Volumen 17 No. 3 Octubre - Diciembre, 2001 Acogida a la franquicia postal como correspondencia de segunda clase en la Administración de Correos de Ciudad de La Habana. CIRCULACIÓN: 1 600 ejemplares DIRECTOR Prof. José M. Ballester Santovenia SECRETARIO Dr. Porfirio Hernández Ramírez COMITÉ DE REDACCIÓN Delfina Almagro Vázquez Gisela Martínez Antuña René Rivero Jiménez Eva Svarch Guerchicoff PRECIO POR EJEMPLAR: $ 3,00 Rinaldo Villaescusa Blanco Consuelo Macías Abraham María Elena Alfonso Valdés ASESORES Sergio Arce Bustabad Adalberto Ballester Santovenia Paulino Basanta Otero José Carnot Uría Elvira Dorticós Balea Edgardo Espinosa Martínez Marianela Estrada del Cueto Alejandro González Otero Renée González Sampedro Ernesto de la Torre Montejo Catalino Ustáriz García Berta Vergara Antonio Bencomo Hernández Mirta Campos Edición Edición: FRANCES SAÍZ. Diseño de cubierta: EDUARDO ÁLVAREZ. Diseño interior: JOSÉ MANUEL OUBIÑA. Traducción: MILTON FERRER. Traducción La REVISTA CUBANA DE HEMATOLOGÍA, INMUNOLOGÍA Y HEMOTERAPIA es una publicación científica cuatrimestral que ofrece una información actualizada al número cada vez más creciente de médicos y otros profesionales interesados en estas tres especialidades, y sirve de intercambio de información científica con especialistas de otros países, fundamentalmente latinoamericanos. Referencias bibliográficas. Sumario y resúmenes en español e inglés. Fotos e ilustraciones. Formato: 16,5 x 23,5 cm. Organismos patrocinadores: Instituto Nacional de Hematología e Inmunología, y Sociedad Cubana de Hematología. SECRETARÍA DE REDACCIÓN TODA LA CORRESPONDENCIA DEBE DIRIGIRSE A: Centro Nacional de Información Admitimos contribuciones de médicos de Ciencias Médicas. cubanos y extranjeros. Los originales Calle E No. 452 e/ 19 y 21. El Vedado. Ciudad de La Habana. deben ser remitidos según las «Instruc- 10400, Cuba. ciones al autor». Los trabajos serán inéditos. Solicitamos y agradecemos el canje con publicaciones similares. Correo electrónico: cnicm @ infomed.sld.cu Fax: 333063. Télex: 0511202. Teléfonos: 32-5338, 32-4519 y 32-4579. 145 INSTRUCCIONES AL AUTOR P R E S E N T A C I Ó N D E O R I G I N A L E S 1. You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980;79:311-4. 2. Goate AM, Haynes AR, Owen MJ, Farrall M, James LA, Lai Ly, et al. Predisposing locus for Alzheimer’s disease on chromosome 21. Lancet 1989;1:352-5. 3. New linking salt and hypertension [editorial]. BMJ 1981;282: 1993-4. · Los trabajos serán inéditos. Una vez aprobados, no podrán someterse a la consideración de otra revista, con vistas a una publicación múltiple, sin la debida autorización de la Editorial Ciencias Médicas (ECIMED). · La extensión máxima será 8 cuartillas para los trabajos originales, 12 las revisiones y 4 las comunicaciones breves e informes de casos, incluidas las tablas y figuras. LIBROS Y OTRAS MONOGRAFÍAS 4. Weinstein I, Swartz MN. Pathologic properties of invading microorganism. En: Sodeman WA Jr Sodeman WA, eds. Pathologic physiology: mechamisms of disease. Philadelphia: WB Saunders, 1974:457-72. 5. Eisen HN. Immunology: an introduction to molecular and celular principles of the immune response. 5. ed. New York: Harper and Row, 1974:406. · Los artículos se presentarán mecanografiados en papel blanco, a doble espacio, con márgenes no inferiores a 2,5 cm y 60 pulsaciones (comprendidos los espacios en blanco), con un total de 28 a 30 líneas por cuartilla, escrita por una sola cara, sin tachaduras ni arreglos manuscritos. Todas las páginas se numerarán, con arábigos y consecutivamente, a partir de la primera. La versión impresa debe acompañarse de un disquete de 3.5 pulgadas en lenguaje Microsoft Word, sin sangrías, tabuladores o cualquier otro atributo de diseño (títulos centrados, justificaciones, espacios entre párrafos, etc.). El disquete se le devolverá al autor. · Resultados y Discusión. Deben presentarse separados. · Conclusiones. No se presentarán aparte, deben estar desarrolladas en la discusión y mencionadas en el resumen. · Primera página. Contendrá el nombre de la institución que auspicia el trabajo; el título que no excederá las 15 palabras; nombres y apellidos completos de todos los autores ordenados según su participación (si el número es superior a 4 se aclarará, por escrito, el aporte de cada uno en la investigación o preparación del artículo); grado científico y categoría docente o investigativa más importante de cada autor, así como su dirección y teléfono. · Tablas, modelos y anexos. Se presentarán en hojas aparte (no se intercalarán en el artículo) y en forma vertical numeradas consecutivamente y mencionadas en el texto . No se aceptarán en papel fotográfico. Las tablas se ajustarán al formato de la publicación y la editorial podrá modificarlas si éstas presentan dificultades técnicas. · Segunda página. Incluirá un resumen informativo de 150 palabras, como máximo, contentivo de los propósitos, procedimientos empleados, resultados más relevantes y principales conclusiones del trabajo al igual que cualquier aspecto novedoso. El autor reflejará el contenido del documento a partir de 3 a 10 términos o frases (palabras clave) al pie del resumen y en orden de importancia. Por su parte, la ECIMED le insertará los descriptores correspondientes a la indización de cada trabajo según el DeCS y el MeSH. · Figuras. Las fotografías, gráficos, dibujos, esquemas, mapas, salidas de computadora, otras representaciones gráficas y fórmulas no lineales, se denominarán figuras y tendrán numeración arábiga consecutiva. Las fotografías se presentarán en papel de brillo con suficiente nitidez y contraste y un ancho máximo de 10 cm. Los gráficos y dibujos se confeccionarán con tinta china negra en cuartilla blanca o papel vegetal con un ancho máximo de 15 cm. Cada figura portará su número correspondiente y una flecha en el reverso que indique la parte superior, escritos con trazos de lápiz suave que no la dañen, Todas se mencionarán en el texto. Los pies de figuras se mecanografíarán en página independiente a 2 espacios. El total de las figuras y tablas ascenderá a 5 para los trabajos originales y de revisión y 3 para las comunicaciones breves e informes de casos. · Referencias bibliográficas. Se mecanografiarán a 2 espacios, en párrafo francés y en hoja aparte. Se seguirán las recomendaciones contenidas en los Requisitos uniformes para preparar los manuscritos que se proponen para publicación en revistas biomédicas, confeccionados por el Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (CIERM). Se numerarán según el orden de mención en el texto y deberán identificarse mediante arábigos en forma exponencial. Los trabajos originales no sobrepasarán las 20 citas; las revisiones, de 25 a 50 y las comunicaciones breves e informes de casos, 10. Se incluirán citas de documentos publicados relevantes y actualizados. Deberá evitarse la mención de comunicaciones personales y documentos inéditos; sólo se mencionarán en el texto entre paréntesis si fuera imprescindible. Las referencias de los artículos aprobados para su publicación, se incluirán indicando el título de la revista y la aclaración en prensa entre paréntesis (). Se relacionarán todos los autores del texto citado; si tiene 7 o más autores, se mencionarán los 6 primeros, seguidos de «et al.» Los títulos de las revistas se abreviarán por el Index Medicus (List of journals indexed in Index Medicus). No se destacará ningún elemento con el uso de mayúsculas ni el subrayado. Se observarán el ordenamiento de los elementos bibliográficos y el uso de los signos de puntuación prescritos por el estilo Vancouver. A continuación, se ofrecen ejemplos de algunos de los principales casos: · Abreviaturas y siglas. Las precederá su nombre completo la primera vez que aparezcan en el texto. No figurarán en títulos ni resúmenes. Se emplearán las de uso internacional. · Sistema Internacional de Unidades (SI). Todos los resultados de laboratorio clínico se informarán en unidades del SI o permitidas por éste. Si se desea añadir las unidades tradicionales, éstas se escribirán entre paréntesis. Ejemplo: glicemia: 5,55 mmol/L (100mg/100 mL). · Los trabajos que no se ajusten a estas instrucciones, se devolverán a los autores. Los aceptados se procesarán según las normas establecidas por la ECIMED. Para facilitar la elaboración de los originales, se orienta a los autores consultar los requisitos uniformes antes señalados. R E V I S T A S 1. You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980;79(2):311-4. Opcionalmente, se admite la omisión del número en las revistas con paginación consecutiva para cada volumen. Los autores residentes en Ciudad de La Habana o en el extranjero enviarán sus trabajos a la Ecimed. Los del interior del país, los entregarán al centro provincial de información correspondiente. 146 Sumario • Contents ARTÍCULOS DE REVISIÓN LAS HISTIOCITOSIS Histiocytosis Eva Svarch, Rafael Arteaga, Valia Pavón Morán y Alejandro González Otero 151 AGAMMAGLOBULINEMIA LIGADA AL X O DE BRUTON. ASPECTOS CLÍNICOS, MOLECULARES Y TERAPÉUTICOS Bruton or X-linked agammablobulinemia. Clinical, molecular and therapeutic aspects Vianed Marsán Suárez 164 ARTÍCULOS ORIGINALES FRECUENCIA DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS A1, A2, AINT, B Y O EN INDIVIDUOS NORMALES Frequency of blood groups A1, A2, Aint,B and O in normal subjects Marcela García Rosasco, Samanta Lippi y Juana Valverde 171 EVALUACIÓN Y TERAPÉUTICA INMUNOLÓGICA EN LA OTITIS MEDIA SUPURATIVA CRÓNICA NO COLESTEATOMATOSA Evaluation and immunological therapeutics in chronic suppurative otitis media without cholesteatoma Miriam de la C. Sánchez Segura, Julianis Quintero Noa, Vianed Marsán Suárez, Elisa Leyva Montero, Isabel M. Torres Leyva, René M. González García y Consuelo Macías Abraham 175 147 NUEVO SISTEMA HOMÓLOGO AUTOCATALÍTICO PARA EVALUAR CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CÉLULAS DEPENDIENTES DE ANTICUERPOS New equivalent autocatalytic system for evaluating antibodydependent cell-mediated citotoxicity José de la Paz Naranjo 184 ALTERACIONES DE LAS SUBCLASES DE IgG EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA IgG subclasses alterations found in patients with sickle cell anemia Rinaldo Villaescusa Blanco, Ada A. Arce Hernández, Julio C. Merlín Linares, Ana M. Guerreiro Hernández, Luz M. Morera Barrios, Edgardo Espinosa Martínez y Porfirio Hernández Ramírez 189 TÉCNICAS VALORACIÓN DE LA TITULACIÓN DE ANTICUERPOS ANTITETÁNICOS POR UMELISA EN DONANTES ESPECIALES Assessment of anti-tetanic antibody titration by UMELISA in special donors Lázaro Mena López, Ciro Núñez Mesa, Nancy Pérez Cabarco, José Fernández Estrada, Rafael Muñoz Fernández, Lester López Molina y Yaramis Armenteros Medina 194 MÉTODO FOSFATASA ALCALINA ANTI-FOSFATASA ALCALINA PARA EL DIAGNÓSTICO DE INMUNODEFICIENCIAS CELULARES Alkaline phosphatase – anti-alkaline phosphatase method for the diagnosis of cell immunodeficiencies Berta B. Socarrás Ferrer, Vianed Marsán Suárez, Miriam Sánchez Segura, Yamilka González de Armas y Consuelo Macías Abraham 201 COMUNICACIÓN BREVE NUEVA OPCIÓN TERAPÉUTICA EN LA LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA New therapeutical option in chronic myeloid leukemia Porfirio Hernández Ramírez 205 148 CARTAS AL DIRECTOR ANALGESIA ELECTROACUPUNTURAL EN LA TOMA DE MUESTRA PARA BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA Electro-acupunctural analgesia applied to sample-taking for bone marrow biopsy Julio D. Fernández Águila, Reynaldo Quintana Ponce, Tamara Guerra Alfonso, Leobaldo Prieto Jiménez y Maritza Cabrera Zamora 211 IMPLANTACIÓN DE LA ACTIVIDAD REGULATORIA DEL CECMED EN EL BANCO DE SANGRE PROVINCIAL DE CAMAGÜEY Implementation of the regulatory activity of the Center for the State Control of Drug Quality in the Provincial Blood Bank of Camagüey Ciro Núñez Mesa, Nancy Pérez Cabarco, Grisel Ug Guevara y Yaramis Armenteros Medina 213 149 150 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):151-63 Artículos de revisión Instituto de Hematología e Inmunología LAS HISTIOCITOSIS Dra. Eva Svarch, Dr. Rafael Arteaga, Dra. Valia Pavón Morán y Dr. Alejandro González Otero RESUMEN El término histiocitosis identifica un grupo de alteraciones que tienen en común la proliferación de células dendríticas (CD) y los macrófagos, y se diagnostican más frecuentemente en niños. Dentro de las relacionadas con las CD las fundamentales son las histiocitosis a células de Langerhans (HCL). Las HCL tienen un comportamiento clínico muy variable, que puede ir desde una lesión que involucra un solo sitio o sistema hasta una enfermedad multisistémica. El tratamiento depende de la extensión del proceso. Una lesión única tiende a desaparecer espontáneamente. También la biopsia diagnóstica con o sin inyección de un esteroide puede iniciar la curación. Los pacientes con enfermedad multisistémica pueden beneficiarse con el tratamiento esteroideo y citostático o inclusive con el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas. La histiocitosis sinusal con linfoadenopatías masivas o enfermedad de Rosai Dorfman se debe a la proliferación de los macrófagos, es de naturaleza benigna y usualmente autolimitada. Afecta sobre todo a niños y adultos jóvenes. La linfohistiocitosis hemofagocítica también se produce por la proliferación de los macrófagos y es una enfermedad rara con una alta mortalidad. Puede ser familiar (autosómica recesiva) o secundaria a infecciones virales. Esta última forma se presenta más frecuentemente en el lactante pequeño. En la actualidad, sobre todo en la variedad familiar, el trasplante alogénico de células progenitoras hematopoyéticas puede ser la única medida curativa. DeCS: HISTIOCITOSIS DE CELULAS NO LANGERHANS/diagnóstico; HISTIOCITOSIS DE CELULAS DE LANGERHANS/diagnóstico; HISTIOCITOSIS DEL SENO/diagnóstico; NIÑO. Las histiocitosis son enfermedades del sistema histiofagocítico que se presentan más frecuentemente en los niños. El histiocito es una célula del sistema inmune que incluye, entre otros, a los macrófagos y a las células dendríticas o dendrocitos. Los macrófagos son los encargados de procesar el antígeno y las células dendríticas de presentarlo a los linfocitos T. Una de las células dendríticas más importante es la célula de Langerhans (CL) que tiene su origen en la médula ósea y reside, en condiciones normales, en la piel, 151 mucosas malpighianas y pulmón; representa del 1 al 2 % de las células de la epidermis y es importante en la vigilancia inmunológica cutánea. La clasificación actual de las histiocitosis se expone en el anexo 1.1 En este trabajo nos referiremos solamente a las histiocitosis relacionadas con las CL, y a algunas relacionadas con los macrófagos, la enfermedad de Rosai Dorfman y la histiocitosis hemofagocítica. inmunológica primaria. Se ha planteado la estimulación de los linfocitos T por un superantígeno, pero esto no se ha podido corroborar.5 Las CL tienen su origen en las células CD34 positivas de la médula ósea, de la cual migran por vía hematógena hacia la epidermis cubriendo con sus dendritas el 25 % de su superficie.6 A partir de la piel migran por vía linfática hacia la zona paracortical de los ganglios para cumplir su función de presentación del antígeno a los linfocitos T. Al contrario de los monocitos y macrófagos, su función de presentación del antígeno predomina sobre la actividad fagocítica. En la histiocitosis a células de Langerhans (HCL) las CL pueden infiltrar todos los órganos: hígado, bazo, tracto digestivo, pulmón, sistema nervioso central y hueso. Es probable que en su migración participen moléculas de adhesión específicas. Se ha encontrado expresión de los CD54, CD58, β1 integrina, α 4, CD2, CD11a, CD11b y CD62L.7 Algunas manifestaciones generales como fiebre y pérdida de peso parecen estar condicionadas por citocinas: IL 1, IL8; FNT α, GM-CSF, interferón γ.7,8 A pesar de que se ha demostrado que se trata de un proceso clonal, la mayoría de los autores coinciden en que es de naturaleza reactiva y no neoplásica.9 HISTIOCITOSIS DE CÉLULAS DE LANGERHANS (HCL) Conocida anteriormente como histiocitosis X (granuloma eosinófilo, enfermedad de Letterer Siwe y enfermedad de Hans Schuller Christian), 2 tiene un espectro clínico muy amplio, que va desde una lesión osteolítica que cura espontáneamente hasta una enfermedad letal semejante a la leucemia. Su evolución es extremadamente variable; indolente durante mucho tiempo o rápidamente progresiva y fatal. También una lesión única puede evolucionar hacia una forma diseminada o hacia la cronicidad. Puede presentarse a cualquier edad, desde el nacimiento hasta la ancianidad, pero se diagnostica más entre 1 y 13 años y es ligeramente más frecuente en varones.3 Su incidencia es de 0,54 / 100 000 niños de 0 a 15 años y de 1,64 / 100 000 en niños entre 0 y 2 años de edad.4 ANATOMÍA PATOLÓGICA En contraste con la heterogeneidad clínica de la HCL, los hallazgos histológicos son uniformes en todas las variedades; el más característico es la presencia de la CL en un contexto semejante al de la inflamación con neutrófilos, eosinófilos, células plasmáticas, linfocitos e histiocitos multinucleados gigantes.10 El hallazgo morfológico patognomónico de las CL es la presencia, en el ETIOPATOGENIA A pesar de numerosos estudios, la etiología es aún desconocida. La etiología viral es poco probable, aunque en algunos pacientes se ha encontrado el genoma de un herpes virus tipo 6. Tampoco se ha podido comprobar que sea una alteración 152 CUADRO CLÍNICO estudio con microscopia electrónica, de los corpúsculos de Birbeck en forma de raqueta localizados en el citoplasma, adyacentes o contiguos a la membrana.11 Inicialmente las lesiones son celulares y en ellas predominan los histiocitos, pero cuando tienen mucho tiempo de evolución, sobre todo las óseas, son paucicelulares, fibróticas, algunas semejantes al xantogranuloma.10 Depende de la extensión de la enfermedad y del tejido u órgano comprometido. En la enfermedad multisistémica están afectados muchos órganos y pueden presentarse manifestaciones generales: fiebre, anorexia, pérdida de peso, anemia, manifestaciones hemorrágicas (sobre todo petequias localizadas en tronco fundamentalmente), astenia e irritabilidad.16 CARACTERIZACIÓN DE LA CL Las CL tienen marcadores de membrana que reaccionan con la aglutinina del maní, la fosfatasa alcalina placentaria, el receptor para el interferón α, la ATP asa, la α D manosidasa,12 el CD45 y la proteína S100.10,13 Un marcador muy específico es el CD1a, que puede ser positivo también en algunos casos de xantogranuloma y de enfermedad de Rosai Dorfman. 2 En la actualidad este marcador se puede estudiar en láminas procesadas con parafina mediante el CD 010.14,15 LESIONES ÓSEAS Se encuentran en casi todos los pacientes con enfermedad localizada y son muy frecuentes en la multisistémica. El signo inicial suele ser un aumento de tamaño indoloro de las partes blandas. El cráneo es el sitio más afectado, en segundo lugar los huesos largos de los miembros superiores y luego los planos: costillas, pelvis y vértebras. El estudio radiológico muestra una o varias lesiones líticas de bordes bien delimitados. Puede existir exoftalmía cuando se afectan las paredes de la órbita. Las lesiones que se producen en la mastoides son semejantes a la mastoiditis y si el proceso se extiende al oído medio puede conducir a la sordera. Cuando la osteólisis tiene lugar en el maxilar se producen dientes flotantes. En una niña con HCL multisistémica atendida en nuestro instituto se observó una necrosis digital no descrita con anterioridad producida por lesiones de vasculitis.17 DIAGNÓSTICO El diagnóstico puede ser presuntivo cuando el cuadro clínico y la morfología con microscopia óptica son característicos; probable cuando a las lesiones histológicas típicas se le agrega la positividad por lo menos de 2 de los siguientes marcadores: ATPasa, lectina del maní, proteína S-100 y α D manosidasa, y definitivo cuando hay positividad al CD1a y están presentes los gránulos de Birbeck en la microscopia electrónica.1 Hay autores que consideran que cuando el cuadro clínico y radiológico es típico, se puede realizar el diagnóstico con un estudio histológico por microscopia óptica con la coloración de hematoxilina eosina.5 PIEL Las manifestaciones cutáneas son muy frecuentes y a menudo el primer signo de la enfermedad; son lesiones eritematosas y 153 conductillos biliares que pueden progresar hacia la colangitis esclerosante, cirrosis biliar e insuficiencia hepática. Ésta se manifiesta por ictericia, edemas por hipoalbuminemia y alteraciones de la coagulación. El aumento de tamaño del bazo puede ser un factor adicional en las citopenias producidas por el hiperesplenismo secundario. En una paciente de nuestro servicio que no respondió al tratamiento es evidente la gran hepatoesplenomegalia con ascitis (fig. 1). escamosas parecidas a la dermatitis seborreica. Se localizan en la piel del cráneo, cara, regiones retroauriculares, pliegues y región perianal. En el lactante sin localizaciones de la HCL en otros sitios, pueden curar espontáneamente.18 MÉDULA ÓSEA Y SANGRE PERIFÉRICA La anemia y la trombocitopenia no son raras, menos frecuente es la leucopenia. Estas alteraciones se atribuyen a una disfunción de la médula ósea, pero su patogenia no es clara. En la médula ósea normal no parecen existir CL, aunque sí otros tipos de células dendríticas. El aumento de histiocitos no es diagnóstico y no es frecuente que se encuentre infiltración, por lo que su estudio no es concluyente. 10 Cuando se demuestra infiltración se acompaña casi siempre de gran hepatoesplenomegalia, lesiones de la piel y fiebre, y tiene valor pronóstico desfavorable. 19 Recientemente se ha comenzado el estudio del CD1a en la médula ósea por citometría de flujo.20 HÍGADO Y BAZO El hígado puede estar aumentado de tamaño por infiltración por CL o debido a la compresión de la vena porta por ganglios linfáticos. La hepatomegalia puede también relacionarse con la hiperplasia e hipertrofia de las células de Kupffer, como resultado de la activación generalizada del sistema inmunológico celular sin infiltración por CL ni hepatopatía obstructiva. Las alteraciones histopatológicas oscilan desde la colestasis moderada hasta la severa infiltración por CL, CD1a +, pero sin gránulos de Birbeck,18 de las áreas portales con evidencias de lesiones hepatocelulares y de los FIG.1. Gran hepatoesplenomegalia y ascitis en una niña de 4 años de edad con histiocitosis de células de Langerhans multisistémica PULMONES Las lesiones pulmonares ocurren a cualquier edad, pero son más frecuentes 154 en la tercera década de la vida. Generalmente se acompañan de fiebre, disnea y pérdida de peso. En la radiografía de tórax aparece un infiltrado micronodular y el diagnóstico se realiza por la presencia de células CD1a positivas en el líquido del lavado bronquial. Evolutivamente aparecen en ocasiones quistes o bulas que al romperse producen neumotórax. En la fase final existen fibrosis y enfisema.21 7 horas y se confirma por la medición de la vasopresina en orina.24 La diabetes insípida aparece fundamentalmente cuando existen lesiones en el cráneo o enfermedad multisistémica. SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Pocos pacientes presentan alteraciones del sistema nervioso central, su frecuencia exacta se desconoce. Además de las lesiones del hipotálamo con la consecuente diabetes insípida, se describen alteraciones del cerebelo, tallo cerebral, hemisferios cerebrales y médula espinal. Algunos enfermos presentan signos de hipertensión intracraneal o ataxia, adiadococinecia, temblor, disartria, hiperreflexia, hemiplejía o cuadriplejía y disfagia, con o sin déficit intelectual.25 APARATO GASTROINTESTINAL Las lesiones del aparato gastrointestinal son raras. Se evidencian por un síndrome de malabsorción con detención del crecimiento, diarreas con o sin sangre o enteropatía exudativa. En el estudio radiológico se observan segmentos de dilatación del intestino delgado que alternan con otros de estenosis. Para el diagnóstico es necesario realizar endoscopia y biopsia de la mucosa intestinal.18,22 ASOCIACIÓN DE LA HCL CON ENFERMEDADES MALIGNAS TIMO Su frecuencia es mayor que lo que cabría esperar por el azar.26 La asociación con leucemias, linfomas o tumores sólidos puede ser atribuida a la quimioterapia o a la radioterapia utilizada en la HCL, pero en ocasiones la precede y a veces coexisten ambos procesos.26 Puede haber aumento de tamaño del órgano y en ocasiones es el único afectado. En la necropsia se encuentra siempre infiltrado.23 GLÁNDULAS ENDOCRINAS PRONÓSTICO La alteración más frecuente es la diabetes insípida, y aunque en general aparece en períodos avanzados de la evolución o como una secuela, se puede presentar en cualquier período en el 17,5 % de los pacientes.3 Su patogenia no se conoce bien y el diagnóstico presuntivo se realiza por la prueba de deprivación de agua durante Depende de la edad en el momento del diagnóstico y del cuadro clínico inicial. Los niños con menos de 2 años de edad y disfunción hepática, pulmonar o de la médula ósea, tienen mal pronóstico. Los aspectos que se tienen en cuenta para el criterio de mal pronóstico en la HCL se 155 detallan en el anexo 2. 27 Existe una correlación lineal entre la mortalidad y el número de órganos afectados; cuando 1 ó 2 están tomados, la mortalidad es del 10 %, cuando son más de 2 la mortalidad alcanza el 90 %.28 Los pacientes con enfermedad localizada en hueso tienen un excelente pronóstico, con mortalidad casi nula. Parece ser que en un niño con enfermedad multisistémica la presencia de lesiones óseas tiene buen pronóstico, mientras que las lesiones cutáneas son de pronóstico desfavorable.29 dividieron al azar para recibir prednisona y vinblastina (VBL) o prednisona y etopósido (VP 16). Con este tratamiento se pudieron identificar en las primeras 6 semanas a los enfermos que no respondían favorablemente, los que se pasaron a la otra rama. Sin embargo, del 10 al 20 % de los enfermos desarrollaron enfermedad progresiva y fallecieron.32 El tratamiento que recomienda en la actualidad la Sociedad Internacional del Histiocito es el LCH-II que se expone en las figuras 2 y 3. 20 En este esquema se recomienda utilizar la VBL a 0,2 mg/kg de peso en los niños de menos de 10 kg y profilaxis de la infección por Neumocistis carinii con sulfametoxazol-trimetropín. Los pacientes de bajo riesgo o con enfermedad localizada que requieren quimioterapia se tratan todos con la rama A. 20 En los enfermos que no responden a ninguna de las ramas de ese protocolo se aplica el protocolo LCH-S, que consiste en la realización de trasplante de células progenitoras hematopoyéticas20 o tratamiento inmunosupresor con ciclosporina A y globulina antitimocítica.33 A diferencia de lo que ocurre en el cáncer, el objetivo del tratamiento en la HCL es el control y no la erradicación de todas las lesiones; el término remisión completa, por lo tanto, no se debe usar.34 Existen varios tipos de respuesta: la más favorable es aquella en la que no se demuestran evidencias de enfermedad con desaparición de los signos y síntomas. En otras ocasiones los signos y síntomas persisten o mejoran, sin aparición de nuevas lesiones, y en otras la HCL progresa, ya sea porque empeoran los signos y síntomas detectados en el momento del diagnóstico o porque aparecen otros nuevos. TRATAMIENTO Depende de la extensión de la lesión. Cuando está localizada a un solo tejido, habitualmente hueso, se puede observar su evolución sin realizar ningún tratamiento. El simple curetaje con o sin inyección de esteroides, cura del 80 al 90 % de los casos; en el 10 % de ellos se producen recidivas, nuevas localizaciones o secuelas, como la diabetes insípida.30 La radioterapia solo se debe utilizar cuando la lesión es inaccesible a la cirugía y compromete órganos críticos, por ejemplo vértebras, con posible compresión de la médula espinal. Las dosis deben ser bajas: de 400 a 800 cGy. Cuando la enfermedad afecta un solo sistema en muchos sitios o es multisistémica, se debe emplear la quimioterapia. El primer estudio cooperativo que demostró la eficacia de la quimioterapia aplicada temprano en la evolución de la enfermedad y que permitió el análisis de niños con diferentes grados de actividad, fue el DAL HX-83.31 En 1991, la Sociedad Internacional del Histiocito instituyó el protocolo LCH-I, en el cual los pacientes se 156 Tratamiento inicial Día 0 Semana 8 15 22 29 36 42 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 2 Vinblastina 6mg/mt IV 2 Prednisona 40mg/mt /día Tratamiento de continuación 6 Semana 9 12 15 18 21 24 2 Vinblastina 6mg/mt IV 2 Prednisona 40mg/mt /día 2 G mercaptopurina 60mg/mt /día FIG. 2. Protocolo HCL-II Rama A. Algunos aspectos del tratamiento de la HCL aún no están claros. Hay acuerdo en cuanto a cómo tratar una lesión ósea única y en cuanto a que en una enfermedad con compromiso multisistémico una quimioterapia relativamente agresiva es beneficiosa, pero no hay consenso en cómo tratar la enfermedad progresiva refractaria, la que incluye la hipófisis con diabetes insípida, la crónica que recae y la infiltración crónica y progresiva del pulmón, hígado o sistema nervioso central. Parte de esa falta de consenso se debe a que persiste la ambivalencia en relación con la patogenia, pues aún no está definido si es una enfermedad neoplásica, una alteración inmunológica o ambas.35 HISTIOCITOSIS RELACIONADAS CON LOS MACRÓFAGOS (ENFERMEDAD DE ROSAI DORFMAN) Es más frecuente en adultos jóvenes. Su etiología es desconocida. Se ha relacionado con una infección por el virus de Epstein-Barr, lo que podría alterar la respuesta a un antígeno específico pero desconocido.36 Existen evidencias de que la célula infiltrante es de naturaleza policlonal.37 Se presenta en general con adenopatías cervicales bilaterales, a veces desfigurantes indoloras (fig. 4). Cualquier 157 Tratamiento inicial Día 0 Semana 8 15 22 29 36 42 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 2 VP-16 150mg/mt IV 2 Vinblastina 6mg/mt /día 2 Prednisona 40 mg/mt /día Tratamiento de continuación 6 Semana 9 12 2 VP-16 150mg/mt IV 2 Vinblastina 6mg/mt /día 15 18 21 24 2 Prednisona 40mg/mt /día 2 G mercaptopurina 60mg/mt /día FIG. 3. Protocolo HCL-II Rama B. grupo ganglionar puede estar afectado. En el 30 % de los enfermos las manifestaciones pueden ser extraganglionares, las más frecuentes son: nasofaringe, glándulas salivales, cavidad oral, huesos y piel.36 La inmunopatología de esta entidad consiste en un llenado progresivo de los sinusoides de los ganglios linfáticos con histiocitos y linfocitos que llevan casi a un borramiento de la arquitectura del ganglio linfático. Elementos muy importantes son la leucofagocitosis y la eritrofagocitosis. En ocasiones el paciente presenta fiebre y corta estatura.36 Las lesiones cutáneas son xantomatosas y las del hueso, líticas, difíciles de diferenciar de las de la HCL. No se ha definido aún un tratamiento estándar. Debido a que casi siempre tiene Fig. 4. Adenopatías cervicales en un paciente de 14 años con enfermedad de Rosai-Dorfman. 158 un curso autolimitado se trata de no usar quimioterapia. Por otra parte, ni ésta ni los esteroides han probado su eficacia. Algunos pacientes han respondido al interferón α y otros a la G mercaptopurina y methotrexato (MTX) orales administrados durante largos períodos de tiempo. Si la enfermedad es indolente no se aconseja tratamiento. Los hallazgos patológicos típicos son: proliferación marcada de histiocitos sin características de malignidad con marcada hemofagocitosis. 12 La infiltración por histiocitos y linfocitos es generalizada, abarca la médula ósea, los órganos linfoides secundarios y todos los órganos vitales, incluyendo el sistema nervioso central.40,41 Sin tratamiento, la LHHF primaria es rápidamente fatal. Se han utilizado diferentes protocolos en los que los medicamentos de elección son la predinosona con VBL o con VP16. La radioterapia en cráneo y el MTX intratecal han aumentado la sobrevida. Exanguinotransfusiones o plasmaféresis repetidas han inducido remisión en algunos pacientes, al igual que el uso de globulina antitimocítica y de la ciclosporina A. Estos tratamientos han logrado aumentar la sobrevida, a veces hasta los 5 años, pero no la curación. El único tratamiento curativo es el trasplante alogénico de células progenitoras hematopoyéticas. La Sociedad Internacional del Histiocito recomienda el protocolo HLA-94, en el que se combina la ciclosporina A con prednisona y VP16 y MTX intratecal. El objetivo es conseguir la estabilización del cuadro clínico para realizar después el trasplante de médula ósea. En la LHHF asociada a virus se recomendaba evitar la quimioterapia. Sin embargo, hay casos controlados con quimioterapia y también se han obtenido éxitos con el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas, sobre todo cuando se demuestra que la activación de las células asesinas naturales está disminuida o ausente. Una extensa revisión sobre este tema se ha publicado recientemente.42 LINFOHISTIOCITOSIS HEMOFAGOCÍTICA La linfohistiocitosis hemofagocítica (LHHF) puede ser familiar, autosómica recesiva, o secundaria. La LHHF familiar se sospecha cuando algún otro miembro de la familia ha sido afectado, o cuando se comprueba consanguinidad en los padres, además se presenta en los primeros meses de la vida siempre en niños menores de 2 años y es uniformemente fatal. La variedad secundaria aparece después de los 2 años, parece estar relacionada con infecciones virales, sobre todo con el virus de EpsteinBarr (síndrome hemofagocítico asociado a virus), y puede curar.38 La frecuencia de las manifestaciones clínicas en la LHHF se observa en la figura 5 y en la 6 se expone el porcentaje de los resultados de las pruebas de laboratorio. En los 2 tipos de LHHF la patogenia se desconoce. Se plantea que está en relación con un defecto en la activación de las células asesinas naturales. Las interacciones inmunológicas entre las células son exageradas y persistentes. En algunos casos el proceso es monoclonal.39 159 Fiebre100% Citopenia 95,9% Disfunción hepática 95,8% Hepatoesplenomegalia 83,8% Ictericia 54,8% Adenopatías 42,8% Coagulopatías 75,4% Síntomas SNC 32,3% 0 20 40 60 80 100 120 FIG. 5. Linfohistiocitosis hemofagocítica. Manifestaciones clínicas. 120 FIG. 6. Linfohistiocitosis hemofagocítica. Pruebas de laboratorio. Hemofagocitosis 100% Ferritina elevada 100% LDH elevada 100% IL2-R elevada 97,6% IFN gamma elevado 80% Actividad de NK disminuida 37,9% Triglicéridos elevados 50% Fibrinógeno bajo 57,4% 0 20 40 60 80 100 160 ANEXO 1. Clasificación actual de las alteraciones histiocíticas Alteraciones con comportamiento biológico variable − Relacionadas con la célula dendrítica: • Histiocitosis de células de Langerhans. • Procesos a células dendríticas secundarios. • Xantogranuloma juvenil y alteraciones asociadas. • Histiocitomas solitarios de células dendríticas con fenotipos variables. − Relacionadas con el macrófago: • Síndromes hemofagocíticos. • Linfohistiocitosis hemofagocítica primaria (familiar y esporádica producida por infecciones virales). • Síndromes hemofagocíticos secundarios. Asociados a infección. Asociados a procesos malignos. Otros. • Enfermedad de Rosai Dorfman (histiocitosis sinusal con adenopatías masivas). • Histiocitoma solitario con fenotipo de macrófago. Alteraciones malignas − Relacionadas con el monocito: • Leucemias (clasificación FAB). • Leucemia monocítica M5a y b. • Leucemia mielomonocítica M4. • Leucemia mielomonocítica crónica. • Tumor o sarcoma monocítico extramedular (contraparte monocítica del sarcoma granulocítico). − Relacionadas con células dendríticas: • Sarcoma histiocítico relacionado con la célula dendrítica (localizado o diseminado) de fenotipo específico: célula dendrítica folicular, célula dendrítica interdigitante, etc. - Relacionadas con el macrófago: • Sarcoma histiocítico relacionado con el macrófago (localizado o diseminado). ANEXO 2. Criterios de mal pronóstico de la HCL Alteraciones hepáticas −Proteínas totales −Albúmina −Bilirrubina total −Edema −Ascitis < 5,5 g/dL < 2,5 g/dL > 1,5 mg/dL Alteraciones pulmonares −Taquipnea −Disnea −Cianosis −Tos −Pneumotórax −Derrame pleural Alteraciones hematopoyéticas −Hemoglobina −Leucocitos −Neutrófilos −Plaquetas < < < < 10 g/dL 4 x 109 /L 1,5 x 109 /L 100 x 109 /L 161 SUMMARY The term histiocytosis identifies a group of disorders that have in common the proliferation of dentritic cells (DC) and macrophages and is frequently diagnosed in children. Among the fundamental variants of histiocytosis related with DC, we find Langerhans cell histiocytosis (LCH). Langerhans cell histiocytosis has very variable clinical behavior that ranges from a lesion involving only one site or system to a multisystem disease. Treatment depends on the spread of the process. An only lesion tends to spontaneously disappear. Also diagnostic biopsy with or without steroid injection may lead to healing. Those patients with multisystem disease may benefit from an steroid and cytostatic-based treatment or even from progenitor hematopoietic cell transplantation. Sinus histiocytosis with massive lymphadenopathies or Rosai Dorfman disease is a benign and usually self-limited disease which is caused by the macrophage proliferation; it generally affects children and young adults. Hemophagocytic lymphohistiocytosis is also caused by macrophage proliferation and is a rare disease with a high mortality rate. It can be familiar hemophagocytic lymphohistiocytosis (recessive autosomal) or secondary to viral infections, being the latter form the most frequent in infants. At present, mainly in the familiar variant, the progenitor hematopoietic allogenic transplant may serve as the only curative option. Subject headings: HISTIOCYTOSIS, NON-LANGERHANS-CELL/diagnosis; HISTIOCYTOSIS LANGERHANS-CELL /diagnosis; HISTIOCYTOSIS, SINUS/ diagnosis; CHILD. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Favara BE, Feller AC, Pauli M, Jaffe ES, Weiss LM, Aricó M, et al. A contemporary clasification of histiocytic disorders of childhood. Med Pediatr Oncol 1997;29:157-66. 2. Favara BE. Langerhans cell histiocytosis: pathobiology and pathogenesis. Semin Oncol 1991;18:3-7. 3. The French Langerhans cell histiocytosis study group: 348 cases observed between 1983 and 1993. Arch Dis Child 1996;75:17-24. 4. Catersen H, Ornvold K. The epidemiology of Langerhans cell histiocytosis in children in Denmark 1975-1984. Med Pediatr Oncol 1993;21:387-8. 5. Beverley PCL, Abbas AK. The scientific challenge of Langerhans cell histiocytosis. Br J Cancer 1994;70:561-3. 6. Chu T, Jaffe R. The normal Langerhans cell and the LCH cell. Br J Cancer 1994;70:4-10. 7. Graaf J, Rienk Y, Tamminga J, Kamps WA, Timens W. 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Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537)578268. Fax: (537)338979. e-mail:ihidir@hemato.sld.cu 163 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):164-70 Instituto de Hematología e Inmunología AGAMMAGLOBULINEMIA LIGADA AL X O DE BRUTON. ASPECTOS CLÍNICOS, MOLECULARES Y TERAPÉUTICOS Dra. Vianed Marsán Suárez RESUMEN La agammaglobulinemia ligada al X o de Bruton constituye el prototipo de deficiencia primaria de célula B. Los niños varones afectados presentan infecciones recurrentes y manifestaciones autoinmunes a partir de los 6 meses de edad. La utilización de modernas técnicas de biología molecular ha permitido la identificación del gen responsable de la enfermedad en el locus Xq22. La naturaleza genética de la misma ha posibilitado además, la detección de madres portadoras y la realización de un diagnóstico prenatal. Actualmente se continúa en la profundización de los aspectos moleculares, con el objetivo de manipular el material genético de los pacientes con fines terapéuticos, lo que resultará en una cura definitiva de la enfermedad. DeCS: AGAMMAGLOBULINEMIA/diagnóstico; CROMOSOMA X/ inmunología; LINFOCITOS B; PROTEINO-TIROSINA QUINASA/deficiencia. Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son desórdenes congénitos que afectan la función del sistema inmunológico, lo que provoca una respuesta inmune inadecuada a microorganismos patógenos, antígenos propios y células tumorales, que se manifiesta clínicamente en un incremento de la susceptibilidad a las infecciones, enfermedades alérgicas, neoplásicas y autoinmunes.1,2 Las anomalías congénitas en el desarrollo y la función de los linfocitos B, dan lugar a una producción defectuosa de anticuerpos (Acs). Los pacientes con estos desórdenes presentan infecciones recurrentes por bacterias piógenas como neumococo, estafilococo, estreptococo y Haemophilus. Además, son susceptibles a ciertas infecciones virales, como la poliomielitis y a algunos parásitos intestinales como la Giardia lamblia, lo que demuestra el papel importante de los Acs en la adherencia, opsonización y fagocitosis de estos organismos. 3,4 La agammaglobulinemia ligada al X (ALX) fue la primera IDP identificada en 1952 por Bruton, por lo que también es llamada agammaglobulinemia de Bruton, y constituye el prototipo de déficit de células B. Es una enfermedad ligada al cromosoma X, de forma tal que las mujeres que presentan el gen defectuoso en uno de sus cromosomas X son normales, pero cuando lo transmiten a sus hijos varones, estos manifiestan la enfermedad. 4,5 164 DIAGNÓSTICO presencia de Acs maternos; en este caso, una biopsia intestinal que muestre la ausencia de células plasmáticas en la lámina propia del intestino, pudiera ser indicada para confirmar el diagnóstico; sin embargo, por lo invasivo del proceder, se recomienda repetir los estudios en el segundo semestre de vida.4,11 Estos pacientes presentan una respuesta celular conservada, la cuantificación de subpoblaciones linfocitarias T, la prueba de hipersensibilidad retardada, la linfoproliferación frente a la fitohemaglutinina y el cultivo mixto de linfocitos muestran valores normales; de igual forma, la actividad de las células asesinas naturales es normal.11 Los niños varones con ALX comienzan a presentar infecciones bacterianas recurrentes a partir de los 6 meses de edad, tiempo en que los Acs maternos adquiridos pasivamente comienzan a ser catabolizados.6 Estos pacientes presentan infecciones causadas fundamentalmente por bacterias grampositivas que colonizan diferentes órganos, principalmente oído medio, bronquios, pulmones, conjuntivas, piel y meninges; pueden además ser infectados en menor frecuencia por enterovirus y virus de la hepatitis. El 20 % de los casos presenta artritis séptica que puede estar asociada o no con un síndrome de malabsorción intestinal. Se ha descrito en algunos pacientes la aparición de manifestaciones autoinmunes, entre las que se encuentran la colitis ulcerativa, una artritis similar a la reumatoide juvenil y anemia hemolítica autoinmune.7-9 En el examen físico de estos niños es característico encontrar la ausencia de tonsilas y adenopatías, así como una disminución del peso y la talla para su edad.4 El diagnóstico clínico debe ser corroborado por la demostración de la ausencia o la marcada disminución de las 5 clases de inmunoglobulinas (Igs) en sangre periférica, mediante una electroforesis de proteína, cuantificación de Igs e inmunoelectroforesis. El nivel serológico de la IgG total usualmente se encuentra por debajo de 250 mg/dL, el resto de los isotipos M, A, D y E, se encuentran extremadamente bajos o no son detectados. La respuesta de Acs específicos tras estimulación con diferentes antígenos está marcadamente deprimida.4,7,10 Este diagnóstico se hace difícil antes de los 6 meses de edad, debido a la DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Para el diagnóstico definitivo de una ALX es necesario descartar otras enfermedades que presentan comportamientos clínicos y serológicos bastante similares, entre las que se encuentran: la hipogammaglobulinemia fisiológica (HF) o transitoria de la infancia (HTI), la malabsorción intestinal severa (MIS), la artritis juvenil (AJ) y la fibrosis quística (FQ). Durante los 3 a 6 meses de vida, el niño presenta una HF como consecuencia de la disminución paulatina de la IgG materna adquirida a través de la placenta y el inicio progresivo de la producción propia de Acs; en el caso de que esta última se retrase, aparece la denominada HTI, que puede persistir hasta los 2 ó 3 años de edad; los niveles de Igs totales se sitúan entre 200 y 400 mg/dL y el número de linfocitos B es normal. Es una ID poco frecuente, con escasas manifestaciones clínicas, que en muchas ocasiones no se diagnostica; afecta por igual a ambos sexos, lo que la 165 diferencia de la ALX. Su incidencia parece ser mayor en familiares de individuos afectados por deficiencia de IgA o inmunodeficiencia variable común. El paciente debe controlarse hasta que normalice la producción de Igs, y las pautas de vacunación han de retrasarse hasta que exista una respuesta adecuada de Acs, la cual es recomendable comprobar midiendo la tasa de Acs específicos posvacunación. La necesidad de tratamiento con gammaglobulina es excepcional.4 La absorción defectuosa de nutrientes a través de la mucosa intestinal da lugar a un síndrome caracterizado por desnutrición proteico-energética, deposiciones anormales, distensión abdominal y carencias de vitaminas y minerales; en algunos casos, la diarrea puede ser episódica. Cuando la MIS se manifiesta con carácter oligosintomático en forma de un retardo del crecimiento de causa no determinada, y con poca sintomatología digestiva, hace más difícil el diagnóstico. La pérdida entérica de proteínas incluye también la de Igs y de albúmina; sin embargo, a diferencia de la ALX, esta puede afectar a ambos sexos, el número de linfocitos B circulantes es normal y la biopsia de la lámina propia intestinal muestra un número normal de células plasmáticas.12 La AJ es la inflamación sinovial crónica de causa no conocida; se caracteriza por lo general por un cuadro poliarticular que se inicia antes de los 16 años de edad, y que puede comenzar de una manera progresiva con pocos síntomas generales, o hacerlo mediante un cuadro agudo que precede a las manifestaciones artríticas. Otras formas de presentación clínicas son la pauciarticular y la sistémica. Similar a la ALX, en estos pacientes hay detención prematura del crecimiento, pero en este caso, debido a un cierre precoz del cartílago de conjunción. A diferencia, en la AJ las hembras son las más afectadas y son más frecuentes las manifestaciones dérmicas. El nódulo reumatoideo no se halla prácticamente nunca, como es característico encontrar en la artritis del adulto. Los estudios de laboratorio muestran generalmente hipoproteinemia y anemia marcada, el factor reumatoide y los Acs antinucleares son generalmente positivos, la electroforesis de proteína y la cuantificación de Igs muestran hipergammaglobulinemia y aumento de todos los isotipos de Igs respectivamente, contrario a lo observado en la ALX.13 La FQ es un trastorno hereditario multisistémico que afecta a niños y adultos, que se caracteriza principalmente por una obstrucción crónica e infección de las vías respiratorias y por mala digestión y sus consecuencias. A diferencia de la ALX, es frecuente encontrar en estos pacientes pólipos nasales, hipertensión portal, hemorragias por várices esofágicas, pancreatitis recurrente y exantema análogo a la acrodermatitis enteropática. Generalmente se encuentran antecedentes familiares de la enfermedad. Valores de cloruros en sudor iguales o mayores a 60 mEq/L corroboran el diagnóstico clínico. En algunos casos, estas concentraciones son normales; sin embargo, la comprobación de mutaciones específicas y de un fenotipo compatible bastan para confirmar el diagnóstico.14 BASES MOLECULARES El hecho de que los pacientes con ALX muestran una ausencia o disminución drástica de sus linfocitos B maduros 166 circulantes, y en médula ósea (MO) un número normal de células pre-B, hacía pensar la existencia de un bloqueo en la diferenciación de estas a células maduras inmunocompetentes. 15 Investigaciones recientes han mostrado que mutaciones en el gen que codifica para una tirosina quinasa citoplasmática, la que se ha denominado tirosina quinasa de Bruton (Btk), son responsables de la aparición de la ALX en el humano y de la ID ligada al X en el ratón. El gen responsable ha sido identificado en el locus Xq22.16,17 Estudios in vivo e in vitro indican que la proteína Btk es esencial para la supervivencia de la célula B, la progresión del ciclo celular y la proliferación en respuesta a estímulos antigénicos a través de receptores específicos.17,18 Esta proteína muestra una secuencia de aminoácidos (aa) altamente homóloga a los miembros de la familia Src de tirosinas quinasas citoplasmáticas Fyn, Lck y Lyn que fosforilan residuos de tirosina, por lo que están involucradas en la transducción de señales en las células hematopoyéticas. La proteína Btk presenta 4 dominios: SH1, SH2, SH3 y PH. Los dominios SH2 y SH3 están involucrados en el reconocimiento intermolecular y en la regulación de la actividad quinasa (fig.).16,19 Las mutaciones de la Btk han sido divididas en 3 categorías: 1) funcionales, cuando afectan los residuos de aa que participan directamente en la unión a fosfotirosinas; 2) estructurales, cuando producen cambios conformacionales que interfieren con el reconocimiento de los residuos de tirosinas fosforilados; y 3) funcio-estructurales, cuando incluyen las categorías anteriores. Las principales mutaciones han sido identificadas en los dominios SH2 y SH3.20 La alta heterogeneidad molecular del gen que codifica para la proteína Btk y el grado de expresión de esta, son responsables de la gran variabilidad fenotípica de la enfermedad.21 Recientes estudios han demostrado el papel importante de la Btk en el incremento de las concentraciones intracelulares de calcio en respuesta a estímulos a través del receptor específico de la célula B; la Btk parece estar involucrada en la activación de las proteínas quinasas activadas por estrés JNK/SAPK 2/2 y por lo tanto, en la regulación de c-jun y de otros factores de transcripción importantes en la activación de los genes para citocinas. Esta regulación de la vía de activación de JNK/ SAPK puede estar relacionada con la función proapoptótica de la Btk en la muerte celular programada en estas células hematopoyéticas.18,19,22 La proteína Btk se expresa en células pro-B, pre-B, B madura, mastocitos y eritrocitos, no así en células plasmáticas ni en linfocitos T. El hecho de que células mieloides y mastocitos expresen proteínas de la superfamilia de Btk adicionales como Tecll e Itk, pudiera explicar por qué estas células no se encuentran ausentes en pacientes con ALX. 23 Estos estudios son la primera demostración de que la mutación o la expresión alterada de una tirosina quinasa citoplasmática puede resultar en la aparición de una enfermedad humana hereditaria; de igual forma, han permitido profundizar en el papel de las tirosinas quinasas en la ontogenia linfoide B y en la patogénesis de las IDP.5-23 TRATAMIENTO Actualmente el tratamiento de elección de los pacientes con ALX consiste en la administración de gammaglobulina endovenosa a razón de 200-400 mg/kg/dosis 167 Subfamilia Btk ( Btk, Itk/Tsk, TeclI ) PH Subfamilia Src ( Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck Blk, Hck, Fgr, Yrk ) SH3 SH2 Myr P SH3 Subfamilia Abl ( Abl, Arg ) SH1 SH2 SH1 Myr SH3 SH2 SH1 Subfamilia Fps ( Fps/Fes, Fer ) SH2 SH1 Subfamilia Jak ( Jak1, Jak2, Tyk2 ) SH1-like SH1 Subfamilia Syk/Zap70 ( Syk/PTK72, Zap70) SH2 SH2 SH1 Myr: miristilación; P: sitio de regulación de la fosforilación. FIG. Comparación de la subfamilia Btk y otras subfamilias de tirosinas quinasas citoplasmáticas. cada 3 ó 4 semanas por varios ciclos. Dosis superiores a 500 mg/kg son efectivas para la prevención de infecciones bacterianas severas e insuficiencia pulmonar.24 Otros pilares importantes en el tratamiento de estos pacientes son la educación a familiares acerca de la enfermedad, extremar las medidas de higiene personal y ambiental, la protección de barreras naturales evitando procederes invasivos, la nutrición adecuada, la lactancia materna, así como el uso de antibióticos sistémicos de amplio espectro para el tratamiento de las infecciones. Debe evitarse la administración de vacunas vivas atenuadas. 4,24 168 El trasplante de MO y de stem cell pudieran ser procederes esperanzadores; sin embargo, el uso de la terapia génica, que permite el remplazo del gen afectado, ofrecerá la cura definitiva a estos.25-28 El diagnóstico prenatal de ALX puede realizarse por la demostración de la ausencia de células B en la sangre fetal. 30 La incidencia de las IDP es baja,1,4 sin embargo, su pronóstico muy sombrío,4 por lo que un amplio conocimiento de estas permite diagnosticarlas y tratarlas precozmente, lo que mejora la calidad de vida de los pacientes y disminuye su mortalidad. La naturaleza genética de esta enfermedad posibilita la detección de portadoras asintomáticas, realizar un diagnóstico prenatal con el consiguiente consejo genético para prevenir estos nacimientos y una vía para un mejor entendimiento de la inmunorregulación humana. DETECCIÓN DE PORTADORAS Y DIAGNÓSTICO PRENATAL Las mujeres heterocigóticas portadoras de ALX pueden ser detectadas por la inactivación al azar del cromosoma X. Las células B de estas mujeres muestran una disminución del crecimiento selectivo en aquellas células que contienen el alelo anormal.29 SUMMARY Bruton or X-linked agammaglobulinemia is the prototype of primary B-cell deficiency. Affected male children present with recurrent infections and autoimmune manifestations at the age of 6 months on. The use of modern molecular biology techniques made it possible to detect the gene responsible for the disease in locus Xq22. Genetic character of the disease also allows the detection of carrier mothers and the prenatal diagnosis. Currently, the research on the molecular aspects of the disease continues to be deepened so as to handle the genetic material of patients for therapeutical use, which will result in a final cure for the disease. Subject headings: AGAMMAGLOBULINEMIA/diagnosis; X CHROMOSOME/ immunology; B-LYMPHOCYTES; PROTEIN TYROSINE KINASE/deficiency. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Ten RM. Primary immunodeficiencies. Mayo Clin Proc 1998;73(9):865-72. 2. Lederman HM. Cancer in children with primary or secondary immunodeficiencies. J Pediatr 1995;127(2):335. 3. García JA, Pacheco A, Regueiro JR. Physiopathogenesis and molecular bases of the primary immunodeficiencies. Sangre 1999;44(2):107-22. 4. Buckeley R. Primary immunodeficiency diseases. En: Paul WE, ed. Fundamental immunology. 3 ed. New York: Raven, 1993:1353-74. 5. Conley ME. X-linked immunodeficiencies. Curr Opin Genet Develop 1994;4:401-6. 6. Rosen FS, Cooper MD, Wedgwood RJ. The primary immunodeficiencies. N Engl J Med 1995;333(7):43140. 7. Kainulainen L, Varpula M, Liippo K, Svedstrom E, Nikoskelainen J, Ruuskanen O. Pulmonay abnormalities in patients with primary hypogammaglobulinemia. J Allergy Clin Immunol 1999;104(5):1031-6. 169 8. 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Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537)578268. Fax (537) 338979 e-mail:v.marsan@hemato.sld.cu 170 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):171-4 Artículos originales Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. Laboratorio de Inmunohematología, Hemorreología e Histocompatibilidad, Argentina FRECUENCIA DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS A1, A2, AINT, B Y O EN INDIVIDUOS NORMALES Dra. Marcela García Rosasco,1 Dra. Samanta Lippi 2 y Dra. Juana Valverde3 RESUMEN Se definen como A intermedio (Aint) los hematíes que comparten caracteres con A1 y A2. Existen diferencias cualitativas y cuantitativas en los epitopes A. Los hematíes A1 son aglutinados por la lectina de Dolichus biflorus (anti-A1), los A2 por la lectina de Ulex europaeus (anti-H), en tanto los hematíes Aint , son variablemente aglutinados por ambas de manera inesperada. Se realizó una búsqueda de individuos Aint en individuos sanos normales de acuerdo con la reacción con las lectinas mencionadas. Nuestros resultados concuerdan con observaciones previas sobre la marcada heterogeneidad de los hematíes Aint. Se estudiaron 1 301 muestras, de las cuales resultaron 703 O (54,04 %); 468 A (35,97 %); 106 B (8,15 %); 18 A1B (1,38 %) y 6 A2B (0,46 %). Las muestras A se subdividieron en: 346 A1 (73,93 %); 82 A2 (17,52 %) y 40 Aint (8,55 %). El reconocimiento de subgrupos débiles del grupo A reviste importancia en la práctica forense y en el estudio de la dinámica de poblaciones. El estudio de la variante Aint es relevante en Inmunogenética Poblacional, por su contribución al conocimiento del mestizaje con poblaciones negras. DeCS: GRUPOS SANGUINEOS/inmunología; INMUNOGENETICA/métodos; MARCADORES GENETICOS/inmunología; SISTEMA DEL GRUPO SANGUINEO ABO/inmunología; DINAMICA DE POBLACION. 1 2 3 Doctora en Ciencias Biológicas. Investigadora Independiente. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Rosario. Auxiliar de Investigación. Laboratorio de Inmunohematología, Hemorreología e Histocompatibilidad, Rosario. Doctora en Bioquímica. Profesora Titular de Inmunología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. 171 El sistema de grupos sanguíneos ABO sigue siendo el primero a tener en cuenta en el momento de realizar una transfusión de sangre. Las cadenas sacáridas de glucoproteínas o de glucolípidos que lo componen están presentes, salvo excepciones, en todas las membranas celulares, en particular la membrana eritrocitaria. En la mayoría de los individuos también se encuentran en secreciones y líquidos biológicos. Los antígenos A y B son productos génicos fácilmente detectables y constituyen marcadores genéticos de gran valor. Entre los individuos A, se distinguen 2 categorías: A1, definido por un anticuerpo particular (anti-A 1 ), y A2 , que no es reconocido por este anticuerpo. Los glóbulos rojos de los individuos A1 presentan aproximadamente 106 sitios antigénicos por célula; en cambio, los A2 sólo poseen entre 0,2 y 0,4 x 106 sitios por glóbulo. Existen otros subgrupos A considerados débiles (A3, Ax, Aend, Am, Ael), en los que la reactividad antigénica es inferior a la de los glóbulos A2. La distinción entre A 1 y A 2 corresponde a una diferencia en el número y distribución de los receptores A en la membrana eritrocitaria y a una diferencia cualitativa de estructura. La diferenciación entre ambas se realiza mediante la utilización de anticuerpos monoclonales y lectinas específicas de grupo sanguíneo Dolichos biflorus (anti-A1) y Ulex europaeus (anti-H).1 Se definen como A intermedio (Aint) aquellos hematíes en los que se observan ciertos caracteres A1 y ciertos caracteres A2. El Aint presenta una mayor frecuencia en la raza negra que en caucásicos.2 Diferentes grupos de trabajo han utilizado diversos criterios para clasificar el Aint . Algunos clasifican como Aint aquellas células con reacciones débiles con Dolichos, pero con reactividad H más fuerte que las A2, mientras que otros las clasifican por su fuerte reactividad con Dolichos y Ulex.3-8 El objetivo del presente trabajo fue determinar la frecuencia de fenotipos A1, Aint y A2 en individuos normales de la ciudad de Rosario, Argentina. MÉTODOS Se enfrentaron glóbulos rojos suspendidos en plasma autólogo, al 40 %, con anti-A, B (Wiener, lote 709107), luego con anti-A (Wiener, lote 705001) y anti-B (Wiener, lote 712145) y, finalmente, con lectinas anti-A1 (CRTSH Nancy Francia, lote 94.3) y anti-H (Laboratorio de Inmunohematología, lote 980805). Las lectinas antiA1 y anti-H fueron diluidas para asegurar su especificidad, debido a que algunas lectinas puras presentan reacciones inespecíficas.9 De acuerdo con la reacción con las lectinas, las muestras A fueron clasificadas en A 1 (reacción positiva con anti-A1/ reacción negativa con anti-H); A2 (reacción negativa con anti-A1/reacción positiva con anti-H) y Aint (reacción positiva con ambas lectinas). Todo el procedimiento fue realizado en placa, a temperatura ambiente (20 °C), por los mismos operadores, a fin de optimizar la reproductibilidad. RESULTADOS Se estudiaron 1 301 muestras en las que se observaron frecuencias decrecientes de los grupos sanguíneos O, A, B y AB. Los resultados pueden observarse en las tablas 1 y 2. La intensidad de la reacción de aglutinación se definió por cruces, y se transformaron luego en un valor numérico 172 asignado según la convención: ++++ = 10, +++ = 8, ++ = 5, + = 2 y reacción negativa = 0. La tabla 3 presenta las reacciones de aglutinación obtenidas convertidas en escores cuali-cuantitativos. La prueba serológica de Simonin demostró la presencia de un solo anticuerpo (anti-B) en los individuos A1 y Aint, mientras que en los individuos A2 este anticuerpo estaba acompañado en algunos casos por otro anticuerpo de especificidad anti-A1, lo que coincide con la bibliografía que señala la presencia irregular de este anticuerpo.9-12 TABLA 1. Distribución de los individuos estudiados según el grupo sanguíneo ABO No. de muestras (n total = 1 301) % Grupo O A B AB DISCUSIÓN 703 (54,04) 468 (35,97) 106 (8,15) 18 A1 B (1,38) 6 A2 B (0,46) Las tablas 1 y 2 presentan valores de distribución poblacional para la ciudad de Rosario, referida a los distintos grupos del sistema ABO, y la tabla 3 los escores calculados a partir de la aglutinación producida para los distintos grupos A. La reacción con anti-A1 decrece desde el grupo A1 hacia el Aint. La reactividad con el anti-H se incrementa desde el Aint hacia el A2. Nuestras observaciones confirman lo expresado por Salmon4,5 con respecto a una marcada heterogeneidad en la expresión antigénica de los hematíes Aint. El reconocimiento de variantes débiles del grupo A reviste importancia en la práctica forense. 13,14 Consideramos importante señalar el valor de este estudio en dinámica de poblaciones por su contribución al conocimiento del mestizaje con poblaciones negras. TABLA 2. Distribución de los individuos estudiados según el grupo A No. de muestras (n total = 468) % Grupo A 346 (73,93) 40 (8,55) 82 (17,52) A1 Aint A2 TABLA 3. Escores cuali-cuantitativos de la reacción de aglutinación (media ± desviación estándar) Eritrocitos A1 A1B Aint A2B A2 anti-A 7,7 ± 1 8 ±0 7,5 ± 1,5 8 ±0 6,8 ± 2 Sueros y lectinas anti-H anti-A1 anti-B 8±1 7 ± 1,5 6 ± 2,5 0 0 0 7 ± 1,5 0 2±0 0 0 0 5±3 6 ± 1,7 6,1 ± 2,6 SUMMARY Blood cells that share characteristics with A1 and A2 are defined as A-intermediates. There are qualitative and quantitative differences in epitope A. Blood cells A1 are binded by Dolichus biflorus lectin(ant1-A1), blood cells A2 are binded by Ulex europareus lectin (anti-H) whereas Aint are indistinctively binded by both lectins in an unexpected way. Aint subjects were looked for among normal healthy individuals according to their reaction to the aforementioned lectins. Our results agree with previous remarks on the marked heterogenecity of blood cells Aint . One-thousand three hundred one samples were studied resulting in 703 from O group (54,04%); 468 from A group (35,97%); 106 from B group (8,15%); 18 from A1B (1,38%) and 6 from A2B (0,46%). The samples A were subdivided into 346 A1(73,93%), 82 A 2 (17,52%) and 40 Aint (8,55%). The detection of weak 173 subgroups within the A group has a great importance for forensic practice and the study of population’s dynamics. The study of Aint variant is relevant in Population Immunogenetics because of its contribution to the knowledge of crossbreeding with Black populations. Subject headings: BLOOD GROUPS/immunology; IMMUNOGENETICS/ methods; GENETIC MARKERS/immunology; ABO BLOOD GROUP SYSTEM/ immunology; POPULATION DYNAMICS. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Goldstein IJ, Hayes CE. The lectins: Carbohydrate-binding proteins of plants and animals. Adv Carbohydr Chem Biochem 1978;35:127. 2. Mourant AE, Kopéc AC, Domaniewska-Sobczak K. The distribution of the human blood groups and other polymorphisms. 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Marcela García Rosasco. Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional Rosario. J.C. Sánchez 4618, piso 2 Dto. 3-2000 Rosario, Argentina. Tel. 00 54 341 4613067. 174 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):175-83 Instituto de Hematología e Inmunología EVALUACIÓN Y TERAPÉUTICA INMUNOLÓGICA EN LA OTITIS MEDIA SUPURATIVA CRÓNICA NO COLESTEATOMATOSA Dra. Miriam de la C. Sánchez Segura, Dra. Julianis Quintero Noa, Dra. Vianed Marsán Suárez, Dra. Elisa Leyva Montero, Lic. Isabel M. Torres Leyva, Lic. René M. González García y Dra. Consuelo Macías Abraham RESUMEN Se estudiaron 40 pacientes con otitis media supurativa crónica no colesteatomatosa a los que se les realizó tratamiento quirúrgico (técnica cerrada). Se analizaron los resultados de las pruebas inmunológicas y la evolución clínica de 20 pacientes con tratamiento inmunológico preoperatorio por un período de 6 a 12 meses y se compararon con la de 20 pacientes operados sin dicho tratamiento. El seguimiento evolutivo se realizó durante un año posterior a la intervención quirúrgica. La alteración inmunológica más frecuente fue un déficit de la inmunidad celular (65 %), con defecto humoral asociado o sin él. Tuvo evolución no satisfactoria sólo 1 paciente que recibió tratamiento inmunológico previo, a diferencia de 11 (55 %) de los 20 pacientes operados sin dicho tratamiento. La deficiencia inmunológica contribuye a la evolución desfavorable de la otitis media supurativa crónica no colesteatomatosa y el tratamiento inmunológico previo puede ayudar al éxito del tratamiento quirúgico. DeCS: OTITIS MEDIA SUPURATIVA/inmunología; OTITIS MEDIA SUPURATIVA/cirugía; NIÑO. La otitis media supurativa crónica (OMSC) no colesteatomatosa se caracteriza por una perforación persistente de la parstensa de la membrana del tímpano y episodios de secreción auricular de forma variable y cuyo oído medio no se encuentra invadido por tejido epitelial cutáneo con origen en la membrana timpánica (MT) o conducto auditivo externo (CAE). La secreción auricular es purulenta, a veces fétida y los períodos de remisión entre las crisis son cortos, resistentes al tratamiento clínico en sus fases supurativas.1 La inflamación crónica de la hendidura del oído medio es lenta e insidiosa y patogénicamente es una afección multicondicionada. Entre los factores responsables de la cronicidad en las afecciones supurativas del oído medio se señalan: las anormalidades de la trompa de Eustaquio, la perforación persistente de la MT, la obstrucción permanente de la aereación del oído medio o de la apófisis mastoide, factores constitucionales como la alergia, desnutrición, infecciones y las alteraciones 175 del sistema inmunológico del paciente, entre otros.2-4 Estudios realizados en muestras de secreciones del oído medio de pacientes con OMSC han demostrado que la opsonización, tanto específica (IgG) como inespecífica (C3b) de las bacterias tiene gran importancia en la capacidad defensiva del huésped y puede servir para evaluar la respuesta inmunológica durante el curso de esta enfermedad.5,6 Se han reportado niveles bajos de inmunoglobulinas séricas, así como del complemento hemolítico en pacientes con OMSC. También se ha descrito un déficit de la inmunidad mediada por células en estos pacientes.2,7,8 Por estas razones, todos los pacientes con OMSC deben someterse a valoración médica integral para detectar estos trastornos subyacentes, ya que resulta difícil controlar la enfermedad a pesar del adecuado tratamiento médico, quirúrgico o de ambos.9 La otitis media es un problema social muy frecuente con gran significación para el futuro del niño, ya que sus secuelas son causantes de pérdida auditiva irreversible, por lo que reviste gran interés el diagnóstico temprano de esta entidad, para lograr la prevención de la cronicidad y evitar las futuras complicaciones. 1,4,10,11 Estos pacientes se encuentran sometidos a estados de sobretensión emocional (estrés psicológico), lo que trae como consecuencia afecciones en la esfera cognitiva, lo que desborda sus posibilidades de adaptación fisiológica y psicológica, sin soslayar la dinámica de las relaciones interpersonales que también se ve afectada en esta entidad. Múltiples evidencias han demostrado la estrecha relación existente entre el estrés y el sistema inmune. Estudios realizados en humanos han puesto de manifiesto que tanto la inmunidad celular como la humoral pueden afectarse por el estrés.12,13 En nuestro trabajo nos propusimos evaluar el estado inmunológico de pacientes pediátricos con OMSC no colesteatomatosa y valorar el efecto del tratamiento inmunológico previo al acto quirúrgico en aquellos de evolución tórpida, con el fin de contribuir a la remisión de esta enfermedad. MÉTODOS Se estudiaron 40 pacientes, 26 del sexo masculino y 14 del femenino, con una edad promedio de 9,5 años y un rango de 4 a 15 años, que acudieron a la consulta de Otología del Hospital Pediátrico "William Soler", a los cuales se les diagnosticó otitis media supurativa crónica (OMSC) no colesteatomatosa y fueron posteriormente remitidos a la consulta de Inmunología del Instituto de Hematología e Inmunología para su valoración previa al acto quirúrgico. La evaluación inmunológica incluyó la realización de un hemograma con diferencial, la cuantificación de las 3 principales clases de inmunoglobulinas séricas (IgG, IgA e IgM) por el método de inmunodifusión radial simple; 14 la determinación de la actividad hemolítica total de la vía clásica del sistema del complemento por el método de Mayer;15 la técnica de roseta espontánea y activa por el método de rosetas16 y el índice opsonofagocítico por una variante estandarizada en nuestro laboratorio.17,18 La evaluación otológica incluyó estudio microbiológico de las secreciones óticas, con cultivo y antibiograma, el cual puso de manifiesto una infección polimicrobiana. Los gérmenes más frecuentemente aislados fueron la Pseudomona aeruginosa, el estafilococo coagulasa positiva y el Proteus mirabilis. Estos pacientes recibieron tratamiento con antibioticoterapia local y sistémica; localmente el antibiótico más usado fue la ciprofloxazina. 176 De los 40 niños evaluados, 20 recibieron algún tipo de tratamiento inmunológico antes de ser intervenidos quirúrgicamente. El tratamiento fue indicado de acuerdo con la inmunodeficiencia detectada. Aquellos pacientes en quienes se diagnosticó una hipogammaglobulinemia recibieron terapéutica con Intacglobin por vía endovenosa, en dosis de 200 mg/kg/ dosis cada 21 días hasta completar 6 ciclos. A los que presentaron déficit selectivo de IgA se les administró Levamisol en dosis de 2,5 - 5 mg/kg 1 vez a la semana durante 8 semanas, en combinación con el factor de transferencia en dosis de 1 unidad subcutánea semanal por igual período de tiempo. Este mismo esquema de tratamiento se aplicó a los niños que presentaban déficit predominante de células T. Los pacientes que tuvieron déficit del sistema del complemento recibieron tratamiento con plasma fresco congelado homólogo, a razón de 10 mL/kg de peso cada 15 días, hasta hacer un total de 6 transfusiones, y a aquellos con déficit de la función fagocítica se les indicó el Levamisol en la misma dosis y tiempo de administración antes señalado. Todos los niños cuyo hemograma con diferencial arrojó una cifra disminuida de polimorfonucleares neutrófilos en sangre periférica, recibieron tratamiento con factor de transferencia en dosis de 1 unidad subcutánea 1, 2 ó 3 veces por semana, en dependencia del grado de severidad de este trastorno. En todos estos casos se prescindió del uso del Levamisol, dada la conocida toxicidad de este medicamento sobre la médula ósea. Además se les recomendó a todos los pacientes tratados inmunológicamente vitaminoterapia, la cual consistió en la administración de vitamina C (500 mg/día), vitamina A (25 000 unidades diarias en meses alternos, por el riesgo de acumulación de esta vitamina) y Multivit (1/2 tableta diaria a los niños menores de 9 años y 1 tableta diaria a los mayores de esta edad). Fueron seleccionados para recibir dicho tratamiento aquellos pacientes que presentaron otorrea persistente, de evolución tórpida y con pobre respuesta a la antibioticoterapia u otras medidas terapéuticas indicadas. Los 20 pacientes restantes no recibieron ningún tipo de tratamiento antes de la intervención. Se realizó examen otoscópico con lupa y otomicroscopio a todos los pacientes operados. El tratamiento quirúrgico consistió en la aplicación de técnicas cerradas, con conservación de la pared del conducto auditivo externo.19,20 La evaluación clínicoinmunológica se realizó cada 8 semanas los primeros 6 meses y cada 12 semanas los 6 meses siguientes. Desde el punto de vista clínico se les realizó a los pacientes examen otoscópico en consulta externa por el especialista de Otología. La evaluación inmunológica consistió en un examen evolutivo del estudio o los estudios que hubiesen arrojado resultados patológicos, acompañado de un hemograma. El seguimiento posoperatorio se realizó semanalmente los primeros 2 meses y de forma bimensual los meses siguientes, con revisión sistemática al año. Desde el punto de vista otológico, se consideró como evolución no satisfactoria la presencia de otorrea, edema de la mucosa de la caja timpánica (CT) o la presencia de granulación, y como satisfactoria aquella en la que los pacientes tuvieron un examen otoscópico normal. ANÁLISIS ESTADÍSTICO La información recogida fue clasificada según las variables estudiadas. Se utilizó como medida de resumen la frecuencia absoluta, porcentaje, promedio y rango. Se 177 aplicó la prueba no paramétrica X2 de homogeneidad, para conocer si existían diferencias en el comportamiento de los 2 grupos estudiados, con un nivel de significación del 5 %. Las combinaciones de defectos inmunológicos encontradas en los pacientes pediátricos evaluados fueron las siguientes: con déficit predominante de células T y defecto de la fagocitosis 4 pacientes (10 %), con déficit predominante de células T, defecto de la fagocitosis y aumento en la cifra de IgM 6 niños (15 %). Se encontró en 12 pacientes (30 %) un déficit predominante de células T con hiper IgM; con defecto predominante de células T, hiper IgM y además un defecto del sistema del complemento 4 (10 %), el déficit de IgA asociado con el defecto de la función fagocítica de los neutrófilos y a hiper IgM en 2 casos (5 %); una cifra elevada de IgM en combinación con un defecto de la fagocitosis y del complemento hemolítico en 2 (5 %) (tabla 2). Se encontró diferencia significativa (p = 1,90 1 E - 03) entre el comportamiento de los niños que recibieron tratamiento RESULTADOS De los 40 pacientes estudiados, sólo 10 tuvieron algún defecto inmunológico aislado (25 %), en el 75 % restante se observó una combinación de varios defectos inmunes. Los defectos aislados encontrados en los pacientes corresponden a hipogammaglobulinemia en 1 caso (2,5 %), déficit selectivo de IgA en 2 (5 %), déficit del sistema del complemento en 5 niños (12,5 %) y déficit inmunológico mixto en 2 (5 %) (tabla 1). TABLA 1. Defectos inmunológicos aislados hallados en pacientes con otitis media supurativa crónica no colesteatomatosa Defectos inmunológicos aislados Hipogammaglobulinemia Déficit selectivo de IgA Déficit del sistema del complemento Déficit inmunológico mixto TABLA 2. Defectos inmunológicos combinados hallados en pacientes con otitis media supurativa crónica no colesteatomatosa Número de pacientes (N = 10) 1 2 5 2 Se observó una disminución en la cifra global de los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos en la lámina de sangre periférica en un total de 30 casos (75 %) e hiper IgM en 26 (65 %). En combinación con otros defectos se observó un déficit predominante de células T en 26 pacientes (65 %), déficit de la fagocitosis en 14 (35 %), déficit del sistema del complemento en 6 pacientes (15 %) y déficit de IgA en 2 niños (5 %). 178 Defectos inmunológicos combinados Número de pacientes (N = 10) Déficit predominante de células T + hiper IgM 12 Déficit predominante de células T + defecto de la fagocitosis 4 Déficit predominante de células T + defecto de la fagocitosis hiper IgM 6 Déficit predominante de células T + déficit del complemento + hiper IgM 4 Déficit de IgA + déficit de la fagocitosis + hiper IgM 2 Defecto de la fagocitosis + déficit del sistema del complemento + hiper IgM 2 inmunológico previo al acto quirúrgico y los que no lo recibieron. De los 20 pacientes que recibieron dicho tratamiento, 19 (95 %) tuvieron una evolución satisfactoria y sólo 1 (5 %), que presentó otorrea, no evolucionó satisfactoriamente. Del total de niños no tratados inmunológicamente antes de la intervención sólo 9 (45 %) tuvieron evolución satisfactoria. De los 11 pacientes restantes (55 %) que no evolucionaron satisfactoriamente, 10 presentaron edema de la mucosa con otorrea y 1 tuvo granulación (tabla 3). pediátricos con OMSC no colesteatomatosa, y que nosotros conozcamos, no se ha reportado el tratamiento inmunológico previo al acto quirúrgico. En nuestro estudio encontramos déficit inmunológicos aislados sólo en 10 pacientes, con hipogammaglobulinemia en 1 caso y déficit selectivo de IgA en 2, lo que concuerda con lo reportado por otros autores.2,7,8 Por otra parte, Hirata y otros, al evaluar los niveles de inmunoglobulinas séricas en 77 niños con otitis media recurrente, con la finalidad de establecer la relación entre esta enfermedad y la inmunodeficiencia, encontraron que los niveles totales de IgG e IgM no fueron detectados por debajo del nivel normal; sin embargo, 7 niños tuvieron niveles reducidos de subclases de IgG y un niño presentó déficit de IgA. 23 La protección contra la infección tiene sus bases en una estrecha interrelación entre el sistema inmunitario innato y el adaptativo. En dependencia del tipo y contexto de un patógeno, el sistema inmunitario innato instruye al adaptativo para inducir una respuesta inmune apropiada.24 Forman parte importante de la inmunidad innata los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN). La disminución en el número global de estas células hallada en el 75 % de los pacientes estudiados, agrava aún más su estado de inmunodeficiencia, ya que la defensa efectiva del huésped contra la infección bacteriana es dependiente de la activación y el reclutamiento de células fagocíticas. 25 Los mecanismos responsables de la eliminación eficaz de bacterias de las vías aéreas incluyen, junto con los anticuerpos opsonizantes y las células T específicas de antígeno, la participación de los PMN activados.21 Además de su papel en las fases tempranas de defensa contra los microorganismos patógenos, la inmunidad TABLA 3. Evolución posoperatoria de pacientes inmunodeprimidos con otitis media supurativa crónica no colesteatomatosa Hallazgos otoscópicos Otorrea Edema de la mucosa Granulación Con tratamiento Sin tratamiento (N = 20) (N = 20) 1 0 0 * 10 1 Los 10 pacientes con edema de la mucosa presentaron además otorrea. * DISCUSIÓN Las enfermedades infecciosas se mantienen como causa de morbimortalidad en todo el mundo; las membranas mucosas son la puerta de entrada más frecuente de los microorganismos patógenos. 21 Las infecciones del tracto respiratorio superior son comunes tanto en niños normales como en inmunodeficientes durante su desarrollo. Una de las manifestaciones más frecuentes de las enfermedades por inmunodeficiencia es la OMSC. El diagnóstico de alteraciones inmunológicas es importante en la evaluación clínica, para que junto al tratamiento de la infección, le sea administrada la terapéutica inmunológica apropiada.22 Escasos trabajos reportan la evaluación inmunológica de pacientes 179 innata en los mamíferos parece desempeñar un importante papel en estimular la respuesta clonal subsecuente de la inmunidad adaptativa. 26 El déficit predominante de células T encontrado en el 65 % de los pacientes, así como el defecto de la función fagocítica en el 35 % de estos, ya ha sido comunicado con anterioridad. Iarlykov y otros, al estudiar el comportamiento de algunos parámetros inmunológicos en pacientes con OMSC, a los que se les indicó posteriormente tratamiento con sustancias adyuvantes, encontraron que el conteo de linfocitos T, así como la fagocitosis, estuvieron reducidos, con niveles incrementados de IgM en el período pretratamiento.8 Este incremento en las concentraciones de IgM fue encontrado en el 65 % de nuestros pacientes, lo que podría atribuirse a la infección crónica, la cual puede conducir a un déficit inmunológico adquirido acompañado de un aumento en los niveles de inmunoglobulinas.27 El estado de inmunodeficiencia de los pacientes incluidos en este estudio puede explicarse porque es bien conocido que la infección crónica es causante de un déficit inmunológico secundario28,29 y por el estrés al cual están sometidos estos pacientes. Entre los factores sociales, físicos y biológicos que provocan estrés, y por lo tanto, pueden ser causa de inmunodepresión, se pueden citar: la incapacidad de adaptación al medio, los traumatismos y las infecciones.30,31 Durante más de 30 años se ha hecho evidente que los eventos estresantes en humanos y en animales de experimentación están asociados con una disminución de las funciones inmunes dependientes de las células T, las principales células involucradas en el inicio de las respuestas inmunes adaptativas, con pérdida de la función Th1 y la consiguiente producción de citocinas y conservación de la función Th2 con producción incrementada de citocinas Th2.32 Se decidió indicar tratamiento inmunológico preoperatorio a aquellos pacientes inmunodeprimidos con evolución clínica desfavorable, basados en el carácter inmunosupresor conferido al acto quirúrgico, el cual está sustentado básicamente en el empleo de las diferentes sustancias anestésicas.33,34 Se ha reportado una disminución de la actividad de las células asesinas naturales (NK) en sangre periférica después de una intervención quirúrgica.35 Se ha comunicado también que las situaciones de trauma, que incluyen al trauma quirúrgico, inducen numerosos cambios en el sistema inmune que alteran señales celulares, las cuales resultan en la liberación de citocinas proinflamatorias y prostaglandinas que median la posterior depleción de la función inmune. La depresión de la presentación del antígeno y de la elaboración de citocinas por los macrófagos y otras células presentadoras de antígeno, evitan una respuesta normal del sistema inmune adquirido y las interacciones linfocitos-monocitos son afectadas. Esto trae consigo un estado de inmunodepresión, tanto humoral como celular, que da lugar a un organismo susceptible a las infecciones microbianas.36 Zemskov en su trabajo plantea la gran importancia que tiene el uso de medicamentos inmunocorrectores, debido a la insuficiente efectividad del tratamiento de muchas enfermedades crónicas, incluyendo la OMSC, manifestada por la supresión de los mecanismos inmunológicos iniciales.37 La diferencia significativa encontrada en nuestro trabajo entre el comportamiento de los niños que recibieron tratamiento inmunológico previo al acto quirúrgico y los que no lo recibieron, apoya la necesidad de la administración de sustancias inmunoestimulantes e inmunomoduladoras a los pacientes pediátricos que padecen esta 180 infecciones del tracto respiratorio superior.38 En nuestro trabajo se demuestra que existe asociación entre la OMSC no colesteatomatosa y la presencia de alteraciones inmunológicas, las cuales contribuyen a la evolución desfavorable de esta enfermedad, y que el tratamiento inmunológico previo puede ayudar al éxito del tratamiento quirúrgico. enfermedad y que van a ser sometidos a cirugía. Ha sido demostrado que la inmunomodulación puede incrementar la expresión de las moléculas de adhesión de la superficie celular y el endotelio vascular, por lo que aumenta la adherencia de los leucocitos PMN al endotelio, y esta regulación positiva puede estar ligada a un efecto beneficioso en la prevención de SUMMARY Forty patients suffering from chronic suppurative otitis media without cholesteatoma were studied and applied a surgical treatment (closed technique). The results of the immunological tests and the clinical progression of 20 patients under pre-operative immunological treatment were analyzed for 6-12 months and compared with those of 20 patients operated on without previous treatment. Patients’ recovery was followed up for a year after surgery. The most frequent immunological disorder was cell immunity deficiency (65%) with or without associated humoral fault. Only one patient did not recover in a satisfactory way after having received a previous immunological treatment in contrast with 11(55%) of 20 patients operated on without such treatment. Immunological deficiency contributes to an unsatisfactory development of chronic suppurative otitis media without cholesteatoma, so a previous immunological treatment may help to the success of the surgical treatment. Subject headings: OTITIS MEDIA, SUPPURATIVE/immunology; OTITIS MEDIA, SUPPURATIVE/surgery; CHILD. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Costa Rego N. Otitis media no colesteatomatosa. En: Sih T. Otorrinolaringología pediátrica. Barcelona: Springer Verlag Ibérica, 1999:139-43. 2. Kenna MA. Tratamiento para otitis media supurativa crónica. Clin Otorrinolaringol Norteam 1994;3:451-64. 3. Tood NN. Cranial anatomy and otitis media: a cadaver study. Am J Otol 1998;19:558-64. 4. Tarlow M. Otitis media: pathogenesis and medical sequelae. Ear Nose Throat J 1998;77(6 Suppl):3-6. 5. 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Fax (537) 338979. e-mail: m.sanchez@hemato.sld.cu 183 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):184-8 Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto” NUEVO SISTEMA HOMÓLOGO AUTOCATALÍTICO PARA EVALUAR CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CÉLULAS DEPENDIENTES DE ANTICUERPOS Lic. José de la Paz Naranjo1 RESUMEN Se propone un sistema que no requiere marcaje radioisotópico, sensible y sencillo que utiliza células efectoras, células diana y anticuerpos de la misma especie para evaluar citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos. La actividad citotóxica se evaluó en células mononucleares periféricas de donantes voluntarios de sangre, aparentemente sanos, y se amplificó en el proceso de lisis mediante la actividad peroxidasa de la hemoglobina liberada por células diana constituidas por eritrocitos O +, papainizados y recubiertos con anti-D. No se evidenció correlación lineal entre índices citotóxicos y relación linfocito/monocito. El método propuesto puede ser utilizado en exploraciones clínicas y experimentales sistemáticas. DeCS: CITOTOXICIDAD CELULAR ANTICUERPO-DEPENDIENTE/ inmunología; INMUNIDAD CELULAR; ERITROCITOR. de lisis se le denomina citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA).1-3 Entre los numerosos métodos in vitro para la evaluación de la CCDA, el radioisotópico, por su sensibilidad y carácter cuantitativo, es más utilizado que los visuales y colorimétricos. Esta superioridad implica instalaciones especiales y equipamiento de alto costo inexistentes en algunos laboratorios cubanos, así como personal entrenado y leyes reguladoras destinadas a proteger al En la práctica clínica, la evaluación de la citotoxicidad mediada por células depedientes de anticuerpos es útil para la valoración de la inmunidad celular en pacientes afectados por cáncer, infección viral, bacteriana o autoinmunidad. Varias poblaciones de linfocitos, los neutrófilos, fagocitos mononucleares y especialmente las células asesinas naturales (NK), son capaces de lisar diferentes tipos de celulas diana. En muchos casos, la muerte de la célula diana requiere que esté recubierta por IgG específica. A este proceso 1 Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto”. 184 personal técnico y al medio ambiente. Una alternativa sería amplificar la reacción citotóxica aprovechando la actividad enzimática de compuestos presentes sólo en las células diana, que elimina las desventajas de los métodos actuales. Es por esta razón que se ha utilizado en el presente trabajo la actividad peroxidasa de la hemoglobina, liberada por los eritrocitos humanos lisados, para evidenciar la CCDA.4-9 extrajo con una pipeta “Pasteur” el anillo que contenía las células mononucleares periféricas (CMP) en la interfaces, y se lavaron 2 veces mediante centrifugación a 1500 rpm durante 15 min con PBS. La concentración se ajustó a 8 x 106 cél/mL en medio esencial mínimo (MEM), libre de rojo fenol. MÉTODOS En calidad de células diana fueron utilizados eritrocitos O+, conservados en solución de ácido cítrico 7,3 g/L, citrato de sodio 22,0 g/L y dextrosa 24,5 g/L (ACD), por no más de 7 días a 4 °C. Los eritrocitos O + el día del ensayo se lavaron con solución de cloruro de sodio (0,15 mol/L), y se trataron enzimáticamente con una solución acuosa de papaína al 1 % durante 4 min. Posteriormente se sensibilizaron con suero hemoclasificador anti-D durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron con MEM para eliminar los anticuerpos no pegados. Una alícuota de hematíes fue también incubada en las mismas condiciones, pero esta vez, con albúmina 2,5 % como control. Se ajustó la concentración a 8 x 105 cél/mL.10-12 OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE CÉLULAS DIANA MUESTRA Se tomaron muestras de sangre venosa de 36 individuos aparentemente sanos, de ambos sexos, donantes voluntarios de sangre que acudieron al Servicio de Transfusiones del Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto” y que cumplían los siguientes criterios de inclusión: adultos menores de 55 años, que no hubieran recibido ningún tipo de hemoterapia ni tratamiento con inmunomoduladores en los 3 meses previos al estudio. A todos los donantes se les realizó leucograma y se les calculó la relación linfocitos/monocitos. DISEÑO AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERIFÉRICAS El ensayo de CCDA se realizó por cuadruplicado en placas de cultivo de 96 pozos de fondo plano. Los reactivos y la metodología utilizada se detallan en la tabla 1. Una vez dispensadas las células (efectoras y diana) en los pozos de la placa de cultivo, ésta fue centrifugada a 1 000 rpm durante 1 min e incubada a 37 °C durante 4 h. Después de este proceso, se homo- Las muestras de sangre obtenidas por punción venosa y anticoagulada con heparina libre de preservo (50 UI/mL), diluidas 2:3 con buffer fosfato salino (0,1 mol/L) y pH 7,4 (PBS), se depositaron sobre la mitad del volumen de urovideo 75 % (d = 1,077 g/cm3), en tubos de 13 x 100 mm y se centrifugaron a 2 500 rpm durante 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente se 185 TABLA 1. Concentraciones celulares y volúmenes de reacción en microlitros necesarios en el ensayo Relación (10:1) Célula efectora/célula diana Lisis experimental CMP 8 × 106 cél/mL Eritrocitos sensibilizados/anti-D 4 × 105 cél/mL Eritrocitos sensibilizados/albúmina 4 × 105 cél/mL Eritrocitos sin sensibilizar 8 × 105 cél/mL Agua destilada Lisis espontánea 50 100 Lisis máxima 50 100 50 100 geneizó la mezcla de reacción en cada pozo por resuspensión, con ayuda de una pipeta “Pasteur”, y se centrifugó a 1 000 rpm durante 5 min. Seguidamente se tomó una alícuota de 70 µL del sobrenadante y se mezcló con 100 µL de buffer citrato (0,1 mol/L) y pH 5,6, se le adicionaron 0,5 mL/L de peróxido de hidrógeno al 30 % y 0,6 g/L orto fenilendiamino (OPD), y se incubó a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. La reacción enzimática fue detenida por la adición de 30 µL de una solución de metabisulfito de sodio (0,5 mol/L) y la densidad óptica se midió a 450 nm contra blanco reactivo en un espectrofotómetro UV/visible. El grado de lisis de las células diana fue fijado por la liberación de hemoglobina durante 4 h de incubación a 37 °C (densidsad óptica, DO 450 nm) y expresado en porcentaje (%) de lisis específica mediante la fórmula: diferencias entre sustancias sensibilizantes, y un test de correlación entre porcentaje de lisis específica y relación linfocito/ monocito. El nivel de significación se fijó en una p ≤ 0,05. RESULTADOS Los valores promedios de hemólisis cuando se utilizaron hematíes recubiertos con anti-D fueron estadísticamente diferentes a los de los hematíes control, es decir, a los tratados con albúmina al 2,5 % que no fueron recubiertos con anti-D (tabla 2). TABLA 2. Indicadores de actividad citotóxica, expresados en unidades de densidad óptica Sensibilización Anti-D Albúmina 2,5 % Densidad óptica Media DE 0,217 0,161 0,046 0,053 Significación p < 0,05 (*) * % de lisis = lisis experimental - lisis espontánea x 100 específica lisis máxima - lisis espontánea La distribución de frecuencia de los índices citotóxicos determinados en el ensayo CCDA propuesto, se muestra en la figura. La relación linfocito/monocito (5,69/1) en los donantes estudiados no mostró influencia sobre los índices citotóxicos según el test de correlación lineal aplicado, en el que se obtuvo un índice de correlación de - 0,01. PROCESAMIENTO ESTADÍSTICO Los datos primarios se procesaron de forma automatizada mediante el paquete estadístico STATISTICA. Se aplicó un test T a las cifras medias de hemólisis, expresadas en DO a 450 nm, para conocer 186 Frecuencia 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 Además, los resultados alcanzados permitieron afirmar que el sistema homólogo empleado fue estadísticamente confiable y atribuir las diferencias entre lisis experimental y espontánea solamente a la inmunoglobulina anti-D, marcador empleado y facilitador de dicho proceso (tabla 2). Aunque se informa que los monocitos incrementan la fragilidad osmótica de los eritrocitos sensibilizados con anti-D,13 en este ensayo no se constató correlación entre relación linfocito/monocito e índices citotóxicos, lo que permitió utilizar para la evaluación células mononucleares y evitar de este modo la depleción de una u otra estirpe celular. La variabilidad amplia de los índices citotóxicos entre individuos encontradas por este proceder, es similar a la informada por otros autores.14 El método homólogo autocatalítico desarrollado, que utilizó la actividad peroxidasa de la hemoglobina para amplificar la reacción citotóxica, no requiere de reactivos, equipamiento ni instalaciones especiales para su empleo, lo cual lo hace económicamente superior y más factible que los existentes. 100 % Lisis específica ( media : 39,86 desviación estándar : 17,27 ) FIG. Distribución de frecuencia de los índices citotóxicos determinados. DISCUSIÓN Con el sistema propuesto para evaluar CCDA, que utiliza hematíes O+ de amplia distribución en la población y cuyos resultados se revelan por la actividad catalítica de la hemoglobina liberada en el proceso de lisis celular, se pudieron obviar las limitaciones de los métodos radioisotópicos citadas al inicio, lo que justifica su incorporación en la evaluación de este tipo de respuesta celular. SUMMARY A simple, sensitive system which does not require radioisotope markers and uses effector cells, target cells and antibodies of the same kind to evaluate antibodydependent cell-mediated citotoxicity is presented in this paper. Citotoxic activity is assessed in peripheral mononuclear cells from apparently healthy voluntary blood donors and was extended in the lysis process through the peroxidase activity of hemoglobin released by target cells made up of anti-D coated O + erythrocytes. There was no linear correlation between cytotoxic indexes and lymphocyte/monocyte ratio. The suggested method may be used in systematic experimental and clinical scanning. Subject headings: ANTIBODY-DEPENDENT CELL CITOTOXICITY/ immunology; IMMUNITY, CELLULAR; ERYTHROCYTE. 187 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Abbas AK. Inmunología celular y molecular. Madrid: Editorial Interamericana, 1995:60-1. 2. Male D, Roitt I. Introducción al sistema inmunitario. En: Roitt I. Inmunología. 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Habana del Este, CP 11700, Ciudad de La Habana, Cuba. e-mail:ismmds@infomed.sld.cu 188 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):189-93 Instituto de Hematología e Inmunología ALTERACIONES DE LAS SUBCLASES DE IgG EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA Lic. Rinaldo Villaescusa Blanco, Lic. Ada A. Arce Hernández, Lic. Julio C. Merlín Linares, Lic. Ana M. Guerreiro Hernández, Lic. Luz M. Morera Barrios, Dr. Edgardo Espinosa Martínez y Dr. Porfirio Hernández Ramírez RESUMEN Se cuantificaron los niveles de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 mediante inmunodifusión radial simple en un grupo de 46 pacientes con anemia drepanocítica (AD) (hemoglobina SS) en estado basal, 21 sin complicaciones clínicas y 25 con complicaciones clínicas referentes a número de infecciones, úlceras maleolares, crisis vasooclusivas, hepáticas y aplásticas, considerando como límite un año anterior a la toma de muestra de sangre. Se demostró un aumento significativo de IgG1 e IgG2 en el grupo de pacientes con complicaciones clínicas en comparación con el resto de los pacientes y controles normales. Se observó una correlación significativa entre el número de crisis vasooclusivas y las concentraciones de IgG1, IgG2 e IgG4. Nuestros resultados sugieren la posibilidad de que algunos fenómenos inflamatorios que pueden persistir en pacientes con AD en estado basal, fundamentalmente aquellos con historia anterior de complicaciones clínicas, pudieron provocar un aumento en la síntesis de IgG1 e IgG2. DeCS: IGG/análisis; ANEMIA/complicaciones; SISTEMA INMUNE/anomalías. Los pacientes con anemia drepanocítica (AD) (hemoglobina SS) cursan con anemia hemolítica crónica, alta susceptibilidad a infecciones y episodios dolorosos agudos llamados crisis vasooclusivas. 1 En estos pacientes se han descrito numerosas alteraciones del sistema inmune innato y adquirido. Se han comunicado incrementos moderados de reactantes de fase aguda como la proteína C reactiva, amiloide sérico A, orosomucoide y el leucotrieno C4 en pacientes en estado basal, lo que evidencia un estado repetido o persistente de inflamación. 2-6 Los procesos sépticos predominantes son los causados por bacterias encapsuladas, como el Streptococcus pneumoniae y el Hemophilus influenzae. 7 Diversos investigadores han relacionado las infecciones en la AD con el desencadenamiento de fenómenos inflamatorios como la IL-1, TNF-α e INF-γ.8,9 Esta elevada frecuencia de infecciones se atribuye, en gran medida, a una disminución de la función esplénica, así como alteraciones en la activación de la vía alternativa del complemento y de otros componentes del sistema inmune.10,11 189 Los trabajos que evalúan las concentraciones de las subclases de IgG resultan escasos y contradictorios. Algunos reportes refieren el hallazgo de hipergammaglobulinemia, fundamentalmente de la clase IgG, donde la IgG1 e IgG3 son las predominantes. 12,13 Otros autores plantean una reducción de IgG2.14 En nuestro trabajo nos propusimos investigar los niveles de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en pacientes con AD en estado basal clasificados de acuerdo con la evolución clínica de la enfermedad. su uso. Los sueros controles se obtuvieron y se conservaron en las mismas condiciones. Los niveles de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se evaluaron por inmunodifusión radial simple empleando placas comerciales (PellRide, CLB, Amsterdam). El método está basado en la precipitación del complejo formado luego de la unión en equivalencia del antígeno que difunde a través de un soporte de agarosa mezclado con el antisuero específico.15 Los valores normales de las variables estudiadas se obtuvieron a partir de 20 sujetos sanos con características similares a la de los enfermos en cuanto a edad y sexo. Se calcularon la media y la desviación estándar de los controles normales y de los pacientes con y sin complicaciones clínicas. Para la comparación entre los 2 grupos y de cada uno con los controles normales se utilizó la prueba de Kruskal-Walls. Se determinaron las correlaciones entre la concentración de las subclases de IgG y el número de las diferentes complicaciones clínicas, así como con las cifras de hemoglobina y reticulocitos. Se consideró un nivel de confianza del 95 %.16 MÉTODOS Se estudiaron 48 pacientes provenientes del Departamento de Clínica de Adultos del Instituto de Hematología e Inmunología, 30 mujeres y 16 hombres con un promedio de edad de 30 años y un rango de 18 a 58 años, con el diagnóstico de AD (hemoglobina SS) en estado basal y sin síntomas ni signos clínicos de infecciones, úlceras o crisis, así como sin requerimientos transfusionales en los últimos 3 meses. Se revisaron las historias clínicas de los pacientes y se analizó la evolución de la enfermedad en el año previo al estudio para establecer la existencia o no de complicaciones clínicas en algún momento de ese período, lo que permitió su clasificación en 2 grupos: uno sin manifestaciones clínicas y un segundo grupo en el que habían ocurrido una o varias complicaciones clínicas como infecciones, úlceras maleolares, crisis vasooclusivas, crisis hepáticas o crisis aplásticas. Las cifras de hemoglobina y de reticulocitos se determinaron mediante las técnicas habituales a partir de la muestra de sangre periférica extraída por punción venosa. El suero obtenido se conservó a -30 °C hasta RESULTADOS Se observó un aumento significativo de IgG1 e IgG2 en los pacientes con antecedentes de complicaciones clínicas en el último año previo al estudio al compararlos con el grupo sin complicaciones previas y controles normales (tabla 1). Se demostró una asociación significativa entre IgG1-crisis vasooclusivas, IgG2crisis vasooclusivas e IgG4-crisis vasooclusivas. El resto de las correlaciones no mostraron significación (tabla 2). 190 TABLA 1. Comparación de los niveles de las subclases de IgG entre los grupos de pacientes con anemia drepanocítica y con los controles normales Anemia drepanocítica Con complicaciones Sin complicaciones (n = 25) (n = 21) Subclases de IgG (g/L) IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 11,56 ± 1,32* 6,18 ± 0,73* 0,56 ± 0,17 1,05 ± 0,27 8,98 ± 1,12 4,59 ± 0,96 0,55 ± 0,15 0,95 ± 0,17 Controles normales (n = 20) 8,32 ± 1,25 4,78 ± 0,93 0,49 ± 0,10 0,99 ± 0,14 * Diferencia significativa con respecto a los controles normales y al grupo de pacientes sin complicaciones, para una p<0,001. n: Número de pacientes. TABLA 2. Correlaciones entre las subclases de IgG y las variables clínicas y hematológicas en los pacientes con anemia drepanocítica Variables IgG1 (r) Crisis vasooclusivas Otras crisis Infecciones Úlceras maleolares Hemoglobina Reticulocitos ,6646* ,2643 ,3516 -,0575 -,0590 -,0019 I gG2 (r) IgG3 (r) IgG4 (r) ,5992* ,1988 ,2264 ,0273 -,1274 -,0709 ,2577 -,0678 -,0460 ,0991 -,1650 ,1047 ,5461* ,0023 ,0572 ,0226 -,0673 ,0854 * Diferencia significativa, p<0,001. (r ): Coeficiente de correlación lineal. DISCUSIÓN una reducción de IgG2, la subclase que predomina en la respuesta de polisacáridos. Otros autores han referido hipergammaglobulinemia, particularmente a expensas de IgG1 e IgG3, ya sea de especificidad conocida o no.12,13 En nuestro estudio, los enfermos sin complicaciones en el año previo mantuvieron concen-traciones de todas las subclases dentro de límites normales. En el grupo de pacientes con complicaciones clínicas previas se demostró un aumento significativo de los niveles de IgG1 e IgG2 al compararlos con el grupo sin complicaciones y controles normales, lo que habla a favor de una activación policlonal. También se obtuvo una asociación significativa entre la frecuencia de crisis vasooclusivas y las concentraciones de IgG1, IgG2 e IgG4. El aumento de la susceptibilidad a infecciones en la AD tiene un origen multifactorial. Alteraciones en la activación de los linfocitos T, una disminución de la actividad de la vía alternativa del complemento, la pérdida de las funciones del bazo, los trastornos de la migración y opsonización, están entre las causas de la incapacidad de estos individuos para enfrentar, limitar y eliminar las sepsis.10,11 Se ha planteado la participación defectuosa de los anticuerpos como otra posibilidad en el compromiso de la capacidad de respuesta de estos individuos. Sin embargo, los hallazgos son contradictorios. Natta y otros14 encontraron 191 En los pacientes con AD en estado basal pueden ocurrir repetidamente procesos inflamatorios subclínicos, debidos a fenómenos isquémicos microvasculares que se producen por la adhesión al endotelio de reticulocitos anormales, que provocan un extasis del flujo y obstrucción de los vasos. Estos trastornos frecuentemente se resuelven espontáneamente, pero pueden progresar para convertirse en sintomáticos.17 Resulta evidente, de acuerdo a los datos obtenidos en nuestro trabajo, que existen pacientes cuya capacidad para dar solución a las consecuencias de los fenómenos isquémicos microvasculares, es superior a otros casos que presentan manifestaciones clínicas con relativa frecuencia y que, por tal motivo, pueden liberar a la circulación citocinas y otros mediadores, provocando una disregulación del sistema inmune y entre otras alteraciones, una activación policlonal inespecífica de los linfocitos B, de ahí los niveles elevados de IgG1 e IgG2, así como la significativa asociación demostrada de estas subclases, como de la IgG4, con las crisis vasooclusivas. La inespecificidad de la activación linfocitaria sería un factor favorecedor de la elevada frecuencia de infecciones que se observan en estos pacientes, al no contar ellos con anticuerpos específicos contra ellas. En relación con la asociación IgG4-crisis vasooclusiva, es conocido que la elevación de los niveles de IgG4 se produce tras inmunizaciones repetidas,18,19 lo que puede compararse con los fenómenos inflamatorios repetidos que ocurren en estos pacientes. El hecho de que en la muestra de pacientes puedan distinguirse 2 grupos según la evolución de la enfermedad, indica la heterogeneidad biológica de los individuos y de su capacidad de respuesta, de ahí que difieran en la frecuencia y severidad de las crisis, resistencia a infecciones y en otras complicaciones. Investigaciones futuras seguramente contribuirán a definir la importancia que puedan tener las diferentes subclases de IgG en la AD. SUMMARY A single radial immunodiffusion method was used to quantify IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 levels in a group of 46 patients with sickle cell anemia (hemoglobin SS) in basal state; 21 of them had no clinical complications and 25 had clinical complications refering to number of infections, melleolar ulcers, vasocclusive, hepatic and aplastic crises. One year before the blood-sample taking was set as the limit. A significant increase of IgG1 and IgG2 was observed in patients with clinical complications compared with the rest of patients and the normal controls. There was a significant correlation between the number of vasocclusive crises and the IgG1, IgG2 and IgG4 concentrations. Our results show the possibility that some inflammatory phenomena, which might persist in patients with sickle cell anemia in basal state- mainly in those with a history of clinical complications-, could cause an increased synthesis of IgG1 and IgG2. Subject headings: IGG/analysis; ANEMIA/complications; IMMUNE SYSTEM/abnormalities. 192 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bunn HF. Disorders of hemoglobin. En: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, Kasper DL (eds). Principles of Internal Medicine. 13th ed. New York: McGraw-Hill, 1994:1033-9. 2. Villaescusa R, Arce AA, Guerreiro AM, Merlín JC, Espinosa E. Alteraciones del sistema complemento y proteína C reactiva en la anemia drepanocítica. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1994;10(12):2-84. 3. Singhal A, Doherty JF, Raynes JG. Is there an acute-phase response in steady state sickle cell disease? Lancet 1993;341:651-3. 4. Hedo CC, Akenova YA, Okpala IE. Acute phase reactants and severity of homozygous sickle cell disease. J Intern Med 1993;233:467-70. 5. Monnet D, Diallo I, Sangre A, Yapo AE. Clinical value of C-reactive protein, alpha 1-glycoprotein acid and transferrin assay in homozygous sickle cell disease. Bull Soc Pathol Exot 1993;86:282-5. 6. 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Se estudió la variabilidad de la concentración de anticuerpos en función del tiempo y la temperatura de almacenamiento en 34 donantes especiales de plasma hiperinmune antitetánico inmunizados con la vacuna toxoide tetánico de producción nacional y sometidos a procedimientos de donación por plasmaféresis automatizada. Se escogieron 2 grupos de estudio según la concentración de inmunoglobulinas séricas (<10 UI/mL y >10 UI/mL) y se trabajaron con muestras conservadas a –30 °C y de 2 a 8 °C. Las pruebas estadísticas utilizadas en el procesamiento de la información arrojaron que la técnica es precisa y exacta, y que las mayores fluctuaciones ocurren cuando los títulos son bajos y se conservan a temperaturas entre 2 y 8 °C. DeCS: GAMMAGLOBULINAS/inmunología; ANTICUERPOS/farmacología; TECNOLOGIA MEDICA/métodos; DONADORES DE SANGRE; PLASMAFERESIS/métodos. En nuestro país comenzó a desarrollarse desde 1996 la obtención de plasma hiperinmune antitetánico a partir de donantes seleccionados con altos títulos de anticuerpos,1 destinado a la producción de gammaglobulina antitetánica de origen humano. Este mismo año, el Banco de Sangre Provincial de Camagüey se incorporó al programa utilizando el procedimiento ético e inocuo de plasmaféresis 2,3 productiva automatizada en personas previamente inmunizadas con la vacuna del toxoide tetánico.4 El monitoraje del título de anticuerpos antitetánicos por la tecnología SUMA permite valorar evolutivamente la respuesta 1 Banco de Sangre Provincial de Camagüey. 2 Planta de Hemoderivados, Ciudad de La Habana. 194 humoral de los donantes y obtener de esta forma un plasma de calidad óptima para la producción de inyectables.5-8 En el presente trabajo se realizó una evaluación de la precisión y exactitud de la técnica UMELISA para la determinación de IgG antitétanos en suero humano. Las muestras de suero fueron diluidas 1: 400 con suero de carnero al 50 % y se colocaron 10 µL de esta dilución en las tiras de reacción conjuntamente con una curva estándar preparada a partir de un suero control de 50 UI/mL de concentración; luego se incubaron durante 30 min a 37 °C en cámara húmeda. A continuación se efectuaron 4 ciclos de lavado con solución tampón de tris-cloruro de sodio-tween 20 con el lavador automático de placas MAS201, después se añadieron 10 mL de conjugado anti IgG/fosfatasa alcalina en cada uno de los pocillos de reacción y se incubó nuevamente durante 30 min a 37 °C. Posteriormente se lavaron las placas en 4 ocasiones y se añadió sustrato fluorigénico, y se dejó incubar a temperatura ambiente hasta lograr una fluorescencia del quinto punto de la curva entre 100-150 U. Finalmente se realizó la lectura en un equipo PR 521 de la tecnología SUMA del Centro de Inmunoensayo. Todo el trabajo lo realizó un mismo analista en iguales condiciones de laboratorio. MÉTODOS Se escogió aleatoriamente un grupo de donantes especiales de plasma hiperinmune antitetánico (n = 34) y se agrupó en 2, uno con concentraciones inferiores a 10 UI/mL y otro con concentraciones mayores de 10 UI/mL. Ambos se subdividieron en otros 2, uno con muestras conservadas de 2 a 8 °C y el otro conservado a - 30 °C en alícuotas que fueron descongeladas durante el procedimiento solo una vez. Los 4 grupos fueron estudiados a la vez en una misma placa del kit UMELISA Tetanus durante 5 semanas consecutivas. A las muestras agrupadas se les calculó la media (X) y la desviación estándar (DE), empleando el test de hipótesis de comparación de las diferencias de las medias (Microstat). Se tuvo en cuenta la temperatura de almacenamiento, la concentración y el momento de ejecución de la prueba, para establecer si las diferencias eran estadísticamente significativas con un nivel de significación alfa <= 0,05. Además, 2 muestras, una con concentraciones < 10 UI/ mL y otra con concentraciones > 10 UI/mL, ambas conservadas a - 30 °C se testaron 50 veces cada una en 5 ocasiones diferentes, y se estableció el valor máximo y mínimo, X, DE y el coeficiente de variación (CV). El estudio se realizó con el kit UMELISA Tetanus, el cual es un ensayo inmunoenzimático heterogéneo de tipo indirecto7,8 producido y estandarizado por el Centro de Inmunoensayo de Ciudad de La Habana. RESULTADOS Se tomó aleatoriamente la muestra # 199 con una concentración inicial de 6,3 UI/mL (< 10 UI/mL) y conservada a - 30 °C. El test de titulación fue realizado 50 veces en 5 oportunidades diferentes y se obtuvo un valor mínimo de 4,0 UI/mL, un valor máximo de 9,7 UI/mL, la media fue de 5,76 UI/mL, la desviación estándar de 1,18 y el coeficiente de variación de 20,49 %. Con estos resultados y aceptando que cualquier determinación reiterada de la misma muestra, con un 95 % de probabilidades, caería en el rango de X ± 2 DE, obtenemos una variabilidad permisible de 4,72 UI/mL, en un rango que oscila de 3,40 a 8,12 UI/mL. 195 Se siguió igual procedimiento con las muestras con concentraciones de más de 10 UI/mL. De estas se tomó la # 233, cuya concentración inicial fue de 18,0 UI/mL y su estudio dio una X = 15,6 UI/mL, con una DE = 1,50 y un CV = 9,62. El análisis de esta muestra arroja una variabilidad de 6 UI/mL, con límites de confianza de ± 2 DE, que oscilarían de 12,6 a 18,6 UI/mL. Tomando los primeros 25 valores de los test realizados y calculando con ellos X y la DE, se obtuvo una X = 15,58 con una DE = 1,36. Con ello confeccionamos la carta de precisión (fig. 2), donde se ubicaron los 25 valores restantes. Se observó que casi todos los resultados cayeron alrededor de la media en el límite de ± 1 DE, y solo 7 valores estuvieron entre 1 y 2 DE y 2 casos más allá de 2 DE. Se tomaron los primeros 25 valores para calcular X y DE y se obtuvieron los siguientes valores: X = 5,97 y DE = 1,23 los cuales son similares a los obtenidos analizando las 50 determinaciones. Con ello confeccionamos una carta de precisión y ploteamos los resultados de las últimas 25 determinaciones y encontramos que 18 están entre X ± 1 DE, 6 caen entre 1 y 2 DE y 1 sola determincación > 2 DE; por lo que podemos decir que aún cuando el coeficiente de variación es elevado, se obtuvo buena precisión en los resultados, con un ligero cambio de exactitud debido a la ubicación de la mayoría de los valores entre X y menos 1 DE (fig. 1). Concentración IgG Anti Tetanus (UI/mL) 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Determinaciones FIG. 1. Carta de precisión No. 1. 196 Concentración IgG Anti Tetanus (UI/mL) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Determinaciones FIG. 2. Carta de precisión No. 2. Al observar la figura 2 vemos que la exactitud y precisión son buenas; se obtuvieron mejores resultados que con la muestra 199 (< 10 UI/mL), a pesar que la variabilidad es mayor, con un rango de 6 UI/mL. Por otro lado, las 34 muestras seleccionadas para el estudio fueron chequeadas durante 5 semanas consecutivas todas a la vez en la misma placa de reacción. Los valores de las 17 muestras con concentración < 10 UI/mL fueron conservadas de 2 a 8 °C y a menos 30 °C, respectivamente (tabla 1). A cada grupo de valores se le determinó X la y la DE y se aplicó el test de hipótesis de comparación de las diferencias de las medias, para determinar si había concordancia entre los resultados o si existían diferencias significativas entre los grupos. En el análisis se encontró que en las muestras almacenadas de 2 a 8 °C hubo diferencias significativas, para un nivel de alfa < = 0,05, entre la primera y segunda, así como entre la primera y la quinta determinación. En las muestras congeladas a -30 °C se encontraron diferencias significativas entre la primera y la segunda. Al comparar los resultados de las muestras conservadas de 2 a 8 °C con aquellas conservadas a -30 °C, hubo diferencias significativas en las determinaciones de la segunda y tercera semanas. En el resto del estudio realizado no hubo diferencias significativas. En cuanto a las 17 muestras escogidas con concentraciones iniciales mayores de 10 UI/mL (tabla 2) se les aplicó el mismo procedimiento estadístico y se encontró la 197 TABLA 1. Valoración de la repetibilidad del UMELISA Tetanus en muestras con concentraciones menores de 10 UI/mL Muestra 172 173 177 186 187 197 199 202 204 213 2 6 10 214 223 231 245 Máx. Mín. X DE1,13 Conservadas de 2 a 8 °C Semanas 1 2 3 4 5 7,3 6,3 8,4 7,5 9,5 7,9 7,0 6,0 6,1 8,0 5,4 6,5 8,0 5,5 8,0 7,2 8,4 9,5 5,4 7,24 1,38 7,8 6,2 6,3 5,7 9,6 8,5 10,5 7,7 10,9 8,5 7,5 6,1 9,7 7,6 7,3 6,9 7,8 6,5 8,1 7,2 7,1 6,6 8,8 7,5 8,8 8,7 5,7 7,3 8,7 8,5 7,7 8,0 8,4 6,8 10,9 8,7 5,7 5,7 8,28 7,31 0,92 1,17 9,3 6,3 10,2 8,4 8,4 6,7 7,3 8,7 7,8 8,5 7,1 6,3 8,0 5,9 8,3 6,7 7,2 10,2 5,9 7,71 0,96 Conservadas a - 30 °C Semanas 2 3 4 1 7,1 4,6 7,0 6,8 7,3 5,7 6,6 5,9 7,9 6,9 4,9 6,2 6,5 5,5 7,8 7,5 7,0 7,9 4,6 6,54 1,16 4,6 5,1 7,2 6,7 7,9 5,6 6,3 7,6 5,8 8,1 5,7 6,7 7,9 5,7 6,4 6,4 8,8 8,8 4,6 6,60 1,16 7,2 5,6 6,7 7,1 9,4 6,6 6,9 7,3 7,0 8,1 5,9 7,2 8,8 6,2 8,7 6,7 9,5 9,5 5,6 7,35 1,30 5,9 4,5 5,6 6,4 7,6 7,4 6,4 6,2 7,0 7,2 5,0 5,6 7,4 4,7 7,4 6,4 9,8 9,8 4,5 6,50 1,36 7,6 5,3 6,8 5,3 8,2 8,3 6,2 6,9 8,2 9,5 5,7 6,7 7,9 5,1 8,2 8,4 8,8 9,5 5,1 7,24 1,30 5 6,3 4,6 6,1 7,3 6,2 6,8 5,5 8,9 6,1 8,5 4,7 5,0 6,7 3,7 6,4 5,3 6,7 8,9 3,9 6,19 TABLA 2. Valoración de la repetibilidad del UMELISA Tetanus en muestas con concentraciones superiores a 10 UI/mL Muestra 149 151 165 171 180 181 183 185 190 192 196 207 211 212 233 243 13 Máx. Mín. X DE Conservadas de 2 a 8 °C Semanas 1 2 3 4 6,8 8,7 8,1 10,6 12,7 13,9 10,8 11,1 14,9 14,1 10,8 13,1 10,7 12,0 20,0 20,0 12,7 14,7 11,6 14,5 15,6 15,9 16,7 20,0 10,8 12,5 12,7 16,1 14,1 17,3 11,7 14,3 12,4 16,6 20,0 20,0 6,8 8,7 12,54 14,72 3,13 3,27 7,6 9,7 9,3 10,4 12,5 14,4 9,9 11,3 13,9 20,0 11,3 14,0 10,1 11,7 20,0 20,0 12,2 16,6 11,8 14,7 14,8 17,2 14,4 20,0 12,1 12,0 11,8 14,0 14,8 17,1 11,8 16,7 14,8 20,0 20,0 20,0 7,6 9,7 12,53 15,28 2,82 3,52 5 1 9,6 10,7 14,1 10,4 17,5 12,6 11,0 20,0 11,7 12,9 14,8 17,8 12,1 11,8 12,7 12,1 14,4 20,0 9,6 13,30 2,85 7,8 8,2 13,1 10,1 13,5 11,8 12,5 20,0 11,4 11,5 12,5 14,9 10,4 11,8 14,5 10,9 12,7 20,0 7,8 12,2 2,8 198 Conservadas a - 30 °C Semanas 2 3 4 7,9 9,4 13,0 10,5 16,7 11,6 11,1 20,0 11,8 14,1 14,7 17,0 11,2 12,5 17,0 11,5 13,7 20,0 7,9 12,2 4,14 7,0 7,6 12,4 9,1 13,5 10,0 9,8 20,0 12,8 11,1 14,1 15,6 11,1 11,0 14,8 10,5 13,6 20,0 7,0 12,0 3,18 7,4 9,5 14,4 8,9 17,1 11,0 11,0 20,0 11,5 13,3 15,5 20,0 12,3 14,5 20,0 11,6 16,0 20,0 7,4 13,80 3,93 5 6,1 7,4 11,9 9,3 14,6 10,7 10,5 20,0 10,5 11,2 13,6 18,1 10,6 10,4 16,5 10,5 13,6 20,0 6,1 12,1 3,61 Por otro lado, la temperatura de conservación también parece influir, pues las mayores diferencias se observaron en aquellas muestras conservadas de 2 a 8 °C. En las conservadas a -30 °C sólo se observaron diferencias significativas entre la primera y segunda determinación en el grupo con concentraciones inferiores a 10 UI/mL, que a nuestro juicio, no es dependiente de la técnica en cuestión. Finalmente, el valor absoluto de los resultados del pesquisaje es muy importante, pues vemos que en el grupo en que la concentración es >10 UI/mL no se observan diferencias significativas al comparar los resultados de los conservados de 2 a 8 °C con las de conservación a menos de 30 °C. Tampoco existieron diferencias significativas dentro del grupo conservado a - 30 °C durante las 5 semanas de duración del estudio, que debe ser la temperatura de conservación de las muestras del programa hasta tanto sean pesquisados. Realizar los pesquisajes por duplicado y tomar el valor medio, o por triplicado, así como la mediana como valor real, ayudaría a mejorar esta situación. Por otro lado, el establecimiento de un programa de control externo de la calidad en UMELISA Tetanus, permitiría conocer la calidad del trabajo de los laboratorios y monitorear la marcha del programa. existencia de diferencias significativas entre la primera y segunda y entre la primera y cuarta determinaciones en aquellos conservados de 2 a 8 °C, pero no se encontraron diferencias significativas en el grupo de muestras con concentraciones mayores de 10 UI/mL conservadas en congelación a - 30 °C. Por último, al comparar los resultados de las muestras conservadas de 2 a 8 °C y a - 30 °C con concentraciones > 10 UI/mL, tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas. DISCUSIÓN A pesar de lo referido inicialmente acerca de que el UMELISA como juego de reactivos para la selección de donantes con alto título de antitoxina tetánica,3,8 tiene exactitud y precisión cuando se repite una muestra un número determinado de veces, la variabilidad del método dentro de los límites de confianza hace que cuando se estudian grupos de muestras de forma repetida, se produzcan en ocasiones diferencias significativas entre los resultados, lo cual se observa más frecuentemente con muestras con concentraciones bajas, independientemente del tiempo de almacenada la muestra en el término de las 5 semanas en que se realizó el estudio. SUMMARY Accuracy and precision of UMELISA kit was evaluated in anti-tetanic IgG dosing. The variability of antibody concentration as a function of time and storage temperature was assessed in 34 special donors of hyperimmune antitetanic plasma, immunized with Cuban-made tetanus toxoid vaccine and subjected to donation methods by automated plasmapheresis. Two study groups were chosen according to serum immunoglobulin concentrations (< 10 UI/ml and > 10 UI/ml) and samples were preserved at –30 oC and at 2-8 oC were used . The statistical tests in the data processing yielded that this technique is accurate and precise ant that the highest fluctuations occur when titers are low and kept at 2-8ºC temperatures. Subject headings: GAMMMAGLOBULINS/immunology; ANTIBODIES/ pharmacology; TECHNOLOGY, MEDICAL/methods; BLOOD DONORS; PLASMAPHERESIS/methods. 199 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Seguridad y garantía de la terapéutica moderna en los más diversos tratameintos. Planta de Hemoderivados, Ciudad de La Habana, 1999:9. 2. Plasmaféresis e inmunización de donantes. 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Aplicación del método de ultramicro ELISA en el banco de sangre para el pesquisaje de plasma antitetánico con vistas a la producción de inmunoglobulina específica. Rev Cienc Farm 1987;(oct):29-31. Recibido: 14 de septiembre del 2000. Aprobado: 11 de mayo del 2001. Dr. Lázaro Mena López. Banco de Sangre Provincial de Camagüey. Camagüey. Cuba. 200 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):201-4 Instituto de Hematología e Inmunología MÉTODO FOSFATASA ALCALINA ANTI-FOSFATASA ALCALINA PARA EL DIAGNÓSTICO DE INMUNODEFICIENCIAS CELULARES Lic. Berta B. Socarrás Ferrer, Dra. Vianed Marsán Suárez, Dra. Miriam Sánchez Segura, Lic. Yamilka González de Armas y Dra. Consuelo Macías Abraham RESUMEN Para el estudio de 25 pacientes con infecciones recurrentes y un grupo control de 25 individuos supuestamente sanos, se aplicó, en nuestro laboratorio, el método inmunocitoquímico de fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina, para la cuantificación de las principales subpoblaciones de linfocitos T identificados con los anticuerpos monoclonales: anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8. Se obtuvieron diferencias significativas para las subpoblaciones TCD3 y CD4 positivos (p < 0,05). Por su bajo costo y rapidez, este método puede aplicarse a otros laboratorios de inmunodiagnóstico del país. DeCS: TESTS INMUNOLOGICOS/métodos; SUBGRUPOS DE LINFOCITOS T/inmunología; ANTICUERPOS MONOCLONALES/inmunología. MÉTODOS La utilización de anticuerpos monoclonales (AcMo), dirigidos contra antígenos celulares permite la caracterización de las diferentes subpoblaciones linfocitarias T auxiliadoras/inductoras y supresoras/citotóxicas. 1-4 Diversos métodos de inmunofluorescencia e inmunocitoquímicos se utilizan para la determinación del fenotipo celular.5-10 En nuestro trabajo se evalúa la introducción del método inmuno-citoquímico fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina modificado, para la cuantificación de subpoblaciones linfocitarias T en pacientes con infecciones recurrentes, en los cuales se sospecha una posible inmunodeficiencia celular. Se estudiaron en total 25 pacientes con infecciones recurrentes, 10 del sexo femenino y 15 del masculino, con un rango de edad de 2 a 36 años, atendidos en las consultas de Inmunología del Instituto de Hematología e Inmunología. Como grupo control se utilizaron muestras de 25 individuos supuestamente sanos, con características similares en cuanto a edad y sexo. Tanto en el grupo control como en los pacientes se cuantificaron las subpoblaciones linfocitarias TCD3, CD4 y CD8, mediante la utilización de un método inmunocitoquímico de fosfatasa alcalina- 201 5 µL, rojo violeta (1 µL) y la contracoloración con hematoxilina de Gill (200 mL). La lectura se realizó en un microscopio óptico DIALUX 20 EB (Leitz, RFA). Se contaron 100 células por lámina y se consideró positivo cuando el número de células marcadas es igual o mayor al 20 %. Para el grupo de pacientes y de control se realizó la media aritmética ( X ) y la desviación estándar (DE). Se utilizó para el análisis estadístico la t de Student para muestras independientes, con un nivel de significación p < 0,05. anti-fosfatasa alcalina (APAAP) modificado en nuestro laboratorio (tabla 1). A cada individuo se le extrajeron 10 mL de sangre periférica en tubos de heparina y se centrifugó a 1 500 rpm durante 10 min, se extrajo la capa blanca que contiene los linfocitos y se hicieron extensiones en láminas portaobjetos de cristal. El área del frotis a estudiar se delimitó con lápiz con punta de diamante. Las láminas fueron fijadas en acetona pura a temperatura ambiente (TA). Fueron añadidos los AcMo específicos para los antígenos a estudiar, previamente diluidos (1:20) (tabla 1); posteriormente antisuero de conejo antiratón (Linking 6) (1:50) y anticuerpos conjugados a la enzima fosfatasa alcalina (complejo APAAP). Se realizaron lavados en solución amortiguadora de tris hidroximetilaminometano 0,5 M, pH 7,6 entre cada uno de los diferentes pasos. Las láminas fueron procesadas en cámara húmeda. Finalmente se llevó a cabo la coloración con naftol (200 µL), levamisol RESULTADOS Al comparar los valores entre pacientes y controles se obtuvieron diferencias significativas para las subpoblaciones TCD3 y CD4 positivos, con p=0,01 y p=0,001, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en el subtipo TCD8 positivo (tabla 2). TABLA 1. Panel de anticuerpos monoclonales (AcMo) para el inmunotipaje celular CD Dirigidos contra células T AcMo CD3 CD4 CD3 OKT3 OKT4 OKT8 Fuente Hospital Clínico de Barcelona, Barcelona, España Filatov, Institute Immunology, Rusia Filatov, Institute Immunology, Rusia TABLA 2. Comparación de los marcadores celulares entre pacientes y controles Marcador CD3 CD4 CD8 Pacientes (X ± DS) 55,48 ± 10,85 40,92 ± 8,30 21,84 ± 8,78 Controles (X ± DS) 61,8 ± 4,61 52,6 ± 9,37 23,72 ± 5,53 P < 0,05 < 0,05 ns X: Media; DS: desviación estándar; CD: Cluster de diferenciación; ns: no significativo. 202 DISCUSIÓN cuando se comparan con el grupo control. Este grupo de pacientes presenta infecciones más severas que aquellos cuyas poblaciones T están dentro de límites normales. La introducción del método inmunocitoquímico APAAP demuestra ser útil para el diagnóstico de las inmunodeficiencias y la modificación de este realizado en nuestro laboratorio, con uso del buffy coat, y no de sangre periférica como se plantea en la técnica original, permite una mejor visualización de las células marcadas, y por lo tanto, un menor rango de error, porque se cuentan en las láminas solo células mononucleares. A diferencia de otros métodos utilizados en nuestra institución para estos fines, 1,3,4 esta técnica permite llegar a un diagnóstico seguro en un breve período de tiempo, la conservación de las láminas a TA con fines docentes e investigativos, y sobre todo, prescinde del uso del Ficoll para el aislamiento de células mononucleares. Por su bajo costo y rapidez, este método puede aplicarse a otros laboratorios de inmunodiagnóstico del país. La integridad de la respuesta inmune celular es importante en la defensa frente a las infecciones.5,11 Los linfocitos T desempeñan un papel central en la inmunidad adaptativa, dentro de éstos los de fenotipo CD4 positivo estimulan a las células B a secretar anticuerpos a través de la producción de interleucina-4 (IL-4) e interleucina-5 (IL-5).12 Por otra parte, aquellos de fenotipo CD8 positivo realizan funciones citotóxicas, liberando perforinas y granzimas B;13 sin embargo, esta relación fenotipo-función no es un dogma, ya que subpoblaciones TCD4 positivas pueden realizar funciones citotóxicas y las TCD8 positivas producir ciertas citocinas, fundamentalmente interleucina-2 (IL-2), que estimulan a su vez la respuesta inmune humoral.14 La cuantificación de las subpoblaciones de células T en pacientes con infecciones recurrentes es útil para el diagnóstico de diferentes estados de inmunodeficiencia celular. En nuestro estudio, la subpoblación de células TCD4 positivas muestra mayor afectación en relación con las CD8 positivas, SUMMARY For the study of 25 patients with recurrent infections and a control group of 25 supposedly healthy individuals, our Laboratory applied the immunocytochemical method of alkaline phosphatase – anti-alkaline phosphatase for the quantitation of the main T-lymphocyte subgroups identified with monoclonal antibodies:antiCD3, anti-CD4 and anti-CD8. There were significant differences in positive TCD3 and CD4 subsets (p<0,05). Because this is a low cost and quick method, it may be applied by other immunodiagnosis labs throughout the country. Subject headings: IMMUNOLOGIC TESTS/methods; T- LYMPHOCYTE SUBSETS/immunology, ANTIBODIES, MONOCLONAL/immunology. 203 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Lorigados Pedré LC, Aranda Rivero RE, Rivero Jiménez RA, Palma Salgado LE. Estandarización de la técnica de la inmunofluorescencia indirecta para el estudio de las subpoblaciones linfocitarias con anticuerpos monoclonales. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1985;1(2):185-92. 2. Rivero Jiménez RA, Aranda Rivero RE, Cruz Sotolongo C, Lorigados Pedré LC, Ramírez Hernández P. Subpoblaciones de linfocitos en la anemia drepanocítica. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1986;2(1):90-2. 3. Aranda Rivero RE, Cruz Sotolongo C, Rivero Jiménez RA, Lorigados Pedré LC, Ramírez Hernández P. Estudio comparativo de las subpoblaciones de linfocitos T humanos mediante anticuerpos monoclonales y técnicas de formación de rosetas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1986;2(2):153-7. 4. Rivero RA, Bello M, Suárez LE, Cruz C, Martínez M, Palma L. Introducción de un ultramicrométodo inmunocitoquímico para la cuantificación de subpoblaciones linfocitarias identificadas con anticuerpos monoclonales. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1995;11(1):46-56. 5. Sánchez-Madrid F. 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Ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ): su aplicación para cuantificar linfocitos TCD4+ en portadores del VIH y en pacientes con SIDA. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1996;12(1):41-6. 10. Rivero R, Bello M, Suárez L, Cruz C, Martínez M, Palma L. Introducción de un ultramicrométodo inmunocitoquímico en células T no-deshidratadas unidas a láminas recubiertas con poli-L-Lisina y fijadas con vapores de formaldehído. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1995;11(1):57-62. 11. Moses RD, Winn HJ, Auchincloss H. Evidence that multiple defects in cell-surface molecule interactions across species differences are responsible for diminished xenogeneic T cells responses. Transplantation 1992;53:203. 12. Moses RD, Pierson RN, Winn HJ, Auchincloss H. Xenogeneic proliferation and lymphokine proliferation and lymphokine production are dependent on CD4+ helper T cells and self antigen-presenting cells in the mouse. J Exp Med 1990;172:567. 13. Sprent J, Schaefer M. 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Desde hace algún tiempo se han tratado de encontrar nuevas vías terapéuticas que permitan eliminar a las células leucémicas, pero sin que se afecten las células hematopoyéticas normales. Este objetivo se ha visto impulsado en los últimos años por los impresionantes resultados obtenidos en el tratamiento de la leucemia promielocítica con el ácido transretinoico,1 y más recientemente con el trióxido de arsénico.2 El conocimiento creciente de los diversos eventos moleculares que intervienen en las leucemias ha estimulado la búsqueda de agentes terapéuticos que puedan actuar sobre ellos e inhibir la transformación celular maligna. La leucemia mieloide crónica (LMC) fue la primera enfermedad maligna en que se demostró una anomalía genética adquirida y es en la actualidad el modelo molecular de leucemia mejor estudiado. En la LMC se expresa la translocación cromosómica t (9; 22) (q34; q11) que da lugar a la formación del cromosoma Filadelfia (Ph). A causa de esta translocación se producen 2 nuevos genes híbridos: el BCR-ABL en el cromosoma 22q- o cromosoma Ph y el gen recíproco ABL-BCR en el cromosoma derivado 9q+, el cual, aunque transcripcionalmente activo, no parece desempeñar ninguna actividad funcional en la enfermedad.3,4 Por el contrario, la proteína híbrida producto de la fusión BCR-ABL tiene actividad leucemogénica, ya que su función tirosincinasa se encuentra permanentemente activada. En la proteína híbrida Bcr-Abl se mantienen los dominios correspondientes a los fragmentos de las proteínas Bcr y Abl que la conforman. Así, en la mitad Abl se encuentra la región con actividad tirosincinasa que contiene un sitio de autofosforilación y en la Bcr existe una tirosina en la posición 177. A diferencia de lo que sucede en la proteína Abl normal, en la que su actividad tirosincinasa está perfectamente regulada, en la Bcr-Abl esta función se ejerce constantemente de una forma autónoma.5 La producción continua descontrolada de la enzima tirosincinasa Bcr-Abl induce 205 múltiples interacciones proteicas que intervienen en diferentes vías de transmisión de señales intracelulares, cuyas activaciones conducen a la transformación maligna celular, les confieren a las células de la LMC ventajas de crecimiento e interfieren con procesos celulares básicos como el control de la proliferación, la adherencia y la apoptosis.5-7 Con esto se produce una constante transmisión de señales mitogénicas, una adherencia defectuosa a las células estromales y a la matriz extracelular y una disminución de la respuesta a los estímulos apoptósicos. La enzima tirosincinasa Bcr-Abl estimula la transmisión de señales mediante la liberación del ATP de un grupo fosfato que se une con las diferentes proteínas que le sirven de substratos. Un gran número de substratos puede ser fosforilado por la proteína Bcr-Abl. Además, debido al proceso de autofosforilación existe un gran aumento de fosfotirosina en la propia proteína Bcr-Abl, lo que crea sitios de unión para otra proteínas.5 La identificación de la tirosincinasa anormal Bcr-Abl como una enzima fundamental para el desarrollo y progresión de la LMC, la convirtió en un sitio de gran interés para el empleo de un inhibidor específico que pudiese controlar su actividad, y de esta forma, ejercer una acción terapéutica en la LMC. Esa acción específica tendría la ventaja de una inhibición selectiva de la proteína anormal Bcr-Abl, sin que se afecte la función de otras tirosincinasas intracelulares normales, acción con la que solo se bloquearía la oncoproteína que se necesita controlar. El desarrollo de los conocimientos sobre las propiedades bioquímicas de las proteínas que intervienen en la transmisión de señales intracelulares en las células hematopoyéticas, y de las posibilidades tecnológicas para la obtención de inhibidores de la transducción de señales (STIs, del inglés signal transduction inhibitors), permitió iniciar las investigaciones apropiadas para la obtención de un STI con esa característica ideal de bloquear la tirosincinasa anormal Bcr-Abl. Se han evaluado diferentes inhibidores de la tirosincinasa para conocer su potencialidad como modificadores del fenotipo de las células de la LMC. Los primeros en probarse procedían de fuentes naturales, entre ellos el isoflavinoide genisteína, el antibiótico herbimicina A y los flavinoides quercetina y erbsteína. Con posterioridad se obtuvieron compuestos sintéticos conocidos como tirfostinas, capaces de competir con el ATP por el sitio de unión en el centro catalítico de la cinasa. Una de estas tirfostinas (AG 1112), la genisteína y la herbimicina A, fueron los primeros productos que mostraron especificidad para las tirosincinasas y efectos positivos sobre líneas celulares de LMC.5,8-10 En una etapa posterior se investigaron otros posibles inhibidores de tirosincinasas, y entre ellos se seleccionó el denominado STI 571 (previamente conocido como CGP 574), que inhibe específicamente la tirosincinasa Abl a concentraciones submicromolares. Este producto se modificó químicamente para obtener un bloqueo selectivo del sitio de unión del ATP, y de esta forma inhibir de forma efectiva la fosforilación que la enzima tirosincinasa Bc-Abl realiza en sus substratos.5,10 En las experiencias realizadas in vitro se pudo comprobar que el STI 571 es capaz también de bloquear las tirosincinasas del receptor para el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, del inglés platelet-derived growth factor) y del c-kit (receptor para el factor de las células progenitoras, stem cells). 206 Estas propiedades abren la posibilidad de que el STI 571 pueda tener también uso terapéutico en trastornos con expresión del receptor PDGF y del c-kit, como puede suceder en la leucemia mieloblástica, síndromes mieloproliferativos, cáncer de próstata, tumores cerebrales y sarcomas.10,11 En los estudios experimentales realizados in vivo se comprobó que el STI 571 disminuyó la masa tumoral y prolongó la supervivencia de ratones a los que previamente se les habían inyectado células leucémicas Bcr-Abl positivas.12,13 En los últimos años se han realizado rápidamente varios ensayos clínicos, en los que se han incluido las 3 fases habituales de la LMC, aunque el mayor número de casos ha sido de enfermos en la fase crónica.10 En un grupo de casos en fase crónica que no habían respondido al interferón-α (IFN-α) se observó que con una dosis oral diaria de 300 mg o más de STI 571, la respuesta hematológica completa fue del 100 %, con el 53 % de respuestas citogenéticas mayores que incluían el 13 % de remisiones citogenéticas completas. La mayoría de estas respuestas continuaban con tratamiento de mantenimiento.10 En 388 enfermos que tampoco habían respondido al IFN-α y que recibieron 400 mg diario de STI 571, se evaluó la respuesta citogenética en las células de la médula ósea a los 3 meses de tratamiento y se apreció que el 13 % logró respuesta completa (ausencia de células Ph+), el 23 % una respuesta parcial (1-34 % de células Ph+) y el 37 % una respuesta mayor (< 35 % de células Ph+). Con posterioridad se analizaron 290 casos a los 6 meses y se encontró que el 56 % había conseguido una respuesta citogenética mayor (suma de respuestas parciales y completas).14 Un estudio evolutivo efectuado en pequeños grupos de pacientes tratados con diferentes dosis de STI 571 permitió conocer el tiempo que demoraron las células en sangre periférica para alcanzar valores normales (tabla).15,16 TABLA. Tiempo en que demoraron las variables hematológicas para alcanzar valores normales Variables Meses en alcanzar los resultados STI 571 STI 571 140-350 mg/d 400-600 mg/d (n = 10) (n = 5) Leucocitos (≤ 10 x 109/L) Plaquetas (≤ 450 x 109/L) Basófilos (≤ 0,2 x 109/L) Celularidad medular (≤ 70 %) Relación mielo/eritroide (≤ 4:1) 1,6 0,5 1,8 0,9 4,0 2,3 5,8 3,2 3,5 2,6 Las manifestaciones secundarias observadas comúnmente con el empleo de STI 571 han sido en su mayoría ligeras: náuseas, erupciones cutáneas, calambres y dolores óseos. En algunos casos se ha producido mielosupresión con anemia, granulopenia y trombocitopenia. Con poca frecuencia se ha señalado hepatotoxicidad importante, aunque en algunos casos se ha comprobado elevación transitoria de las transaminasas. Con cierta frecuencia, generalmente cuando se usan dosis altas, se ha producido edema periorbitario y también en las piernas. En algunos casos se ha comunicado retención hídrica.10 La evaluación de 154 pacientes en fase acelerada de la LMC tratados ambulatoriamente, al menos durante 4 semanas, con una dosis que varió de 400 a 600 mg/día, mostró que en este tiempo se consiguió respuesta hematológica en el 78 % de ellos, que incluía 22 casos con una respuesta hematológica completa.17 Recientemente también se han comunicado los resultados obtenidos durante la crisis blástica (CB) de la LMC y en algunas leucemias linfoides agudas con cromosoma Ph (LLA-Ph+). La dosis de STI 571 varió de 300 a 400 mg diarios. Treinta y 207 tres casos tenían CB mieloide, 7 CB linfoide y 8 eran LLA-Ph+. De las CB mieloides, el 12 % obtuvo una respuesta hematológica completa, el 15 % logró la remisión medular, pero sin normalización de los conteos en la sangre periférica y el 45 % consiguió una respuesta parcial (<15 % de blastos en la médula ósea); mientras que en los 15 casos con CB linfoides y LLA-Ph+ el porcentaje de respuesta hematológica completa fue del 20 %, la respuesta medular se obtuvo en el 40 % y una respuesta parcial en el 13 %. La mayoría de estas respuestas fueron transitorias, con una mediana de duración de 3 meses. De los casos con CB que lograron respuesta hematológica completa muy pocos se mantenían así después de un año y solamente 3 enfermos alcanzaron la remisión citogenética completa.10 En un estudio multicéntrico que incluía 262 casos en CB mieloide, se evaluaron 60 pacientes a las 4 semanas de iniciado el tratamiento y 34 a las 8 semanas. En aquellos enfermos que no habían sido tratados previamente por la CB, los porcentajes de respuestas hematológicas a las 4 y 8 semanas fueron de 48 % y 47 %, respectivamente, mientras que en los que habían recibido tratamiento previo para la CB los porcentajes de respuestas en esos períodos fueron de 38 % y 33 %, respectivamente. 18 En estos casos se consideró que había respuesta hematológica cuando se producía cualquiera de las siguientes condiciones: 1) < 5 % de blastos en la médula ósea con normalización de los recuentos en sangre periférica. 2) Normalización de la médula ósea sin normalización de los recuentos en sangre periférica. 3) Retorno a la fase crónica de la LMC. Para poder definir el estado de remisión completa, que incluye la obtención de remisión molecular, es necesario aplicar la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa. En este aspecto los resultados no son uniformes, puesto que se han comunicado casos en remisión citogenética inducida por el STI 571 que han alcanzado también la remisión molecular, mientras que otros mantienen evidencia de enfermedad mínima residual.19,20 Otros aspectos interesantes incluyen la observación que el IFN-α aumenta el efecto apoptósico del STI 571, lo que sugiere la posibilidad de asociar ambos medicamentos en el tratamiento de la LMC.21 La comprobación de que el STI 571 puede inhibir la evolución de la mielofibrosis en una proporción importante de LMC, plantea la posibilidad de que también pueda ser efectivo en otros trastornos mieloproliferativos con incremento de la fibrosis medular.22 A pesar de los conocimientos adquiridos sobre el STI 571 en un tiempo relativamente corto, es necesario incrementar las investigaciones para poder llegar a conclusiones sobre su impacto real sobre la supervivencia de los pacientes con LMC y el control de la enfermedad. Por otra parte, se ha señalado la necesidad de estudios que comparen el STI 571 con el INF-α; también se ha planteado que algunas investigaciones en el que el STI 571 se asocia con el INF-α y con dosis bajas de arabinósido de citosina se encuentran ya en ejecución o en fase de planificación.10 Además surge la posibilidad de usarlo para purgar la médula ósea ex vivo, in vivo o en ambas condiciones como estrategia para el autotrasplante en la LMC.10,23 Las respuestas a las interrogantes de cuál será el verdadero impacto del STI 571 sobre el pronóstico y evolución de la LMC y sobre los beneficios que podrían aportar su asociación con otros métodos terapéuticos, seguramente ampliarán las perspectivas que se han abierto en el tratamiento de esta enfermedad y posiblemente también para el de otras hemopatías y procesos neoplásicos. Sobre estos aspectos, los ensayos clínicos y el tiempo tienen la palabra. En fecha reciente, la firma Novartis ha introducido en el mercado el medicamento en cápsulas de 100 mg bajo el nombre comercial deGleevec. 208 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Lo Coco F, Nervi C Avvisati G, Mandelli F. Acute promyelocytic leukemia: a curable disease. Leukemia 1998;12:1866-80. 2. Shen Z, Chen G, Ni J, Li X, Xiong S, Qiu QY, et al. Use of arsenic trioxide (As 203) in the treatment of acute promyelocityc leukemia (APL). II clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood 1997;89:3354-60. 3. Melo JV. Te diversity of BCR - ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype. Blood 1996;88:2375-84. 4. Melo JV, Gordon DE, Cross NC, Goldman JM. The ABL-BCR fusion gene is expressed in chronic myeloid leukemia. Blood 1993;81:158-65. 5. Melo JV. CML: molecular pathophysiology and potential new targets for therapy. En: Kantarjian H, Melo JV, Tura S, Giralt S, Talpaz M. 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Chronic myelogenous leukemia: disease biology and current and future therapeutic strategies. Hematology 2000. American Society of Hematology Education Program. Book. San Francisco, California. December 1-5,2000:90-109. 11. Druker BJ, Lydon NB. Lesson learned from the development of an Abl tyrosine kinase inhibitor for chronic myelogenous leukemia. J Clin Invest 2000;105:3-7. 12. Gambacorti-Passerini C, Zuchetti M, Cleris L, Rossi F, Pogliani E, Corneo G, et al. Alpha 1 acid glycoprotein (AGP) binds to STI 571 and alters its tissue distribution and intracellular concentrations. (Abstract 421). Blood 2000;96(11, part 1):98a. 13. Wolff NC, Xu H, Zhang S, Ilaria RL (Jr). The tyrosine kinase inhibitor STI 571 prolongs survival in a murine model of chronic myelogenous leukemia. (Abstract 1484) Blood 2000;96(11, part 1):344 a. 14. Kantarjian H, Sawyers C, Hochhaus A, Guilhot F, Schiffer C, Resta D, et al. Phase II study of STI 571, tyrosine kinase inhibitor, in patients with resistant or refractory Philadelphia cromosome positive chronic myeloid leukemia (Ph+CML). (Abstract 2022). Blood 2000;96(11, part 1):470a . 15. Launder TM, Druker BJ, Mauro MJ, O´Dwyer ME, Resta D, Braziel RM. Morphologic findings in peripheral blood and bone marrow of STI 571 –treated chronic myelogenous leukemia patients. (Abstract 3177). Blood 2000;96(11, part 1): 735a . 16. Mauro MJ, Druker BJ, Braziel RM, Launder TM, Ford J, O´Dwyer ME. Dose response effect and time to clinical response in patients with interferon refractory CML treated with STI 571. (Abstract 3179). Blood 2000;96(11, part 1):735 a. 17. Talpaz M, Silver RT, Druker B, Paquete R, Goldman JM, Reese SF, et al. A phase II study of STI 571 in adult patients with Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia in accelerated phase. (Abstract 2021). Blood 2000;96(11, part 1):469 a. 18. Hochhaus A, Feldman E, Goldman JM, Miller C, Ben-Am M, Capdeville R, et al. A phase II study to determine the safety and antileukemic effects of STI 571 in patients with Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia in myeloid blast crisis. (Abstract 2165). Blood 2000;96(11, part 1):503 a . 19. Shah NP, Snyder DS, Nicoll JM, McMahon RJ, Hsu NC, Forman SJ, et al. PCR-negative molecular remissions in chronic, accelerated and blast crisis-phase CML patients treated with STI 571, an ABLspecific kinase inhibitor. (Abstract 2165). Blood 2000;96(11, part 1):471a . 20. Paschka P, Schoch C, Lahaye T, Weisser A, Kuhn C, La Rosse P, et al. Monitoring the response of CML patients treated with STI 571 by molecular cytogenetics and quantitative RT-PCR. (Abstract 3174). Blood 2000;96(11, part 1):734 a. 209 21. Barteneva N, Kantarjian H, Somasundaran B, Estrov Z, Donato N, Talpaz M. Interferon-α (INF α) augments the apoptosis effect of STI 571 in Ph+ blastic crisis cell lines by inducing TRAIL and Fas (CD95/AP01). (Abstract 1489). Blood 2000;96(11, part 1):345a. 22. Boecklin F, Hasserjian RP, Olavarria E, Armstrong L, Mulvanny M, Eades A, et al. Anti-fibrogenic effect of the tyrosine kinase inhibitor STI 571 of bone marrow fibrosis in chronic myeloid leukemia. (Abstract 3175). Blood 2000;96(11, part 1):734 a. 23. Lin N, Zhon Y, Mansukhani M, Nichols G. STI 571 as potential ex vivo purging agent for CML autotransplantation. (Abstract 796). Blood 2000;96(11, part 1):185 a . Recibido: 30 de julio del 2001. Aprobado: 3 de agosto del 2001. Dr. Porfirio Hernández Ramírez. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537)578268. Fax: (537)338979. e-mail:ihidir@hemato.sld.cu 210 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):211-2 Cartas al Director Hospital Provincial Universitario “Dr. Gustavo Aldereguía” ANALGESIA ELECTROACUPUNTURAL EN LA TOMA DE MUESTRA PARA BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA Al Director: El examen de la médula ósea (MO) es de gran importancia para el diagnóstico de las enfermedades hematológicas. La médula puede obtenerse por aspiración, por biopsia realizada con agujas especiales diseñadas con este objetivo o por cirugía abierta.1 El fragmento óseo para el estudio histológico se toma de la cresta ilíaca al nivel de la espina póstero-superior, utilizando habitualmente una aguja de Jamshidi2 o las modificadas de Westerman-Jensen y de Vim-Silverman.3 El paciente se coloca en decúbito lateral y previa limpieza y desinfección de la zona, se procede a infiltrar la piel, tejidos subcutáneos y periostio con una solución de lidocaína o procaína. La analgesia acupuntural es una técnica milenaria,4-6 con creciente uso en nuestro país en los últimos años, para el tratamiento de diversas afecciones y como alternativa a la anestesia convencional en procederes quirúrgicos.7-10 No encontramos referencias del uso de este método durante la realización de biopsias de MO; por tal motivo decidimos realizar toma de muestra en 30 pacientes con el uso de analgesia acupuntural y medir el dolor que manifestaron los enfermos. Se le informó al paciente en qué consistía el proceder y se obtuvo su consentimiento. Se excluyeron los que se quejaban de dolores óseos y/o manifestaron temor al uso de la acupuntura. Se seleccionaron 3 puntos a distancia (IG-4, TR-8, y VG-6) y 4 puntos locales (V-25, V-27, V-32 y V-54). Se colocaron agujas de acero inoxidable No. 32x2 de 2,5 pulgadas a una profundidad donde se logró el qi y luego se acopló a un equipo de electropuntura modelo KWD-806. Se aplicó corriente 1-ADJ que se aumentó en intensidad y frecuencia según la tolerancia del paciente y se fue explorando la sensibilidad hasta lograr la analgesia deseada para realizar el proceder; se mantuvo el estímulo eléctrico durante la toma de muestra. La intensidad del dolor se determinó con una escala verbal que tiene como descriptores los términos: sin dolor, leve, moderado, severo e intolerable.11 Los resultados de la algisimetría durante el proceder se detallan en la tabla. La analgesia acupuntural fue un método eficaz para realizar la biopsia de MO en el 70 % de nuestros pacientes con dolor mínimo o ausente, sólo el 10 % manifestó dolor intenso. Por este motivo nos propusimos comenzar un protocolo de investigación que distribuye de forma aleatoria a los enfermos en 2 grupos, para comparar el uso de anestesia local con 211 lidocaína con la acupuntura. Hasta el momento podemos recomendar esta técnica de medicina tradicional como una alternativa a la analgesia convencional. TABLA. Resultados de la algisimetría Descriptor del dolor No. % Sin dolor Leve Moderado Severo Intolerable 5 16 6 2 1 16,5 53,3 20,0 6,7 3,3 Total 30 100,0 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. William WJ, Nelson DA. Examination of the bone marrow. En: William WJ, Beutler E, Erslev AJ, Lichtman MA, eds. Hematology. 4 ed. New York: Mc Graw-Hill, 1990:24-31. 2. Jamshidi K, Swim WR. Bone marrow with unaltered architecture: a new biopsy devive. J Lab Clin Med 1971;77:335. 3. Ellis LD, Jensen WD, Westerman NP. Needle biopsy of bone and marrow. An experience with 1445 biopsies. Arch Intern Med 1964;114:213. 4. Anton J. Acupunture the fourteen channels. 10 ed. Kalubowila: Chandrakanthi Press, 1988:41-149. 5. Álvarez Díaz TA. Manual de acupuntura. La Habana: Editorial Ciencias Médicas, 1992:1-6. 6. Goldberg B. Medicina alternativa: la guía definitiva. Tiburón: Future Medicine Publishing, 1999:37-46. 7. Rodríguez RA, Mulet QA, Ibáñez MN, Navarro GH, Garcés GE. 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Hospital Provincial Universitario “Dr. Gustavo Aldereguía” CP 55100, Cienfuegos. Teléf: (432)8945. Fax: (432)7387. e-mail:jfernández gal.cfg.sld.cu 212 Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(3):213-4 Cartas al Director Banco de Sangre Provincial Camagüey IMPLANTACIÓN DE LA ACTIVIDAD REGULATORIA DEL CECMED 1 EN EL BANCO DE SANGRE PROVINCIAL DE CAMAGÜEY Al Director: La sangre y sus componentes, como productos biológicos susceptibles de transmitir diversos agentes infecciosos a los receptores, requieren de una normación adecuada (Requisitos para la selección de donantes de sangre, Resolución Ministerial del MINSAP No. 148, 1997:1-10. Las Buenas Prácticas de Producción para Bancos de Sangre constituyen una herramienta necesaria y lógica para el trabajo diario en función de lograr una auténtica calidad mediante un enfoque orgánico, que integre todas las actividades de un programa de sangre con una estructura de gestión que garantice la calidad óptima de los servicios.1 Las Buenas Prácticas para Bancos de Sangre se implantaron en Camagüey a partir de 1997 para incrementar la garantía del suministro de sangre segura para la red asistencial y la Industria Médico-Farmacéutica (IMEFA). Después de 3 años se evaluaron los resultados alcanzados por las diferentes secciones de trabajo en la aplicación de las reglamentaciones nacionales orientadas por el Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED) y en los Procedimientos Normalizados Operacionales (PNO)2 elaborados y aprobados por el Banco de Sangre Provincial para aplicar las Regulaciones de Calidad establecidas en el país. Esta forma de gerencia ejecutiva de los servicios3 en nuestra institución ha definido y documentado la política de calidad con el propósito de alcanzar y mantener una óptima captación y selección del donante, un buen control de proceso y almacenamiento, una correcta y eficaz distribución de la sangre y sus componentes, y un mayor grado de satisfacción de nuestros clientes (receptores de sangre y derivados). Los incrementos que muestra la tabla se corresponden con una mayor calidad de la sangre como producto farmacéutico en cuanto a seguridad y efectividad, lo que permite cumplir con el objetivo trazado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) que expresa: "Los bancos de sangre deben cumplir con los mismos requisitos de aseguramiento de la calidad que los fabricantes de productos farmacéuticos comerciales.4,5" 1 Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos. 213 TABLA. Instauración progresiva de las Buenas Prácticas de Producción para Bancos de Sangre (BPPBS), 1997-1999 Componentes de BPPBS 1997 1998 1999 Sistemas de registros Procedimientos Normalizados Operacionales (PNO) Reglamento de bioseguridad Reglamento de higiene Protocolos de trabajo Software de trabajo Regulaciones del CECMED implantadas Secciones de trabajo que establecieron un sistema de calidad Generalización a otros centros de la provincia Aplicación de la Resolución Ministerial 148-97 para la selección de donantes Flujogramas y organigramas Informes de ensayos Programas de auditorías Programas de capacitación 22 10 Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno 1 Ninguna No 45 36 Incompleto Incompleto 3 2 6 8 Sí 60 55 Integral Integral 3 3 8 Todas Sí No No 3 No No Sí Sí 7 Sí Sí Sí Sí 14 Sí Sí REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Wagstaff W. La calidad es un modo de vida. Transfusión Internacional. Federación Internacional de Sociedades de la Cruz Roja y de la Media Luna Roja 1997;70:1-2. 2. ISO/DIS 8402. 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