de los cuales el VPH 16 representa la
mayor proporción (50%) seguido por el VPH 18 (12%), el VPH 45 (8%) y el VPH 31 (5%).
La asociación con estos tipos de VPH son bastantes fuertes y consistentes en todos los
estudios de casos y controles en los países con alto y bajo riesgo de CaCU. [1]
No obstante, la presencia del VPH no constituye una causa suficiente de esta
enfermedad, son necesarios ciertos cofactores como número de parejas sexuales, edad de
inicio de vida sexual activa, edad durante el primer embarazo, multiparidad, y el propio fondo
genético del huésped, entre otros, para que un porcentaje de infecciones persistentes por VPH
logre progresar y desarrollar cáncer. [5] Sin embargo existen estudios que sugieren que la
cantidad de carga viral del VPH en el epitelio citológicamente normal es un factor importante
para la progresión neoplásica.[7]
4
El estudio de la carga viral del VPH en pacientes con CaCU, esta adquiriendo mayor
importancia médica ya el análisis de la cantidad de DNA del VPH
parece tener una
especificidad más alta que la tipificación de ausencia o presencia de VPH, aúnado a que
actualmente el VPH es considerado el principal factor etiológico del CaCU. [8]
Debido a esto, actualmente en nuestro país se están realizando avances importantes
para entender tanto la interacción papilomavirus-célula huésped como los mecanismos
involucrados en el desarrollo del cáncer, para desarrollar nuevas técnicas inmunológicas y de
genética molecular útiles en el diagnóstico y terapia de esta neoplasia.
En el presente estudio se cuantifico la carga viral (cantidad de partículas víricas
encontradas por cada 10 000 células <copias/103celulas>) del VPH de alto riesgo en muestras
de ADN de mujeres con Neoplasia Intraepitelial de bajo grado (NIC I), procedentes del Estado
de Colima, mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) en Tiempo
Real.
5
IV. MARCO TEORICO
IV.1 CÁNCER
El Cáncer es una enfermedad caracterizada por el crecimiento anormal y diseminado
de células que al desarrollarse en forma incontrolada avanzan entre los tejidos normales y los
destruyen, alterando así el funcionamiento del organismo [9].
Su habilidad para crecer en localizaciones inapropiadas o propagarse indefinidamente
puede ser letal para el organismo individual en que se produce. Se describen tres tipos de
cambios que tienen lugar cuando una célula se vuelve cancerosa:
a) Inmortalización: Describe la propiedad de crecimiento indefinido.
b) Transformación: Describe el fallo de observación de los límites normales de
crecimiento.
c) Metástasis: Describe la etapa en la que la célula cancerígena desarrolla la habilidad
de invadir el tejido normal, moviéndose así desde su lugar de origen y
estableciendo una nueva colonia en cualquier parte del cuerpo.[10]
El riesgo de desarrollar cáncer es influenciado por muchos factores incluyendo
genéticos, edad, etiología, sexo, sistema inmune, enfermedad pre-existente y desnutrición
[11]; convirtiendo las células normales en células transformadas que dan lugar a procesos
implicados en la formación de tumores.
Algunas veces los tumores incrementan su malignidad como resultado de una serie de
cambios progresivos, la incidencia de cánceres humanos con la edad sugiere que típicamente
se requieren 6 - 7 acontecimientos en un período de 20 - 40 años para provocar el cáncer. Para
los factores genéticos se sabe que en algunos casos se hereda como un rasgo mendeliano,
implicando que un cambio genético se convierte en un componente necesario o cuando
menos, importante. Existen dos clases de genes en los que mutaciones causan transformación:
a) Supresores de tumores, se detectan mediante deleciones que conducen a la aparición de
tumores. Como los cánceres hereditarios, en los que los pacientes desarrollan tumores que han
perdido ambos alelos, y por lo tanto carecen de un gen activo. b) Oncogenes, inicialmente
identificados como genes transportados por virus que causan la transformación de sus
objetivos celulares. Los genes celulares se denominan protooncogenes, y en ciertos casos su
mutación o activación aberrante en la célula se asocian con formación de tumor, actuando ya
6
sea en las proteínas de membrana hasta los factores de transcripción. Esto puede involucrar un
cambio mutacional en la proteína, o su activación constitutiva, sobreexpresión, o fallo en la
interrupción de la expresión en el momento adecuado.[10]
Existen una variedad de agentes que pueden incrementar la frecuencia con la que las
células se convierten en células transformadas; se dice que estos agentes son carcinogénicos.
El
diagnóstico puede ser
histopatológico y/o citológico. En el diagnóstico
histopatológico de las neoplásias se basan en un fenotipo de acuerdo a su origen blastodérmico
y a su morfología citológica, con amplia correlación anatomoclínica, o sea, de la experiencia
que se tiene de su comportamiento. Por otra parte, está el diagnóstico citológico el cual se
basa en su contenido nuclear y a su capacidad para duplicarse.[12]
La transformación de las células neoplásicas malignas puede ocurrir espontáneamente,
puede ser resultado de infecciones con virus tumorales o cancerígenos.[10] El criterio de
malignidad es aumento del tamaño nuclear lo que determina una desproporción núcleocitoplásmica; hipercromasia y con frecuencia gigantismo celular debido a hiperdiploidia o
poliploidia el cual se debe a una síntesis descontrolada de ácido desoxirribonucleico (ADN)
[10]. Estos virus se consideran como la segunda causa de cáncer en humanos, siendo sólo
superados por el tabaquismo, los cuáles contribuyen al desarrollo de 10 al 20% de todas las
neoplasias malignas del mundo. Los virus involucrados en cáncer son de 2 tipos los de
genoma de ADN y los de genomas de ARN. Los virus tumorigénos alteran la maquinaria de la
célula infectada para promover su propia supervivencia y crecimiento. En este proceso, los
virus interfieren con los mecanismos de control celular, originando un crecimiento anormal,
alteraciones genéticas y finalmente malignidad.[13]
IV.2 CANCER CERVICO UTERINO
El CaCU es una neoplasia muy frecuente en la población femenina; constituye el 30%
de los tumores malignos que se presentan en los habitantes de los países en desarrollo y es la
segunda causa de muerte en mujeres de todo el mundo.[14]
El CaCU suele crecer lentamente por un período de tiempo. Antes de que se encuentre
células cancerosas en el cuello uterino, sus tejidos experimentan cambios y empiezan a
aparecer células anormales (proceso conocido como displasia). La prueba de papanicolau
7
generalmente encuentra estas células. Posteriormente, Las células cancerosas comienzan a
crecer y se diseminan con mayor profundidad en el cuello uterino y en las áreas circundantes,
actualmente la frecuencia de Neoplasia intraepitelial cervical (NIC), se refiere a los cambios
neoplásicos del cuello uterino con finados al epitelio superficial sin invasión del estroma, se
considera como la lesión precursora del CaCU.[15] Se considera que estos cambios
neoplásicos son causados por VPH.[16]
IV.2.1 Definiciones y Clasificación
La presente tesis hace uso de la nomenclatura propuesta por Richard en 1967, el cual
propuso el término neoplasia intraepitelial cervical (NIC), con tres grados progresivos (1, 2,
3), la ventaja principal de esta nomenclatura es el reconocimiento de la unidad del proceso
patológico lo cual conlleva una relación con las técnicas terapéuticas. Esta clasificación ha
sido bastante adecuada
durante más de 20 años y por lo tanto la más utilizada
internacionalmente.
IV.2.2 Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC).
La displasia implica una anormalidad en el crecimiento y desarrollo celular. Su uso en
una descripción patológica sugiere una anormalidad premaligna. La asociación del VPH con
el crecimiento displásico ha sido la más estudiada en el cervix. La NIC, es comúnmente usada
para describir estas anormalidades celulares. La NIC es graduada dependiendo del grueso de la
proporción del epitelio que ha sido reemplazado por células anormales. De acuerdo a este
sistema, lesiones con menos de un tercio del epitelio remplazado por células inmaduras son
graduadas como NIC I, las lesiones que van de un tercio a dos tercios del epitelio remplazado
son graduadas como NIC II, y aquellas lesiones que van de dos tercios o más del epitelio
remplazado son graduadas como NIC III, incluyendo carcinoma in situ (figura 1), numerosos
estudios mostraron una asociación entre la infección por VPH y NIC. La NIC puede ocurrir en
ausencia de características citológicas de infección por VPH, aunque muchas de estas lesiones
han demostrado tener DNA de VPH. El hecho que la displasia es considerada como una lesión
premaligna, y el VPH el factor etiológico más importantes para el desarrollo hacia CaCU, la
asociación entre el VPH y displasia es lógica.[17].Pero la asociación entre la caga viral del
DNA de VPH y la severidad de NIC es controversial.[18]
8
Cabe mencionar que ninguna de las nomenclaturas existentes hace mención al grado
de infección por VPH.
Figura 1. Correlación de las nomenclaturas para las lesiones premalignas y cáncer in
situ.[19]
IV.2.3 Epidemiología
El CaCU es el segundo más común en el mundo, después del cáncer de mama en la
mujer. Constituyendo así un problema importante de salud pública, cada año se estima, que se
diagnostican 500 000 casos nuevos en el ámbito mundial.[20]Aproximadamente el 80 % de
ellos corresponden a los países en desarrollo. Entre las poblaciones existen grandes diferencias
de incidencia y grado de invasividad del cáncer, esto refleja la influencia de los factores
ambientales, su detección con pruebas de papanicolaou y el tratamiento de las lesiones
9
preinvasoras.[20] El CaCU es un problema prioritario de Salud Pública en México. En el
Estado de Colima, en el año 2005, se reportaron 48 defunciones por CaCU, 468 casos nuevos
de displasia leve con una tasa de 219,30 por 100 000 habitantes femeninos mayores de 14 años
ocupando el séptimo lugar a nivel nacional, solo por debajo de Quintana Roo, Nayarit, Jalisco,
Guerrero, Durango y Veracruz.[2]
IV.2.4 Etiología.
Actualmente se considera que el origen de esta enfermedad es multifactorial, con
factores conocidos como el inicio temprano de la vida sexual activa (antes de los 18 años),
primer
embarazo
antes
de
los
20
años
de
edad,
multiparidad
[21], número de compañeros sexuales, infecciones cérvico vaginales donde se involucran
algunos virus y protozoos, tales como trichomonas vaginalis, entre otros el tabaquismo.[21,
22] Sin embargo, la infección por el VPH es considerado como agente causal para CaCU.[21,
23]
Arriba de 100 genotipos de VPH han sido identificados [24, 25]. Más de 35 tipos de
VPH infectan el tracto genital, donde cerca de 20 están asociados a cáncer.[26]
Las que tienen expresión clínica pueden ser lesiones verrugosas y son causadas por
virus de bajo riesgo, principalmente por los tipos 6, 11, 42, 43 y 44. Las lesiones premalignas
pueden expresarse clínicamente como un NIC y los virus de alto riesgo más frecuentemente
involucrados son el 16, 18, 45 y 56, pero también pueden ser ocasionadas por virus de riesgo
intermedio como el 31, 33, 35, 39, 51, 52, 58, 65 y 66.[27, 26, 28]
La asociación del VPH, en displasia y carcinomas está bien establecido y se sabe que
los agentes tales como actividad sexual, inmunidad deficiente, factores demográficos y
sociales, o agentes biológicos están implicados en los múltiples estadios de progresión de la
infección viral al cáncer, la inactivación de los productos de los genes supresores de tumores
(p53, Gen Rb), activación de oncogenes (c-myc, c-ras), aneuploidía, anormalidades
cariotípicas son la llave de los eventos de la progresión tumoral.[29]
10
IV.2.5 Fisiopatología.
Los VPH oncogénicos tienen tendencia a transformarse de monoméricos a variantes
multiméricas. Cuando el ADN viral se incorpora en el genoma humano puede iniciarse la
evolución hacia una neoplasia, que es activa cuando el contenido de ADN diploide cambia a
poliploide y por último se transforma en aneuploide.[30]
La progresión de displasia leve a severa y a cáncer invasivo esta asociado con el
incremento de expresión
de los oncogenes vírales los cuales con cofactores adicionales
contribuyen a la progresión de
algunas displasias a carcinomas hablándose que la
predisposición genética, reacción inmune celular y expresión de citoquinas son importantes
[31],
así el mecanismo molecular oncogénico del virus se basa
en la acción de las
oncoproteínas E6 y E7 viral.
IV.3 PAPILOMAVIRUS HUMANO
El VPH pertenece al grupo Papovaviridae, en el que están varios virus que infectan
tanto animales como al hombre, produciéndole lesiones neoplásicas. Este grupo es
heterogéneo cuyos diversos genotipos son capaces de producir cambios celulares tanto en piel
como en mucosas (epitelio escamoso); su desarrollo depende del genoma viral y de las
condiciones del tejido infectado.[32]
Algunos de los tipos de VPH causan varias lesiones en el tracto genital femenino y
masculino.(ver tabla 2)
La infección por VPH se inicia en células básales del epitelio y se integra en sitios
cercanos a secuencias de proto-oncogenes o en sitios frágiles de los cromosomas.[33]
El VPH tiene importancia en salud pública por ser una de las infecciones de
transmisión sexual más frecuentes a nivel mundial, esta asociada con cáncer anogenital, de
tratamiento complejo, no existe antiviral específico y todas las modalidades terapéuticas tienen
alto índice de recidivas y muy probablemente no se erradica.[34]
11
TABLA 1. Tipos de VPH asociados con Lesiones en el tracto genital [35]
TIPO
VPH
6
11
16
18
30
31
33
35
39
40
42
43
44
45
51
52
53
56
58
61
LESIÓN CLÍNICA
Neoplasia intraepitelial cervical(NIC), condiloma,verrugas cancerosas
NIC, Condiloma
NIC, Cancer cervical
NIC, Cáncer cervical
NIC
NIC, Cáncer cervical
NIC
NIC
NIC
NIC
NIC, Neoplasia intarepitelial peneana
NIC
NIC
NIC, Cáncer cervical
NIC, Cáncer cervical
NIC, Cáncer cervical
NIC, Cáncer cervical
NIC, Cáncer cervical
NIC, Cáncer cervical
NIC
IV.3.1 Epidemiología de VPH
La infección por VPH es la más frecuente de las trasmitidas sexualmente debido quizá
a los cambios en la conducta sexual. Se considera que 2% de todas las mujeres en edad fértil
tienen VPH, mientras que mujeres con actividad sexual el 30% de ellas están infectadas,
alrededor de 25 a 65 % de las personas que han tenido contacto sexual con personas infectadas
la adquieren. La transmisión es generalmente de tipo sexual aunque se sugieren otros como la
auto–inoculación, fómites, iatrogénica durante la exploración ginecológica y anal con el
mismo guante, instrumental mal esterilizado y en mujeres núbiles.[34] La edad más frecuente
12
en que se presentan los condilomas es entre los 16 y 25 años, con predominio en mujeres
blancas en relación con negras de 2:1, en los hombres no hay diferencias.[36]
El intervalo entre la exposición y la detección de condilomas es entre tres semanas a 8
meses (Media: 3 meses), los condilomas acuminados afecta a ambos sexos, pero el papiloma
plano rara vez da origen al condiloma florido en el hombre, la piel del pene parece menos
susceptible a la aparición de neoplasia intraepitelial, a diferencia de la zona de transformación
(ZT) cervical que puede llegar a evolucionar a carcinoma. [36]
IV.3.2 Virología
La clasificación
de los VPH se basa en el análisis serológico de determinantes
antigénicas u homología de nucleótidos.[34]
La familia de los papovaviridae comprende 2 géneros: poliomavirus y papilomavirus ( y el
virus simio 40 ), [31], los papovavirus son virus que poseen un genoma circular de ADN de
doble tira encerrado en una cápside, sin cubierta, con simetría icosaédrica, las histonas
celulares sirven para condensar el DNA viral dentro de la partícula. [37]
Características de los papovavirus.
Estimulan la síntesis de ADN celular. Los poliomavirus son modelos importantes de
virus tumorales, los papilomavirus son causa importante de enfermedad humana, las
oncoproteínas virales interactúan con proteínas supresoras de células tumorales [37].
Los VPH miden
55 nanometros de diámetro, con un
peso molecular de
aproximadamente 5 x 106 daltons [34]. Tienen una estructura de icosaédro compuesta de 72
capsómeros proteínicos que rodea al ADN viral, la principal proteína capsídica posee un PM
de 54 Kilodaltons, dentro de la cápside también está una especie menor con peso molecular de
76 Kilodaltons.[31]
13
IV.3.3 Configuración genómica
Figura 2. Organización genómica del VPH.
El ADN de VPH es de doble banda y se presenta en forma de círculo cerrado con 8000
pares de bases.[15] En VPH se han identificado genes de expresión tempranas (E-early) o
tardía (L-late) y son:
Regiones tempranas ( E )
Esta región consiste de 6 a 8 estructuras para lectura abierta, el producto de ambas
estructuras de la lectura abierta del E1 y E2 son necesarias para la replicación
y
mantenimiento episomal de los genomas virales, la proteína E2 juega un papel adicional en la
regulación de la transcripción, y es el mayor activador de la expresión viral de los papiloma
virus bovinos.
En los papilomas humanos la función primaria de transcripción de E2 parece ser un
represor de la expresión. Otros genes importantes son el E5, el cual codifica para una proteína
de membrana con actividad transformadora débil, el E4, el cual cuando es expresado como
una proteína de fusión con el E1 destruye el ensamblaje de la queratina en las células
estratificadas suprabásales permitiendo el ingreso viral.[15, 33, 36]
Los genes E6 y E7 codifican oncoproteínas nucleares transformadoras, las cuales
interactúan con proteínas del ciclo celular. E6 se une a la proteína tumoral supresora p53 :
14
fosfoproteína Mr 53 000, producto del gen p53, y la E7 se une al gen Rb : fosfoproteína MR
105 000, producto del gen del retinoblastoma. Ambas proteínas celulares supresoras de tumor.
Provocando que el crecimiento celular no se inhiba en la célula huésped. [15, 33, 36]
Frecuentemente se ha encontrado en suero de pacientes con CaCU anticuerpos contra la
proteína E7 del VPH 16 o el VPH 18. También se encontraron anticuerpos contra las proteínas
E2 del VPH 16 y del VPH 18,11,12 E4, 13, 14 y E6 del VPH 16. Igualmente se han
descubierto que los niveles de anticuerpos aumentan con el estadio clínico y varían de acuerdo
con la manera en que es tratada la enfermedad.[15]
Región tardía ( L ) , codifica proteínas estructurales, L1 y L2 codifican proteínas de la
cápside. [15, 33, 36]
Infección: El epitelio escamoso está compuesto de 20 a 30 capas de células de la cuales
únicamente la capa basal más interna está continuamente dividiéndose, la infección por VPH
se piensa que ocurre a través de pequeñas heridas del epitelio, con respuesta de la células
basales a la entrada el virus. El curso natural de la infección es muy variable suele observarse
regresión espontánea de las lesiones proliferativas papilomatosas, el traumatismo puede hacer
que se diseminen los antígenos vírales y con ello se refuerza la inmunidad del huésped.[31,
37]
IV.4 VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y CANCER CERVICOUTERINO
La mayoría de los estudios epidemiológicos han demostrado que el CaCU es una
enfermedad de transmisión sexual y que la asociación con el VPH es la principal causa de
Neoplasia cervical. [38]
IV.5 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL.
En la RCP en tiempo real, el proceso de amplificación y detección se producen de
manera simultánea en el mismo capilar cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.
Además, mediante detección de fluorescencia se puede medir durante la amplificación la
cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida
en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar
en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.
15
El termociclador para llevar a cabo la RCP a tiempo real incorpora un lector de
fluorescencia y esta diseñado para poder medir, en cualquier momento la fluorescencia
emitida en cada uno de los capilares donde se realiza la amplificación.
Sondas de hibridación específicas.
La sonda es indispensable en la reacción, debido a que es la responsable de emitir la
fluorescencia ya que se encuentran marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un
aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia
entre dos moléculas. Las sondas más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas
también sondas Taqman.
Sonda de hidrólisis (sondas Taqman):
Son oligonucleotidos marcados con un fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite
fluorescencia al ser excitado y un apagador en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia
liberada por el reportero. Para que esto ocurra, las moléculas reportera y apagadora deben estar
espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el
espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda esta intacta, la fluorescencia emitida
por el reportero es absorbida por el apagador. Sin embargo, durante la amplificación de ADN
diana, la sonda se hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la
cadena, en su acción de síntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad
5’ exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciendo la liberación del
fluorocromo reportero.[39] Como el reportero y apagador están ahora espacialmente alejados,
la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector. (Figura 3, paso 4)
16
Figura 3. Pasos de la RCP en Tiempo Real
1. Polimerización: Un reportero fluorescente (R) y un apagador son unidos al extremo 5’
y 3’ de una sonda Taqman respectivamente.
2. Desplazamiento de la cadena: cuando la sonda esta intacta la emisión del
reportero esta apagada.
3. Corte: Durante cada ciclo de extensión, la DNA polimerasa corta al reportero de
la sonda.
17
Figura 3. continuación…
4. Polimerización Completa: Una vez separado del apagador el reportero emite su
fluorescencia característica.
IV.6 CARGA VIRAL Y VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO.
La carga viral de los VPH’s de alto riesgo ha sido asociada con la prevalencia de
neoplasia cervical y algunos investigadores sugieren que la una alta carga viral en el epitelio
citológicamente normal es un factor de riesgo para la progresión neoplásica. Sin embargo no
ha sido identificado y validado un método Standard de oro para la medida de la carga viral. Y
una amplia variedad de medidas han sido utilizadas. Estudios previos muestran una asociación
positiva con la carga viral del VPH y neoplasia cervical .[39, 40]
La RCP en tiempo real provee la mejor medida de la carga viral de los VPHs. Y así
poder investigar el role de la carga viral del VPH en la historia natural de la asociación VPHcarcinogenesis cervical. [39, 40]
La determinación de la carga viral, esta adquiriendo mayor importancia clínica debido
a que las terapias encaminadas a la eliminación de las lesiones provocadas por VPH están
asociadas con altas tasas de recurrencia, no así donde se emplea la terapia antiviral, se piensa
que esto se debe a una reducción de la carga viral y a la estimulación de la inmunidad local
gracias a la liberación de antígenos virales, permitiendo una inmunidad celular para todo el
VPH residual. De esta manera la cuantificación de la carga viral esta permitiendo visualizar la
efectividad de los tratamientos y así desarrollar tratamientos antivirales más efectivos.[41]
18
V. OBJETIVO GENERAL:
Determinar la carga viral del Papiloma Humano de alto riesgo (tipos 16 y 18), en
pacientes con Neoplasia Intraepitelial cervical de bajo grado (NIC I) del estado de Colima.
V. 1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Describir la frecuencia del VPH-16 y VPH-18 en pacientes con NIC I del Estado de
Colima.

Comparar la frecuencia del VPH-16 y VPH-18 en pacientes con NIC I del Estado de
Colima.

Conocer el número de copias del VPH -16 y VPH -18 en pacientes con NIC I del
Estado de Colima.

Comparar las cargas virales del VPH-16 y VPH-18 de pacientes con NIC I del Estado
de Colima.
19
VI. Tipo de estudio
Descriptivo Comparativo
Variables
a) Independiente:
Neoplasia Intraepitelial de bajo grado (NIC I)
b) Dependiente
Numero de copias de VPH-16 y VPH-18
Definición conceptual y operativa de las variables independientes:
Son pacientes con diagnóstico, histopatológico de NIC I y que además conste en el
expediente clínico del Hospital.
Clasificación
La variable independiente esta clasificada de acuerdo a su naturaleza y escala de medición
como cualitativa, nominal.
El indicador para la variable independiente son: Neoplasia intraepitelial cervical grado I,
Definición conceptual y operativa de las variables dependientes.
Es la determinación de las cargas virales de los tipos en que se encuentra clasificado
en VPH en la literatura como de alto riesgo (Tipos 16 y 18), y además que se identifiquen
mediante la utilización del método de la RCP en tiempo Real.
Clasificación.
La variable dependiente se clasifica de acuerdo a su naturaleza y escala de medición como
cuantitativa.
Los indicadores para la variable dependiente son: copias/células
20
VII. Universo de Estudio.
Pacientes con NIC I del
Hospital Universitario de Colima y del Instituto Mexicano
del seguro Social del estado de Colima.
VI. 1. Tamaño de la muestra:
VPH-18
El tamaño de muestra fue calculado a través del programa estadístico Epi Info 2000.
Versión 6.04., con los datos siguientes:
Tamaño de la población: 311 casos de NIC I en 2004. [2]
Frecuencia esperada: 23% (0.23)
Error relativo: 10%
N = 36
VPH-16
El tamaño de muestra fue calculado a través del programa estadístico Epi Info 2000.
Versión 6.04., con los datos siguientes:
Tamaño de la población: 311 casos de NIC I en 2004. [2]
Frecuencia esperada: 22% (0.22)
Error relativo: 10%
N = 40
21
VII. 2 CRITERIOS DE CAPTACIÓN DE PACIENTES.
Criterio de Inclusión.
a) Pacientes con diagnóstico NIC I, procedentes del Hospital Regional Universitario de
Colima, y del Instituto Mexicano del Seguro Social, de la ciudad de Colima y que sean
positivos para VPH-16 y VPH-18, diagnosticados por RCP.
b) Que acepten participar en el estudio.
Criterio de Exclusión.
a).Mujeres con tratamiento antiviral.
Criterio de Eliminación.
Aquellas personas cuya información fue incompleta tanto clínica como laboratorialmente, así
como las que ya no quisieron seguir participando en el proyecto.
22
VIII. JUSTIFICACIÓN
El CaCU es un problema prioritario de Salud Pública en México. En el Estado de
Colima, en el año 2005, se reportaron 48 defunciones por CaCU, 468 casos nuevos de
displasia leve con una tasa de 21,93 por 10 000 habitantes femeninos mayores de 14 años
ocupando el séptimo lugar a nivel nacional, solo por debajo de Quintana Roo, Nayarit, Jalisco,
Guerrero, Durango y Veracruz.[2]
En esta investigación se identifico el tipo de VPH y se midió su carga viral por medio
de RCP Tiempo Real en muestras cervicales (citología exfoliativa) de mujeres con NIC I, de
esta forma contribuir a un mayor conocimiento del VPH de alto riesgo en el Estado de
Colima, que pueda servir de base para estrategias de manejo de la paciente y convertirse en un
pequeño paso que pretende ayudar a resolver el problema concreto
lesiones premalignas de esta región.
.
23
en las mujeres con
IX. MATERIALES Y MÉTODOS
Captación de Muestras: Se captaron muestras por citología exfoliativa (citocepillo) del
cervix de mujeres con diagnóstico histopatológico de NIC I, correspondientes a los Servicios
de la clínica de displasia del Hospital Regional Universitario y del Instituto Mexicano del
Seguro Social de la Ciudad de Colima. Los citocepillos se depositaron en microtubos de 1.5
ml conteniendo PBS (3.56gr Na2HPO4.H2O, 0.52gr NaH2PO4.2H2O, 8.5gr NaCl, por litro)
como medio de transporte. Se elaboró un cuestionario (anexo 2) para obtener información
sobre la historia sexual, y reproductiva de las pacientes así como su estado civil, y conocer las
características generales de la población (tabla 5)
Extracción del ADN: Se centrifugaron las muestras con el citocepillo, por 20 seg. A 10 000
rpm., con movimientos circulares se sacó el citocepillo, se centrifugó de nuevo a 10 000 por
25 min. Y se quitó el sobrenadante con el cuidado de no tirar el botón, se agregó a las
muestras 100 µl de buffer de digestión que contiene 200 µg/ml de Proteinasa K. Si la cantidad
de muestra era mucha se agregó 200 µl, se dejó en baño maría a 37º C de 48 hr, se inactivó la
Proteinasa K a 98º C por 8 min. Y se agregó 300 µl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
(25:24:1), se mezcló bien, y se separó las dos fases por centrifugación a 10 000 rpm por 10
min. A 4º C. se tomó la fase acuosa superior y la pasé a otro tubo, cuidando de no tomar la
interfase. Se agregó 300 µl) de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se Mezcló bien. Se
centrifugó a 10 000 rpm por 10 min. A 4º C. se tomó la fase acuosa cuidando no tomar la
interfase, transfiriendo a otro tubo, se agregaron dos volúmenes de alcohol absoluto frío y una
décima de volumen de acetato de sodio 3 M a un pH 5.2. se permitió que el ADN precipitará
a -20º C por una hora, se centrifugó a 7 000 rpm por 10 minutos, y se eliminó el exceso de
alcohol, cuidando de no tirar el botón, se adicionó 50 µl de Alcohol al 70 %, se centrifugó a
7 000 rpm por 10 min. Y se decantó con el cuidado de no tira el botón, se secó el botón con el
tubo destapado por lo menos 2 horas, y posteriormente se disolvió el botón con 100 µl de
Buffer TE 1X (10mM Tris-HCL pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) estéril a 70 °C durante 15
minutos.
24
Cuantificación del ADN: Se colocaron en una celda de cuarzo 5 µl de ADN extraído y se
disolvieron en 495 µl de Buffer TE 1X estéril, se midió la absorbancia a 260 nm con un
espectrofotómetro para conocer su concentración, mientras que la pureza con respecto a
proteínas se determinó por la relación de absorbancia entre 260/280 nm. Considerándose
como aceptables muestras con una concentración mayor de 50 ng/ul y una de pureza de 1.5-2.
IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP): Las reacciones se desarrollaron en un
volumen total de 10 µl, conteniendo 1X de Buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl),
1.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de cada dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 10 µM de cada uno de los
primers, 0.25 U de Taq DNA polimerasa, 100 ng ADN genómico y la cantidad de H2O
inyectable necesaria para completar 10 µl.
Todas las reacciones fueron amplificadas usando el termociclador Stratagene Gradient
40, usando las siguientes condiciones, para la desnaturalización inicial 1 ciclo de 94 °C, 5
min; para la amplificación 35 ciclos de 94 °C, 20 seg., 55 °C, 50 seg., 72 °C, 20 seg.; para la
extensión final se llevo a cabo 1 ciclo de 72 °C, 5 min. Finalmente, los productos se separaron
por electroforesis, utilizando geles de poliacrilamida al 6% en TBE (T+ris base 89mM. Ácido
Bórico 89 mM y EDTA 20 mM, pH 8.0), los geles fueron teñidos con nitrato de plata y
analizados para la identificación del VPH-16 (figura 4) y VPH-18 (figura 5) respectivamente.
Los iniciadores utilizados (tabla 2) para la amplificación e identificación para el VPH16 y VPH-18 fueron los siguientes:
Primer
16 E6U
16 E6L
18 E7U
18 E7L
Especificidad
VPH-16
VPH-16
VPH-18
VPH-18
Secuencia (5’ a 3’)
ATgACTTTgCTTTTCgggAT
CTTTgCTTTTCTTCAggACA
ATgTCACgAgCAATTAAgC
TTCTggCTTCACACTTACAACA
Producto
235 pb
139 pb
TABLA 2. Secuencia de primers utilizados para la identificación de los VPHs.[42]
GEL DE POLIACRILAMIDA AL 6 %. Mezcla acrilamida-bisacrilamida (29%-1%) 12 ml.
Buffer TBE (1X) 48 ml, Persulfato de Amonio (APS) al 10 % 600 µl, TEMED (N,N,N’,N’tetramethyl-ethylendiamina) 60 µl.
25
Tinción del gel de poliacrilamida con AgNO3 : Se colocó el gel por 20 minutos en solución
fijadora (ver parte inferior), se desecho la solución y se agregó AgNO3 al 0.2% durante 7-10
minutos, se lavó de 1 a 2 veces con H2O desionizada, se eliminó el exceso de AgNO3 con
solución reveladora (ver parte inferior), posteriormente se agregó solución reveladora recién
preparada y 600 µl de formaldehído y se esperó hasta que aparecieran las bandas. Se eliminó
la solución reveladora y el formaldehído y se agrego H2O para facilitar la recolección del gel.
Solución fijadora (1000 ml): Etanol absoluto 10%, ácido acético 0.5 % y se aforo con H2O
desionizada a 1000 ml.
Solución de AgNO3 (100 ml): AgNO3 0.2 %, aforada a 100 ml con solución fijadora.
Solución reveladora (1000 ml): NaOH 3 %, formaldehído 0.5 5, aforada con H2O desionizada
a 1000 ml.
Carril
1
2
3
4
5
6
7
8
(+)
(+)
9
10
250pb
225pb
200pb
175pb
(+)
150pb
(+)
139pb
125pb
100pb
Ctrl
(-)
MPM HeLa
25 pb
Figura 4. Identificación del VPH-18 en gel de poliacrilamida al 6 %. Se obtuvieron productos de
amplificación para VPH-18 de 139pb , se utilizo marcador de peso molecular (MPM) de 25 pb , mientras
que ADN de HeLa fue utilizado como control positivo para VPH-18.
26
Carril
1
(+)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
(+)
(+)
300p
b
275p
(+)
235pb
b
250pb
(+)
225p
b
200p
b
175p
b
150p
b
125p
b
100p
b
SiHa
MPM
25 pb
Ctrl
(-)
Figura 5. Identificación del VPH-16 en gel de poliacrilamida al 6 %. Se obtuvieron productos de
amplificación para VPH-16 de 235pb , se utilizo marcador de peso molecular (MPM) de 25 pb , mientras
que ADN de SiHa fue utilizado como control positivopara VPH-16
DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL DE LOS VPHs
Preparación de las Curvas Estadáres: Con la finalidad de realizar la estandarización de
nuestros resultados Se prepararon diluciones de 108 a 102 copias tanto para VPH-16, VPH-18
así como de HMBS Homo Sapiens Hydroxymethylbilane synthase; GenBank No. M95623)
[anexo 1.] para la realización de curvas estándares que nos sirvieron para determinar la carga
viral de cada una de las muestras.
Se realizo la técnica de RCP en tiempo real para el HMBS para conocer el número de
células presentes en cada una de las muestras con el fin de normalizar los resultados. (Expresar
los resultados en copias/células)
Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo Real (RCP-Tiempo Real): El sistema de
tipificación esta diseñado para determinar la carga viral de los tipos de VPH-16 y VPH-18
encontrados en NIC I.[39] El ensayo está basado en 3 reacciones en paralelo de RCP en
27
tiempo real de cada muestra. La reacción 1: Permitió amplificar y cuantificar los VPH 16
que fueron detectados y cuantificados juntos), en el cual se utilizan 2 iniciadores y 1 sondas
(ver tablas 3 y 4), la reacción 2: Nos permitió amplificar y cuantificar el VPH 18, en el cual
se utilizan 2 iniciadores y 1 sondas. (ver tablas 3 y 4).mientras que la reacción 3 nos permitió
amplificar y cuantificar la cantidad de una simple copia del gen humano (HMBS), en el cual
se utilizaran 2 iniciadores y 1 sonda. (ver tablas 3 y 4).
Iniciador
Especificidad
Secuencia (5’ a 3’)
F16E7
VPH16
AGCTCAGAGGAGGAGGATGAA
R16E7
VPH16
GGTTACAATATTGTAATGGGCTC
F18E1
VPH18
CATTTTGTGAACAGGCAGAGC
R18E1
VPH18
ACTTGTGCATCATTGTGGACC
HMBS F
HMBS
GCCTGCAGTTTGAAATCAGTG
HMBS R
HMBS
CGGGACGGGCTTTAGCTA
Tabla 3. Secuencia de primers utilizados en la RCP en tiempo Real.[45 ]
Sonda
S1.1
Especificidad
VPH16
5’ fluoroforo
FAM
Secuencia (5’ a 3’)
CCAGCTGGACAAGCAGA
3’ fluoroforo
TAMRA
ACCGG
S1.2
VPH18
FAM
AGAGACAGCACAGGCAT
TAMRA
TGTTCCATG
S3
HMBS
FAM
TGGAAGCTAATGGGAAG
CCCAGTACC
Tabla 4. Sondas utilizadas en la RCP en Tiempo Real. [45]
28
TAMRA
La amplificación de la RCP en tiempo real fue desarrollada a un volumen total de 10
µl, conteniendo: 1X de Master Mix (FastStar Taq DNA polimerasa, buffer de reacción, MgCl2
y una
mezcla de los dNTPs), 0.5 µM de cada primer, 0.1 µM de la sonda, 2 µl de ADN
genómico y la cantidad de H20 inyectable necesaria para completar 10 µl de mezcla total.
La amplificación y detección fue desarrollada usando el termociclador Lightcycler
versión 1.5 de Roche Diagnostics de la siguiente manera: pre-incubación 1 ciclo a 95 °C , 10
min; amplificación y cuantificación 45 ciclos a 95 °C, 10 seg., 57 °C, 20 seg., 72 °C, 1 seg.;
Enfriamiento 1 ciclo 40 °C, 30 seg.
Análisis de los datos de RCP en Tiempo Real: Se utilizó el Lightcycler software versión 4.0,
para la detección de la secuencia, y se produjo un archivo con datos crudos. El software fue
desarrollado y utilizado para el cálculo del ciclo umbral y conversión en números de las copia
de VPH por célula.
Análisis Estadístico: Se realizó la determinación de frecuencias y proporciones de cada uno de
los tipos de papilomavirus humano, para el análisis estadístico de comparación se utilizo U. de
Mann Whitney , el nivel de significancia fue considerado de p< 0.05.
29
X. RESULTADOS
Características generales de la población estudiada

Como resultado del cuestionario practicado a las pacientes, se obtuvo información acerca
de los factores de riesgo para el desarrollo de CaCU.(tabla 5)
TABLA 5. Características Generales de la población estudiada según tipo de
VPH.
Mínimo
Mediana
Máximo
17
18
17
36.5
37
36
65
65
64
12
14
12
18
18
17
35
35
26
1
1
1
1
1
1
8
8
8
0
0
0
3
3
3
14
14
10
0
0
1
3.5
4
3
15
15
10
0
0
0
1
1
1
4
4
4
Edad (años)
GENERAL
VPH-16
VPH-18
IVSexual(años)
GENERAL
VPH-16
VPH-18
No. de PSVida
GENERAL
VPH-16
VPH-18
Paridad
GENERAL
VPH-16
VPH-18
No. de Gestaciones
GENERAL
VPH-16
VPH-18
No. De PSAño
GENERAL
VPH-16
VPH-18
IVSexual = Edad que inicio su vida sexual.
No. de PSVida = Número de parejas sexuales en su vida.
No. de PSaño = Número de parejas sexuales el último año.
30
Identificación y tipificación de los VPHs

Un total de 245 muestras se analizaron para identificar el VPH-16 (figura 5) de las cuales
54 muestras resultaron ser positivas para este tipo de VPH, representado una frecuencia
del 22%.(figura 6)

Mientras que para el VPH-18 se analizaron 196 muestras de las cuales solo 45 muestras
resultó ser positiva para este tipo de VPH (figura 4), Obteniéndose el 23 % de frecuencia.
(figura 6)
Con respecto a coinfección solo 11 muestras resultaron ser positivas para ambos tipos de
VPH , representando el 11.11% de las 99 muestras positivas para el VPH (54 muestras
VPH-16 y 45 muestras VPH-18),.(figura 6)
200
191
180
VPH-16
151
160
Frecuencia ( n )

140
VPH-18
120
100
78%
80
77%
54
60
45
40
22%
23%
11
20
0
Negativas
Positivas
coinfeccion
Positivas
Negativas
Figura 6 . Frecuencia del VPH-16 y VPH-18. Las muestras positivas de VPH se identificaron mediante la
técnica de RCP de punto final. Nótese que el porcentaje encontrado del VPH-18 es mayor que del VPH-16.
31
Cuantificación de la carga Viral de los VPHs.

La determinación de la carga viral del VPH-16, mediante la técnica de RCP en tiempo
real. Se llevo a cabo en un total de 54 muestras, de las cuales solo en 47 de ellas se pudo
determinar la cantidad de copias de ADN del VPH presente, en las otras 7 muestras
restantes no se determino el número de copias probablemente por la degradación del ADN.
(tabla 6)
No.
Paciente
1a
Carga Viral
(copias/103Células)
1,60E+04
No.
Paciente
25a
Carga Viral
(copias/103Células)
4,10E+06
2a
1,60E+03
26a
2,50E+01
3a
5,20E+05
27a
1,10E+01
4a
1,90E+04
28a
1,60E+04
5a
5,30E+01
29a
3,20E+02
6a
3,40E+01
30a
5,60E+01
7a
1,40E+01
31a
3,10E+02
8a
2,20E+05
32a
1,00E+03
9a
5,80E+00
33a
1,30E+01
10a
1,10E+03
34a
2,70E+01
11a
2,40E+02
35a
4,10E+01
12a
1,20E+02
36a
1,10E+01
13a
1,50E+01
37a
5,80E-01
14a
8,70E+01
38a
8,30E+01
15a
5,30E+00
39a
1,10E+00
16a
6,00E+02
40a
1,10E+00
17a
1,20E+03
41a
1,20E+05
18a
1,00E+04
42a
3,80E+01
19a
1,70E+02
43a
1,00E+04
20a
2,30E+03
44a
2,80E+01
21a
2,60E+00
45a
4,30E+00
22a
1,00E+02
46a
5,80E+03
23a
1,30E+01
47a
3,60E+04
24a
4,40E+01
Tabla 6. Carga Viral del VPH-16 en pacientes con NIC I. Se muestra de manera individual la carga
viral del VPH- 16 obtenidas para cada uno de las muestras.
32

Debido a que en la RCP en tiempo real algunos resultados no fueron satisfactorios, se
eliminaron 7 muestras de VPH-16. Mientras que se toman en cuenta para la prevalencia
debido a que cuando se hizo el escrutinio para VPH-16 dichas muestras fueron positivas.

Con respecto a la cuantificación del VPH-18, se determinó la carga viral en un total de 45
muestras cuyas cargas obtenidas se pueden ver en la tabla 7.
No.
Paciente
1b
Carga Viral
(copias/103Células)
2,51E+02
No.
Paciente
24b
Carga Viral
(copias/103Células)
5,49E+00
2b
5,90E+01
25b
4,50E+02
3b
5,02E+01
26b
2,87E+02
4b
2,94E+02
27b
6,60E+01
5b
1,43E+02
28b
2,23E+01
6b
5,67E+02
29b
2,96E+02
7b
1,95E+02
30b
3,01E+03
8b
2,17E+01
31b
2,54E+02
9b
2,58E+01
32b
1,04E+02
10b
3,81E+01
33b
2,50E+02
11b
1,04E+02
34b
1,47E+01
12b
1,01E+02
35b
1,63E+02
13b
1,00E+02
36b
9,58E+00
14b
2,28E+01
37b
1,74E+01
15b
9,44E+00
38b
3,61E+00
16b
1,90E+01
39b
4,72E+00
17b
1,26E+00
40b
2,64E+01
18b
2,11E+00
41b
8,88E+03
19b
7,58E+01
42b
4,81E+01
20b
5,19E+00
43b
1,76E+01
21b
1,44E+00
44b
1,51E+01
22b
1,12E+01
45b
4,73E+00
23b
1,11E+02
Tabla 7. Carga Viral del VPH-18 en pacientes con NIC I. Se muestra de manera individual la
carga viral del VPH- 18 obtenidas para cada uno de las muestras.
33
Con la finalidad de visualizar de una manera general las cargas virales obtenidas, se
realizo una agrupación de dichas cargas virales en intervalos según su log 10. resultando
con un mayor porcentaje el intervalo de 1.0E+01 con un 37%, seguido por el intervalo
1.0E+02 con un 25 %,(figura 7). De igual manera se realizo esta distribución para cada uno
de los tipos de VPH ( 16 y 18). De manera general se observa que el VPH-18 tiene una
menor carga viral con respecto al VPH-16. (figura 8)
40
34
35
No. de Muestras ( n )

30
23
25
20
17
15
10
18%
37%
8
25%
6
5
3
9%
1
7%
3%
0
1.0E+00
1.0E+01
1.0E+02
1.0E+03
1.0E+04
1.0E+05
1%
1.0E+06
3
Carga Viral (Copias/10 Celulas)
Figura 7 . Distribución General de las Muestras según su Carga Viral. Las cargas virales se
agruparon en intervalos según su log 10. Nótese la distribución del número de muestras
correspondiente en cada uno de los intervalos así como su porcentaje.
34
20
18
18
16
16
No. de Muestras ( n )
16
14
11
12
VPH-16
VPH-18
10
8
36%
6
38%
6
36%
6
6
24%
4
2
7
13%
3
15%
13%
2
4%
13%
0
6%
1
0
0
2%
0
1.0E+00 1.0E+01 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06
Carga Viral (Copias/103 Células)
Figura 8 . Distribución de las Muestras según Tipo de VPH y Carga Viral. Las cargas virales se
agruparon en intervalos según su log 10. Nótese el tipo de VPH y la distribución del número de
muestras correspondiente en cada uno de los intervalos así como su porcentaje.
Análisis Estadístico.

Al analizar los datos obtenidos para la carga viral con la prueba de Kolmogorov-Smirnov
para verificar su normalidad, se concluyo que su distribución no era normal por tal
motivo para la estadística inferencial se utilizo la prueba no parametrica de U. de Mann
Whitney.

Se compararon las cargas virales obtenidas del VPH-16 y las del VPH-18 con la prueba de
U. de Mann Whitney teniendo una p = 0.030, por tal motivo se considera que la
diferencia entre las cargas virales del VPH-16 y VPH-18
estadística.(tabla 9)
35
tiene
significancia
Grupo
VPH-16
(N=47)
VPH-18
(N=45)
Mínimo
(copias/103celulas)
1.05E+00
Mediana
(copias/103celulas)
8.70E+01
Máximo
(copias/103celulas)
4.05E+06
1.26E+00
4.80E+01
8.88E+03
Valor de
p
0.030
Tabla 8. Diferencia significativa entre carga Viral de VPH-16 y VPH-18. Nótese el resultado de la
prueba de U. de Mann Whitney tuvo una p de 0.030.

Se analizaron las carga virales según los factores de riesgo para el desarrollo de CaCU
mediante la prueba de U. de Mann Whitney la mayoría de los grupos formados no
tuvieron significancia estadística y solo el grupo de “mayor parejas sexuales el ultimo año”
del VPH-16 vs. del VPH-18 tuvo una p de 0.021. por lo cual se consideró dicha diferencia
significativa. Algunos de estos grupos estuvieron cerca de tener significancia estadística
como lo muestra la tabla 9.
36
Grupo
Tipo de
VPH
Mínimo
(copias/103celulas)
Mediana
(copias/103celulas)
Máximo
(copias/103celulas)
Valor
de p
PSAño
≥1
VPH16
(N=42)
VPH18
(N=40)
VPH16
(N=30)
VPH18
(N=27)
VPH16
(N=23)
VPH18
(N=19)
VPH16
(N=31)
VPH18
(N=28)
VPH18
(N=15)
VPH18
(N=23)
1.08E+00
1.35E+02
4.10E+06
0.021
1.26E+00
4.40E+01
8.88E+03
1.08E+00
1.02E+02
4.10E+06
1.26E+00
3.80E+01
8.88E+03
1.05E+00
5.60E+01
4.10E+06
1.44E+00
2.60E+01
3.01E+03
1.05E+00
8.30E+01
2.20E+05
1.26E+00
2.45E+01
8.88E+03
5.19E+00
1.00E+02
8.88E+03
1.26E+00
2.30E+01
4.50E+02
Casadas
Edad ≥
17 años
Gestas
≥1
Paridad
≥1
0.068
0.063
0.081
0.060
Tabla 9. Comparación de carga viral del VPH-16 y VPH-18 según diferentes factores de riesgo. Se indica
el valor de p obtenido según factores de riesgo, teniendo significancia estadística el grupo de mayor de 1
pareja sexual el ultimo año. Y demás grupos que estuvieron cerca de tener significancia estadística.
37
XI. DISCUSION
Observamos que la frecuencia de positividad para el VPH-18 en pacientes con NIC I del
Estado de Colima es muy alta (23%), mientras que para el VPH-16 (22%), la consideramos
alta. En comparación con la reportada con Taesook Hwang, quien detecto y tipifico el VPH,
en mujeres coreanas, sin encontrar evidencia de infección por el VPH-18 (0%), en contraste
para el VPH-16, reporto una frecuencia mayor (29%). [43] O bien se reportan frecuencias muy
bajas para VPH-18, del 2%, encontrada por Anderson y Cols, que estudiaron el tipo de
distribución del VPH en pre-estados de cáncer cervical en mujeres suecas, mientras que para
el VPH-16, reportaron una frecuencia del 20%, siendo muy similar a la encontrada por
nosotros.[44] En un estudio hecho en Texas (Estados Unidos) por Swan y Cols mostraron una
frecuencia para el VPH-18 de 5.7%, mientras que para el VPH-16 fue de 8.5 %[45], ambas
frecuencias menores a las encontradas en el presente tesis. Cabe recordar que las frecuencias
descritas anteriormente corresponden únicamente a las encontradas en relación con NIC I.
Piña-Sánchez
y cols analizaron la prevalencia de los tipos de VPH y determinaron su
asociación con lesión cervical en población mexicana, reportando una frecuencia de VPH-16
de 25.3%, y para el VPH-18 de 4.2% en pacientes con LIE de bajo grado.[46] Un estudio
previo en el Estado de Colima, realizado por Tamayo y Cols, donde se clasificaron los
pacientes con LIE de bajo grado se encontró una prevalencia alta de VPH-18 (44.7%), Sin
embargo las frecuencias encontradas para el VPH-16, fue del 76.7%.[47]
Estas diferencias pueden ser explicadas por las poblaciones estudiadas. En la población
de mujeres mexicanas son pocos los estudios que hacen referencia a la frecuencia entre la
infección por el VPH y NIC I. Dichos estudios no pudieron ser comparados con los nuestros,
porque utilizaron primers consensos y reportan una frecuencia general del VPH, si mencionar
los diferentes tipos.[48] O bien por la metodología utilizada en la detección del VPH, como
es el caso del estudio previo realizado en el mismo Estado, así como la nomenclatura en la
clasificación de las lesiones utilizada fue diferente.
La RCP en tiempo real en el diagnóstico molecular ha sido muy bien aceptada a nivel
mundial, por su alta especificidad y sensibilidad por lo tanto su uso se ha incrementando.[49]
Al tratar de comparar la carga viral encontrada en el presente trabajo con otros estudios nos
percatamos que la bibliografía en
la cual se apoyo principalmente
38
nuestro trabajo
experimental solo se evaluó la reproducibilidad para cuantificar la carga viral del VPH-16 y
VPH-18 , la cual sus resultados no sirvieron como referencia. [42] Ninguno de los estudios
encontrados realizo una comparación entre la carga viral del VPH 16 vs VPH-18 en lesiones
premalignas en especial NIC I.
La comparación de la carga viral, se rescato al encontrar un estudio en la cual se basa
en la variación del ciclo umbral (Ct), el cual su valor es considerado inversamente
proporcional a la cantidad inicial del ADN del VPH, al comparar el Ct medio del VPH-16
(28.70) el estudio la considera dentro intervalo de 103 de genoma de VPH mientras que para el
valor medio de Ct del VPH-18 (29.77) el estudio la considera dentro del intervalo de 102 de
genoma de VPH y ambos intervalos (103 y 102) son considerados como de baja carga viral, de
acuerdo con las respectivas curvas estándares que ellos hicieron para VPH-16 y VPH-18.[39]
No existe un parámetro validado que nos diga los intervalos en los cuales se considera que la
carga viral sea alta, media o baja, la mayoría de los estudios encontrados realizan ellos mismos
sus intervalos de acuerdo a las cargas virales que cada uno de ellos encuentra difiriendo de un
estudio a otro. La baja carga viral encontrada en esta tesis se podría explicar a las muestras
que son de pacientes con NIC I. Al no encontrar estudios previos que nos hallan servido de
comparación esto se puede explicar debido a que, para la determinación de la carga viral en
especial del VPH, han sido utilizadas una amplia variedad de químicas para su detección así
como de unidades de medición, pero aún no ha sido identificado y validado un método que
sea considerado como el estándar de oro.[42]
Nuestros resultados demuestran que en pacientes con NIC I, la carga viral normalizada del
VPH-16
(copias/103 células) es más alta en comparación con la carga viral obtenida
normalizada del VPH-18, siendo una diferencia significativa con un valor de p de 0.030.
Diversos estudios sugieren que el DNA del VPH-18 es aproximadamente de 10 a 50 veces
más eficiente que el DNA del VPH-16 en la inmortalización de células epiteliales haciéndole
más agresivo.[50] Otros investigadores reportan que el HPV-18 puede estar asociado a con
una forma más agresiva de cáncer cervical que otros tipos de VPHs.[51] O bien se reporta que
el DNA del VPH-18 fue 5 veces más eficiente que el ADN del VPH-16 para la transformación
de queratinocitos in vitro.[52] Inclusive un estudio sugiere que la expresión de proteínas
virales tempranas incluyendo los oncogenes pueden ser directamente de un segundo promotor,
localizado dentro del LCR del VPH-18. [53] o bien que el VPH-18 puede estar asociado con
39
el desarrollo de la progresión hacia cáncer cervicouterino más rápidamente. [54] Lo anterior
puede ser debido a que la LCR, principal promotor de E6 y E7 de VPH-18 es más potente que
el de VPH-16. Al tener el VPH-18 un promotor más potente, esto podría explicar el porque
una infección con baja carga viral del VPH-18 podría ser suficiente para alterar al epitelio
cervical y provocar una NIC I con una menor carga viral que el VPH-16.
Al comparar los grupos de carga viral que se formaron
en base a características
epidemiológicas, en la mayoría la diferencia entre la carga viral del VPH-18 y VPH-16 no
hubo significancia estadística, a excepción de un solo grupo (tabla 6). Esto es probable a que
se deba a nuestro tamaño muestral pues los grupos que se formaron quedaron muy pequeños,
con un tamaño insuficiente para hacer un análisis confiable.
XII. CONCLUSION

La frecuencia del VPH-18 en mujeres con NIC I, en el Estado de Colima es muy alta.

La frecuencia del VPH-16 en mujeres con NIC es alta en el Estado de Colima.

La frecuencia del VPH-18 es mayor con respecto a la frecuencia del VPH-16, en el Estado
de Colima.

La Carga Viral, del VPH-16 es mayor significativamente con respecto al VPH-18, en
pacientes con NIC I. (p = 0.030)

Una carga viral de 102 genomas de VPH-18, es capaz de producir NIC I.

En base a los resultados presentados en esta tesis se concluye que se realizó
satisfactoriamente la determinación de la carga viral del VPH tipos 16 y 18, mediante
RCP en tiempo real en mujeres con NIC I del estado de Colima.
40
XIII. PERSPECTIVAS
Los resultados de esta tesis demuestran que la frecuencia del VPH-18 es poco mayor que
la del VPH-16, dichas frecuencias las consideramos altas, para el Estado de Colima. La carga
viral del VPH-16 cuantificada es significativamente mayor que la del VPH-18. La
contribución experimental de la presente tesis consistió en la determinación de la carga viral
del VPH-16 y VPH-18, esta determinación por el momento en pacientes con NIC I, es
suficiente para tomar de base la presente metodología para en lo futuro determinar la carga
viral en lesiones premalignas más avanzadas como NIC II, NIC III, Cáncer in situ y cáncer
invasor. Eventualmente estos estudios combinados con estudios del factor de metilación del
DNA del VPH, que indican que una eficiente metilación del DNA del VPH, podría estar
asociada con la progresión y desarrollo de cáncer cervical, contribuirán a un conocimiento más
completo del VPH-16 y 18 en el Estado de Colima.
41
XIV. GLOSARIO
Ácido desoxirribonucleico: Ácido nucleico de los cromosomas; contiene codificada la
información genética de la célula.
Acido nucleico: ADN o ARN. Polímero formado por nucleótidos que contiene las bases
purínicas adenina y guanina y las bases pirimidínicas, citosina, timina y uracilo.
Alelo: Forma alternativa de un gen situado en un locus particular en un par de cromosomas
homólogo. Se segregan durante la meiosis y el hijo sólo recibe uno de cada par de
alelos de cada progenitor.
Amplificación: Tratamiento indicado para incrementar la proporción de ADN plasmídico
frente al ADN bacteriano; 2. Replicación de un banco genómico en bulto; 3.
Generación de múltiples copias de un gen.
Anticuerpos (Inmunoglobulinas): El tipo de inmunoglobulina se determina por medio de la
región constante de la cadena pesada y está asociada con las propiedades genéricas del
anticuerpo: localización tisular y celular, unión del complemento y otras. Es
independiente de la región variable y de la cadena ligera.
Anticuerpos monoclonares: Anticuerpo que se puede obtener en el laboratorio y que tienen
la propiedad de ser altamente específicas contra un epitope. Los anticuerpos
monoclonares pueden producirse por un hibridoma o por una célula productora de
anticuerpos específicos contra un antígeno en particular.
Antígeno: Sustancia o agente que el organismo reconoce como ajena, tales como toxinas,
bacterias o virus y produce una respuesta inmune. El antígeno es capaz de provocar
una respuesta del sistema inmunológico, ya sea por medio de anticuerpos o de células
inmunes, es decir por medio de la respuesta humoral o celular. Un antígeno contiene
varias subunidades llamadas epitopes, que son el objetivo de los anticuerpos
específicos y de los linfocitos T Citotóxicos. Los antígenos pueden circular en el
organismo a través de los vasos linfáticos o sanguíneos, tanto la linfa como la sangre
contienen glóbulos bancos que los atacan y destruyen, para ser finalmente eliminados a
través de los nódulos linfáticos o del bazo respectivamente.
42
Cápside: Cubierta proteica de un virión celular. Un antígeno contiene varias subunidades
llamadas epitopes, que son el objetivo de los anticuerpos específicos y de los linfocitos
T Citotóxicos. Los antígenos pueden circular en el organismo a través de los vasos
linfáticos o sanguíneos, tanto la linfa como la sangre contienen glóbulos bancos que los
atacan y destruyen, para ser finalmente eliminados a través de los nódulos linfáticos o
del bazo respectivamente.
Carcinogénico: Agente o sustancia química que produce cáncer o que acelera su desarrollo.
Carcinoma: Neoplasia Intraepitelial maligna que tiende a invadir los tejidos circundantes y
metastatizar en regiones circundantes del organismo.
Carcinoma in situ: Neoplasia premaligna que no ha invadido la membrana basal, pero que
presenta características histológicas de un cáncer invasivo, generalmente se dan en
epitelio glandular o escamoso estratificado.
Cariotipo: Constitución cromosómica de un individuo. Por lo común, el cariotipo se realiza
fotografiando los cromosomas y ordenando las pares homólogos por tamaño y posición
del centrómero.
Célula basal: Células que proceden de la capa basal o germinal (la más profunda). A partir de
éstas se origina por división (mitosis) el resto del epitelio.
Células intermedias: Células que proceden del estrato medio del epitelio cervicovaginal.
Poseen citoplasmas ligeramente más pequeños que las superficiales y núcleos
discretamente más grandes.
Cérvix: es el cuello y la apertura del utero que conecta con el canal de la vagina.
Citología: Parte de la biología que estudia a las células y sus funciones.
Citomegalovirus: Virus que ocasiona una infección oportunista. Es un virus de la familia de
los herpes. Las infecciones por CMV pueden ser sin síntomas o con síntomas
inespecíficos como fiebre, irritación de la garganta, debilidad, escalofríos y
crecimiento ganglionar. El virus se elimina a través de la orina, semen, saliva, heces y
sudor. Una citomegalovirosis se puede manifestar como retinitis, esofagitis, hepatitis,
mononucleosis, polirradiculopatía, pancreatitis, colitis o afección del pulmón pudiendo
43
llegar a ocasionar la muerte. Su tratamiento es con ganciclovir o foscarnet. Un nuevo
medicamento llamado cidofovir, cuyo nombre comercial es Vistide, sus iniciales
químicas HPMPC y conocido como GS-504, está en proceso de aprobación.
Coilocito: célula intermedia-superficial con gran halo claro perinuclear citoplasmático y
núcleos hipercromáticos agrandados
Coilocitosis silenciosa: Es cuando los coilocitos no siempre se observan y, además,
disminuyen progresivamente en número conforme se incrementa la severidad de la
displasia (aunque está ligada a dicha infección), siendo excepcionales en casos de
cáncer invasivo.
Colposcópico (Estudio): consiste en la evaluación directa del Cuello Uterino, con un lente
binocular de gran aumento denominado Colposcopio, el cual permite visualizar las
llamadas atipias epiteliales (tejido de aspecto anormal), de encontrarse ésta presente, se
tomará de inmediato una pequeña muestra del tejido (biopsia), la cual se enviará al
laboratorio para su estudio histológico y determinar dentro de que categoría se
encuentra la lesión.
Condiloma: Elevación verrugosa que se localiza en el ano, vulva o glande peneano.
Condiloma acumuminado: Elevación verrugosa o papilomatosa de consistencia blanda,
propia de las zonas de la piel caliente y húmeda y las mucosas genitales. Denominada
también verrugas acuminadas y verrugas venérea.
Condiloma plano:
Elevación papulosa plana y húmeda que aparece en el periné o glande
peneano.
Correlacionar: Relación reciproca entre dos o más cosas.
Cromosomas: Estructura compuesta de una larga molécula de ADN y proteínas asociadas,
que contiene la información hereditaria de un organismo.
Delación: Forma de aberración de los genes o cromosomas, en la que se pierde una parte de
éstos.
44
Desnaturalización: Cambio dramático en la conformación de ácidos nucleicos causados por
calentamiento o por exposición a químicos y resultando usualmente en la pérdida de
la función biológica.
Diploide: Número cromosómico equivalente al doble del número presente en los gametos, que
tiene dos juegos cromosómicos.
Diseminación: Acción y efecto de esparcir.
Displasia: Desarrollo anormal.
Electroforesis: Método que permite separar determinados constituyentes de una solución,
sometiéndolos a la acción de un campo eléctrico. Este método es utilizado por las
pruebas Western Blot y RIPA.
Elongación: Diferencia de longitud.
Endonucleasas de restricción: Endodesoxirribonucleasa que corta en sitios específicos al
reconocer secuencias específicas de nucleótidos. Ambas cadenas son cortadas.
Usualmente son aisladas a partir de bacterias.
Episoma: Elemento genético circular. Existe en forma independiente del material genético
principal de la célula.
Erradica: Terminar con una enfermedad.
Estudio Descriptivo: El estudio incluye sólo una población, cuyo objetivo es sistematizar y
cuantificar hechos con el fin de conocer con mayor precisión el fenómeno, algunos
autores lo denominan con exploratorio, estudio piloto “Pesquisas”.
Etiología: Parte de la medicina que estudia la causa de las enfermedades. Agente causal de las
enfermedades.
Fenotipo: Conjunto de características observacionales de un organismo o grupo, incluidos los
rasgos anatómicos, fisiológicos, bioquímicos y de comportamiento que son
determinados por la interacción de la base genética y los factores ambientales.
Frecuencia: Repetición de un suceso que pasa muy a menudo.
Gen: Unidad de ADN que codifica un cierto producto, usualmente una proteína.
45
Gen supresor: Gen que puede revertir el efecto de una mutación específica en otros genes.
Genoma: Dotación completa de genes existentes en los cromosomas de cada célula de un
organismo particular.
Genotipo: Constitución genética completa de un organismo o grupo, determinada por la
combinación y localización particulares de los genes en los cromosomas. Alelos
situados en uno o mas loci de cromosomas homólogos.
La información genética
contenida en un par de alelos determina un carácter específico.
Heterogeneidad genética: Término amplio utilizado para indicar que un mismo cuadro
clínico puede tener causas genéticas diferentes.
Hipercromasia: Aumento de la coloración de la célula.
Hiperplasia: Aumento del número de células.
Lesiones proliferativas papilomatosas: No siempre se observan dichas células y, además,
disminuyen progresivamente en número conforme se incrementa la severidad de la
displasia (aunque está ligada a dicha infección), siendo excepcionales en casos de
cáncer invasivo.
Locus (plural: loci): Localización exacta del gen de un cromosoma. Las diferentes formas del
gen (alelos) ocupan siempre la misma posición o locus en el cromosomas.
Membrana basal: Capa de tejido conectivo subyacente al epitelio de los vertebrados.
Metaplasia: Es la sustitución del epitelio glandular endocervical por otro de tipo escamoso en
respuesta a diversos estímulos (pH, endocrinos, trauma, inflamación, etc.).
Metástasis: Proceso por el que las células tumorales se discriminan hacia partes distantes del
organismo.
Mortalidad: Número proporcional de defunciones en población o tiempo determinado.
Mucosas: Membrana que tapiza cavidades del cuerpo que tienen comunicación con el
exterior.
Multifactorial: Determinada por múltiples factores tanto genéticos como no genéticos, cada
uno con efecto mínimo.
46
Mutación: Cambio permanente y hereditario del material genético. Definida comúnmente
como el cambio en un solo gen (mutación en un punto), aún cuando el término se
emplea también para designar un cambio en el número o en la disposición de los
cromosomas.
Neoplasia: Crecimiento anormal de un tejido nuevo puede ser benigno o maligno.
Neoplasia maligna: Tumor que tiende a crecer, invadir, metastatizar en forma irregular, está
compuesto por células poco diferenciadas.
Oligonucleótido: Secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces fosfo-diéster,
habitualmente no mayor de 50 nucleótidos.
Oncogénico: Que es capaz de causar el desarrollo de una enfermedad neoplásica maligna.
Oncogén: Gen que induce una proliferación celular incontrolada.
Oncogenes: Un largo numero de genes que pueden ayudar hacer una célula cancerosa.
Típicamente, muta el gen norma (protooncogen) perdiendo el control del crecimiento
o la división celular.
Oncología: Parte de la medicina que estudia los tumores, entre ellos los cancerosos y su
tratamiento.
Polimerasa: Enzima que cataliza la unión de nucleótidos para formar ARN y de
desoxirribonucleótidos para formar ADN.
Polimorfismo: Variante que se encuentra presente al más del 1% de la población en general.
Pólipo: Pequeño crecimiento de aspecto tumoral que sobresale de una mucosa superficial.
Poliploide: Célula o individuo que tiene tres o más complementos cromosómicos (3N, 4N,
etc.).
Poliploidia: Posesión de más de dos juegos de cromosomas por núcleo.
Pólipo cervical: Tumoración del
tejido epitelial columnar que aparece en el canal
endocervical, por lo general está unido a su pared por un pedículo muy delgado.
47
Protooncogenes: Gen normal, concierne usualmente con la regulación de la proliferación de
células, que pueden iniciar promoviendo el cáncer por medio de la mutación del
oncogen.
Queratina: Proteína córnea, insoluble de agua, presente en la epidermis, uñas, plumas, pelo y
cuerno de los vertebrados.
Reacción en Cadena de la Polimerasa: Técnica de amplificación de una región especifica
del ADN con múltiples ciclos con polimerización de ADN.
Región tardía: Parte de la región viral que contiene genes para las proteínas estructurales,
como los antígenos de la cápside.
Región temprana: Parte del genoma viral que contiene genes que se expresan de inmediato
en las infectadas transformadas.
Represor transcripcional: Proteína celular o viral que evita la trascripción de un gen al unirse
al promotor asociado.
Transformación: Adquisición de las células de alguna o todas las propiedades de las células
neoplásicas.
Trichomonas vaginalis: Protozoo de 8-30
de tamaño, que produce picor y leucorrea
verdosa. Destacar que puede simular fácilmente displasias de bajo grado.
Tumor: Masa de tejido que crece de modo descontrolado; neoplasma.
Virus: Patógeno minúsculo formado por un núcleo de ácido nucleico, generalmente envuelto
por proteína,
capas de infectar células vivas. Y se caracterizan por su total
dependencia de un hospedero viviente.
Zona de transformacion (epitelio endocervical): sitio donde se van a originar la gran mayoría
de los carcinomas escamosos
48
XV. REFERENCIAS
1. Bosch FX and Muñoz N. Cervical cancer and human papillomavirus: Epidemiological
evidence and perspectives for prevention. Salud Pública Mex. 1997;39: 274-282
2. Dirección General de Epidemiología; SSA; Sistema Epidemiológico y Estadístico de las
Defunciones, 2001 (Base de datos preliminares)
3. Dorántes J, Tapia JR, Torres JL). Mortalidad por cáncer cervicouterino en México:19791999. Perinatol y Reprod Hum 2002; 16: 35-42.
4. Castellanos MR. Cáncer cervicouterino y el VPH. Opciones de detección. Revista de la
Facultad de Medicina UNAM. 2003;46: 63-66.
5. Frias M, Ibarra M, Mohar A, Ramírez JL, Suchil L . Factores de riesgo asociados a
cáncer cervicouterino. Un estudio de casos y controles. Rev Inst Nal Cancerol (Mex).
1999 ;45:209-216.
6. Cortés EI and Leal C. Papilomavirus Humano. Biología Molecular y Patogénesis. Rev
Salud Pública y Nut, .2001;2.
7. Van Duin M, Snidjers P, Schrijnemarkers H, Voorhorst F, Rozendaal L, Nobbenhuis M,
Van der Brule A, Verheijen R, Helmerhorst T, Meijer C. Human papillomavirus 16 load in
normal and abnormal cervical scrapes: an indicador of CIN II/III and viral clearance. Int J
Cancer .2002;98:590-595
8. Josefsson A.M, Magnusson P. K, Ylitalo N, Sorensen P, Qwar-forth-Tubbin P. Andersen
K, Melbye M, Adami H, Gyllenstein U,Viral Load of papilloma virus 16 as a determinant
for development of cervical carcinoma in situ: a nested case-control study . Lancet: 2000:
355: 2189-2193
9. Alonso RP,
Lazcano PE, Hernández AM.
Cáncer cervicouterino: Diagnóstico,
Prevención y Tratamiento. Médica Panamericana. 2000;57-65.
10. Lewing B. Oncogenes and Cancer. Genes VII (7ª ed.):2001; 28;876.
11. Perera FP. Molecular Epidemiology: Insights Into Cancer Susceptibility, Risk Assessment,
and Prevention. J Natl Cancer Inst;1996; 88 (8), 496-505.
12. Márquez H .Cáncer, Patogenia, invasión y metástasis, tratamiento con nucleótidos
antisentido en un modelo in vitro. Patología. 1994;32:143-53
49
13. Delgado-Enciso I, Rojas-Martínez A, Barrera-Saldaña H, Ortiz-López R. Los Virus: Una
importante causa de neoplasias en los seres humanos. Rev Inv Clín.2004:56 (4);495-506.
14. Guzman L, Alcocer JM, Madrid V . Perspectivas para el desarrollo de vacunas e
inmunoterapia contra cáncer cervicouterino. Salud Pública Mex/ vol. 40, no. 1. Editado
por el Centro de investigación sobre enfermedades infecciosas del Instituto Nacional de
Salud Pública. Cuernavaca, Morelos, México. 1998;38-46
15. García-CarrancaA, Gariglio Patrico V. Aspectos moleculares de los papilomavirus y su
relación con el cáncer cervicouterino. Rev Inv Clín. 1993:45:85-92.
16. Niv A, Sion VN, Gatot A, Nash M y Fliss DM. Identification and typing of human
papillomavirus (HPV) in squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx. The
Journal of Laryngology and Otology,;2000; 114, 41-46
17. Roman A, Fife K. Human Papillomaviruses: Are we ready to Type?: J clin Microb. 1989:2
(2):166-190.
18. Hsiu-Ting T, ching-Hu W, Hsiao-Ling L, Ruei-Nian L, Yi-Ching T,Hung-Yi C,TrongNeng W,Li-Jen L, Chi-Kung H, Hon-Wein L, Ming-Tsang W. association between
quantitative High-risk human papilomavirus DNA load viral and cervical intraepithelial
Neoplasm Risk.Cancer epidemiology, Biomarkers & Prevention. Article in press.
19. Siritantikorn S, Laiwejpithaya S, Siripanyaphinyo U, Auewarakul P, Yenchitsomanus P,
Thakernpol K, Wasi C. Detection and typing of human papilloma virus DNAs in normal
cervix, intraepithelial neoplasia and cervical cancer in Bangkok. Southeast Asian J Trop
Med Public Health;1997;28(4): 707-710
20. Schoell WM, Janicek MF , Mirhashemi R. Epidemiology And Biology of cervical Cancer.
Semin Surg Oncol;1999; 16 (3): 203-211
21. Cortes EG, Rojas MA. Algunos factores epidemiologicos en el CaCU. Rev Med IMSS;
1995(33), 177-182.
22. Sanchez J, Torres ME. Frecuencia de neoplasia intraepitelial del cervix y factores de
riesgo en mujeres de la ciudad de México. Ginecol Obstet Mex :1997; (65),.3- 7.
23. Yorhikawz H, Nagata C, Noda. Human Papillomavirus Infection and other risk factors for
Cervical Intraepitelial neoplasia in japan. Br J Cancer;1999 : 80 ( 3-4 ) : 621 –624
50
24. Plaisant O. Descubren en México una variable más oncogénica del virus papiloma
humano. Difusión y divulgación de la Ciencia y la Tecnología. Coordinación General de
Postgrado e Investigación (CEGEPI-IPN). México.;1998.
25. Combita AL, Bravo MM, Touzé A, Orozco O y Coursaget P. Serologic response to human
oncogenic papillomavirus types 16, 18, 31, 33, 39, 58 and 59 virus-like particles in
colombian woman with invasive cervical cancer. Int J Cancer, ; 2002 ; 97, 796-802
26. Torroella KM, Morsberger S, Carrillo A, Mohar A, Meneses A, Ibarra M, Daniel RW,
Ghaffar AM, Solorza G and Shah KV. HPV Prevalence among Mexican Women with
Neoplastic and Normal Cervixes. Gynecol Oncol;1998; 70, 115-120
27. Labropoulou V. Type Specific Prevalence of Genital Human Papillomaviruses in Bening,
premalignant , and malignant biopses in patients from Greece. Sex Transm Dis; 1997;24 (
8) : 469 – 74
28. Zamora PA. Infección por virus del papiloma humano en mujeres y hombres mexicanos.
Identificación por el sistema de captura de híbridos. Rev Hosp. Met;2000;, 9-13
29. Mougin C, Bernard B, Lab M. Biology of papillomavirus II infections. Their role in the
carcinogenesis of the cervix Ann Biol Clin (Paris);1998 56(1): 21-8
30. Arends MJ, Buckley CH, Wells M. Aetiology, pathogenesis, and pathology of cervical
neoplasia. J Clin Pathol;1998; 51(2):96-103
31. Garfias RC, Villareal PC. Conceptos actuales sobre la infección por virus del papiloma
humano. Ginecol Obstet Mex,; 1995; 63: 509 –513
32. Alonso RP,
Lazcano PE, Hernández AM.
Cáncer cervicouterino: Diagnóstico,
Prevención y Tratamiento. Médica Panamericana. 2000;57-65.
33. Milde-Langosch K, Riethdorf S, Park TW. Natural course of HPV infection. Usefulness of
HPV analysis in cervix diagnosis. Pathologe;1999 20(1):15-24
34. Watts KJ, Thompson CH, Cossart YE y Rose BR. Sequence variation and physical state of
Human Papillomavirus type 16 cervical cancer isolates from australia and new Caledonia.
Int J Cancer;2002; 97, 868-874
35. Sedlacek T, Advances in the diagnosis and treatment of human papillomavirus
infections.Clin Obstet Gynecol.1999:42 (2):206-220
36. Taja CL, Salas GM y Salcedo VM. Bases Moleculares de la carcinogénesis viral de
papiloma y polioma. Salud Publica Mex;1996;, 38 (1), 47-57
51
37. Vargas-Hernández VM.Virus del papiloma Humano. Aspectos epidemiológicos,
carcinogenéticos, diagnósticos y terapéuticos.Ginecol Obstet Mex;1996;64,411-417.
38. Berumen J, Villegas N. Vacunas terapéuticas recombinantes contra el cáncer del cuello
uterino. Salud Publica Mex; 1997; 39, 288-297
39. Moberg M, Gustavsson I, Gyllenstein U. Real-Time PCR-Based System for Simultaneous
Quantification of Human Papillomavirus Types Associated with High risk of cervical
cancer. J Clin Microb. 2003;41(7):3221-322
40. Ferrerira AL, Maurice SF, Martins MR, zanatta LO, Martinez EZ, Syrjänen KJ.Human
papillomavirus viral load in predicting high-grade CIN in women with cervical smears
showing only atypical squamous cells or low-grade squamous intraepithelial lesion.
Medical Journal;2003;121(6):238-243
41. Hernández M, Ríos M, Aguilar O, Torres A. Actualización de la terapia del papilomavirus
humano. Terapia convencional. Rev Cub Med.2004:43(1).
42. Gravitt EP, Peyton C, Wheeler C, Apple R, Higuchi R, Shah KV.Reproducibility of HPV
16 and HPV 18 viral load quantitation using TaqMan real-time PCR assays. J Virol
Met;2003;112:23-33
43. Taesook Heang. Detection and typing of human papillomavirus DNA by PCR using
consensus primers in various cervical lesions of kKorean Women. J Korean Med Sci,1999;
14:593-9
44. Andersson S, Safari H, Mints M, Lewensohn I, Gyllenstein U, Johansson B.Type
distribution, viral load and integration status oh high- risk human papillomaviruses in prestages of cervical cancer (CIN).B J cancer ;2005;92;2195-2200
45. Swan D, Tucker RA, Tortoledo G, Follen M,Wideroff L, Unger E, Nisenbaum R, Reeves
W, Icenogle J.Human Papillomavirus (HPV) DNA copy number is dependent on grade of
cervical disease and HPV type. J Clin Microb;1999;37(4):1030-1034
46. Piña-Sanchez P, Hernández-Hernández D, López-Romero R, Vazquez-Ortiz G, PerezPlasencia C, Lizano-Soberon M, Gonzalez-Sanchez J, Cruz-Talonias, Salcedo M. Human
Papillomavirus-specific viral types are common in Mexican women affected by cervical
lesions. Int J Gynecol Cancer.2006:16:1041-1047
47. Tamayo_acevedo L, asociación y predicción del riesgo de lesiones intraepitelial escamosa
y cancer cervicouterino en función de los factores: infección por el virus del papiloma
52
humano ginecoobstetricios, comportamiento sexual, sociodemograficos y antecedentes
genéticos em mujeres mayores de 15 años. Estado de Colima, México, 2002.Tesis
Doctoral:2002
48. Hernández-Hernández D, García-Carranca A, González-Sánchez J, Muñoz S. Virus de
papiloma humano de alto riesgo (VPH-AR) y neoplasia intraepitelial cervical (NIC) en
mujeres de dos hospitales de la ciudad de México. Rev Invest Clín 2002;Vol 54 (4):299306
49. MacKay I, arden K, Nitsche A. Real-Time PCR in virology. Nucleic acids research, 2002,
Vol 30(6); 1292-1305
50. Villa LL, Schelgel R. Differences in transformatiom activity between HPV-18 and HPV16 map tp the viral LCR-E6-E7 region. Virology. 1991;181(1):374-7
51. Willard B, Delgado G, Kurgan R, Petrilli E, Smith D, Ahmed S, Lorincz A, Temple G,
Bennet J, Lancaster W. Possible prognosis significance of the human papillomavirus type
in cervical cancer.1987.
52. Barbosa MS, Schlegel R. The E6 and E7 genes of the HPV-18 are sufficient for inducing
two-stage in vitro transformation of human keratinocytes. Oncogene.1989;4(12):1529-32
53. Steger G, rehtanz M, Schnabel C. identification of a promoter in position 56 within the
long control region of human papillomavirus type 18.Arch Virol. 2001;146:2069-2084
54. Kurgan RJ, Schffman MH, Lancaster WD, reid R, Jenson AB, Temple GF, Lorincz AT.
Analysis of individual human papillomavirus types in cervical neoplasia: a possible role
for type 18 in rapid progression. Am J Obstet Gynecol. 1988; 159(2):293-6.
53
ANEXOS
54
ANEXO 1. CALCULOS PARA LA PREPARACIÓN DE LAS CURVAS ESTANDARES
VPH-16
Peso Molecular de una molécula de ADN = (No. de pares de base) x (650 daltons/pares de base)
PM = (80 pb) x (650 daltons/pb)= 52 000 Daltons
Moles Finales de una Molécula de ADN= 2 X (gramos de ADN) / (PM en daltons)
1 x 10-9 gr
1 ng
= 6.6 x 10-8 gr
66 ng
Moles = 2 x (6.6 x 10-8 gr)
52 000 Daltons
= 2.53 x 10-12 moles
1 mol = 6.023 x 1023 moléculas
6.023 x 1023moléculas
1 mol
2.53 x 10-12
= 1.52 x 1012 moléculas /ul de ADN
VPH-18
Peso Molecular de una molécula de ADN = (No. de pares de base) x (650 daltons/pares de base)
PM = (78 pb) x (650 daltons/pb)= 50 700 Daltons
Moles Finales de una Molécula de ADN= 2 X (gramos de ADN) / (PM en daltons)
1 x 10-9 gr
1 ng
= 5.3 x 10-8 gr
53 ng
Moles = 2 x (5.3 x 10-8 gr)
52 000 Daltons
= 2.09 x 10-12 moles
1 mol = 6.023 x 1023 moléculas
6.023 x 1023moléculas
1 mol
2.09 x 10-12 moles
= 1.52 x 1012 moléculas /ul de ADN
55
HMBS
Peso Molecular de una molécula de ADN = (No. de pares de base) x (650 daltons/pares de base)
PM = (121 pb) x (650 daltons/pb)= 78 650 Daltons
Moles Finales de una Molécula de ADN= 2 X (gramos de ADN) / (PM en daltons)
1 x 10-9 gr
1 ng
= 5.9 x 10-8 gr
59 ng
Moles = 2 x (5.9 x 10-8 gr)
78 650 Daltons
= 1.50x 10-12 moles
1 mol = 6.023 x 1023 moléculas
6.023 x 1023moléculas
1 mol
1.50 x 10-12 moles
= 9.03 x 1011 moléculas /ul de ADN
De esa manera y a partir de las concentraciones anteriores se prepararon diluciones de 108
a 102 copias tanto para VPH-16, VPH-18 así como de HMBS. Obteniendose las
curvas
estándares.
HMBS
Figura 5. Curva Estándar para el HMBS. Muestra la curva obtenida de diluciones 10 8-102 referente a Homo
Sapiens Hydroxymethylbilane synthase. Muestra una eficiencia de 1.87 (eficiencia optima 1.8-2.0).
56
VPH-16
Figura 6. Curva Estándar para VPH 16. Muestra la curva obtenida de diluciones 10 8-102 correspondiente a Virus
del Papiloma Humano tipo 16. Muestra una eficiencia de 1.86 (eficiencia optima 1.8-2.0).
VPH-18
Figura 7. Curva Estándar para VPH 18. Muestra la curva obtenida de diluciones 108-102 correspondiente a Virus del
Papiloma Humano tipo 18. Muestra una eficiencia de 1.99 (eficiencia optima 1.8-2.0).
57
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA. CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN
BIOMÉDICA
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
ANEXO 2.
IDENTIFICACIÓN-ENCUESTA.
Nombre del encuestador: ____________________________________________ Fecha: ________________
I. Nombre de la paciente: ______________________________________________ Edad: _______________
Afiliación: _______________________________________ No. Consultorio _______ Turno M ( ) V ( )
Domicilio: _______________________________________ Colonia: _________________________________
C.P. ________________ Municipio: __________________________ Estado: ___________________________
Ocupación: _______________________________________ Estado Civil: S ( ) C ( ) UL ( ) D ( ) V ( )
II. SINTOMATOLOGÍA: marque con una X
(1) ASINTOMÁTICA (2) DOLOR PÉLVICO (3) SANGRADO GENITAL ANORMAL (4) SANGRADO
POSTCOITO
(5)
FLUJO
(6)
DISPAREUNIA
(7)
CITOLOGÍA
ANORMAL
(8)
OTRO:
_______________________________
III. CÉRVIX (al momento de la toma de la muestra con citocepillo y/o biopsia):
9.- LEUCORREA SI ( ) NO ( ) 10.- ASPECTO: (a) sano (b) congestivo/inflamatorio (c) ectoprión
(d) pseudoerosión (e) leucoplaquia (f) mosaico (g) puntilleo (h) otro: _________________________
11.- SANGRA a la toma con citocepillo: SI ( ) NO ( )
IV. FACTORES DE RIESGO:
12.- ESCOLARIDAD: (1) analfabeta (2) primaria (3) secundaria (4) técnica (5) universitario (6) otro: _______
13.- A que edad inició relaciones sexuales? ________
14.- Cuántas parejas sexuales ha tenido durante toda su vida: ______
15.- Cuántas parejas sexuales ha tenido el último año: _______
16.- Con que frecuencia ha tenido relaciones sexuales el último año? 1) diario 2) cada tercer día 3) 2 o 3
veces por semana 4) cada semana 5) cada 15 días 6) cada mes 7) ocasional 8) sin relaciones
17.- ANTECEDENTES OBSTÉTRICOS: G ___ P ___ A ____ C ___ EDAD PRIMER HIJO: ________ FUP
_______
FUA _____ FUC ______ EDAD MENARCA: ______ EDAD MENOPAUSIA: _____ FUM ________
18.- Antecedentes familiares CaCU: 1) Madre 2) Abuela materna 3) Hermana 4) Tía materna 5) Otra: ______
6) Otro tipo de cáncer:
19.- Que métodos ANTICONCEPTIVOS ha usado en toda su vida? 1) Hormonales cuanto tiempo: _____
2) DIU cuánto tiempo _________ 3) Barrera 4) OTB/Vasectomía 5) Otros _______________________
20.- Enfermedades de transmisión sexual (ETS): SI ( ) cuál: _________________________________ NO ( )
21.- Fuma o fumó: NO ( ) SI ( ) Cuántos cigarrillos fuma al día? _____ A que edad comenzó a fumar? _____
a que edad dejó de fumar? _______ FUMADORA PASIVA: NO ( ) SI ( ) por cuánto tiempo? __________
V. EXÁMENES, DIAGNÓSTICOS Y RESULTADOS:
22.- Se ha realizado citologías anteriores a esta? NO ( ) SI ( ) Cuántas? ________ FUDOC _______________
23.- Ha tenido tratamientos vaginales anteriores? NO ( ) SI ( ) hace cuanto? FUTto. ____________________
Óvulos/cremas vaginales ____ Conización ________ Electrocauterización _______ Congelación _________
Biopsia _________ Otro: __________________________________________________________________
24.REPORTE
POR
CITOLOGÍA:
____________________
REPORTE
POR
COLPOSCOPÍA:
__________________
25.- REPORTE POR BIOPSIA: _______________________________________________________________
58