Diagnóstico microbiológico de las micosis cutáneas

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Diagnóstico microbiológico de las micosis
cutáneas superficiales
Josep M. Torres-Rodríguez
Unidad de Investigación en Micología Experimental y Clínica. IMIM/IMAS.
Universidad Autónoma de Barcelona. Barcelona. España.
El diagnóstico etiológico de las micosis superficiales es microbiológico y se considera necesario para establecer un tratamiento correcto y
valorar el pronóstico del proceso infeccioso. Ello es particularmente
importante en algunas localizaciones como las ungueales.
El método microbiológico o micológico, para que proporcione resultados útiles al médico clínico, debe efectuarse de forma rigurosa. Por
esa razón se revisan los diferentes procedimientos para obtener y procesar de forma adecuada las muestras clínicas con el fin de obtener
datos fiables.
De forma detallada se valora la utilidad del examen microscópico y de
los cultivos en el diagnóstico micológico, y se analizan los sistemas
de identificación de hongo aislado.
También se analiza la aplicación de las pruebas de estudio de la sensibilidad in vitro a los antifúngicos, y la posibilidad de realizar un tipado de los varios aislados de un mismo hongo que aporta datos para
un estudio epidemiológico.
Palabras clave: Dermatomicosis. Diagnóstico micológico. Microbiología.
Micología. Micosis superficiales.
Microbiological diagnosis of superficial cutaneous mycoses
ha de estar conservada en las mejores condiciones y debe
llegar al laboratorio con la información clínica necesaria
para orientar la metodología de estudio que, por ejemplo,
incluye el medio de cultivo más adecuado, la temperatura
de incubación óptima y el tiempo que se deben mantener
los cultivos en observación antes de descartarlos como negativos.
Los métodos micológicos de diagnóstico son simples y fáciles de realizar, pero a menudo difíciles de interpretar porque es necesaria una experiencia específica en micología,
disponer de información bibliográfica y gráfica, así como de
un centro de referencia donde consultar1.
Un diagnóstico correcto, en el que se eviten falsos negativos, falsos positivos y contaminaciones que ocasionan dificultades para interpretar los cultivos, se consigue en gran
medida cuando se han seguido las normas elementales
para la toma de la muestra.
Recogida de muestras
The etiological diagnosis of superficial mycoses is microbiological and
is considered essential to establish appropriate treatment and evaluate the prognosis of the infectious process. This is particularly important in some localizations such as ungual areas.
To provide the clinician with useful results, the microbiological or mycological method should be rigorously performed. For this reason, the
various procedures to obtain and correctly process clinical samples
with the aim of obtaining reliable results are reviewed.
The utility of microscopic examination and of cultures in mycological
diagnosis are examined in detail, and the systems used to identify
isolated fungi are analyzed.
The application of tests to study in vitro sensitivity to antifungal
agents and the possibility of typing the various isolates from the same
fungus, providing data for epidemiological study, are also analyzed.
El paciente ha de estar sin tratamiento antifúngico tanto sistémico como tópico. Es imprescindible que se evite el uso
de cremas, pomadas, ungüentos o polvos de cualquier tipo
que, al depositarse sobre la lesión, dificulte la recogida de la
muestra. En el laboratorio también se producen problemas
al observar la muestra al microscopio y al cultivarla2.
En primer lugar, se debe determinar cuáles serán las zonas
de muestreo y proceder a su limpieza y desinfección. Para
ello es recomendable utilizar alcohol de 70º o solución salina fisiológica estéril (principalmente si existen heridas o erosiones). Una vez seca se procederá a recoger la muestra.
Describiremos 4 posibilidades:
Key words: Dermatomycoses. Mycological diagnosis. Microbiology.
Mycology. Superficial mycoses.
1. Lesiones de zonas pilosas
El diagnóstico de laboratorio de las infecciones fúngicas de
piel y de anexos utiliza métodos microbiológicos que, cuando se aplican a la micología, con las peculiaridades de esta
especialidad, habitualmente se denominan métodos micológicos.
La primera base del diagnóstico etiológico de una micosis
superficial es que el laboratorio disponga de una muestra
tomada en las condiciones adecuadas y en cantidad necesaria para efectuar todas las pruebas. Esta muestra también
Se recogerán pelos cortos con pinzas de depilar, ya que
pinzan mejor que las de uso clínico. Estas pinzas estarán
estériles o por lo menos se habrán desinfectado previamente. Los pelos cortos de fácil extracción, en los que el paciente no siente dolor al arrancarlos, son los más adecuados.
Los pelos se pueden depositar sobre un portaobjetos de vidrio estéril o desinfectado que se cubrirán con otro de iguales características. Si existen zonas supuradas o rezumantes, se tomará también una muestra con una torunda
estéril. De haber descamación se realizará también un raspado como se describe más adelante.
2. Lesiones en zonas glabras
Correspondencia: Dr. J.M. Torres-Rodríguez.
Unitat de Recerca en Micologia Experimental i Clínica. IMIM/IMAS.
Universidad Autónoma de Barcelona. URMEC. IMIM.
Dr. Aiguader, 80. 08003 Barcelona. España.
Correo electrónico: jmtorres@imim.es
Si las lesiones están bien definidas se tomará la muestra de
los bordes con mayor eritema. En el caso de áreas despigmentadas o hiperpigmentadas, compatible con una pitiriasis
versicolor, el raspado será uniforme. Para el raspado se utilizará un bisturí estéril y se evitará producir cortes, o bien
una cucharilla de Vidal, siempre estéril o desinfectada.
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Fig. 1. a) Toma de muestra utilizando un cuadrado de tapiz (moqueta) estéril; b) siembra en la superficie de medio de cultivo de las escamas recogidas con el
cuadrado de tapiz.
Para tomar muestras de las uñas, es necesario extremar la
limpieza y desinfección, y proceder al raspado, preferiblemente de la tabla interna, utilizando una cucharilla o un bisturí con el filo hacia la uña. Si la lesión es más superficial,
habrá de rasparse o tomarse finas rebanadas de la tabla externa ungueal. De haber una perionixis, ha de tomarse una
muestra con torunda estéril.
3. Muestras de mucosas
Existen dos posibilidades. La más utilizada, tomando la
muestra con una torunda estéril directamente sobre la lesión, y la segunda, que permitirá cuantificar la muestra, mediante un lavado con un volumen conocido de suero fisiológico estéril que se recogerá en un recipiente estéril. Este
método es útil en las candidiasis orofaríngeas y en las vaginales. La siembra de un volumen conocido (p. ej., 10 µl)
permite determinar el número de colonias por mililitro o unidades formadoras de colonias por mililitro.
4. Toma de muestra por contacto
En este procedimiento básicamente existen dos variantes: la
que permite una observación microscópica directa de la
muestra y la que se utiliza para cultivar.
En la pitiriasis versicolor y otras lesiones descamativas en las
que el raspado puede ser inconveniente (niños que se mueven
mucho, lesiones mal definidas) se utilizará una cinta adherente
transparente (cello-tape) que se aplicará sobre la lesión para
que las escamas queden adheridas. Luego se colocará sobre
un portaobjetos, como se describirá más adelante.
La otra variante se emplea para recoger muestra para cultivar, que puede hacerse con una placa de contacto o de Rodac que contenga medio de cultivo general o diferencial
para hongos. También se utiliza el método del cuadrado de
tapiz1. Para ello se toma un fragmento de tapiz o moqueta
de unos 4 × 4 cm que se esteriliza. Al usarse se aplica sobre la lesión raspando suavemente para que se desprendan
escamas y pelos3. El tapiz o moqueta se aplica sobre una o
más placas de Petri con medio de cultivo (figs. 1a y b). Si
no se dispone de este tapiz, puede emplearse una gasa estéril, aunque en ella la adherencia de las escamas es menor. En la tinea capitis puede utilizarse un cepillo dental esterilizado que sirve para cepillar la zona afectada y luego se
cultiva por improntas.
No debe olvidarse el cultivo de muestras tomadas para
biopsias, sobre todo en las dermatomicosis profundas como
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los granulomas dermatofíticos. Sólo por excepción está indicado biopsiar para un estudio micológico en una infección
superficial.
Conservación de las muestras
Como regla general, las muestras han de procesarse lo antes posible, por lo que debe evitarse que transcurra un
tiempo excesivo entre la toma y los cultivos. Algunos puntos
son importantes: los hongos dermatófitos resisten más tiempo que las levaduras las condiciones de desecación; las torundas siempre deben conservarse, ya sea en medio de
transporte o bien humedecidas con suero fisiológico estéril.
Las placas de contacto, una vez utilizadas y rotuladas, ya
pueden incubarse.
Si el tiempo de conservación es superior a las 24 h, siempre
es mejor guardar las muestras refrigeradas.
Procesamiento de las muestras en el laboratorio
En el laboratorio de micología se realizan básicamente 3
procedimientos: el examen microscópico de la muestra, el
cultivo y la identificación del agente causal4. En ocasiones
se ha de realizar el estudio in vitro de la sensibilidad a los
antifúngicos o el tipificado de una o más cepas con fines
epidemiológicos.
Examen microscópico
Se puede efectuar con la preparación nativa sin teñir en el
llamado examen directo, o examen en fresco, o bien puede
requerir una tinción previa.
El examen en fresco es un método de amplio uso en micología por varias razones: se puede realizar con gran rapidez
y, de ser positivo, en muchos casos orienta o afirma el diagnóstico sin tener que esperar a los cultivos, es muy económico y sólo requiere de un microscopio óptico sencillo. El
tamaño de las células fúngicas, hifas, esporas o levaduras
es suficiente como para que se puedan observar con el objetivo de ×40, es decir, a 400 aumentos. Para realizarlo se
utiliza principalmente una solución de hidróxido de potasio
(KOH) entre el 10 y el 40%, a la que se puede añadir dimetilsulfóxido o un colorante de contraste, como la tinta azulnegra al 10%, para facilitar la visión. En las muestras con
mucha queratina se utiliza la mayor concentración y para
aumentar el poder queratolítico del KOH puede calentarse
ligeramente la preparación evitando la ebullición, que la estropearía. Con el cubreobjetos colocado se mira primero a
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Fig. 2. Examen microscópico en fresco (sin tinción y tratado con KOH) en el
que se observan células cornificadas de descamación ungueal y abundantes
conidios característicos de Scopulariopsis.
bajo aumento para seleccionar la zona a observar y luego a
×400 en búsqueda de elementos fúngicos. Básicamente se
encontrarán hifas ramificadas, artroesporas que sugieren un
dermatófito, conidios que pueden ser típicos de mohos
como Scopulariopsis (fig. 2), levaduras en general sin seudohifas, de clasificación incierta si no se cultivan.
La observación microscópica en fresco de pelos parasitados
por dermatófitos permite clasificar las tiñas en endotrix (si las
esporas son interiores), ectotrix (si son externas formando un
manguito alrededor del pelo), así como conocer el tamaño y
disposición de las esporas. Por lo general, las tiñas endotrix
son producidas por especies antropófilas de dermatófitos
como Trichophyton violaceum, por ejemplo, y las ectotrix por
especies zoofilas como Microsporum canis (fig. 3).
Casi todas las publicaciones concuerdan en que el examen
directo posee una sensibilidad inferior al cultivo. Otro inconveniente es considerar como estructuras fúngicas artefactos
como cristales de colesterol, bordes celulares doblados, gotas de aceite o grasa y burbujas de aire, entre otros. También pueden observarse hifas de hongos contaminantes
presentes en muestras no desinfectadas.
Las tinciones se aplican cuando la muestra procede de una
mucosa o es una secreción serosa o purulenta y, sobre
todo, son útiles para visualizar levaduras. Las más utilizadas
son el azul de metileno, la tinción de Gram y el Giemsa; raramente es necesario realizar tinciones más complejas y específicas de hongos como el PAS o el Gomori, las que se
utilizan principalmente en las biopsias junto con la tradicional hematoxilina-eosina.
En las tinciones, la observación microscópica se realiza con el
objetivo de ×40 y también de ×100, es decir de inmersión.
Fig. 3. Medio de cultivo DTM (Dermatophytes test medium) en el que el desarrollo de un hongo dermatófito produce un viraje de color del amarillo al
rojo.
Se han descrito otros medios de aislamiento, algunos de los
cuales son diferenciales porque llevan un indicador cromogénico más o menos específico. Entre los que se utilizan corrientemente se encuentran el Dermatophytes test medium
(DTM), descrito por Taplin et al5, útil para observar el desarrollo de la mayoría de dermatófitos que, al crecer, alcalinizan el
medio y ocasionan un viraje de color amarillo a rojo (fig. 3).
Este viraje ha de valorarse en condiciones concretas, es decir
antes de los 7 días de la siembra, descartando contaminación
por bacterias. Siempre es conveniente asegurar la identificación por medio de una observación microscópica de la colonia desarrollada. Fuera de estas condiciones, el viraje puede
estar ocasionado por otros microorganismos contaminantes.
En las levaduras se han descrito varios medios diferenciales
en los que algunas especies (Candida albicans y, según el
medio, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei) originan colonias
que adquieren un color diferente del blanco o el amarillento, común a todas ellas (fig. 4).
En los cultivos hay que tener presente que, si bien las levaduras crecen rápidamente en 24-48 h y también lo hacen
Cultivo
Excepto Malassezia sp., una especie lipofílica, el resto de
los agentes de micosis superficiales crecen en medios de
cultivo artificiales generales para hongos. El medio utilizado
universalmente es el agar de Sabouraud, cuya composición
es la peptona, la glucosa, el agar y el agua, con un pH ácido
de 5,5, aproximadamente. Como las muestras suelen estar
contaminadas con bacterias de la flora normal, el medio incluye un antibiótico antibacteriano, el cloramfenicol, y a veces la gentamicina. Para muestras en que se pretende aislar un dermatófito también se agrega cicloheximida, un
antifúngico inhibidor de numerosos hongos contaminantes,
aunque también puede inhibir especies de levaduras y mohos oportunistas.
Fig. 4. Placa de cultivo para levaduras que utiliza medio cromogénico. Algunas especies de Candida desarrollan colonias cracterísticas de diferentes colores, mientras que en medios generales son de aspecto similar.
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Fig. 5. Reverso de una placa de cultivo donde ha crecido el dermatófito Trichophyton rubrum. Presenta un pigmento rojo intenso característico de la especie.
Fig. 6. Método de estudio de la sensibilidad in vitro a los antifúngicos utilizando tiras con concentraciones crecientes de antifúngico (itraconazol/fluconazol). La concentración mínima inhibitoria corresponde al punto de intersección del crecimiento de la levadura con la tira de antifúngico.
algunos mohos (Aspergillus, Penicillium, etc.), los dermatófitos tienen un desarrollo lento y raramente se observan colonias antes de los 4-5 días, por lo que hay que esperar
hasta 3-4 semanas para algunas especies como T. verrucosum o T. violaceum. Es necesario recordar que la esporulación y la pigmentación que ayudan a identificar las especies
de dermatófitos no se obtienen, en general, hasta transcurrida 1 semana o 10 días de la siembra (fig. 5).
En la técnica del cultivo debe prestarse especial atención a
las muestras procedentes de uñas en las que pueden crecer
muy diversos hongos oportunistas. La valoración de estos cultivos se hará aplicando unas estrictas normas propuestas por
English hace varias décadas6. Estas normas son las siguientes: deben realizarse numerosos puntos de siembra en cada
placa, se considerarán si en ellos desarrolla el mismo moho,
al menos en el 50% de los puntos, siempre que no haya ningún dermatófito y además es necesario repetir el cultivo en 3
ocasiones diferentes con nuevas muestras de las mismas
uñas, obteniéndose resultados similares. Obviamente esto
puede obviarse si la muestra sembrada es una biopsia.
zan principalmente en grandes hospitales con un elevado
número de muestras para identificar. A pesar de la importancia de las pruebas bioquímicas, no debe olvidarse la
aportación de la morfología microscópica por siembra en
medios especiales y la gran orientación que ofrecen los medios de cultivo cromogénicos9.
Con los hongos miceliares, las pruebas bioquímicas tienen
un valor más limitado puesto que es la característica de las
colonias, observadas macro y microscópicamente, lo que
permite la identificación de la especie. En muchas ocasiones, para estimular el desarrollo de las estructuras reproductivas la colonia aislada debe resembrarse en medios especiales, en general con menos nutrientes como el agar
patata dextrosa, el Sabouraud diluido 1/10, u otros.
Los hongos dermatófitos habituales en una región suelen dar
colonias parecidas, pero hay que tener presente que las características del medio de cultivo (calidad de la peptona, dureza del agar, pH del agua) influyen en la pigmentación y la
esporulación. Esto es fácilmente visible en una de las más
comunes: Trichophyton rubrum. Algunas especies, como
Epidermophyton floccosum, tienden a degenerar rápidamente y originar un micelio blanco con numerosas clamidosporas a los pocos días de la siembra.
Es imprescindible disponer de obras de referencia donde se
proporcionan claves dicotómicas de identificación, descripciones minuciosas de las especies e imágenes (dibujos y fotografías) que pueden sen imprescindibles para clasificar la
especie aislada10.
Identificación de la especie causal
Es imprescindible para realizar un correcto tratamiento y
emitir un pronóstico adecuado7. Esto se percibe claramente
en el caso de las onicomicosis por la variedad de agentes y
la resistencia de alguno de ellos a determinados antifúngicos, pero también tiene interés en otras localizaciones como
la tinea capitis, que responde peor al antifúngico terbinafina
si el agente es Microsporum canis. El cultivo es el único método de identificar correctamente un hongo y tener información, cuyo valor no sólo es diagnóstico sino epidemiológico,
puesto que puede indicar un cambio en la prevalencia de
algunas especies, la fuente común de contagio, el origen
zoófilo, antropófilo o geófilo del dermatófito o la introducción
de nuevas especies8.
Para la identificación de las levaduras se utilizan principalmente pruebas bioquímicas basadas en la utilización de determinados azúcares o la inhibición por algunas sustancias,
así como la actividad enzimática del hongo. Existen numerosas técnicas comercializadas de mayor o menor complejidad que pueden llegar a estar automatizadas y que se utili-
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Estudio de la sensibilidad in vitro a los antifúngicos
Así como en muchas micosis sistémicas por levaduras y
hongos miceliares oportunistas, cada vez es más necesario
realizar pruebas in vitro para determinar la sensibilidad a varios antifúngicos, en las micosis superficiales esta necesidad
es menor. Por lo general se recomienda la determinación de
la sensibilidad en infecciones por levaduras que no responden al tratamiento, principalmente si los enfermos están inmunodeprimidos, en las infecciones mucosas (orofaríngeas y
vaginales) y cuando se trata de un hongo oportunista poco
conocido en cuanto a su sensibilidad a los antifúngicos comunes. Principalmente se han de administrar por vía oral11.
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En la actualidad, se dispone de varias pruebas comercializadas y estandarizadas por comparación con el método de
referencia, de uso corriente en laboratorios de rutina. Estas
pruebas pueden clasificarse en las que realizan una determinación de la concentración mínima inhibitoria del antifúngico y, por tanto, proporcionan resultados cuantitativos, y
las que solamente ofrecen una información cualitativa que
clasifica al hongo como sensible, resistente o de sensibilidad intermedia. Según el método las pruebas se realizan en
medios de cultivo líquidos o en placas de agar con medios
especiales (fig. 6).
El método más ampliamente aceptado como referencia es
el que utiliza medio de cultivo líquido y emplea diluciones
progresivas del antifúngico en microplacas, por lo que se
trabaja con bajos volúmenes de reactivos e inóculo. Este
método, en sus diferentes variantes, ha sido publicado por
la National Committee of Clinical Laboratory Standards
(NCCLS) de EE.UU. No obstante, este método sigue siendo
laborioso, muy artesanal y requiere disponer del antifúngico
en forma de polvo bien estandarizado en cuanto a su potencia. Por ello esta técnica suele restringirse a laboratorios
más especializados.
Tipificado de las cepas
En algunas situaciones en las que se pretende conocer si 2
o más aislados de un mismo hongo son similares, se utilizan
técnicas de tipificado que pueden hacerse basadas en caracteres fenotípicos, pero que cada vez más se basan en
características moleculares que pueden requerir la obtención y amplificación del ADN por PCR. La mayoría de las
veces estos tipificados tienen la finalidad de determinar la
fuente de la infección, la forma de transmisión y la distribución de una cepa determinada, y su utilidad suele ser epi-
demiológica o para la investigación. Obviamente, este tipo
de pruebas raramente están estandarizadas y no están disponibles en laboratorios no especializados12.
Como se ha detallado anteriormente, el diagnóstico de laboratorio de una micosis superficial no suele ser dificultoso
por la facilidad de acceso a la muestra, pero la utilidad y la
fiabilidad de los resultados obtenidos están determinadas
por la aplicación rigurosa del método micológico.
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