ivan dario castro miller -20655500

MÉTODO DE MEDICIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE MEDIANTE LUZ
INFRARROJA
IVÁN DARÍO CASTRO MILLER
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE OCCIDENTE
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE AUTOMÁTICA Y ELECTRÓNICA
PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA
SANTIAGO DE CALI
2011
1
MÉTODO DE MEDICIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE MEDIANTE LUZ
INFRARROJA
IVÁN DARÍO CASTRO MILLER
Pasantía de Investigación para optar al título de
Ingeniero Biomédico
Director
FARUK FONTHAL RICO
Ingeniero Electrónico, Magíster en Tecnología electrónica y Doctor en
Ingeniería Electrónica.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE OCCIDENTE
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE AUTOMÁTICA Y ELECTRÓNICA
PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA
SANTIAGO DE CALI
2011
2
Nota de aceptación:
Aprobado por el Comité de Grado
en cumplimiento de los requisitos
exigidos
por
la
Universidad
Autónoma de Occidente para optar
al título de Ingeniero Biomédico
FARUK FONTHAL RICO
______________________________
Director
Santiago de Cali, 25 de Julio de 2011
3
CONTENIDO
RESUMEN
13
INTRODUCCIÓN
14
1. OBJETIVOS
16
1.1.
OBJETIVO GENERAL ................................................................................. 16
1.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 16
2. ANTECEDENTES
17
3. MARCO TEÓRICO
22
3.1.
METABOLISMO DE LA GLUCOSA Y SUS COMPLICACIONES ............... 22
3.2.
LA LUZ Y SU INTERACCIÓN CON LA MATERIA ...................................... 27
4. METODOLOGÍA
30
4.1.
OPERACIONALIZACION DE VARIABLES ................................................. 30
4.2.
ETAPAS DEL PROYECTO .......................................................................... 32
4.3.
DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................... 34
4.3.1.
Espectroscopía IR para D-glucosa diluida en agua ultrapura.
34
4.3.2.
Espectroscopía IR para D-glucosa en matriz de plasma.
36
4.3.3.
Espectroscopía IR para D-glucosa en matriz de sangre entera.
38
4.3.4.
Barrido espectroscópico.
40
4.4.
PROCESAMIENTO Y RESUMEN DE DATOS ............................................. 43
4.4.1.
Suavizado de la señal cruda mediante filtros digitales.
43
4.4.2.
Promediado de espectros.
44
3
4.4.3.
4.5.
Corrección de la línea base de la señal filtrada.
45
IDENTIFICACIÓN DE REGIONES Y LONGITUDES DE ONDA .................. 47
4.5.1.
Criterio de la varianza y Factor de Mérito (FM).
47
4.5.2.
Aproximación indirecta, métrica de la Información Mutua (IM).
48
4.5.3.
Combinación entre variables individuales y set de variables.
49
4.6.
REGRESIÓN Y VALIDACIÓN DE LOS MODELOS..................................... 52
4.6.1.
Regresión lineal simple.
52
4.6.2.
Regresión de de componentes principales (PCR).
53
4.6.3.
Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales (PLSR).
53
5. RESULTADOS
54
5.1.
ESPECTROSCOPÍA IR EN MUESTRAS DE D-GLUCOSA DILUIDA EN AGUA
ULTRAPURA.......................................................................................................... 54
5.1.1.
Espectros NIR.
54
5.1.2.
Espectros MIR.
56
5.2.
ESPECTROSCOPÍA IR EN MUESTRAS DE PLASMA ............................... 58
5.2.1.
Espectros NIR.
58
5.2.2.
Espectros MIR.
58
5.3.
5.3.1.
ESPECTROSCOPÍA IR EN MUESTRAS DE SANGRE ............................... 59
Espectros NIR.
59
5.4.
PROCESAMIENTO DE DATOS ................................................................... 60
5.5.
MODELOS DE PREDICCIÓN....................................................................... 61
4
5.5.1.
Construcción de los modelos.
61
5.5.2.
Validación de los modelos.
65
6. CONCLUSIONES
71
7. RECOMENDACIONES
73
BIBLIOGRAFÍA
74
ANEXOS
78
5
LISTA DE CUADROS
pág.
Cuadro 1. Operacionalización de variables
31
Cuadro 2. Etapas del proyecto
32
Cuadro 3. Etapas del proyecto (Continuación)
33
Cuadro 4.
Volúmenes Vi para la preparación de las mezclas DGA.
36
Cuadro 5.
Volúmenes Vi para la preparación de las mezclas DGP (plasma)
38
Cuadro 6.
Volúmenes Vi para la preparación de las mezclas DGS (sangre)
Cuadro 7.
Parámetros a configurar para el barrido espectroscópico
40
41
Cuadro 8.
Algoritmo de cálculo del factor de mérito de un set de espectros.
48
Cuadro 9.
Selección de modelos con mejores resultados para la región MIR
68
Cuadro 10.
Selección de modelos con mejores resultados para la región NIR
69
Cuadro 11. Estadísticas Espectro DGA NIR
89
Cuadro 12. Estadísticas Espectro DGA MIR 1
89
Cuadro 13. Estadísticas Espectro DGA MIR 2
90
Cuadro 14. Estadísticas Espectro Plasma MIR Sujeto A
90
6
Cuadro 15. Estadísticas Espectro Plasma MIR Sujeto B
91
Cuadro 16. Estadísticas Espectro Plasma NIR Sujeto A
91
Cuadro 17. Estadísticas Espectro Plasma NIR Sujeto B
92
Cuadro 18. Estadísticas Espectro Sangre MIR Sujeto A
92
Cuadro 19. Estadísticas Espectro Sangre MIR Sujeto B
93
Cuadro 20. Estadísticas Espectro Sangre NIR Sujeto A
93
Cuadro 21. Estadísticas Espectro Sangre NIR Sujeto B
94
7
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Niveles diagnósticos de la DM
8
25
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1.
Proceso de generación y consumo de glucosa en el cuerpo
humano.
23
Figura 2. Interacción de la luz con la materia.
28
Figura 3. Filtrado Savitzky-Golay para espectroscopía.
44
Figura 4.
Procedimiento para el ranking de variables utilizando la
Información Mutua.
50
Figura 5.
Procedimiento para la selección de variables utilizando la
Información Mutua.
51
Figura 6.
Espectros de referencia de muestras de agua pura en la región
NIR.
55
Figura 7. Espectros de estabilidad en la región NIR.
56
Figura 8. Señales de referencia en la región MIR.
57
Figura 9.
Pruebas de estabilidad y alta concentración en la región MIR.
58
Figura 10.
Espectros de sangre en la región NIR para diferentes caminos
ópticos.
59
Figura 11.
Información Mutua para un set de datos en la región NIR.
60
Figura 12. Factor de Mérito para un set de datos en la región NIR.
61
Figura 13.
62
9
Selección de longitudes de onda principales de acuerdo a la
Información Mutua.
Figura 14.
Selección de regiones a partir de las longitudes de onda con
mayor Información Mutua.
63
Figura 15.
Selección de regiones a partir de las longitudes de onda con
mayor Factor de Mérito.
64
Figura 16.
Respuesta del modelo de regresión PLS, a partir de regiones de
señales de plasma con corrección de modelado lineal LDT.
66
Figura 17. Espectro DGA NIR
78
Figura 18. Espectro DGA MIR 1
79
Figura 19. Espectro DGA MIR 2
80
Figura 20. Espectro Plasma MIR Sujeto A
81
Figura 21. Espectro Plasma MIR Sujeto B
82
Figura 22. Espectro Plasma NIR Sujeto A
83
Figura 23. Espectro Plasma NIR Sujeto B
84
Figura 24. Espectro Sangre MIR Sujeto A
85
Figura 25. Espectro Sangre MIR Sujeto B
86
Figura 26. Espectro Sangre NIR Sujeto A
87
Figura 27. Espectro Sangre NIR Sujeto B
88
Figura 28. Identificación de regiones DGA MIR
95
Figura 29. Identificación de regiones PSM MIR
96
Figura 30. Identificación de regiones SNG MIR
97
Figura 31. Identificación de regiones DGA NIR
98
10
Figura 32. Identificación de regiones PSM NIR
99
Figura 33. Identificación de regiones SNG NIR
100
11
LISTA DE ANEXOS
Pag.
Anexo A. Espectros filtrados y sin outliers
78
Anexo B. Cuadros de validación de los modelos de predicción
89
Anexo C.
Identificación de regiones a partir de modelos con menor RMSECV
95
12
RESUMEN
En la actualidad existen más de 40 dispositivos para medición de glucosa de
forma portable. Sin embargo, estos son de carácter invasivo, e implican una
punción para la extracción de pequeñas muestras de sangre, lo cual además de
ser doloroso puede desencadenar infecciones y otras complicaciones de las
patologías que involucran este tipo de medida.
En la búsqueda de dispositivos menos invasivos, se ha trabajado en el desarrollo
de prototipos como el GlucoWatch G2 Biographer, el cual hace uso de principios
de iontoforesis reversa, y otros de monitoreo continuo como el Minimed Medtronic
y el GluCatch, siendo estos últimos implantados en diferentes áreas del cuerpo.
Diferentes estudios han identificado la espectroscopía IR como potencial técnica
de medición no invasiva de glucosa. A nivel nacional, los estudios de Vargas y
colaboradores han identificado longitudes de onda en las regiones NIR y MIR del
espectro que pueden estar relacionadas con la concentración de la molécula.
En este documento se presenta un análisis cuantitativo de la medición de glucosa
en muestras de diferente complejidad con el fin de identificar las características de
procesamiento y regresión óptimas para la medición de glucosa en sangre. Se
realizan barridos espectroscópicos de las regiones NIR y MIR, en muestras de Dglucosa en matrices de agua, plasma y sangre entera.
Se utilizan técnicas de filtrado y corrección de línea base como procesamiento
inicial de los espectros. Para la identificación de longitudes de onda y regiones
óptimas, se hace uso de la Información Mutua y el Factor de Mérito; dos índices
que permiten estimar la importancia de cada una de las variables de predicción en
relación a las concentraciones de las muestras.
Mediante la utilización de regresión lineal, regresión de mínimos cuadrados (PLS)
y regresión de componentes principales (PCA) se obtienen modelos de
calibración. Se calculan los errores cuadráticos medios de calibración (RMSEC),
de predicción (RMSEP), y de validación cruzada (RMSECV). Se hace uso de este
último para la identificación de los mejores modelos y técnicas, y se identifican las
regiones que contienen longitudes de onda comunes para los modelos con menor
RMSECV.
13
INTRODUCCIÓN
La glucosa es el principal carbohidrato presente en el cuerpo humano; este
monosacárido cumple diversas funciones, participa en muchas de las reacciones
químicas que se llevan a cabo en el proceso metabólico, y es por lo tanto la
principal fuente de energía para los procesos biológicos.
La alta importancia de la D-glucosa en el metabolismo, en la salud y vida de los
seres humanos, exige que las patologías e irregularidades que la involucren
tengan una atención importante por parte de investigaciones biomédicas, con el
fin de mejorar la calidad de vida de personas con estas condiciones. Uno de los
aspectos importantes radica en conocer los niveles de glucosa en sangre;
parámetro principal que indica la disponibilidad de la molécula para su uso en las
reacciones y sistemas de producción de proteínas.
Las personas con alteraciones de los niveles de glucosa necesitan de una
constante medición de los mismos, con el fin de conocer su estado actual,
prevenir posibles alteraciones mayores, y realizar un control mediante la ingesta o
inyección de medicamentos, suplementos, o simplemente un cambio en la
alimentación.
Estas alteraciones incluyen diabetes mellitus, hipoglucemia e hiperglucemia, y
pueden implicar riesgo coronario e hipertensión arterial. La diabetes mellitus es la
patología de mayor cuidado y necesidad de una medición continua de glucosa en
sangre, para su control mediante inyección de insulina y una dieta adecuada.
Los pacientes que padecen diabetes mellitus, se ven obligados en la actualidad a
realizar chequeos periódicos de sus niveles de glucosa en sangre con una
periodicidad mínima de entre 3 y 5 veces al día. Esto mediante la utilización de
glucómetros convencionales que utilizan una muestra de sangre, para lo cual
deben realizar molestas punciones en la yema de los dedos; práctica dolorosa e
incómoda que daña los tejidos y aumenta los riesgos de infección en estas
personas.
Esta problemática de la utilización de técnicas invasivas junto con la necesidad de
la obtención de estas mediciones en personas con alteraciones en glicemia, han
llevado a realizar estudios acerca de diferentes técnicas para mediciones no
invasivas, indoloras, cómodas y prácticas para el usuario.
14
En la actualidad, la más aceptada científicamente es la espectroscopia, que
analiza la absorción de la luz por las moléculas, y busca predecir compuestos de
la solución analizada. La viabilidad de esta técnica parte de las características de
los enlaces de la molécula, los cuales responden a las vibraciones de longitudes
de onda específicas en el espectro IR. Esta técnica óptica ha sido ampliamente
estudiada con el fin de determinar la respuesta de la D-glucosa a diferentes
emisiones en el espectro electromagnético, obteniendo como conclusión la
posibilidad de mejorar este tipo de métodos para su aplicación clínica.
Sin embargo, las investigaciones discrepan en el protocolo técnico a ser utilizado,
y en la región del espectro infrarrojo más adecuada. Se identifican longitudes de
onda diferentes para obtener una respuesta significativa que pueda indicar los
niveles de glucosa en sangre, y procedimientos que tienen variaciones
significativas para aplicaciones prácticas de una medición no invasiva.
Estas diferencias técnicas y metodológicas entre los resultados de las diferentes
investigaciones no han permitido el desarrollo de un dispositivo completamente no
invasivo mediante técnicas de espectrofotometría en la región infrarroja. Esto
hace necesario llevar a cabo estudios in-vitro que incluyan diferentes técnicas de
procesamiento de señales, para que una vez establecidas las características del
sistema de medida se realicen pruebas similares utilizando potenciales
interferentes, y pruebas in-vivo en sujetos sanos y con diabetes mellitus.
La presente investigación determina algunas características para un método de
medición mediante técnicas ópticas que utilicen luz infrarroja, lo cual permitirá el
posterior diseño y construcción de dispositivos que lo utilicen. Esto con el fin de
iniciar pruebas que proporcionen herramientas para un diseño más confiable que
permita una lectura de los niveles de glucosa en sangre sin necesidad de la
extracción de una muestra.
Los resultados de esta investigación serán un aporte a los estudios realizados
hasta ahora a cerca de las longitudes de onda óptimas a ser utilizadas en el
infrarrojo y el protocolo utilizado para obtener mediciones de este tipo.
De esta forma se aclararán aspectos necesarios y se brindarán herramientas
útiles que serán utilizadas por investigadores que decidan trabajar en el campo
del diseño de dispositivos de medición de ésta molécula en la sangre humana de
forma no invasiva.
15
1. OBJETIVOS
1.1.
OBJETIVO GENERAL
Determinar las características de un método que permita la medición de glucosa
en sangre mediante luz infrarroja y que pueda ser utilizado en posteriores
investigaciones orientadas hacia el diseño de dispositivos no invasivos.
1.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Realizar una revisión bibliográfica de los estudios de métodos no invasivos
basados en Infrarrojo Medio (MIR), e infrarrojo cercano (NIR) para la
determinación de glucosa en sangre.
•
Diseñar el protocolo experimental para estructurar los modelos de calibración,
y la metodología de validación a utilizar.
•
Construir modelos de calibración a partir de la selección de las longitudes de
onda óptimas dentro del espectro infrarrojo para la medición de glucosa en
sangre.
•
Validar los modelos de calibración e identificar las características del método
óptico optimo para la medición no invasiva de glucosa.
16
2. ANTECEDENTES
Los esfuerzos científicos para la medición de glucosa en sangre de los pacientes
con diabetes mellitus permitieron el desarrollo de sensores y dispositivos de
medición que fueron mejorados hasta llegar a los equipos portables que se
comercializan en la actualidad.
Inicialmente las mediciones se realizaban mediante reacciones químicas con la
orina, la cual es una medida viable, pero no sustituye las medidas en sangre
debido a sus numerosas limitaciones. Mediciones más acertadas se realizaban a
partir de bandas colorimétricas que cambiaban de tonalidad al contacto con la
sangre. Sin embargo, estas requerían de equipos adicionales de detección de
color que hacían el proceso más largo y no permitían la portabilidad de los
sistemas de medida.
El desarrollo de biosensores entre 1956 y 1975 permitió realizar mediciones a
partir de la oxidación de la glucosa. Éste método consiste en la utilización de una
muestra de sangre, para que la molécula sea oxidada y el peróxido de hidrógeno
producido en la reacción sea medido de forma amperométrica.
En la actualidad existen más de 40 dispositivos invasivos para medición de
glucosa de forma portable, comercializados en su mayoría por 4 laboratorios.
Estos equipos tienen variaciones orientadas hacia la practicidad de las
mediciones y la comodidad de los pacientes; pero se basan en métodos
electroquímicos muy similares que fueron inspirados por el desarrollo de los
primeros biosensores.
Las investigaciones para mejorar la calidad de vida de las personas que sufren de
diabetes mellitus, han llevado al desarrollo y comercialización de dispositivos
integrados, que incluyen la lanceta de punción y las tiras de análisis en el mismo
equipo portable. Esto permite una punción que no alcanza los nervios del dedo, y
evita la manipulación de accesorios adicionales presentes en la mayoría de las
versiones comerciales, realizando toda la operación mediante un botón.
Otros desarrollos más avanzados han iniciado la construcción de prototipos
mínimamente invasivos, como el GlucoWatch G2 Biographer. Este dispositivo en
forma reloj utiliza principios de iontoforesis reversa para obtener muestras de
glucosa del fluido intersticial y realizar una estimación de la glucosa en sangre.
17
Revisiones a cerca del tema indican que a pesar de la aproximación que brinda
este dispositivo mínimamente invasivo, necesita de un periodo de
precalentamiento de 3 horas y es posible obtener mediciones únicamente cada 20
minutos. De igual forma es necesaria una calibración mediante punción cada 12
horas y presenta algunas fallas debido a cambios de temperatura, sudoración o
campos electromagnéticos, generando en ocasiones irritaciones en la piel.
Algunos acercamientos a mediciones de monitoreo continuo (CGM) son el
Minimed Medtronic y el GluCatch, los cuales son insertados en el área abdominal
para medición en el fluido intersticial, y en un vaso sanguíneo para medición
directa en sangre respectivamente.
El GluCatch hace uso de espectrofotometría para detectar los cambios en el color
de un hidrogel fluorescente que responde a las concentraciones de ésta molécula.
Por su parte, el Minimed Medtronic utiliza las técnicas electroquímicas estándar
de detección de glucosa; sin embargo, realiza un registro continuo durante 3 días
sin posibilidad de visualización de los datos, y debe ser calibrado con técnicas
estándar después de este periodo.
En la actualidad se está desarrollando un sensor para ser implantado basado en
mediciones espectroscópicas en la región infrarroja, que serían enviadas a un
dispositivo externo y cuya duración de funcionamiento sería de 5 años. Este
desarrollo ha identificado algunos inconvenientes en la medición espectroscópica
como la intervención de otras sustancias en la medición y la pérdida de energía
lumínica en los tejidos.
A partir de estos desarrollos, y de las investigaciones adelantadas por los
diferentes laboratorios se han realizado múltiples estudios. Estos han indicado
que de las diferentes técnicas no invasivas, la más aceptada en el ambiente
científico es la espectroscopia.
Teniendo en cuenta diferentes conceptos de la interacción entre la luz y la
materia, como lo son la absorbancia, la reflectancia, la transmitancia y la
dispersión; se han sugerido medidas de estos parámetros. Los tres primeros
índices de interacción con una mayor participación en las mediciones, debido a su
relación matemática establecida.
Se han sugerido mediciones de dispersión de la luz incidente, sin indicar
longitudes de onda en particular, y estableciendo mediante pruebas en la región
18
abdominal de pacientes, que el coeficiente de dispersión en las regiones visible y
NIR del espectro, tiene una relación inversa con la concentración de glucosa en
fluidos extracelulares.
Otros estudios han sugerido diversas técnicas y regiones en el espectro infrarrojo
para realizar la medición de forma no invasiva. Modelos de calibración y teoría
estadística han sido herramientas claves para obtener una predicción con la
mayor precisión y exactitud posible.
De forma particular se identifican las bandas de absorción de la glucosa en las
regiones 2801 nm - 3205 nm (Enlace O-H), 3241 nm - 3311 nm (Enlace C-H),
8130 nm - 10000 nm (Enlace C-O), y 7843 nm - 12500 nm (Enlace C-O-C).
Estudios experimentales indican que los mayores picos de absorción de la
glucosa se encuentran en la región MIR, y es esta la razón para que sea la región
utilizada en análisis clínicos. Sin embargo, también es conocido que ésta región
es altamente absorbida por los tejidos y el agua presente en los mismos; lo cual
hace que penetre solamente unos pocos micrómetros en el medio biológico, e
implica un limitante para las mediciones no invasivas en esta región del espectro.
A pesar de esto, algunos de los acercamientos han persistido en la utilización de
longitudes de onda en la región MIR, con resultados que indican la existencia de
una correlación entre la concentración de glucosa y la señal obtenida.
En el año 1999, el Dr. Petibois y colaboradores realizaron una exploración de la
región MIR entre 7692 nm y 10928 nm, en la que muestras secas de plasma
sanguíneo de 32 sujetos fueron analizadas para validar una calibración realizada
a partir de un set de soluciones de glucosa en agua, y otro que incluía adiciones
de plasma.
Esta investigación permitió identificar que los cambios en la concentración de
glucosa de las muestras del set de validación tenían una mayor respuesta en la
región que responde al enlace C-O (8130 nm -10000 nm). Además, que la
diferencia más alta que no se veía influenciada por otras hexosas que fueron
analizadas en esta región se encontraba en el pico de los 9680 nm. Se identificó
una alta correlación (0,997) en los modelos de calibración, y al utilizar el pico
identificado para la predicción, la validación arrojó una correlación de 0,998.
A pesar de los acertados resultados en mediciones en plasma seco, se identifica
que las medidas de transmitancia en sangre entera o plasma en estado líquido
presentan dificultades en la región MIR debido a la absorción de agua en las
matrices con estas características.
19
Por otro lado, estudios en la región NIR han encontrado que a pesar de la
disminución de los coeficientes de absorción de la glucosa para estas longitudes
de onda, las interferencias que se presentaban en MIR disminuyen
considerablemente. Esto debido a una menor absorción por parte de los tejidos y
el agua, que permite una mayor penetración del haz incidente y la obtención de
mayor información de los niveles de glucosa en sangre.
El Dr. Araujo y colaboradores, utilizaron medidas de reflectancia en 3 pacientes
realizando un barrido en el espectro NIR para obtener respectivamente el modelo
de calibración y validar las predicciones de los niveles de glucosa. En este estudio
se obtuvieron resultados satisfactorios, con un coeficiente de correlación de 0,74 y
un error cuadrático medio (ECM) de 16 mg/dl. A pesar de que se concluyó que
estos resultados aun no permitían mediciones clínicas, el ECM fue inferior a
reportes anteriores.
Otras aproximaciones como las del Dr. Pulenta y colaboradores sugieren la
identificación de una longitud de onda particular para realizar el estudio,
considerando el armónico de la vibración C-H a 1688 nm. En este estudio se
desarrolla el sistema de emisión y detección, y se evalúan diferentes
configuraciones electrónicas que indican que el camino óptico para la medida de
la transmitancia puede ser modificado configurando adecuadamente la potencia
del sistema de emisión. A pesar de que no se realiza un procedimiento de
calibración ni validación respecto a medidas estándar, este estudio se encuentra
orientado a identificar las configuraciones óptimas que brinden una mayor
precisión en medidas repetitivas, y utiliza una solución simuladora de tejido que se
acerca más a lo que sería una medición in vivo.
Aproximaciones más avanzadas han realizado el estudio de sus prototipos in vivo
con cantidades considerables de sujetos de estudio. El Dr. Gabriely y
colaboradores realizaron un análisis en el espectro NIR de la respuesta de
transmitancia del dedo de 10 sujetos sanos y 2 con diabetes mellitus, obteniendo
unos coeficientes de correlación entre 0,94 y 0,96, con errores entre 2 y 4 mg/dl.
En un intento por determinar la influencia de otros componentes sanguíneos en el
espectro infrarrojo tanto en las regiones MIR como NIR, se realizó un completo
estudio que identificó los picos de absorción de la glucosa en MIR (7153, 7656,
8643, 9049, 9242 y 10070) nm y la hemoglobina en la misma región (7142, 7668 y
9049) nm. Al validar diferentes sets de calibración que consideraban los picos
anteriores, se obtuvo un menor error para los modelos obtenidos a partir de la
región comprendida entre 8936 nm y 9784 nm, correspondiente a un SEC de 10,8
mg/dl y un r de calibración de 0,9967.
20
Para el análisis en la región NIR, se evidenció una alta correlación entre el
espectro obtenido y los niveles de hemoglobina en sangre. Ellos obtuvieron un
menor error para la calibración obtenida en la región entre 1390 nm - 1888 nm y
2044 nm -2392 nm, correspondiente a un SEC de 21,6 mg/dl y un r de calibración
de 0,9847.
La sangre está compuesta en un 40% por hemoglobina; por lo tanto este estudio
realizó sets de calibración con diferentes composiciones de esta proteína. Se
dividieron muestras para este proceso con niveles bajos, medios y altos de la
misma y uno adicional que comprendía el rango completo de su concentración. El
resultado tanto para la región NIR como para la MIR, arrojó que el error de
predicción aumentaba si el modelo se realizaba con un set de calibración con
concentraciones en rangos diferentes que el set de validación. Esto les permitió
concluir que el set de calibración debería comprender todo el rango de
concentración de la proteína para reducir los errores que variaciones en las
muestras de validación pudieran ocasionar.
Las diferentes técnicas presentadas por las aproximaciones científicas, indican
que es necesario realizar estudios que permitan finalmente identificar las regiones
a ser utilizadas en una medición no invasiva, y evaluar muestras de sujetos que
permitan tener el rango fisiológico de la glucosa en sangre. De igual forma se
indica que los modelos de calibración deben incluir cada vez más variables de
confusión, y que las reacciones de la piel con la radiación deben ser ampliamente
estudiadas, para garantizar una medida adecuada.
El presente proyecto de investigación propone por lo tanto un estudio en las
regiones MIR y NIR, que permita evidenciar las características de un método de
medición de glucosa en sangre mediante luz infrarroja. Este podrá ser utilizado
por los investigadores para iniciar diseños posteriores de dispositivos de medición
no invasiva que podrían ser evaluados in vivo.
21
3. MARCO TEÓRICO
3.1.
METABOLISMO DE LA GLUCOSA Y SUS COMPLICACIONES
La importancia de la D-glucosa presente en el cuerpo humano radica en sus
múltiples funciones para el proceso de soporte de la vida. Este monosacárido es
la forma de transporte de los carbohidratos que utiliza el cuerpo para la
producción de energía, y cumple un papel importante en la síntesis de proteínas y
en el metabolismo a nivel general.
Debido a su papel fundamental en el metabolismo humano, existe un completo
sistema de regulación de la glucosa en sangre que permite a las células de todo
el cuerpo recibir esta molécula para generar energía de acuerdo a las
necesidades particulares.
Existen tres fuentes principales de glucosa en el cuerpo humano: la absorción
intestinal (consumo de alimentos), la glicogenolisis, y la gluconeogenesis. Estas
últimas dos fuentes son producto de procesos hepáticos, y son denominadas
producción endógena de glucosa; la primera de ellas corresponde al rompimiento
del glucógeno (forma de almacenamiento de la glucosa).
Por su parte, la gluconeogenesis es la producción de glucosa desde el hígado a
partir de aminoácidos, glicerol, y algunos residuos de la oxidación de la glucosa
como el lactato y el piruvato. Estas fuentes endógenas de glucosa en sangre se
encuentran reguladas por la hormona Glucagon, sintetizada por células alfa
presentes en el páncreas.
El consumo de glucosa por parte de los tejidos se da gracias a los
transportadores de esta molécula, los cuales permiten su paso a través de la
membrana celular a favor o en contra de un gradiente de concentración,
dependiendo del tipo de transportador, según sea dependiente de Na+ (SGLT: En
contra del gradiente), o independiente del mismo (GLUT: A favor del gradiente).
Los transportadores GLUT, existen en diversas configuraciones, de acuerdo a su
funcionamiento particular y ubicación en el cuerpo. Sin embargo, la mayoría de
los transportadores de glucosa cambian su habilidad de ingresar glucosa a la
célula en respuesta a la concentración de la hormona insulina, secretada por las
22
células beta presentes en el páncreas. Se indica que la insulina tiene efectos
opuestos a los del glucagon.
El consumo corporal de glucosa comprende en un 55 % la oxidación de la misma
por parte de los diferentes tejidos para la producción de energía; un 20 % resulta
en glucolisis, y el restante 25 % es utilizado en almacenamiento por el hígado y
otros tejidos. Los procesos de consumo como la oxidación y la glucolisis son la
fuente principal de lactato y piruvato para el proceso de gluconeogenesis en
situaciones de hipoglicemia. En la figura 1 se ilustra el proceso de generación y
consumo de esta importante molécula.
Figura 1. Proceso de generación y consumo de glucosa en el cuerpo humano
Fuente: WEBSTER, Jhon G, RITENOUR E. Russel, TABAKOV Slavik y NG
Kwan-Hoong. Handbook of Optical Sensing of Glucose in Fluids and Tissues
Los niveles de glucosa en sangre se encuentran regulados alrededor de los 80
mg/dl, pudiendo tener oscilaciones entre 60 mg/dl y 110 mg/dl. Esta regulación se
da mediante la secreción de hormonas como la insulina y el glucagon, entre otras
como la amilina, epinefrina, cortisol y la hormona del crecimiento.
Estudios han demostrado que las altas concentraciones de ácidos grasos
bloquean la glucolisis, disminuyen la producción de insulina en respuesta a la
glucosa y generan apoptosis celular; por lo tanto aumentan los riesgos de sufrir
alteraciones de la glucosa en sangre como la diabetes. Este factor, junto con el
efecto que tiene la actividad física en el aumento de los transportadores de
23
glucosa y la sensibilidad de los mismos a la insulina, hace que esta práctica sea
una gran ayuda para este sistema de regulación.
Este sistema de regulación, responde por lo tanto a las condiciones internas y
externas del cuerpo humano, estando también sujeto a la disponibilidad de
oxígeno. En condiciones de hipoxia, el consumo de glucosa del musculo
esquelético es estimulado, y se aumenta la barrera entre la sangre y el cerebro
para el transporte de esta molécula a nivel de las microvesiculas cerebrales.
La insulina, hormona encargada de estimular el consumo de glucosa de los
tejidos, cumple también la función de promover los procesos de glicogénesis
(almacenamiento de glucosa en forma de glicógeno) en el hígado e inhibe la
secreción de glucagon por parte de las células alfa del páncreas y la producción
endógena de glucosa que se lleva a cabo en el hígado. De igual forma cumple
funciones de aumento del flujo sanguíneo, y estimula la producción de Oxido
Nitroso en el endotelio, el cual a su vez puede actuar como regulador del
consumo de glucosa en el musculo esquelético.
La liberación de esta hormona se encuentra directamente relacionada con los
niveles de glucosa en sangre, limitando toda producción de la misma para niveles
por debajo de 59,5 mg/dl. Existen de igual forma otros factores asociados a su
producción, relacionados con compuestos secretados al ingerir alimentos como lo
son los péptidos.
Los niveles de glucosa en sangre, y su regulación a partir de la secreción de
insulina para estimular su transporte a las células de diferentes tejidos en el
cuerpo, juegan un papel fundamental en las características y el funcionamiento
del endotelio. Este tejido cumple diversas funciones, dentro de las cuales se
encuentra un metabolismo activo de la glucosa, y un límite en el transporte desde
el espacio vascular al intersticial.
Las patologías que involucran variaciones de la glucosa en sangre en el cuerpo
humano se deben a alteraciones en el metabolismo y las vías regulatorias y de
absorción. La Diabetes Mellitus (DM) es una de las principales patologías con
estas características, y cobra gran atención debido a su alta prevalencia e
incidencia a nivel mundial. En ella, la secreción de insulina y la sensibilidad de la
misma por los transportadores de glucosa se ven disminuidas, lo cual genera
condiciones de hiperglucemia. Sin embargo, algunos estudios indican que no
solamente las cantidades de esta hormona se ven disminuidas, sino que también
24
se presenta un aumento del glucagón, que inhibe los procesos estimulados por la
insulina.
La medición de glucosa es uno de los principales diagnósticos de la DM. De
acuerdo a lo que se indica en la tabla 1, se identifican niveles que indican una
regulación anormal de la glucosa en sangre (IGR) o la existencia de la patología
descrita. A pesar de las características generales de esta violación del
metabolismo normal de la glucosa, existen dos tipos principales de DM: La tipo 1,
o dependiente de insulina; y la tipo 2, o no dependiente de insulina.
Tabla 1. Niveles diagnósticos de la DM
Fuente: WEBSTER, Jhon G, RITENOUR E. Russel, TABAKOV Slavik y NG KwanHoong. Handbook of Optical Sensing of Glucose in Fluids and Tissues
La principal diferencia entre estos tipos de DM radica en que el primero implica
una deficiencia en la producción de insulina debido a la muerte de las células beta
del páncreas, mientras que el segundo se encuentra relacionado con una
resistencia de los mecanismos de transporte de la glucosa a la insulina, en
combinación con una disminución de producción de la misma. Esto genera que el
tratamiento para cada una de ellas presente algunas diferencias.
La DM tipo 1 debe ser tratada estrictamente mediante inyección de insulina de tal
forma que esta pueda ser absorbida por la sangre. Por su parte, la DM tipo 2, más
abundante entre los pacientes con esta patología, debe tratarse mediante una
dieta balanceada y medicamentos orales, considerando la posibilidad de insulina
inyectada sin que esta sea una necesidad prioritaria.
La falta de tratamiento de pacientes con DM puede generar complicaciones como
hipertensión, micro trombos arteriales, y efectos inflamatorios que afectan la
regulación vascular. De igual forma pueden desencadenarse retinopatías,
catarata,
nefropatía
diabética,
neuropatía,
enfermedades
vasculares
(arterioesclerosis, enfermedad coronaria arterial, etc.), daño en el ADN de las
células endoteliales, y disfunciones de carácter inmune.
25
Los tratamientos de la diabetes deben encontrarse acompañados de un monitoreo
continuo de los niveles de glucosa en sangre, con el fin de garantizar dosis y
estilos de vida adecuados y reducir estas complicaciones. Estas mediciones
pueden realizarse en diferentes fluidos biológicos como sangre, plasma, suero,
liquido intestinal, fluido cerebroespinal, liquido sinovial, saliva, semen, entre otros.
Sin embargo, la medición estandarizada en investigaciones de laboratorio clínico
se realiza en plasma sanguíneo, o en su defecto en sangre entera o capilar. A
pesar de esto, algunas aproximaciones matemáticas permiten estimar los niveles
en sangre a partir de mediciones no tan invasivas como lo son las del fluido
intersticial.
Existen diferentes exámenes que permiten conocer estos valores, que van desde
los de laboratorio hasta los de equipos portables, pasando por los test funcionales
que indican las interacciones reales de los componentes del sistema regulatorio
en el organismo, como lo son los exámenes de carga de glucosa.
A pesar de esto, los exámenes de laboratorio necesitan de muestras de sangre y
no permiten una obtención de los resultados de forma práctica y rápida. Por su
parte, los equipos portables permiten un fácil uso por parte de los usuarios; sin
embargo, siguen siendo técnicas invasivas de medición.
Algunos estudios para el desarrollo de medidores mínimamente invasivos y no
invasivos de glucosa en sangre han propuesto técnicas de iontoforesis reversa,
medición directa en fluido intersticial, medición directa en sangre, y
espectroscopia en diferentes regiones del infrarrojo. Sin embargo, se han
identificado inconvenientes en estas aproximaciones que no han permitido el
desarrollo de un dispositivo confiable de carácter no invasivo.
La utilización de espectroscopia infrarroja y espectroscopia fotoacústica han
demostrado ser las más aceptadas en el ambiente científico para la medición de
glucosa en sangre de forma no invasiva. A pesar de esto, limitantes como
variaciones espectrales no relacionadas con la glucosa, y asociadas al flujo
sanguíneo, temperatura, dispersión de la luz y absorción por metabolitos no
relacionados con la glucosa como el agua, han limitado los desarrollos mediante
esta técnica.
26
3.2.
LA LUZ Y SU INTERACCIÓN CON LA MATERIA
La interacción de luz con la materia, y más específicamente con el tejido biológico
y sus componentes es parte fundamental de los estudios que buscan superar los
inconvenientes existentes en este tipo de medidas. Los principios de
transmitancia, absorbancia y dispersión de la luz al incidir en el medio biológico e
interactuar con la totalidad de sus componentes son la base conceptual de este
tipo de investigaciones.
Las características de la luz incidente en un tejido, que dependen principalmente
de la longitud de onda incidente (distancia entre las crestas de la onda
electromagnética que conforma la luz), determinan el tipo de interacción de esta
con el medio biológico.
La transmitancia de una muestra se encuentra determinada por cada una de las
interacciones que se presentan: reflexión, absorción y dispersión, las cuales son
consideradas como pérdidas de intensidad. Debido a esto, este parámetro es
definido como la relación entre las intensidades de luz transmitida e incidente.
La reflexión se presenta como la devolución de la radiación electromagnética por
la superficie en la que esta incide. Este fenómeno se debe a la transición de los
fotones entre dos medios con diferentes índices de refracción, y establece una
relación geométrica entre el ángulo de la luz incidente reflejada y refractada
(cambio de orientación de la luz que no es reflejada). Sin embargo, esta relación
se encuentra establecida únicamente para superficies lisas en las que se presenta
reflexión especular como la que se indica en la figura 2, y no para materiales
rugosos como lo es la piel humana, en la cual se presenta una reflexión dispersa
que devuelve parte de la intensidad en diferentes direcciones de forma aleatoria.
27
Figura 2. Interacción de la luz con la materia
Fuente: NIEMZ, Markolf H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and
Applications
Es posible identificar las características de reflexión de un tejido mediante dos
parámetros principales: la reflectividad, que se determina como la relación entre
las amplitudes del campo magnético reflejado e incidente; y la reflectancia,
definida como la relación entre la intensidad reflejada e incidente. Ambos
parámetros dependen del ángulo de incidencia, la polarización de la radiación, y
los índices de refracción del material. La relación entre estos se encuentra
determinada mediante las leyes de Fresnel.
A pesar de lo que se pueda pensar, las medidas de intensidad reflejada y
refractada no son complementarias. En la ecuación 1 se observa que la
se define como la cantidad de flujo radiantei (F) por unidad de
intensidad
ii
ángulo sólido (Ω). Esto indica que la energía total es la que se conserva al
realizar la suma de los diferentes fenómenos de interacción, y que la reflectancia
se encuentra definida por la ecuación 2, como el cuadrado de la reflectividad.
(1)
i
El flujo radiante es la medida de la cantidad de energía electromagnética que emite una fuente por unidad
de tiempo, y su unidad de medida es el Watt (W).
ii
El ángulo solido es el ángulo espacial que abarca un objeto visto desde un punto dado, que se corresponde
con la zona del espacio limitada por una superficie cónica. Esta medida indica el tamaño aparente del objeto.
Su unidad de medida es el estereorradián (sr).
28
(2)
Donde E’ representa la intensidad reflejada, y E representa la intensidad
incidente.
Por su parte, la absorción se debe a la conversión de la energía lumínica en calor,
movimiento, o vibración de las moléculas del material. Esta condición se presenta
gracias a una igualdad entre la frecuencia de radiación que se absorbe y la
frecuencia de vibración molecular de compuestos específicos en la muestra
irradiada.
La absorbancia de una muestra al recibir un haz de luz se define como la relación
entre la intensidad absorbida y la intensidad incidente. Este parámetro depende
de diferentes factores como la temperatura, el grosor de la muestra y la
concentración de las diferentes moléculas de la misma. Estos dos últimos se
encuentran descritos mediante la ley de Beer-Lambert, y son la razón por la cual
las técnicas espectroscópicas son ampliamente utilizadas para la determinación
de la concentración de diferentes moléculas en muestras.
En contraste al fenómeno de absorción que se hace presente al existir una
resonancia entre las frecuencias vibracionales de una molécula y la frecuencia de
la onda electromagnética, la dispersión se presenta cuando estas frecuencias no
corresponden. Esta diferencia de frecuencias genera una vibración forzada de
magnitud menor a la presente en resonancia, lo cual desencadena una
disminución de la velocidad de los fotones y un cambio en la orientación de parte
de la intensidad incidente.
29
4. METODOLOGÍA
4.1.
OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
Con el fin de identificar las variables a ser tratadas, y conocer su manejo durante
la investigación, se realiza la operacionalización de las mismas que se indica en el
cuadro 1. Se incluye en este una definición, sus características de clasificación así
como otros aspectos de importancia para su obtención y procesamiento.
30
Cuadro 1. Operacionalización de variables
Variable
Tipo de variable
OperacionaUnidad de
Valor
Fuente
Técnica de
lización
medida
recolección
Distancia entre • nm
Infrarrojo
Emisor de Equipo de
dos crestas de • cm-1
Cercano (NIR):780 luz (integrado espectroscopia
una onda
nm–2500 nm
a un equipo en IR
Factor de
electromagné- Conversión:
Infrarrojo Medio de espectrotica. Variable
(MIR): 2500 nm –
scopia.)
asociada a la
5000 nm
frecuencia de la
Infrarrojo Lejano:
onda.
50 µm – 1000 µm
Longitud de
onda
Interviniente
Atributiva
ContinuaCuantitativa
Controlada
Concentración
de glucosa
Independiente
Atributiva
ContinuaCuantitativa
Controlada
Cantidad
proporcional
masa/volumen
de glucosa en
una muestra
determinada.
Absorbancia
Dependiente
Atributiva
ContinuaCuantitativa
No controlada
Relación entre
la intensidad
absorbida y la
emitida.
%
Transmitancia
Dependiente
Atributiva
ContinuaCuantitativa
No controlada
Relación entre
la intensidad
transmitida y la
emitida.
%
• mg/dl
• mmol/L
Conv.:
31
Normal: 60 – 110
mg/dl
Muestras
analizadas
0 – 100%. 0: Para Cálculos a
material
partir de la
“transparente”
luz
100: Para
transmitida
material “Opaco” y/o reflectada
en las
muestras.
0 – 100%. 0: Para
Luz
material “opaco” transmitida a
100: Para
través de las
material
muestras.
“transparente”
Técnica
estándar
(Glucómetro).
Preparación de
muestras con
concentración
conocida.
Equipo de
espectroscopia
en IR
Equipo de
espectroscopia
en IR
4.2. ETAPAS DEL PROYECTO
Cuadro 2. Etapas del proyecto
Objetivos
Actividades
Realizar
una
revisión
bibliográfica de los estudios de
métodos no invasivos basados
en Infrarrojo Medio (MIR), e 0. Revisión
infrarrojo cercano (NIR) para
Bibliográfica
la determinación de glucosa
en sangre.
Periodo
de Tiempo
Resultados Esperados
•
•
17/01/11
- 12/02/11
•
•
•
•
•
Diseñar
el
protocolo
experimental para estructurar
los modelos de calibración, y 1. Diseño
la metodología de validación a experimental
utilizar.
•
30/01/11
- 12/03/11
•
•
•
•
•
•
•
Revisión bibliográfica de los estudios de medición no invasiva de glucosa en
sangre mediante métodos ópticos.
Identificación de metodologías y análisis de resultados de los estudios que
utilizan cada una de las regiones del espectro infrarrojo (NIR y MIR).
Estudio de la respuesta teórica de la molécula de glucosa al estímulo del
espectro infrarrojo.
Evaluación de las debilidades y fortalezas de las mediciones en los espectros
MIR y NIR con el fin de tener herramientas de selección para el rango de
medición del método a desarrollar.
Selección de las regiones del espectro a evaluar a partir de la revisión
bibliográfica.
Selección de las técnicas de medición a utilizar en el estudio, considerando la
región del infrarrojo escogida y las características de la misma.
Evaluación de la disponibilidad de equipos con las técnicas seleccionadas en la
Universidad Autónoma de Occidente y las instituciones asociadas a la misma.
Identificación de las restricciones de la aplicación de espectroscopia infrarroja
en la medición no invasiva de glucosa.
Propuesta de simuladores de interferencia para utilizar en el estudio
espectroscópico.
Selección del set de calibración.
Determinación de las técnicas de calibración a utilizar.
Selección del set de validación.
Determinación del protocolo de validación y la técnica patrón a utilizar.
Determinación del protocolo para la extracción, almacenamiento, mezcla y
transporte de las muestras presentes en los set de calibración y validación.
Plasmar el proceso detallado a realizar incluyendo los protocolos,
procedimientos, técnicas y características de la fase experimental.
32
Cuadro 3. Etapas del proyecto (Continuación)
Objetivos
Actividades
Periodo de
Tiempo
Resultados Esperados
•
Construir
modelos
de
calibración a partir de la selección
de las longitudes de onda óptimas 2. Construcción
dentro del espectro infrarrojo para de modelos de
la medición de glucosa en sangre. calibración
•
13/03/11 9/04/11
•
•
•
•
Validar
los
modelos
calibración construidos.
de
3. Validación de
los modelos de
calibración
4. Selección de
Identificar las características del
las características
método óptico óptimo para la
del método de
medición no invasiva de glucosa.
medición.
•
10/04/11 19/05/11
•
•
•
20/05/11 20/06/11
•
33
Obtención y preparación de las muestras del set de calibración
según lo establecido en el diseño experimental.
Obtención de los espectros de las muestras del set de
calibración.
Selección de diferentes longitudes de onda y/o regiones para la
construcción de los modelos de calibración.
Construcción de los diferentes modelos de calibración
utilizando las técnicas seleccionadas previamente.
Obtención de los diferentes modelos de calibración a ser
evaluados y validados.
Obtención y preparación de las muestras del set de validación
según lo establecido en el diseño experimental.
Obtención de los espectros de las muestras del set de
validación.
Medición de los niveles de glucosa de las muestras del set de
validación con la técnica patrón establecida.
Validación estadística de los modelos de calibración.
Análisis de los resultados y selección de las longitudes de onda
y/o regiones más acertadas asociadas a los modelos de
calibración.
Descripción del método de medición de glucosa en sangre
propuesto a partir de los resultados del estudio
espectroscópico.
4.3.
DISEÑO EXPERIMENTAL
4.3.1. Espectroscopia IR para D-glucosa diluida en agua ultra pura. Se
considera el rango fisiológico de la concentración de glucosa para el experimento
(20 mg/dl -260 mg/dl) de acuerdo a los niveles estándar de hipoglucemia y a los
límites de diagnóstico de la Diabetes Mellitus, por lo cual se prepara una mezcla
de alta concentración de 400 mg/dl a ser diluida para la obtención de las muestras
restantes. De igual forma se obtiene una mezcla con una concentración de 2700
mg/dl con el fin de evidenciar diferencias marcadas a causa de la presencia de la
D-glucosa en agua ultra pura.
Se obtienen 19 muestras de agua ultra pura con D-glucosa en polvo en las
siguientes concentraciones: (0, 20, 40, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160,
180, 200, 220, 240, 260, 400, 2700) mg/dl. Se aclara que en la etapa de
procesamiento de datos, las mezclas de 400 mg/dl y 2700 mg/dl se excluyen de
los modelos de calibración y son empleadas con el fin de identificar de forma más
clara regiones de interés en los espectros seleccionados. Cada una de las
muestras se obtiene por triplicado, para un total de 57 tubos de ensayo.
•
Se rotulan 19 tubos de ensayo de la siguiente manera: (0-d, 20-d, 40-d, 60d, 70-d, 80-d, 90-d, 100-d, 110-d, 120-d, 140-d, 160-d, 180-d, 200-d, 220-d, 240d, 260-d, 400-d, 2700-d) mg/dl, con la variable d indicando el número de dilución
(1 a 3).
•
Se prepara la mezcla de 2700 mg/dl:
o
Se pesan 2,7 g de D-glucosa utilizando la balanza analítica
o
Se disuelven los 2,7 g en 70 ml de agua ultra pura en una probeta de 100
ml
o
Se enrazan los 100 ml con agua ultra pura y se agita por inversión y
utilizando el agitador magnético.
•
Se prepara la mezcla de 400 mg/dl:
o
Se pesan 4 g de D-glucosa utilizando la balanza analítica
o
Se disuelven los 4 g en 150 ml de agua ultra pura en el matraz aforado de
250 ml
o
Se enrazan los 250 ml, se agita por inversión y se vierte la mezcla en un
recipiente de 1 L
o
Se realizan tres mediciones adicionales de 250 ml de agua ultra pura en el
matraz aforado y se vierten en el recipiente de 1 L
o
Se realiza agitado por inversión y con agitador magnético del recipiente de
1 L, obteniendo la mezcla de 400 mg/dl a ser diluida
34
Haciendo uso de la ecuación 3 se calcularon los volúmenes Vi de la solución base
con concentración de 400 mg/dl. Estos volúmenes registrados en el cuadro 4 se
utilizan en cada preparación en un orden aleatorio obtenido por la función
randsample del software MatLab como se indica: (80, 40, 240, 140, 90, 260, 200,
100, 70, 220, 0, 20, 60, 180, 110, 120, 160) mg/dl
La dilución se realiza de la siguiente manera:
• Utilizando una pipeta volumétrica se vierte el volumen Vi de la solución base en
una probeta de 100 ml y se enraza con agua ultra pura hasta completar los 100
ml.
• Se agita por inversión, y se llevan de 10 a 15 ml de la mezcla al tubo de ensayo
correspondiente.
• Se almacenan las muestras a temperatura ambiente.
Se repite todo el procedimiento de preparación para obtener las muestras por
triplicado, con el fin de analizar espectros de diferentes preparaciones, detectar
posibles errores en las diluciones y disminuir el error aleatorio. Las dos
preparaciones adicionales se realizan de igual forma, incluyendo la preparación de
dos muestras adicionales de solución base a 400 mg/dl y de solución de alta
concentración a 2700 mg/dl. Se utiliza el orden aleatorio indicado para las
diluciones:
Dilución 2: (180, 40, 220, 240, 140, 200, 110, 120, 20, 80, 160, 100, 90, 260, 60,
70, 0) mg/dl
Dilución 3: (60, 110, 220, 20, 80, 70, 140, 120, 160, 260, 240, 0, 180, 200, 90, 100,
40) mg/dl
(3)
35
Cuadro 4. Volúmenes Vi para la preparación de las mezclas DGA.
Concentración
Volumen Vi a
de las mezclas utilizar de la solución
(mg/dl)
base de 400 mg/dl
(ml)
0
0
20
5
40
10
60
15
70
17.5
80
20
90
22.5
100
25
110
27.5
120
30
140
35
160
40
180
45
200
50
220
55
240
60
260
65
400
100
4.3.2. Espectroscopia IR para D-glucosa en matriz de plasma. La preparación
de las muestras por este método pretende utilizar plasma de sangre entera
extraída en ayunas, con el fin de tener un bajo nivel de glicemia en la misma y
realizar posteriormente el procedimiento de adición estándar.
• Se explica el procedimiento y se solicita firmar el consentimiento informado a dos
sujetos sanos en ayunas.
• Se utiliza el sistema BD Vacutainer con el equipo alado Safety Lock, el adaptador
Luer para toma múltiple y los tubos de tapa verde para la extracción de las
muestras.
• Se registra el tiempo de ayuno de los sujetos.
• Se extraen 12 tubos de 10 ml de sangre a cada sujeto sano.
36
• Posteriormente a cada extracción se debe invertir el tubo cinco veces para su
mezcla con la heparina que actúa como anticoagulante.
• Se realiza medición de la muestra No. 6 dos veces utilizando el glucómetro para
medición en sangre venosa.
• Cada muestra se lleva a una centrifuga por 10 minutos a 2400rpm para la
obtención del plasma.
• Se repite la medición de glucosa dos veces con glucómetro en los 2 tubos de
ensayo seleccionados (uno para cada sujeto) utilizando únicamente el plasma
obtenido, y se registran los resultados.
Se consideran los niveles normales de glucosa en sangre entre 60 mg/dl y 110
mg/dl, a ser diluidos para la preparación de las mezclas con una composición de
plasma de 80%, se obtienen concentraciones estimadas entre 48 mg/dl y 88
mg/dl. Debido a esto se realizan 10 adiciones aumentando la concentración en 20
mg/dl por vez, llegando una muestra de concentración máxima entre 248 mg/dl y
288 mg/dl.
Suponiendo una muestra de plasma inicial con una concentración de 80 mg/dl se
obtienen las siguientes muestras para cada sujeto:
(64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264) mg/dl
La preparación de las muestras por el método de adición estándar se realiza de la
siguiente manera:
Nota: Este procedimiento debe realizarse al interior de la cabina de flujo laminar.
• Se preparan soluciones base de 400 mg/dl, 800 mg/dl, y 1000 mg/dl mezclando
agua ultra pura con 400 mg, 800 mg y 1 g respectivamente en los matraces
aforados de 100 ml, enrazando hasta la marca, y etiquetando cada una de las
soluciones.
• Se etiquetan 26 tubos de ensayo de la siguiente manera: (+0x, +20x, +40x,
+60x, +80x, +100x, +120x, +140x, +160x, +180x, +200x, PSMx, H2O-1, H2O-2),
reemplazando la x por A o B, para identificar las muestras de uno u otro sujeto
• Utilizando la micropipeta se extraen 4 ml de plasma de cada uno de los tubos
Vacutainer en los cuales fue centrifugada la muestra de sangre entera, y se vierten
en un tubo de ensayo estéril de 15 ml debidamente etiquetado.
37
• De la solución base correspondiente se agrega un volumen Vi al tubo de ensayo
de 15 ml dependiendo de la concentración a adicionar. Todo esto de acuerdo al
cuadro 5.
• Completar 5 ml de volumen en el tubo de ensayo de 15 ml con la cantidad de
agua ultra pura indicada en el cuadro 5.
• Mezclar la solución cinco veces por inversión.
• Llenar los tubos etiquetados como H2O-1 y H2O-2 con agua ultra pura, y los
etiquetados como PSMx con 4 ml de plasma puro extraídos de dos tubos
vacutainer.
• Se almacenan todas las muestras en los tubos de ensayo a una temperatura de
4°C
Cuadro 5. Volúmenes Vi para la preparación de las mezclas DGP (plasma).
Concentración Concentración Solución Volumen Vi a Volumen
a adicionar
final estimada
Base
utilizar de la
de agua
(mg/dl)
(mg/dl)
(mg/dl) solución base ultra pura
(ml)
(ml)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
57
77
97
117
137
157
177
197
217
237
257
400
400
400
400
400
400
800
800
800
800
800
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,4
0,3
0,2
0,1
0
4.3.3. Espectroscopia IR para D-glucosa en matriz de sangre entera. Se
utiliza sangre entera extraída en ayunas para obtener un bajo nivel de glicemia en
la misma y realizar la adición estándar.
38
• Se explica el procedimiento y se solicita firmar el consentimiento informado a dos
sujetos sanos en ayunas.
• Se utiliza el sistema BD Vacutainer con el equipo alado Safety Lock, el adaptador
Luer para toma múltiple y los tubos de tapa gris para la extracción de las
muestras.
• Se registra el tiempo de ayuno de los sujetos.
• Se extraen 12 tubos de 6 ml de sangre a cada sujeto sano.
• Posteriormente a cada extracción se debe invertir el tubo cinco veces para su
mezcla con el Oxalato de Potasio y el Fluoruro de Sodio.
• Se realiza medición de la muestra No. 6 dos veces utilizando el glucómetro para
medición en sangre venosa.
A partir de los niveles normales de glucosa en sangre entre 60 mg/dl y 110 mg/dl,
a ser diluidos para la preparación de las mezclas con una composición de sangre
de 71,42%, se obtienen concentraciones estimadas entre 42,8 mg/dl y 78,6 mg/dl.
Debido a esto se realizan 10 adiciones aumentando la concentración en 20 mg/dl
por vez, llegando una muestra de concentración máxima entre 242,8 mg/dl y 278,6
mg/dl.
Suponiendo una muestra de sangre inicial con una concentración de 80 mg/dl se
obtienen las siguientes muestras:
(57, 77, 97, 117, 137, 157, 177, 197, 217, 237, 257) mg/dl
La preparación de las muestras por el método de adición estándar se realiza de la
siguiente manera:
Nota: Este procedimiento debe realizarse al interior de la cabina de flujo laminar.
• Se prepara una solución base de 400 mg/dl y otra de 700 mg/dl, mezclando agua
ultra pura con 400 mg y 700 mg respectivamente en los matraces aforados de 100
ml enrazando hasta la marca, y etiquetando cada una de las soluciones.
• Se etiquetan 26 tubos de ensayo de la siguiente manera: (+0x, +20x, +40x, +60x,
+80x, +100x, +120x, +140x, +160x, +180x, +200x, SNGx, H2O-1, H2O-2),
reemplazando la x por A o B, para identificar las muestras de uno u otro sujeto
• Utilizando la micropipeta se extraen 5 ml de sangre entera, y se vierten en un
tubo de ensayo estéril debidamente etiquetado.
• De la solución base correspondiente se agrega un volumen Vi al tubo de ensayo
dependiendo de la concentración a adicionar. Todo esto de acuerdo a la tabla 6.
• Completar 7 ml de volumen en el tubo de ensayo con la cantidad de agua ultra
pura indicada en el cuadro 6.
39
• Mezclar la solución cinco veces por inversión.
• Llenar los tubos etiquetados como H2Ox con agua ultra pura, y los etiquetados
como SNGx con 6 ml de sangre entera pura.
• Se almacenan todas las muestras en los tubos de ensayo a una temperatura de
4°C
Cuadro 6. Volúmenes Vi para la preparación de las mezclas DGS (sangre).
Concentración Concentración
Solución
Volumen Vi a Volumen
a adicionar
final estimada Base (mg/dl) utilizar de la
de agua
(mg/dl)
(mg/dl)
solución base ultra pura
(ml)
(ml)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
57
77
97
117
137
157
177
197
217
237
257
400
400
400
400
400
400
700
700
700
700
700
0
0,35
0,7
1,05
1,4
1,75
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2
1,65
1,3
0,95
0,6
0,25
0,8
0,6
0,4
0,2
0
4.3.4. Barrido espectroscópico. La obtención de los espectros de cada una de
las muestras preparadas (Set DGA, PSM y SNG) se realiza mediante el
espectrofotómetro Shimadzu Prestige IR-21 y la utilización del software IRSolution.
Para la utilización del equipo se hace necesario configurar diferentes parámetros.
Las características para el procedimiento a realizar se indican en el cuadro 7.
Previo al inicio de los registros de cada región, se realiza una prueba de
estabilidad que consiste en verificar el adecuado funcionamiento de la fuente de
luz y del sistema de recolección mediante la obtención de tres espectros idénticos
a la referencia, en los cuales se debe observar como resultado una línea recta
horizontal.
40
Cuadro 7. Parámetros a configurar para el barrido espectroscópico
Parámetro a
configurar
Apodización
Sensibilidad
# barridos
Configuración
HAPP-GENZEL
4 cm-1
25
Para la obtención de los espectros se debe utilizar un espectro de referencia, el
cual puede variar entre el recipiente de medición vacío, o el recipiente con agua
ultra pura. Este procedimiento se realiza con el fin de que la señal final obtenida
corresponda únicamente a la muestra al interior del recipiente ó a los
componentes de la misma diferentes de la referencia.
Para cada una de las regiones y técnicas utilizadas se realiza una medición del
espectro del accesorio vacío y con agua ultra pura, tomando como referencia el
equipo en su estado inicial, con el fin de identificar posibles inconvenientes del
sistema utilizado en cada configuración. Posteriormente se utiliza como referencia
agua ultra pura y se procede a realizar las mediciones de las diferentes mezclas
preparadas.
4.3.4.1. Cercano infrarrojo (NIR). Para la medición en esta región se configura el
equipo para trabajar entre 4000 cm-1 y 12000 cm-1, haciendo uso de una placa de
CaF2 recubierta en silicio como divisor del haz de luz que emite la lámpara de
tungsteno utilizada por el equipo en esta región, y un detector de InGaAs.
Se realizan medidas de transmitancia directa utilizando el accesorio “Demountable
Liquid Cell” con ventanas de ZnSe, y ajustando el camino óptico con diferentes
espaciadores.
• Se realizan los 3 registros correspondientes a la prueba de estabilidad.
• Se realiza el espectro de referencia como el equipo vacío.
• Se ubica el accesorio Demountable Liquid Cell utilizando las ventanas de ZnSe,
que permiten trabajar espectros entre 461 cm-1 y 15000 cm-1. Se utiliza un
espaciador para un camino óptico inicial de 1 mm, el cual se disminuye en caso de
observar saturación de la señal. Disponibles: (0,015; 0,025; 0,050; 0,100; 0,200;
0,500; 1) mm
• Se registran los espectros de la celda de líquidos sola y la celda con agua ultra
pura.
41
• Para las mediciones PSM y SNG se realiza un tercer espectro de la muestras de
plasma puro (PSM) y sangre pura (SNG) para verificar el camino óptico.
• Se verifica que la señal no esté saturada, de lo contrario se selecciona un
espaciador que brinde un menor camino óptico.
• Se realiza el espectro de referencia como la celda con agua ultra pura.
• Se ingresan muestras y se obtienen los espectros de cada una de las mezclas en
orden aleatorio definido por el software MatLab.
• Se almacenan todos los datos en formato txt para su posterior procesamiento en
MatLab como se indica:
DGA: DGANIRLCxx-D-M. Donde ‘xx’ corresponde a la concentración, ‘D’ al
número de dilución correspondiente a las muestras por triplicado, y M el número
de medida.
PSM: PSMNIRLCxx-M. Donde ‘xx’ corresponde a la concentración adicionad, y M
el número de medida.
SNG: SNGNIRLCxx-M. Donde ‘xx’ corresponde a la concentración adicionada, y
M el número de medida.
4.3.4.2. Medio infrarrojo (MIR). Para la medición en esta región se configura el
equipo para trabajar entre 200 cm-1 y 4000 cm-1, haciendo uso de una placa de
KBr revestida en Germanio como divisor del haz de luz de la Fuente cerámica
refrigerada por aire que el equipo utiliza en esta región, y un detector DLATGS de
alta sensibilidad con temperatura controlada.
Se realizan medidas utilizando el accesorio ATRMax II con cristal de ZnSe a 45°,
ideal en esta región del infrarrojo debido a su poca penetración en la muestra.
• Se realizan los 3 registros correspondientes a la prueba de estabilidad.
• Se registra un espectro de referencia como el equipo sin ningún accesorio.
• Se ubica el accesorio ATRMax II con cristal de ZnSe a 45°, que permite trabajar
espectros entre 461 cm-1 y 15000 cm-1.
• Se registran los espectros del accesorio ATR II solo y con 750 µl de agua ultra
pura.
• Para las mediciones PSM y SNG se realiza un tercer espectro de la muestras de
plasma puro (PSM) y sangre pura (SNG) para verificar el camino óptico.
• Se verifica que la señal no esté saturada.
• Se realiza el espectro de referencia como el accesorio ATR II con 750 µl de agua
ultra pura.
• Se ingresan 750 µl de muestra de cada una de las mezclas y se obtienen los
espectros en el orden aleatorio establecido anteriormente.
42
• Se almacenan todos los datos en formato .txt para su posterior procesamiento
con el software MatLab como se indica:
DGA: DGAMIRATRxxD-M. Donde ‘xx’ corresponde a la concentración, ‘D’ al
número de dilución correspondiente a las muestras por triplicado, y M el número
de medida.
PSM: PSMMIRATRxxD-M. Donde ‘xx’ corresponde a la concentración adicionada,
y M el número de medida.
SNG: SNGMIRATRxx-M. Donde ‘xx’ corresponde a la concentración adicionada, y
M el número de medida.
4.4. PROCESAMIENTO Y RESUMEN DE DATOS
4.4.1. Suavizado de la señal cruda mediante filtros digitales. Con el fin de
tener una señal con la menor distorsión posible para la posterior extracción de
información analítica, es necesario aplicar una técnica disminución de ruido que
permita posteriores análisis estadísticos de una señal con un mayor SNR. Debido
a la presencia de picos de alta frecuencia que son de interés, se realizó una
selección cuidadosa de los métodos a ser empleados.
La función “Smooth” de MatLab permite realizar diferentes configuraciones para el
suavizado mediante un filtro de media móvil. Este ofrece 6 métodos diferentes,
cada uno con características particulares.
El método Savitzky-Golay es comúnmente utilizado en señales de espectroscopía
o con información de altas frecuencias, debido a que se conserva la información
con estas características. En la figura 3 se evidencia este comportamiento para un
filtrado con polinomios de aproximación cuadráticos y cuarticos. Debido a estas
consideraciones, éste será el método a utilizar para la reducción de ruido de las
señales obtenidas.
43
Figura 3. Filtrado Savitzky-Golay para espectroscopía
Fuente: Filtering and Smoothing. [En línea]. R2011a Documentation: MatLab,
2011 [consultado 30 de Abril de 2011].
http://www.mathworks.com/help/toolbox/curvefit/bq_6yqb.html#top_of_page
4.4.2. Promediado de espectros. El promediado de espectros es una técnica
ampliamente utilizada en el área de quimiometría con el fin de reducir el ruido
presente en las señales obtenidas e identificar los denominados “outliers” dentro
del set de medición. De acuerdo a esto, y considerando que para las muestras
DGA preparadas por triplicado, se tienen tres espectros para trabajar.
Estos espectros son evaluados con el fin de identificar posibles errores en alguna
de las mediciones y omitir los espectros denominados como “outliers”. Una vez
realizada esta selección se realiza el promediado de los espectros restantes,
obteniendo como resultado un espectro final para cada concentración con el que
se trabajaría en las transformaciones siguientes.
44
4.4.3. Corrección de la línea base de la señal filtrada. Con el fin de disminuir
los efectos de la variación de la línea base, diferentes algoritmos y aproximaciones
de corrección han sido estudiados, intentando evitar al máximo la pérdida de la
información de interés.
4.4.3.1. Modelado y sustracción (Detrending). El método de modelado y
sustracción es ampliamente utilizado en espectroscopía, y se encuentra
denominado como detrending,,. Para llevarlo a cabo se realiza una estimación
simple (lineal), o polinomial del comportamiento de la señal espectroscópica,
generando una función característica que es sustraída de la señal original para
obtener la corrección deseada.
Aunque en ocasiones se sugiere la aplicación de esta técnica en espectroscopía
MIR más que en datos recolectados en la región NIR, es necesario observar los
resultados en ambas regiones con el fin de tener mejores argumentos para una
selección particular.
Se realiza la corrección a los espectros NIR y MIR para evaluar su desempeño en
cada una de las regiones. De acuerdo a las técnicas más utilizadas para este
método, se lleva a cabo una corrección con un modelado lineal, y otra con un
polinomio de orden superior como se indica:
• Ajuste lineal de la variación de línea base utilizando la función ‘detrend’ del
software MatLab.
• Ajuste y truncamiento iterativo de curvas, con un polinomio de orden superior, el
cual se determina de acuerdo a la respuesta obtenida al modelar diferentes
valores. El truncado permite que la línea base modelada no responda a los picos
característicos de la señal espectroscópica, sino al comportamiento general de la
misma.
4.4.3.2. Derivadas de la señal. Los métodos derivativos aplicados a señales de
espectroscopía han sido utilizados no solamente para correcciones de línea base,
sino también como técnica de extracción de información de los espectros. Esta
técnica utiliza la primera derivada de la señal para desplazamientos uniformes de
la línea base, mientras que utiliza la segunda derivada para eliminar efectos
aditivos y multiplicativos sobre la misma, teniendo como resultado reducción en
cambios de pendiente de la línea base y mejoramiento de la resolución de las
bandas que se encuentran solapadas entre ellas.
45
A pesar de que algunas aproximaciones realizan derivadas de orden superior, las
dos primeras derivadas son generalmente las más útiles en este tipo de análisis.
Sin embargo, es necesario que sean llevadas a cabo posterior al proceso de
filtrado debido a que generan un aumento en el ruido presente en los datos.
De acuerdo a lo anterior, se llevan a cabo tanto la primera como la segunda
derivada de la señal, con el fin de evaluar la información que puede ser extraída
de las señales resultantes.
4.4.3.3. Variable normal estándar (SNV). La técnica SNV busca corregir efectos
del tamaño de las partículas, dispersión y variaciones de pendiente en
espectroscopia NIR, pero puede ser aplicada a la totalidad del espectro trabajado
en la presente investigación (MIR+NIR).
Éste método es muy similar al denominado “corrección de efecto multiplicativo de
dispersión” (MSC), el cual también busca realizar una reducción de los efectos
multiplicativos de dispersión, de diferencias en los tamaños de las partículas,
temperaturas, entre otros. Diferentes estudios han demostrado que ambos
métodos son equivalentes, y que se obtienen resultados muy similares en cuanto
a capacidad de predicción.
La diferencia entre el SNV y el MSC radica en que este último utiliza como
referencia el espectro medio de las señales a tratar, por lo que los parámetros
cambian con cada variación en los datos de entrada, mientras que el SNV es
aplicado de forma individual sin depender de ningún espectro de referencia, y
obteniendo por lo tanto una escala común a todos los espectros.
A pesar de que algunos estudios realizan combinaciones de éste método con el
denominado ‘detrending, otros sugieren que no deben realizarse combinaciones
de técnicas de preprocesamiento que busquen realizar correcciones de línea base
y efectos similares ya que pueden eliminar información útil. Debido a esto, se
llevan a cabo los procesamientos de forma independiente y se analizan los
resultados para determinar si es necesario realizar alguna combinación de los
mismos.
La transformación se lleva a cabo de la siguiente manera:
(4)
46
Donde:
Xi,m: Absorbancia del espectro i a la longitud de onda m.
/Xi: Absorbancia media del espectro i.
Si: Desviación estándar de los valores de absorbancia de cada muestra.
4.5. IDENTIFICACIÓN DE REGIONES Y LONGITUDES DE ONDA
Con el fin de omitir posibles errores inducidos por los algoritmos de corrección de
línea base, los diferentes métodos de selección indicados se aplican tanto a los
espectros filtrados como a los resultados de las 5 correcciones.
4.5.1. Criterio de la varianza y Factor de Mérito (FM). El cálculo del Factor de
Mérito (FM) se lleva a cabo considerando la varianza de los espectros obtenidos
para cada longitud de onda. El método realiza una comparación entre varianza
interclase e intraclase, para lo que se agrupan espectros definiendo rangos de
concentraciones de la muestra a analizar.
Varianza intraclase: Promedio de las varianzas al interior de cada clase por
longitud de onda.
Varianza interclase: Varianza del promedio de los datos de cada clase por
longitud de onda.
Factor de mérito: Relación entre la varianza interclase y la varianza intraclase
(Ecuación 5)
(5)
Un valor alto de FM a una longitud de onda particular implica que la distancia
media entre cada medida de una clase y la posición del centroide de la misma es
menor a la distancia media entre las centroides de todas las clases. Éste índice
determina si la variabilidad observada corresponde al azar, o si existen
diferencias significativas de la señal para cada una de las muestras, y permite
realizar una selección de las variables con mayor FM.
47
Este factor puede ser calculado mediante el software MatLab utilizando la función
fmerito creada por los investigadores, y que obedece al algoritmo indicado en el
cuadro 8.
Cuadro 8. Algoritmo de cálculo del factor de mérito de un set de espectros.
Fuente: GONZÁLEZ VÁSQUEZ, Francisco Manuel. Desarrollo de un método de
selección de variables para datos espectroscópicos en el infrarrojo cercano.
Trabajo de grado Ingeniero Electrónico. Tarragona: Universitat Rovira I Virgili.
Departamento de Ingeniería Electrónica, Eléctrica y Automática, 2004. 128 p.
4.5.2. Aproximación indirecta, métrica de la Información Mutua (IM). Dentro
de las técnicas de selección de variables que se plantean como solución al
problema Feature Subset Selection (FSS) se encuentran las aproximaciones
indirectas o filter, y las directas o wrapper. A pesar de que estas últimas realizan
un análisis más exhaustivo al evaluar cada posible subconjunto de variables con
un modelo de regresión, no son muy utilizadas debido a sus altos requerimientos
computacionales y sus rendimientos similares a las técnicas de aproximación
indirecta.
Uno de los métodos más utilizados dentro de las aproximaciones filter es el
ranking de variables, el cual utiliza heurísticos basados en medidas de divergencia
entre funciones de distribución para ponderar las variables. Dentro de este
método, la métrica más utilizada y contrastada en análisis espectroscópicos es la
de información mutua (IM).
48
Ésta realiza un cálculo de relación entre dos variables, como la diferencia entre la
entropía (medida de la incertidumbre) de la variable X: H(X), y la entropía de la
misma variable cuando se conoce el valor de la variable Y: H(X/Y) (Ecuación 6).
(6)
En esta métrica que tiene como rango [0-1], valores cercanos a cero indican
independencia entre las variables, mientras que valores cercanos a uno marcan
una alta correlación entre ellas.
Este índice puede ser utilizado de diferentes formas y combinado con otras
técnicas de selección y diferentes modelos predictivos,. Debido a esto se indican
las características de procesamiento seleccionadas para la presente investigación
de acuerdo a los resultados reportados por las investigaciones de teoría de la
información relacionadas con la métrica.
4.5.3. Combinación entre variables individuales y set de variables. En esta
combinación se realizan dos selecciones independientes de variables. El primer
método consiste en la obtención de un ranking de las variables con base en el
índice IM individual entre cada longitud de onda y la concentración de glucosa,
como se muestra en el diagrama de la figura 4.
49
Figura 4. Procedimiento para el ranking de variables utilizando la
Información Mutua.
Inicio
Ciclo i=1
IM λi vs []
NO
i=λf
i++
S
Ubicación IM individual
máx: sel (S1)
Ciclo n=1
n++
IM= IM ≠ sel
Ubicación IM máximo
Selección de
máximo local: sel
NO
n=λf
S
Ranking de variables
según su IM
El segundo selecciona la primera variable como aquella con mayor IM, y tiene en
cuenta esta selección para el proceso siguiente. Debido a esto, para la segunda
variable se busca maximizar el índice de información mutua entre un set que
involucra tanto la variable previamente seleccionada como la nueva variable a
incluir, con respecto a la concentración de glucosa. Posteriormente se incluyen de
forma sucesiva todas las variables que al hacer parte del set generen un mayor
índice de la métrica, como se muestra en el diagrama de la figura 5.
50
Figura 5. Procedimiento para la selección de variables utilizando la
Información Mutua
Inicio
Ciclo i=1
IM λi vs []
NO
i=λf
i++
SI
Ubicación IM individual
máx: sel (S1)
Ciclo x=1
x++
Ciclo n=1
SI
λn
ε sel?
n++
NO
Setp: [sel , λn ]
IM Setp vs []
NO
n=λf
SI
Ubicación máximo local
de IM
NO
max(x) > maxT
SI
Selección de variable adicional: sel
Procedimiento ‘Backward’
51
Fin
Una vez realizados los dos procedimientos anteriores, el método sugiere realizar
una unión entre el set de variables seleccionado mediante el algoritmo de la figura
4 y las primeras variables del ranking obtenido en el algoritmo de la figura 5. La
cantidad de variables seleccionadas en este último paso es determinada de tal
forma que el set total de variables no implique un aumento muy significativo en los
tiempos de ejecución de los algoritmos a llevar a cabo (un máximo total de 20
variables).
4.6. REGRESIÓN Y VALIDACIÓN DE LOS MODELOS.
Una vez realizado el procesamiento correspondiente indicado en los apartados
anteriores, se hace necesario realizar modelos de regresión con el fin de generar
las curvas de calibración correspondientes que permitan realizar la predicción de
los niveles de glucosa.
Teniendo en cuenta las diferentes opciones de procesamiento a llevar a cabo, y
considerando que cada una puede ser ajustada de una mejor forma con modelos
de regresión diferentes, se deben realizar procesamientos paralelos con el fin de
realizar una comparación del rendimiento de las técnicas de procesamiento al ser
sometidas a modelos de regresión con características particulares.
Para cada uno de los modelos generados se realiza el cálculo del error cuadrático
medio de calibración (RMSEC), el cual brinda información acerca de los errores de
predicción del modelo para cada una de las señales que fueron parte de la
construcción del mismo.
Con el fin de validar cada uno de los modelos con datos diferentes a los utilizados
en la construcción del modelo, se llevan a cabo procedimientos de validación
cruzada “Leave One Out”, obteniendo el error cuadrático medio respectivo
(RMSECV). De igual forma se dejan tres de los espectros por fuera de la
construcción del modelo, y se realiza el cálculo del error cuadrático medio de
predicción (RMSEP) a partir de la estimación de los mismos.
4.6.1. Regresión lineal simple. A partir de los componentes o variables que
cada uno de los procesamientos anteriores genera se realiza una regresión lineal
simple para la obtención de las concentraciones de cada una de las muestras.
Ésta regresión se lleva a cabo en el software MatLab utilizando la función
“regress”, que realiza la regresión por el método de mínimos cuadrados como se
indica.
52
4.6.2. Regresión de de componentes principales (PCR). Este análisis es muy
útil en la reducción de variables, ya que disminuye la cantidad de variables sin
eliminar información, generando nuevos atributos llamados componentes
principales. En el caso de la presente investigación, los componentes principales
corresponden a una combinación lineal de las longitudes de onda presentes en los
espectros a analizar.
Posterior a la conversión de las longitudes de onda seleccionadas en términos de
los componentes principales mencionados, se realiza la regresión lineal para
generar el modelo de predicción de concentraciones.
4.6.3. Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales (PLSR). El análisis PLS es
ampliamente utilizado en sets de información que contienen variables altamente
correlacionadas, y tiene características comunes al PCA, ya que realiza el cálculo
de nuevas variables o componentes a partir de una combinación lineal de las
variables originales.
Sin embargo, el PLS tiene en cuenta los valores “Y” observados de la variable a
predecir. Debido a esto, brinda un mayor poder predictivo que el PCA, en el cual
este cálculo se encuentra únicamente basado en la varianza de cada variable
original con el fin de reducir la correlación entre los componentes generados.
Los cálculos relacionados a esta transformación se realizan en el software MatLab
mediante la función ‘plsregress’. Este comando realiza no solamente el cálculo de
los nuevos componentes, sino también la regresión lineal multivariable
correspondiente, debido al conocimiento del vector Y de respuestas y a la
utilización del mismo en el cálculo de los nuevos componentes.
53
5. RESULTADOS
5.1. ESPECTROSCOPÍA IR EN MUESTRAS DE D-GLUCOSA DILUIDA EN
AGUA ULTRA PURA
Una vez preparadas las muestras de D-glucosa en agua a diferentes
concentraciones como se indica en el diseño experimental, se realizaron los
barridos espectroscópicos utilizando el espectrofotómetro Shimadzu Prestige IR21 y el software IRSolution.
5.1.1. Espectros NIR. Las pruebas correspondientes para determinar el camino
óptico adecuado a utilizar en la región NIR con la celda de líquidos y las ventanas
de ZnSe identifican regiones del espectro saturadas (con absorción total) al utilizar
espaciadores de 1 mm y 0,5 mm, por lo que se determina que los espectros de las
muestras de D-glucosa diluida en agua, se realizarían para un camino óptico de
0,2 mm.
En la figura 6 se muestran los espectros de referencia de muestras de agua pura
tomados por el espectrofotómetro para diferentes caminos ópticos, al igual que las
señales correspondientes para el equipo vacío y con las ventanas de ZnSe. Se
evidencia la saturación de las señales de 1 mm y 0,5 mm alrededor de 5000 cm-1.
54
Figura 6. Espectros de referencia de muestras de agua pura en la región NIR
De igual forma, las mediciones de transmitancia para evaluar la estabilidad del
equipo que se muestran en la figura 7 evidencian los errores que la medida
presentaría al utilizar caminos ópticos mayores a 0,2 mm. Esto debido a que al
realizar una medición con la misma muestra utilizada como referencia, la señal
debería ser una línea recta indicando un 100% de transmitancia como sucede con
el espaciador de 0,2 mm de espesor.
55
Figura 7. Espectros de estabilidad en la región NIR.
Al realizar medidas de transmitancia de una muestra con alta concentración de
glucosa (2700 mg/dl) utilizando aire como señal de referencia, se identifica que
tampoco existe saturación de la señal, por lo que se determina continuar los
espectros con el camino óptico seleccionado. De forma adicional, se selecciona
tomar como señal de referencia el aire debido a que mediciones iniciales utilizando
agua pura como referencia mostraron variaciones considerables para la misma
medida.
5.1.2. Espectros MIR. Para la región MIR del espectro se obtuvieron las señales
de referencia correspondientes a agua y aire mostradas en la figura 8, utilizando el
accesorio ATRMAX II. Al igual que en la región NIR, se realizaron pruebas de
estabilidad (figura 9) obteniendo espectros de la misma muestra utilizada como
referencia (H2O), y de una alta concentración de glucosa (2700 mg/dl), con el fin
de verificar el funcionamiento adecuado del accesorio y la obtención de la señal.
56
Figura 8. Señales de referencia en la región MIR
Las señales de estabilidad utilizando agua ultra pura evidencian un pico negativo
entre 2000 cm-1 y 2500 cm-1, correspondiente a la variación de CO2 desde la toma
de la muestra de referencia, por lo cual se identificó como potencial interferente
para los análisis posteriores.
57
Figura 9. Pruebas de estabilidad y alta concentración en la región MIR
Se obtuvieron señales en la región MIR con diferentes características para dos
momentos de medición. Sin embargo, cada uno de los sets contiene los espectros
de todas las concentraciones, por lo que se decide procesarlos por separado,
considerando que las diferencias pueden obedecer a las características del
entorno de medición en el momento y a las condiciones del espectrofotómetro.
5.2. ESPECTROSCOPÍA IR EN MUESTRAS DE PLASMA
5.2.1. Espectros NIR. Las pruebas de saturación y de estabilidad al utilizar
plasma como muestra objetivo no indicaron variaciones considerables que
implicaran algún cambio en las técnicas de medición en comparación a la
recolección de espectros de las muestras de agua ultra pura.
5.2.2. Espectros MIR. De igual forma se obtuvieron los espectros de las
muestras de plasma para cada uno de los sujetos utilizando la técnica ATR para la
región MIR. Se evidenció un comportamiento muy similar al de la última medición
MIR en muestras de agua, por lo que se determinó que la primera medida
correspondiente a las mismas muestras pudo haber sido la afectada por factores
ambientales y de condiciones de equipo.
58
5.3. ESPECTROSCOPÍA IR EN MUESTRAS DE SANGRE
5.3.1. Espectros NIR. Las pruebas en la región NIR de las muestras de sangre
hicieron evidente la absorción por parte de este fluido, ya que al utilizar un camino
óptico de 0,2 mm, el espectro oscilaba entre 0,5 % y 2 % de transmitancia. Debido
a esto, se adoptó el espaciador de 0,1 mm. De esta forma se obtuvo una señal un
poco mayor que podría ser más fácilmente procesada y comparada
estadísticamente (figura 10).
Figura 10. Espectros de sangre en la región NIR para diferentes caminos
ópticos
5.3.2. Espectros MIR. De igual forma se realizaron los barridos espectroscópicos
para la región MIR para cada uno de los sujetos y se obtuvieron los espectros
correspondientes.
59
5.4. PROCESAMIENTO DE DATOS
Cada uno de los espectros crudos obtenidos fue filtrado mediante la función
“Smooth” de Matlab utilizando el método Savitzky-Golay descrito en la
metodología. Se obtuvieron las señales suavizadas, a partir de las cuales se
realizó una identificación gráfica de outliers. Estos fueron eliminados de cada uno
de los set de datos, teniendo como resultado final los espectros para realizar las
correcciones correspondientes establecidas anteriormente (Anexo A).
Se llevaron a cabo los 5 tipos de corrección de línea base, teniendo como
resultado 6 sets por cada grupo de espectros (al incluir las señales originales) en
las regiones MIR y NIR para las muestras de agua, plasma y sangre.
A cada uno de los sets de espectros resultado de las correcciones de línea base
se aplicaron técnicas de selección de Información Mutua y Factor de Mérito,
obteniendo las gráficas correspondientes a estos índices como las que se
muestran en las figuras 11 y 12 correspondientemente.
Figura 11. Información Mutua para un set de datos en la región NIR
60
Figura 12. Factor de Mérito para un set de datos en la región NIR
5.5. MODELOS DE PREDICCIÓN
5.5.1. Construcción de los modelos. Para la construcción de los modelos se
realizaron tres tipos de selección. En la primera se incluyeron en el modelo
únicamente las longitudes de onda que en conjunto maximizan la información
mutua, y que fueron identificadas a partir del algoritmo iterativo descrito en la
metodología. En la figura 13 se muestra un ejemplo de la selección; en rojo se
resaltan las longitudes de onda del set seleccionado, mientras que en azul se
muestran las primeras 15 longitudes de onda con mayor Información Mutua
individual.
61
Figura 13. Selección de longitudes de onda principales de acuerdo a la
Información Mutua
En el segundo tipo de selección se incluyeron las longitudes de onda del set
anterior, además de las primeras 20 longitudes de onda con mayor Información
Mutua individual, y las primeras 20 con mayor Factor de Mérito. Esto permitió
realizar modelos con un número mayor de longitudes de onda seleccionadas por
técnicas diferentes.
El tercer tipo de selección incluyó regiones con altos índices de Información Mutua
o Factor de Mérito de forma gráfica. Para esto se mostró el 10% de las longitudes
de onda de la totalidad del espectro con mayor Información Mutua en un gráfico, y
el 10% correspondiente a las longitudes con mayor Factor de Mérito en otro, como
se evidencia en las Figuras 14 y 15 correspondientemente.
62
Figura 14. Selección de regiones a partir de las longitudes de onda con
mayor Información Mutua
63
Figura 15. Selección de regiones a partir de las longitudes de onda con
mayor Factor de Mérito
A partir de este tipo de gráficos se identificaron las regiones del espectro con una
mayor densidad de variables con un alto índice, y fueron estas las seleccionadas
para la construcción de los modelos correspondientes.
Estas técnicas de selección fueron aplicadas a cada uno de los 12 sets de datos
(6 en la región MIR y 6 en la región NIR) de cada una de las muestras analizadas
(agua, plasma y sangre). Cada grupo de longitudes de onda seleccionadas fue
ingresado en los tres tipos de modelos de regresión: regresión lineal simple (RL),
regresión de componentes principales (PCR), y regresión de mínimos cuadrados
(PLSR).
64
5.5.2. Validación de los modelos. Con el fin de identificar los procesamientos
más adecuados para la predicción de las concentraciones de glucosa, las técnicas
de selección más acertadas, y los modelos de regresión óptimos, se realizó el
cálculo de tres tipos de error cuadrático medio (MSE), y se realizaron
comparaciones de la raíz del mismo (RMSE), para manejar información que
pudiera ser comparada en las unidades del estudio (mg/dl).
Como primera medida se obtuvo el error cuadrático medio de calibración
(RMSEC). En éste, el modelo es construido con todas las concentraciones
disponibles en el rango especificado, y el error es calculado a partir de las
desviaciones de estas mismas muestras.
Este cálculo, al partir de los mismos espectros con los que se construye el modelo,
es generalmente muy optimista. Esto debido a que está indicando el error del
modelo, sin evaluar su habilidad de predicción para muestras no incluidas en el set
de calibración.
Con el fin de evaluar de forma real dicha habilidad, se realizó el cálculo del error
cuadrático medio de predicción (RMSEP). Para esto, se seleccionaron tres
muestras de forma aleatoria en cada modelo, las cuales fueron utilizadas como
muestras de validación. En la figura 16 se observa la respuesta de uno de los
modelos en la cual se incluyen en rojo las tres muestras de validación que no
fueron parte de la regresión.
65
Figura 16. Respuesta del modelo de regresión PLS, a partir de regiones de
señales de plasma con corrección de modelado lineal LDT.
A pesar de que el RMSEP proporciona un índice relacionado con la predicción de
muestras nuevas, su cálculo implica dejar de utilizar algunas de las muestras
disponibles en el set de calibración para incluirlas en el de validación. En estudios
como el presente, en los que la obtención de las muestras necesita de un proceso
detallado y no es posible obtener un alto número de las mismas, este tipo de
validación implica sacrificar de forma significativa el contenido del modelo.
Debido a lo anterior, se utiliza una técnica más avanzada denominada validación
cruzada “Leave One Out”, que proporciona el error cuadrático medio de validación
cruzada (RMSECV). En esta técnica se realiza una construcción iterativa de
modelos en los cuales se extraen de forma individual muestras para realizar la
validación.
66
Esto permite obtener un error real de la predicción del modelo construido con
todas las muestras exceptuando una, y garantiza que cada una de las
concentraciones disponibles en el rango fue evaluada como muestra de
validación.
En el Anexo B se incluyen los cuadros correspondientes a los errores RMSEC,
RMSEP y RMSECV. Esta información permite realizar una comparación de cada
tipo de error para los modelos generados. Sin embargo, debido a la gran cantidad
de datos para ser analizados, se determina como criterio de selección el
RMSECV, que evalúa modelos más completos y lo hace en todo el rango de
concentraciones determinado para el estudio.
De cada uno de los 11 cuadros del anexo B se seleccionaron los 15 modelos con
menor RMSECV. A partir de esta clasificación inicial, se identificaron las técnicas
de procesamiento que coincidían en estas 11 listas, y se determinó su porcentaje
de aparición en las mismas, el error promedio para muestras de agua (DGA), el
error promedio para muestras de plasma (PSM), el error promedio para muestras
de sangre (SNG), y el promedio total de los errores de cada combinación de
técnicas (Cuadros 9 y 10).
En estos cuadros se realizó para cada región la selección de los cinco modelos
con mayor frecuencia entre los listados anteriores (subrayados en amarillo), los
cinco con un menor promedio total (en letras rojas), y se identificó de forma
adicional los modelos con menor RMSECV para las muestras DGA, PSM y SNG
de forma individual (subrayados en verde).
67
Cuadro 9. Selección de modelos con mejores resultados para la región MIR
68
Cuadro 10. Selección de modelos con mejores resultados para la región NIR
Esta selección permitió concluir que tanto la primera como la segunda derivada
permiten realizar una mejor identificación de las longitudes de onda que se
relacionan con la concentración de glucosa, y brindan una alta información acerca
de la misma. De los 17 modelos seleccionados que incluyen las regiones MIR y
NIR, 15 correspondían al procesamiento derivativo, mientras que otros 2
correspondían a procesamiento de corrección polinomial de línea base y cálculo
de variable normal estándar respectivamente.
De igual forma se identificó que 12 de los modelos seleccionados utilizaron las
principales longitudes de onda teniendo en cuenta los criterios de Información
Mutua y Factor de Mérito en conjunto, 4 utilizaron la selección exclusiva del set de
datos que maximiza la Información Mutua, y tan solo 1 utilizó una región como
fuente de datos.
A partir las longitudes de onda que fueron utilizadas en la creación de los modelos
seleccionados en los cuadros 9 y 10, se identificaron las coincidencias de
selección entre modelos tanto para la región MIR como para la región NIR.
69
En la región MIR, se identificó una marcada selección de longitudes de onda entre
648 cm-1 y 1250 cm-1 y entre 3000 cm-1 y 3870cm-1, común tanto para las muestras
de agua, como para las de plasma y sangre.
Con poca aparición en las muestras de agua, pero con presencia significativa en
muestras de plasma y sangre, se identificaron longitudes de onda entre 1850 cm-1
y 2210 cm-1, y entre 2350 cm-1 y 2565 cm-1. De igual forma se identifican, aunque
con menor repetición, algunas longitudes entre 1380 cm-1 y 1726 cm-1 para dichas
muestras.
Por otro lado, en la región NIR se identifican longitudes de onda entre 11100 cm-1
y 11950 cm-1, y entre 5190 cm-1 y 5700 cm-1 en la mayoría de los modelos
seleccionados, tanto para las muestras de agua, como para las de plasma y
sangre. Uno de los modelos que utilizan la selección del set principal seleccionado
a partir de la Información Mutua, presenta de forma aislada longitudes de 5958 y
5890, cercanas a la región anterior.
Se identifica la presencia de longitudes entre 8790 cm-1 y 9265 cm-1 en una mayor
proporción para muestras de plasma y sangre que para muestras de agua,
mientras que longitudes entre 4700 cm-1 y 4900 cm-1 se presentan de forma
significativa en varios de los modelos de agua, y en menor proporción en las
muestras de plasma.
Longitudes entre 6000 cm-1 y 6760 cm-1 se identifican exclusivamente en las
muestras de plasma de varios de los modelos, y se evidencia una menor cantidad
de longitudes entre 10400 cm-1 y 10900 cm-1 tanto en muestras de plasma como
de sangre.
Con el fin de identificar de forma gráfica las regiones en las cuales se concentran
las longitudes de onda que fueron repetitivas en los modelos con un menor
RMSECV, se incluyen en el anexo C figuras en las cuales se muestran los
espectros originales NIR y MIR, y se señalan las longitudes identificadas en
muestras de sangre, plasma, y agua para cada una de las regiones.
Es importante considerar que, aunque estas regiones se señalan en espectros
originales filtrados, fueron identificadas en su mayoría en las derivadas de los
mismos, y es necesario realizar modelos de las señales con diferentes
procesamientos, ya que la derivada pudo haber sido una adecuada herramienta
de identificación que lleve a errores menores al utilizar las longitudes de onda
indicadas en señales con procesamientos diferentes.
70
6. CONCLUSIONES
La aplicación de técnicas de dilución y de adición estándar permitió obtener
muestras de diferente complejidad que cubrieran el rango de concentración de
glucosa para la obtención de los espectros correspondientes.
A partir de técnicas estadísticas novedosas para esta aplicación, fue posible
identificar longitudes de onda y regiones con una mayor tendencia a predecir la
concentración de glucosa en las muestras e incluirlas en modelos de regresión. La
obtención de dos espectros por región al trabajar con dos sujetos sanos, permitió
recopilar una mayor cantidad de datos y realizar 11 cuadros de combinación de
técnicas de procesamiento, selección, y regresión.
El contraste general de los errores de cada uno de los modelos generados
permitió identificar opciones de procesamiento más acertadas, y longitudes de
onda que predicen de una mejor manera la concentración de glucosa en las
muestras. Las regiones en las que se encontraban las longitudes de onda
repetitivas para los modelos con un menor RMSECV fueron identificadas.
Las longitudes de onda significativamente relevantes encontradas en la región
MIR entre 648 cm-1 y 1250 cm-1 para todas las muestras (agua, plasma y sangre),
coinciden con la región entre 1000 cm-1 y 1230 cm-1 indicada por el Dr. Petibois y
colaboradores en sus trabajos como correspondiente a la absorción del enlace
C-O, y ratifican sus hallazgos en el pico de 1033 cm-1. Esta identificación coincide
de igual forma con la región entre 1022 cm-1 y 1119 cm-1 indicada por Webster y
colaboradores en su libro “Handbook of Optical Senging of Glucose in Biological
Fluids and Tissues”, con los picos en 1032 cm-1, 1042 cm-1, y 993 cm-1
encontrados por Vargas y colaboradores en el año 2009 y 2011, y con la
absorción teórica del enlace C-O-C entre 800 cm-1 y 1275 cm-1.
De igual forma, las longitudes encontradas en la región entre 3000 cm-1 y 3870
cm-1 corresponden a la absorción teórica entre 3120 cm-1 y 3570 cm-1 del enlace
O-H y entre 3020 cm-1 y 3085 cm-1 del enlace C-H.
Para las regiones entre 1850 cm-1 y 2210 cm-1, entre 2350 cm-1 y 2565 cm-1, y
entre 1380 cm-1 y 1726 cm-1 encontradas exclusivamente en muestras de plasma y
sangre, no se identificaron antecedentes que coincidieran con los hallazgos.
71
Por otro lado, en la región NIR, las longitudes de onda encontradas entre 11100
cm-1 y 11950 cm-1 no se evidencian referenciadas en estudios anteriores. Sin
embargo, con respecto a la región entre 5190 cm-1 y 5700 cm-1, Webster y
colaboradores muestran en su libro estudios hallazgos entre 5296 cm-1 y 7194
cm-1, y el Dr. Pulenta considera el armónico de la vibración C-H en 5924 cm-1,
longitud de onda que coincide con los hallazgos puntuales de 5958 cm-1 y 5890
cm-1 del presente estudio.
Webster y colaboradores reportan de igual forma en su libro longitudes de onda
entre 4180 cm-1 y 4892 cm-1, que coinciden con la región comprendida entre 4700
cm-1 y 4900 cm-1 encontrada en la presente investigación. Para las longitudes de
onda entre 8790 cm-1 y 9265 cm-1, entre 6000 cm-1 y 6760 cm-1, y entre 10400
cm-1 y 10900 cm-1, no se encuentra bibliografía relacionada.
Algunas de las variaciones presentes en los espectros, y la obtención de outliers
para cada uno de los set recolectados, permitió identificar la alta importancia de
las condiciones de laboratorio para este tipo de análisis, al igual que los protocolos
de limpieza de los accesorios, ya que una mala limpieza puede interferir en
espectros posteriores.
72
7. RECOMENDACIONES
Los resultados de la presente investigación se prestan para realizar diferentes
análisis y contrastes estadísticos debido a las combinaciones de técnicas
aplicadas. Esto puede conllevar a estudios enfocados en alguna de las regiones
utilizadas para la construcción de los modelos, y una validación más exhaustiva de
los mismos.
De igual forma, la información permite realizar comparaciones entre las técnicas
de selección utilizadas, evidenciando su validez no solamente para esta aplicación
en particular, sino como identificadores de variables de predicción en diferentes
análisis cuantitativos.
Una vez se analicen en detalle las regiones y longitudes de onda utilizadas en los
modelos con menor error, es necesario iniciar procesos de diseño de equipos
portables en las diferentes regiones del espectro IR, con el fin de realizar pruebas
clínicas y acercarse aun mas a la posibilidad de una medición no invasiva y
portable.
Para estudios posteriores enfocados a las diferentes regiones identificadas como
significativas por el presente estudio, algunas de las cuales se encuentran
confirmadas por estudios anteriores, se propone realizar mediciones de matrices
más complejas como lo son simuladores de tejido y tejidos reales.
La inclusión de estos simuladores puede darse de forma digital en el
procesamiento de los datos, o de forma física en la obtención de los espectros
correspondientes. La primera de ellas con ayuda de paquetes de programas de
simulación óptica como el OptoIQ, mientras que la segunda puede hacer uso de
polímeros denominados “optical phantoms”, desarrollados para simular la
respuesta del tejido en diferentes regiones del espectro, investigados y
comercializados por la compañía Biomimic.
73
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77
ANEXOS
Anexo A. Espectros filtrados y sin outliers
Figura 17. Espectro DGA NIR
78
Figura 18. Espectro DGA MIR 1
79
Figura 19. Espectro DGA MIR 2
80
Figura 20. Espectro Plasma MIR Sujeto A
81
Figura 21. Espectro Plasma MIR Sujeto B
82
Figura 22. Espectro Plasma NIR Sujeto A
83
Figura 23. Espectro Plasma NIR Sujeto B
84
Figura 24. Espectro Sangre MIR Sujeto A
85
Figura 25. Espectro Sangre MIR Sujeto B
86
Figura 26. Espectro Sangre NIR Sujeto A
87
Figura 27. Espectro Sangre NIR Sujeto B
88
Anexo B. Cuadros de validación de los modelos de predicción
Cuadro 11. Estadísticas Espectro DGA NIR
Cuadro 12. Estadísticas Espectro DGA MIR 1
89
Cuadro 13. Estadísticas Espectro DGA MIR 2
Cuadro 14. Estadísticas Espectro Plasma MIR Sujeto A
90
Cuadro 15. Estadísticas Espectro Plasma MIR Sujeto B
Cuadro 16. Estadísticas Espectro Plasma NIR Sujeto A
91
Cuadro 17. Estadísticas Espectro Plasma NIR Sujeto B
Cuadro 18. Estadísticas Espectro Sangre MIR Sujeto A
92
Cuadro 19. Estadísticas Espectro Sangre MIR Sujeto B
Cuadro 20. Estadísticas Espectro Sangre NIR Sujeto A
93
Cuadro 21. Estadísticas Espectro Sangre NIR Sujeto B
94
Anexo C. Identificación de regiones a partir de modelos con menor RMSECV
Figura 28. Identificación de regiones DGA MIR
95
Figura 29. Identificación de regiones PSM MIR
96
Figura 30. Identificación de regiones SNG MIR
97
Figura 31. Identificación de regiones DGA NIR
98
Figura 32. Identificación de regiones PSM NIR
99
Figura 33. Identificación de regiones SNG NIR
100