Portada de fax - Junta de Andalucía

INFORME FINAL
Laboratorio
CULTIVOS CELULARES
Línea celular
Código: 32120173
Nombre: BBSSPA- hMSC-UC#8
Biorecurso
Línea de Células Madre Mesenquimales
Humanas (hMSC) derivadas de cordón
umbilical.
37ºC, se añaden 3-4 ml de medio específico
para hMSC hasta cubrirlos por completo.
Durante la primera semana de cultivo, van
apareciendo células adheridas de los
explantes, que dejaremos expandir.
Cuando el número de células es el adecuado,
se eliminan los explantes y se procede a la
tripsinización para homogeneizar el cultivo,
continuando con la expansión y la
caracterización de esta línea.
El cultivo de las células obtenidas se ha ido
congelando en crioviales utilizando el sistema
Mr Frosty, en un ultracongelador de -80ºC.
Tras 24 horas, los crioviales han sido
almacenados en contenedores de nitrógeno
en fase gaseosa a -196ºC.
Origen del soporte celular utilizado para la
derivación
Ninguno. No es necesario.
Datos de la muestra de origen
Tejido de origen: Secciones de cordón
umbilical humano, excedente de un parto,
cedido al BBSSPA.
Sexo: 46, XY.
Anomalías genéticas: Sin anomalías genéticas
y ni antecedentes de interés conocidos.
Medio de cultivo utilizado
Las células madre mesenquimales fueron
derivadas en DMEM Advanced/10%FBS/LGlutamine/pen-strep-anfotB/plasmocín.
Formato de entrega
Edad: 0 (neonato).
Biorecurso: Crioviales de hMSC congelados a
-196ºC.
Suspensión celular con un historial de pase
máximo: Pase 10.
Número de células congeladas: 1x10 células
viables/vial.
Lugar procedencia: Banco de Cordón
Umbilical. Málaga.
Viabilidad >95%.
Datos sobre la generación
La muestra de cordón umbilical es troceada en
fragmentos de 1 cm de grosor y los
fragmentos obtenidos se lavan durante 15 min
con una solución de PBS y antibiótico. Con
ayuda de material quirúrgico se diseccionan
cada uno de los trozos para extraer las
estructuras endoteliales (arterias y venas).
Estas son seccionadas transversalmente y
divididas en fragmentos de 2x2 mm. Los
explantes son depositados en flask de cultivo
T25 cell+ sin medio de cultivo para que se
adhieran a la superficie. Tras 30-45 minutos a
6
Caracterización Morfológica Y Fenotípica
De La Línea
La línea celular en cultivo muestra células con
un gran ratio núcleo/citoplasma, que crecen
adheridas en monocapa, con morfología
fibroblastoide.
La caracterización morfológica: Se realizó a
pase 2.
La caracterización fenotípica: Se realizó a
pase 2.
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Parque Tecnológico Ciencias de la Salud. Centro de investigación Biomédica
Avda. del Conocimiento s/n · 18100 Armilla, Granada, España
Tel.: 958 894 672 · Fax: 958 894 652 · biobanco.sspa@juntadeandalucia.es
La velocidad de crecimiento del cultivo: Ha
sido óptima, con un double-time de 4,6 días,
haciendo subcultivo 1:3.
Foto Cariotipo
Foto
Para la caracterización fenotípica se realizó
una extensión celular sobre portaobjetos que
fue teñida inmunohistoquímicamente por
vimentina y citoqueratina.
Caracterización microbiológica
Vimentina: Positiva 100 %.
- Kit: Venor GeM (Minerva Biolabs). PCR (Kit
16S rRNA Gene. Cat. Nº. MP-70114. Maxim
Biocth, Inc.)
Citoqueratina: Positiva 5 %.
Foto
Determinación de la presencia de micoplasma
realizada con 2 Kits:
- Kit: Sigma LookOut Mycoplasma PCR
Detection kit.
Testándose como: Doblemente Negativo.
Marcadores por Citometría
Análisis Citogenética
Método
Nº de
pases
Resultados
Porce
ntaje
CD73
Citometría
P7
+
99.4
CD90
Citometría
P7
+
86.1
CD105
Citometría
P7
+
87.8
CD14
Citometría
P7
-
1.6
CD20
Citometría
P7
-
1.6
CD34
Citometría
P7
-
1.6
CD45
Citometría
P7
-
1.6
La línea BBSSPA-hMSC-UC#8 tiene un
cariotipo normal como se determina en
análisis de citogenética convencional mediante
bandeo G.
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Plots de la citometría:
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Capacidad de Diferenciación:
Diferenciación condrogénica:
Las células de la línea BBSSPA- hMSC-UC#8
se diferencian a condrocitos cuando se las
cultiva con su correspondiente medio de
diferenciación específico.
Tinción con oil red.
Huella Genética
Tinción con azul alcián.
Diferenciación osteogénica:
Las células de la línea BBSSPA- hMSC-UC#8
se diferencian a osteocitos cuando se las
cultiva con su correspondiente medio de
diferenciación específico.
El objetivo de esta técnica es el detectar y
poder comprobar que las líneas celulares
existentes se corresponden genotípicamente
con los tejidos o cultivos celulares primarios de
los que proceden.
Realizamos PCR múltiple para la identificación
mediante la amplificación de 5 regiones de
microsatélites diferentes. Se trata de STRs
(trinucleotidos y tetranuclaotidos) que varían
en número de copias en función del individuo.
Estos productos varían entre las 100-300 bp;
concretamente se trata de 4 locis ligados al
cromosoma X (GATA31E08, DXS6789,
GATA175D03 y DXS7132) y un loci ligado al
cromosoma Y (DYS390).
Resultado: Coincidente.
Almacenamiento
Las células son suministradas criopreservadas
en hielo seco. Cuando las reciba, es
recomendable antes de ser utilizadas su
almacenamiento en nitrógeno líquido.
Tinción con alizarin red.
Descongelación
Diferenciación adipogénica:
Las células de la línea BBSSPA- hMSC-UC#8
se diferencian a adipocitos cuando se las
cultiva con su correspondiente medio de
diferenciación específico.
- Transferir a un baño a 37ºC, impidiendo que
el agua penetre por el tapón o que el vial se
hunda.
- Rápidamente, esterilizar el vial con etanol al
70% y transferir a la cabina de flujo laminar.
Añadir 10 ml de medio completo atemperado
a un tubo de 15 ml. Justo antes de terminar
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de descongelarse (se vea una pequeña
bolita de hielo), suavemente, transferir el
contenido del criovial al tubo de 15 ml
conteniendo el medio de cultivo, y
centrifugamos a 300 g durante 5 min.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el
botón celular en medio de cultivo fresco
atemperado, sembrando las células en el
recipiente destinado para el cultivo.
expuestas
del
laboratorio
desinfectantes apropiados.
con
los
- El personal de laboratorio debe tener
entrenamiento específico en el manejo de
agentes patógenos.
- El acceso al laboratorio debe ser restringido
cuando se esté realizando algún trabajo.
- Se tomarán precauciones extremas con
instrumentos punzocortantes contaminados.
Siembra y Subcultivo
- Recomendamos sembrar a una densidad de
2
1.000-2.000 células/cm .
- Para su manipulación se utilizarán cabinas
de trabajo de bioseguridad nivel 2.
Conclusiones
- El medio de cultivo debe ser reemplazado al
siguiente día después de su siembra, y cada
3-4 días desde entonces.
- Las células han de ser subcultivadas cuando
estas hayan alcanzado un 90 % de
confluencia de la superficie utilizada para su
cultivo.
La línea celular caracterizada presenta todas
las
características
definidas
por
la
“Mesenchymal and Tissue Stem Cell
Committee” de la “International Society for
Cellular Therapy (ISCT)”, para definirla como
una línea de Células Madre Mesenquimales
humana.
PRECAUCIONES
El uso de esta línea debe ser únicamente
para investigación.
No debe ser utilizada en análisis clínicos o
veterinarios, trasplantes o procedimiento de
diagnóstico in vitro.
Normas de bioseguridad al utilizar esta
línea celular
El usuario de esta línea celular ha de trabajar
con nivel de bioseguridad tipo 2 como mínimo.
Este nivel incluye el seguimiento de los
siguientes puntos.
- Se requiere la utilización de guantes de
plástico.
- Los materiales contaminados se desecharán
en recipientes especiales para residuos.
- Los procedimientos de descontaminación
incluirán lavarse las manos con jabón
antibacteriano y lavar todas las superficies
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