INFORME FINAL 1 Vigilancia de susceptibilidad a insecticidas de Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi, An. (N.) nuneztovari y An. (N.) albimanus en localidades centinelas de los departamentos de Antioquia, Cauca, Choco, Córdoba y Valle del Cuaca. Año 2009 - 2014. Proyecto: Uso de la inteligencia epidemiológica con participación social para fortalecer la gestión del programa, mejorar el acceso al diagnóstico y tratamiento y ejecutar intervenciones eficaces para la prevención y control de la malaria, Colombia, 2010 - 2015 Actividades desarrolladas en el marco del objetivo 2: Implementar la protección con TILD en la población vulnerable objeto de la intervención. Responsable: John Jairo González Duque, Entomólogo Unidad Ejecutora del Proyecto Malaria Colombia. Actividades desarrolladas de manera coordinada y participativa con el Laboratorio de Entomología del Instituto Nacional de Salud y los programas de ETV departamentales de Antioquia, Cauca, Chocó, Córdoba y Valle del Cauca por medio de la participación de entomólogos y técnicos de ETV. Abril 2015 RESUMEN. 2 En Colombia, el control vectorial de la malaria se basa principalmente en la utilización de insecticidas y su utilización masiva o prolongada genera presión de selección sobre la población de mosquitos vectores, y en consecuencia se puede ocasionar resistencia amenazando la efectividad y por lo tanto el impacto de los programas de prevención y control. Uno de los lineamientos de la Red Nacional de Entomología que lidera el INS es la vigilancia en áreas centinelas de la resistencia de los vectores de malaria a los principales insecticidas empleados para su control. En el presente estudio se desarrollaron evaluaciones a las tres principales especies de mosquitos vectores de malaria en el país procedentes de 14 localidades centinelas de los departamentos de Antioquia, Cauca, Chocó, Córdoba y Valle del Cauca de donde se reporta cerca del 80% de la malaria en Colombia. Estas evaluaciones fueron realizadas utilizando la metodología de papeles impregnados de la OMS o de botellas impregnadas del CDC sobre mosquitos colectados en campo sobre atrayente humano protegido, abrigo animal u obtención de adultos a partir de larvas colectadas en criaderos. Todos los mosquitos empleados en las pruebas fueron identificados por taxonomía clásica y se realizó reconfirmación del diagnóstico de especies por biología molecular por PCR-RFLP ITS2 para una muestra de mosquitos identificados como Anopheles spp y los que sus patrones de caracteres diagnósticos por taxonomía clásica se sobrelapan con An. nuneztovari. Los resultados compatibles con resistencia se observaron: en el departamento de Chocó al insecticida Permetrina en la población de mosquitos An. nuneztovari de la localidad La Italia de San José del Palmar para el año 2010 y para Deltametrina, Alfacipermetrina, Lambdacialotrina y DDT en An. darlingi de la localidad Tagachí de Quibdó en el año 2014. En el departamento de Córdoba para An. nuneztovari de la localidad Quebrada de Torre de Tierralta frente a los insecticidas Deltametrina y Lambdacialotrina en el año 2014. En la población de mosquitos An. albimanus de la localidad Punta Soldado del distrito de Buenaventura en Valle del Cauca frente al insecticida Deltametrina en el año 2014 y a esta misma especie del municipio de Guapi Cauca frente a Alfacipermetrina durante el año 2010. TABLA DE CONTENIDOS 3 1 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 7 2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ..................................... 8 3 MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 9 4 OBJETIVOS ................................................................................................................. 19 4.1 4.2 5 Objetivo General.....................................................................................................19 Objetivos Específicos .............................................................................................20 MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................................... 20 5.1 Área de estudio. ......................................................................................................20 5.1.1 Criterios de selección de las localidades de estudio. ..........................................20 5.2 Recolección de Material Biológico. .......................................................................21 5.3 Insecticidas Evaluados:...........................................................................................22 5.4 Pruebas Biológicas: ................................................................................................22 5.5 Determinación taxonómica de los especímenes .....................................................23 5.6 Análisis e Interpretación de Resultados..................................................................24 6 RESULTADOS ............................................................................................................ 25 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 Antioquia ................................................................................................................25 Chocó ......................................................................................................................28 Córdoba ..................................................................................................................31 Valle del Cauca. ......................................................................................................34 Cauca. .....................................................................................................................36 7 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES ............................................................................. 37 8 RECOMENDACIONES .............................................................................................. 40 9 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 41 LISTA DE TABLAS 4 Tabla 1. Notificación de casos de malaria Colombia 2012 – 2014 a semana epidemiológica 53. ......................................................................................................................................... 11 Tabla 2. Insecticidas, dosis y tiempo diagnóstico empleados en las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad con la metodología OMS y CDC en Anopheles spp. ............. 22 Tabla 3. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las centinelas de Antioquia........................................................................................ 26 Tabla 4. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las localidades centinelas de Chocó. ......................................................................... 28 Tabla 5. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las localidades centinelas de Córdoba. ...................................................................... 31 Tabla 6. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las localidades centinelas de Buenaventura, Valle del Cauca. .................................. 34 Tabla 7. Evaluaciones de susceptibilidad de An. albimanus de las localidades Punta Bonita del distrito de Buenaventura a insecticidas por medio de la metodología papeles impregnados de la OMS. Junio de 2011 ............................................................................... 35 Tabla 8. Consolidado de resultados de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas en los departamentos de Antioquia, Chocó, Córdoba, Valle del Cauca y Cauca. .......................... 38 LISTADO DE FIGURAS 5 Figura 1. Epidemiologia de la malaria en el mundo. Año 2013. ...........................................10 Figura 2. Epidemiologia de la malaria en las Américas. Año 2013. .....................................10 Figura 3. Cambios en las frecuencias de genes resistentes por la presión con insecticidas ..14 Figura 4. Área de estudio donde se realizaron evaluaciones de resistencia a insecticidas en el marco del proyecto malaria Colombia. .......................................................................21 Figura 5. Esquema de los productos de PCR-RFLP ITS2 esperados para cada una de las especies según la metodología de Ruiz et al. 2005. .......................................................24 Figura 6. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de la localidad Corrales El Playón y An. albimanus de la localidad Yarumal a insecticidas piretroides, DDT y Fenitrotion por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Septiembre de 2010. ..........................................................................................................................27 Figura 7. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de la localidad Asturias del municipio de Cáceres a insecticidas piretroides, DDT y Fenitrotión por medio de la metodología de papeles impregnados de la OMS. Mayo de 2014. ................................28 Figura 8. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de la localidad La Italia y An. darlingi del municipio de la localidad Beté a insecticidas piretroides por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Septiembre y noviembre de 2010 respectivamente. .............................................................................................................30 Figura 9. Evaluaciones de susceptibilidad de An. darlingi de la localidad Tagachí del municipio de Quibdó a insecticidas Deltametrina, Alfacipermetrina, Lambdacialotrina, DDT (a) y Fenitrotion (b) por medio de la metodología de papeles impregnados de la OMS. Junio 2014. ...........................................................................................................30 Figura 10. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de las localidades Juan José, La Boga, San Rafael del Pirú, Brasil y Quebrada de Torre en Córdoba a los insecticidas Deltametrina, Lambdacialotrina, Alfacipermetrina, DDT y Fenitrotion por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Agosto - diciembre de 2010, noviembre de 2012 y Julio de 2014. .................................................................................................32 Figura 11. Evaluaciones de susceptibilidad de An. albimanus de las localidades Punta Soldado del distrito de Buenaventura a insecticidas por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC y papeles impregnados de la OMS. Agosto de 2010 – Mayo de 2014. ................................................................................................................35 Figura 12. Evaluaciones de susceptibilidad de An. albimanus del municipio de Guapi en el departamento de Cauca a insecticidas por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Julio - agosto de 2009 (a) y julio de 2010 (b). ..........................36 LISTADO DE FOTOS 6 Foto 1. Mosquito Anopheles spp. ...........................................................................................12 Foto 2. Métodos de recolección de material biológico empleados. .......................................21 Foto 3. Desarrollo de evaluaciones de susceptibilidad a insecticidas con la metodología CDC y OMS. ...........................................................................................................................23 Foto 4. Identificación de mosquitos Anopheles spp por taxonomía clásica. ..........................23 1 INTRODUCCIÓN 7 En Colombia, el control vectorial de la malaria se basa principalmente en la aplicación de insecticidas de efecto residual y en la entrega e instalación de Toldillos Insecticidas de Larga Duración (TILD); estrategia, esta última, que ha sido implementada por el Ministerio de Salud y Protección Social desde el año 2005 en baja escala y recientemente con una mayor intensidad en algunas áreas prioritarias gracias al trabajo conjunto con el Proyecto Malaria Colombia, con coberturas superiores al 95% de las viviendas habitadas para las localidades beneficiadas. La utilización masiva de insecticidas genera presión de selección sobre la población de mosquitos vectores, y en consecuencia se puede ocasionar resistencia a los ingredientes activos de uso en salud pública, amenazando la efectividad y por lo tanto el impacto de los programas de control de malaria (WHO 1975). Desde el año 2005, el Instituto Nacional de Salud está liderando la Red Nacional de Vigilancia de Resistencia a Insecticidas (RNVRI – INS). De acuerdo a los resultados obtenidos en el marco de la red, se ha detectado resistencia a insecticidas organoclorados (DDT), organofosforados (Fenitrotion) y piretroides (Deltametrina y Lambdacialotrina) en poblaciones naturales de Anopheles; sin embargo, las evaluaciones son escasas dadas las dificultades de recolección de material biológico. El Proyecto Malaria Colombia en su marco de ejecución, como estrategia de control vectorial implementó la entrega e instalación de 431.630 TILD en localidades endémicas de los 45 municipios de su ámbito de acción en los departamentos de Antioquia, Cauca, Chocó, Córdoba y Valle del Cauca entre los años 2011 a 2014. Teniendo en cuenta la intervención masiva con TILD en estos cinco departamentos y las intervenciones previas realizadas por los programas de control de ETV con TILD y otras estrategias de control químico como son el rociado intradomiciliario residual e incluso la fumigación espacial a Ultra Bajo Volumen (ULV), se hizo necesario evaluar el estado de susceptibilidad de poblaciones naturales de los tres principales vectores de malaria de Colombia a insecticidas de uso en salud pública. 2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 8 En Colombia, la malaria constituye una prioridad en las metas del milenio del Ministerio de Salud y Protección Social debido a que es un grave problema de salud pública, teniendo en cuenta que el 85% del territorio reúne las condiciones ecológicas para su transmisión y más del 65% de la población se encuentra en riesgo (OPS 1999-2000, OPS 1995). Este evento provoca enfermedad, incapacidad y muerte, generando costos directos en los programas de prevención, vigilancia y control, como también costos indirectos asumidos por las familias afectadas (Kroeger et al. 2004). La dinámica de transmisión de malaria se hace compleja teniendo en cuenta que su intensidad depende de factores relacionados con el parásito (resistencia a los medicamentos), el huésped humano (susceptibilidad del hospedero otorgado por el grado de experiencia malárica), el medio ambiente (cambios climáticos con sus variaciones en los régimen de lluvias, la temperatura y la humedad) y el vector (resistencia a insecticidas) además de los factores socioculturales como los cultivos ilícitos, del conflicto armado, la pobreza en el campo, entre otros (Nicholls 2001, Mendoza et al. 2000). Una de las estrategias para la vigilancia, prevención y control de las enfermedades transmitidas por vectores es el control integrado y selectivo de vectores (CISV), el cual debe responder eficazmente a situaciones epidemiológicas específicas, optimizando recursos, generando poco impacto al medio ambiente y asegurando su evaluación de impacto y sostenibilidad (Ministerio de Salud 1996). Las acciones de control están encaminadas a eliminar o interrumpir la transmisión de la enfermedad a través de estrategias de ordenamiento del ambiente, eliminación de sitios de cría de los vectores, educación y participación comunitaria, COMBI y aplicación de productos biológicos y químicos que afecten el desarrollo de los vectores. Sin embargo, la actividad más ampliamente utilizada es el control químico dirigido particularmente a disminuir la densidad de los mosquitos aunque no haya transmisión activa, o a interrumpir la transmisión de la enfermedad en caso de brotes y epidemias (Najera y Zaim 2002). Colombia ha registrado resistencia de las especies vectores primarios de malaria a insecticidas de uso en salud pública (Quiñones et al 1987, Suárez et al 1990, González et al 2005, Santacoloma 2008). La resistencia a insecticidas es la capacidad de una población de insectos a tolerar dosis de insecticidas que serían letales para la mayoría de los individuos en una población normal de la misma especie (OMS 1957). La aparición de resistencia está determinada por las características genéticas intrínsecas de los vectores siendo afectada además, por aspectos operativos tales como la calibración de equipos, aplicación de dosis subletales o excesivas de insecticida, personal poco capacitado, y desarrollo de actividades no regulares. Con este estudio se espera contribuir con el diagnóstico del estado de la resistencia o susceptibilidad a insecticidas de los vectores primarios de malaria en Colombia procedentes de localidades centinelas de los departamentos con mayor carga de la enfermedad que ofrezca criterios técnicos oportunos para la toma de decisiones en el control químico en el país. 3 MARCO TEÓRICO 9 La malaria o paludismo es una enfermedad infecciosa de gran relevancia para la salud pública potencialmente mortal causada por parásitos del género Plasmodium, que se transmite entre los seres humanos por la picadura de mosquitos infectados del género Anopheles, los llamados vectores del paludismo, que pican sobre todo entre el anochecer y el amanecer. Es una enfermedad crónica con períodos de paroxismos caracterizados por fiebre, escalofríos, temblores y dolor de cabeza. La gravedad de su evolución depende de un número de factores, entre ellos la especie de Plasmodium que provoca la infección, las características genéticas, inmunológicas y la experiencia del individuo en términos de exposiciones en el pasado y la frecuencia de la exposición. (Rodriguez et al 2008, WHO 2014, WHO 2015). Existen cuatro especies del parásito que infectan a los seres humanos: Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale. Los más frecuentes son el paludismo por P. falciparum y por P. vivax, y el más mortal el paludismo por P. falciparum. En los últimos años ha habido algunos casos humanos por P. knowlesi, una especie que circula en primates y que aparece en zonas boscosas de Asia Sudoriental por lo que este parásito ha sido propuesto como el quinto parásito que infecta a los humanos. Las personas adultas no inmunes, los niños menores de 5 años y las mujeres embarazadas pueden experimentar un cuadro más severo, incluso puede causar la muerte, especialmente si están infectados por el P. falciparum. Aproximadamente la mitad de la población mundial corre el riesgo de padecer el paludismo. La mayoría de los casos y de las muertes se registran en el África subsahariana. No obstante, también se ven afectadas Asia, Latinoamérica y, en menor medida, Oriente Medio y algunas zonas de Europa. En 2014 el paludismo estaba presente en 97 países y territorios y una población en estado de riesgo en contraerla de aproximadamente 3300 millones de personas de las cuales 1200 millones se encuentran en riesgo elevado (> 1 caso por cada 1000 habitantes al año). Según las últimas estimaciones, en 2013 se produjeron 198 millones de casos de paludismo (con un margen de incertidumbre que oscila entre 124 millones y 283 millones) que ocasionaron la muerte de unas 584 000 personas (con un margen de incertidumbre que oscila entre 367 000 y 755 000). La mayoría de las muertes se producen entre niños que viven en África, donde cada minuto muere un niño a causa del paludismo a pesar de que en esta región la tasa de mortalidad por paludismo en menores se ha reducido desde 2000 en un porcentaje estimado del 58% y a nivel mundial en la población general esta reducción ha sido de más de un 47% durante el mismo periodo. De acuerdo con los casos notificados en 2013, 55 países están en camino de reducir sus tasas de incidencia de casos de paludismo en un 75%, de conformidad con las metas fijadas por la Asamblea de la Salud para 2015. En los últimos años, la Directora General de la OMS ha certificado la eliminación del paludismo en cuatro países: Emiratos Árabes Unidos (2007), Marruecos (2010), Turkmenistán (2010) y Armenia (2011) (Rodriguez et al 2008, WHO 2014, WHO 2015). 10 Figura 1. Epidemiologia de la malaria en el mundo. Año 2013. Tomado de World Malaria Report 2014. Para el caso de las Américas, se estima que 145 millones de personas en 21 países se encuentran en riesgo de contraer malaria. Para el año 2012 se registraron 469.000 casos confirmados de malaria y 108 muertes en la región aunque es importante mencionar que la tendencia de la enfermedad es a la disminución a nivel mundial y para el caso de las Américas entre el año 2000 y 2012 el descenso se estimó en un 60% en los casos y una disminución del 72% en las muertes (WHO 2014-2015). Figura 2. Epidemiologia de la malaria en las Américas. Año 2013. Tomado de World Malaria Report 2014. En Colombia, la malaria continúa siendo un grave problema de salud pública, debido a que cerca del 85% del territorio rural está situado por debajo de los 1.500 metros sobre el nivel del mar y presenta condiciones climáticas, geográficas y epidemiológicas aptas para la transmisión de la enfermedad. Cerca del 60% de la población colombiana se encuentra en riesgo de enfermar o morir por esta causa. A semana epidemiológica 53 de 2014 se notificaron al SIVIGILA un total de 40718 casos de malaria no complicada en todo el territorio nacional, de los cuales el 49,3% fueron producto de la infeccion con P.vivax y otro 49,3% fueron debidos a P.falciparun y el 1,4 % restante a infecciones mixtas y por P.11 malarie (INS 2015). Tabla 1. Notificación de casos de malaria Colombia 2012 – 2014 a semana epidemiológica 53. Tomado de memorias de reunion de celebración del día internacional de lucha contra la malaria. Hotel Tequendama 26-04-2015. En terminos generales, comparando la morbilidad por malaria en tre los año 2012 y 2014, se refleja una tendencia decreciente de la infección en un 32,3% siendo más marcaa por P. vivax. Con relación a los casos de malaria complicada, hasta semana 53 de 2014 se notificaron 325 casos en todo el territorio nacional de los cuales el 62,9% de ellos proceden de los departamentos de Chocó (36,8%) Valle del Cauca (13,8%) y Antioquia (12,3%) y se notificaron 17 muertes debidos a este evento de los cuales el 47% ocurrieron en el departamento de Chocó. Los vectores de malaria se han clasificado como especies de importancia primaria y secundaria con base en hallazgos de infectividad natural por Plasmodium spp, comportamiento de picadura y distribución geográfica (Herrera et al., 1987; Olano et al., 2001). Los vectores primarios son aquellos que tienen una amplia distribución y se les considera como responsables de la transmisión de la malaria en grandes áreas endémicas. Los vectores secundarios presentan una distribución limitada y pueden transmitir la enfermedad de una manera esporádica. Sin embargo, en determinadas circunstancias un vector secundario puede ser más importante que un vector principal o ser el único vector presente (Fleming, 1986). En Colombia aparecen registradas 45 especies, de las cuales se consideran tres vectores principales: Anopheles (Nyssorhynchus) albimanus Wiedemann, Anopheles (Nys.) darlingi Root y Anopheles (Nys.) nuneztovari Gabaldón y como vectores secundarios Anopheles (Anopheles) punctimacula Dyar & Knab, Anopheles (An.) pseudopunctipennis Theobald, Anopheles (Kerteszia) neivai Howard, Dyar & Knab y Anopheles (Ker.) lepidotus Zavortink (Olano et al., 2001). Otras especies como Anopheles (Argyritarsis) marajoara Galvao & Damasceno, Anopheles (Nys.) evansae Brethes, Anopheles (Nys.) strodei Root y Anopheles (An.) neomaculipalpus Curry se han citado como vectores en determinadas regiones del país, aunque sin pruebas de su capacidad vectorial, a pesar de su tendencia antropofílica y antecedentes de hallazgo de infectividad natural por Plasmodium humano (Brochero, 2001, Herrera et al., 1987). Recientemente, han sido incriminadas en la transmisión de la malaria en el departamento de Putumayo Anopheles rangeli (Nys.) Gabaldón, Cova Garcia, y12 López y Anopheles oswaldoi (Nys.) (Peryassú) (Quiñones et al., 2006). Varias especies pertenecientes al subgénero Nyssorhynchus presentan alta similaridad morfológica del adulto, generando dificultad en la identificación taxonómica. En los últimos años se han utilizado marcadores moleculares como los espaciadores internos transcritos (ITS) del DNA ribosomal (DNAr) para examinar variaciones ínterespecies (ITS2) e intraespecie (ITS1) (Zapata et al., 2004). Zapata et al. (2007) emplearon una PCR-RFLP basada en el espaciador interno transcrito 2 (ITS2) para la diferenciación de siete especies de Anopheles recolectados en San Pedro de Urabá, una localidad en Antioquia, Colombia, la cual presentaba altos niveles de transmisión de la malaria. Las comparaciones de la identificación morfológica con el patrón obtenido mediante la prueba molecular permitió confirmar la designación de especie para cada de espécimen. Este nuevo método puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para la discriminación de la especies de anofelinos de importancia médica en esta región y para la realización de estudios complementarios en que se requiera la identificación rápida y precisa de un gran número de especímenes. En la Costa Pacífica Colombiana Cienfuegos et al. (2008) emplearon la PCR-RFLP de Zapata et al. (2007) presentes y además, adecuaron esta metodología para la identificación molecular de las cuatro especies más pertenecientes al Grupo Oswaldoi, encontradas en Colombia. Foto 1. Mosquito Anopheles spp. Tomado de schools-wikipedia.org/wp/m/Malaria La lucha antivectorial es el medio principal de reducir la transmisión del paludismo en la comunidad. Se trata de la única intervención que puede reducir la transmisión de niveles muy elevados a niveles cercanos a cero. A nivel individual, la protección personal contra las picaduras de los mosquitos es la primera línea de defensa en la prevención del paludismo (WHO 2015). Hay dos formas de control de los vectores que son eficaces en circunstancias muy diversas: Los mosquiteros tratados con insecticidas: Los mosquiteros tratados con insecticidas de acción prolongada son los preferidos en los programas de distribución de salud pública. La OMS recomienda la cobertura de todas las personas en riesgo; y en la mayoría de los13 ugares, la forma más rentable de conseguirla consiste en suministrar mosquiteros tratados con insecticidas de acción prolongada, de modo que todos los residentes en zonas con gran transmisión duerman cada noche bajo esos mosquiteros (WHO 2015). Fumigación de interiores con insecticidas de acción residual: La fumigación de interiores con insecticidas de acción residual (FIAR) es una intervención potente para reducir rápidamente la transmisión del paludismo. Sus posibilidades máximas se materializan cuando se fumiga al menos el 80% de las casas de las zonas destinatarias. La FIAR es eficaz durante 3 a 6 meses, dependiendo del insecticida utilizado y del tipo de superficie fumigada. En algunos casos puede ser eficaz durante 9 a 12 meses. Se están desarrollando formas de insecticidas para la FIAR con una acción más prolongada, y nuevas clases de insecticidas para ser utilizadas en los programas de FIAR (WHO 2015). Los grupos de insecticidas de mayor uso empleados en salud pública son organoclorados (OCs), organofosforados (OFs), carbamatos y piretroides, sin embargo actualmente están siendo consideradas otras alternativas como reguladores de crecimiento, e insecticidas microbianos (López et. al 1993). Organosforados y carbamatos: estos insecticidas presentan su acción tóxica bloqueando una importante enzima del sistema nervioso, en las uniones sinápticas: la acetilcolinesterasa (AchE). La (AchE) hidroliza rápidamente a la ACh (acetilcolina), lo que conlleva a la repolarización de la membrana o de la placa basal (en las conexiones neuromusculares) y las prepara para la llegada de un nuevo impulso. De tal manera que la función de la ACh depende de su rápida hidrólisis por la AchE, que permite la brevedad y unidad de los impulsos propagados sincrónicamente. Así pues, al formarse enlaces covalentes muy fuertes entre el insecticida y la AchE, esta se inhibe provocando la acumulación de la Ach en la unión sináptica y la interrupción de la transmisión normal de los impulsos nerviosos. En insectos el efecto de los organofosforados y carbamatos es principalmente afectar el sistema nervioso central, desde la unión neuromuscular no colinérgica como en mamíferos. La única sinapsis colinérgica conocida en insectos es en el sistema nervioso central. La unión neuromuscular química transmitida en insectos es ácido glutámico (Ponce et.al 2006). Piretroides: este tipo de insecticidas afectan tanto el sistema nervioso central como el periférico de los insectos. Los piretroides estimulan inicialmente las células nerviosas produciendo repetidas descargas y eventuales casos de parálisis, estos efectos son producidos en la membrana nerviosa y causados por acción en los canales de sodio, a través de los poros por donde se permite la entrada a los axones para causar la excitación (Bissett et. al 2002) El sitio exacto de acción de los piretroides en la sinapsis no es conocido, pero es probable que la acción tóxica de los piretroides sea bloquear el axón nervioso (Zerva et. al 1988). En esencia, los piretroides son moduladores en los canales de sodio, es decir el insecticida interfiere en los canales de sodio del sistema nervioso central y periférico, provocando repetitivas descargas nerviosas, induciendo parálisis y la muerte. Gran parte del éxito obtenido hasta ahora en el control del paludismo se debe al control del vector, que depende en gran medida de la utilización de piretroides, la única clase de insecticidas recomendada en la actualidad para los mosquiteros tratados con insecticidas y14 los mosquiteros tratados con insecticidas de acción prolongada. En los últimos años han aparecido mosquitos resistentes a los piretroides en muchos países. En algunas zonas se ha detectado resistencia a las cuatro clases de insecticidas utilizados en el ámbito de la salud pública. Por fortuna, esta resistencia raramente se ha asociado a una disminución de la eficacia, y los mosquiteros tratados con insecticidas de acción prolongada y la fumigación de interiores con insecticidas de acción residual siguen siendo muy efectivos en casi todos los entornos. No obstante, hay motivos de gran preocupación en algunos países del África subsahariana y en la India, donde se combina un alto nivel de transmisión del paludismo con una generalización de la resistencia a los insecticidas. La detección de la resistencia a los insecticidas debe ser un componente esencial de todos los esfuerzos nacionales por controlar el paludismo, con el fin de garantizar que se están utilizando los métodos más eficaces de lucha antivectorial. La elección del insecticida de acción residual utilizado en la fumigación debe basarse siempre en datos locales y recientes sobre la susceptibilidad de los vectores a los que se dirige (WHO 2015). La resistencia a insecticidas es la capacidad de una población de insectos de tolerar dosis de insecticidas que serían letales para la mayoría de los individuos en una población normal de la misma especie y se genera por presión de selección del insecticida sobre genes que se encontraban a bajas frecuencias (WHO, 1957). Los genes de resistencia se encuentran normalmente en las poblaciones a unas frecuencias muy bajas, una vez se empiecen a hacer presiones químicas con insecticidas, los individuos susceptibles comienzan a desaparecer y predominan los individuos que portan los genes de resistencia, ocasionando un aumento de individuos resistentes dentro de la población (Paroonagian et.al 1994). Figura 3. Cambios en las frecuencias de genes resistentes por la presión con insecticidas La aparición de la resistencia está determinada por características genéticas intrínsecas de los vectores tales como la frecuencia y dominancia de los alelos R, penetración, donde la composición del exoesqueleto llega a ser modificada inhibiendo la penetración del insecticida, expresividad e interacción entre los alelos R y selección por otros productos químicos, así como factores biológicos tales como ciclo de vida, número de descendientes por generación, aislamiento, movilidad y migración y aspectos operativos como calibración de equipos, aplicación de dosis subletales o excesivas de insecticida, personal poco capacitado y desarrollo de actividades no regulares (Bisset et. al, 2002). Los factores más influyentes en el desarrollo de la resistencia son: frecuencia de aplicación, tasa de reproducción y dosis y persistencia del efecto del insecticida: 15 Frecuencia de aplicación: la tasa de aumento de la resistencia de cualquier población de insectos puede incrementarse ante una presión de selección frecuente de un mismo insecticida. Tasa de reproducción: especies de insectos que presentan altas tasas de reproducción y ciclos de vida cortos pueden desarrollar resistencia a una velocidad mayor a comparación de las especies que tienen una menor tasa de reproducción, debido a que los genes de resistencia pueden propagarse rápidamente a toda la población (IRAC, 2011) Dosis y persistencia del efecto insecticida: la propiedad que tienen los insecticidas para persistir en el tiempo depende de la química – física de estos, de su formulación y la tasa de disipación del insecticida en el medio ambiente, de tal manera que los insecticidas persistentes pueden estar proporcionando una presión de selección constante sobre las poblaciones de mosquitos en este caso (IRAC, 2011). La disipación de un insecticida persistente ocurre lentamente, sin embargo por algún tiempo existe una dosis efectiva pequeña, es decir una dosis subletal que puede estar influyendo en el desarrollo de la resistencia. Adicionalmente se considera que un insecticida que persiste en el tiempo puede eliminar individuos susceptibles inmigrantes, evitando de esta manera que la inmigración sea efectiva. (Bisset et.al 2002). Existen cuatro clases de mecanismos de resistencia de acuerdo a la categorización de Miller 1988: resistencia por comportamiento, resistencia por penetración disminuida, resistencia metabólica y resistencia por modificación en el sitio químico de acción. Resistencia por comportamiento: En este tipo de mecanismo el insecto no entra en contacto con el depósito del insecticida, debido a la modificación del comportamiento del insecto, lo cual le permite evadir los efectos letales de los insecticidas. Resistencia por penetración disminuida: Este tipo de mecanismo, conocido también como mecanismo físico ocurre por modificaciones en la composición del exoesqueleto del insecto lo cual inhibe la penetración del insecticida. Las propiedades del tegumento del insecto y las características moleculares del insecticida afectan la velocidad de penetración de este último, por ejemplo una demorada penetración requiere un tiempo mayor para la detoxificación de la dosis aplicada. La resistencia de Heliothisvirescens al DDT es un ejemplo de resistencia por penetración disminuida, debido al grado de esclerotización y cantidad de proteínas y lípidos, el cual era mayor que en otros insectos susceptibles. En este caso se demostró alto contenido de proteínas, lípidos y un grado de esclerotización mayor que en los insectos susceptibles. De tal manera, que el incremento en la cantidad de lípidos puede provocar que la liberación de los compuestos lípo-solubles en el cuerpo del insecto sea lenta, lo que permite un mayor tiempo para que ocurra la detoxificación de los insecticidas. Modificación en el sitio químico de acción: Este es el segundo mecanismo de resistencia más comúnmente encontrado en los insectos, ocurre cuando el insecticida no logra unirse a su sitio de acción ya sea porque hay disminución en la sensibilidad del sitio blanco o modificación de este (Hemingway et. al, 2000). A continuación se citan dos ejemplos de16 este mecanismo: Reducción de sensibilidad de la acetilcolinesterasa AchE En el numeral 3.2.3 se describe el mecanismo de acción de organofosforados y carbamatos, detallando cómo actúan la ACH y AchE en este. La insensibilidad de la AchE ha sido responsable del desarrollo de resistencia a insecticidas en especies de Culex y Anopheles (Bisset et. al 1990; Bourguet et.al 1996; Bourget et.al 1996b; Bourget et.al 1996c; Bourget et.al, 1996d; Brogdon et.al, 1988; Villany et.al, 1983). Esta resistencia mediada por AchE está relacionada con cambios cualitativos y cuantitativos en la enzima y con mutaciones puntuales acompañadas por modificación de los parámetros cinéticos de la hidrólisis de acetilcolina. Tales mutaciones involucran sustituciones de aminoácidos en el sitio activo de la enzima (Fonseca et.al, 2005). Canales de sodio dependientes de voltaje – mutación tipo kdr El blanco de acción de insecticidas organoclorados y piretroides son los canales de sodio dependientes de voltaje en el sistema nervioso (Scott et.al 1990, Liu et.al 2000). La resistencia ‘Knockdown’ (kdr) hacia los piretroides es causada frecuentemente por mutaciones no sinónimas en la proteínatransmembranal del canal de sodio dependiente de voltaje (para), la cual reduce la unión de lospiretroides. El gen que codifica para el canal de sodio en insectos, se denomina para y fue identificado en Drosophila spp (Loughney et.al 1989). La secuencia de aminoácidos de las subunidades alfa codificados por el gen paraanalizados en conjunto tienen una gran similitud. Cada uno de los genes consiste de cuatro dominios homólogos repetidos (I-IV) con seis segmentos transmembranales (S 1-6) en cada dominio. La expresión de para en Xenoipusoocytes codifica para un canal de sodio funcional voltaje-dependiente (Feng et.al 1995, Liu et.al 2000). Estudios recientes demostraron que mutaciones de punto en la secuencia del gen para del canal de sodio son responsables de la resistencia a insecticidas tipo kdr y súper kdr (la cual posee una mutación adicional que le confiere mayor nivel de resistencia) en insectos (Miller y col 1999). Por su parte, Metcalf (1989), menciona que la modificación delsitio de acción a DDT y piretroides en los canales de sodio del axón nervioso es controlado por un gen en el cromosoma (dominio) II. De tal forma, que una amplia variedad de estudios de investigación reportaron como causa de insensibilidad del sitio de acción a mutaciones de punto en el dominio II del canal de sodio en varios insectos (Liu et. al 2000). Resistencia metabólica: Este es el mecanismo de resistencia más comúnmente observado en los insectos. Este mecanismo es producto de la acción de enzimas capaces de detoxificar los insecticidas antes de que éstos alcancen sus sitios de acción. Existen tres categorías de enzimas que cumplen esta función: las Oxidasas de Función Múltiple (OFM), Esterasas y Glutatión STransferasas (GST). Oxidasas de Función Múltiple (OFM): monoxigenasas del grupo P450. Estas enzimas ubicadas en el retículo endoplasmático liso pertenecientes a una superfamilia de hemoproteínas, son responsables del metabolismo oxidativo de componentes xenobióticos y se encuentran presentes en plantas, animales, bacterias, levaduras y especies de insectos de los órdenes Díptera (Scott J, 1999), Lepidóptera (Rose et.al, 1997) y Coleóptera (Sharf 17 et.al, 2001). Una de las características más significativas de los P-450 que metabolizan xenobióticos es su baja especificidad, lo que permite que sean capaces de metabolizar un número casi ilimitado de substratos, principalmente a través de reacciones de oxidación, pero también de reducción e hidrólisis. El sistema P-450 presenta una enorme versatilidad funcional que se refleja tanto en la gran variedad de procesos que puede catalizar, como en el elevado número de substratos que es capaz de metabolizar. Este sistema está constituido por la coenzima NADPH, una flavoproteína (NADPH-citocromo C reductasa), una ferroproteína y el citocromo P-450 (Bisset J, 2002). El factor implicado en muchos de los casos de resistencia metabólica a carbamatos y detoxificación de organofosforados, piretroides y DDT es el citocromo P-450. Estudios en mosca doméstica demostraron que cepas resistentescon niveles de oxidasas altos presentaban una mayor cantidad de P 450 a diferencia de las cepas susceptibles. Durante la fase I, las oxidaciones catalizadas por el P-450 son reacciones de monooxigenación dependientes de NADPH y para las que utiliza oxígeno molecular, como consecuencia de estas reacciones el P-450 acelera la eliminación del organismo de gran número de compuestos tóxicos, pero también es el responsable de la activación de toxinas. En la fase 2 los xenobióticos, o los metabolitos generados por las reacciones de la fase 1, se combinan con moléculas endógenas de carácter polar para formar productos de conjugación que son rápidamente excretados. En general, los enzimas de fase 1 son capaces de transformar múltiples substratos y catalizar reacciones diferentes. Esterasas: Las esterasas son enzimas que catalizan reacciones de hidrólisis (fase I de la biotransformación) de ésteres carboxílicos (carboxiesterasas), amidas (amidasas), ésteres de fosfato (fosfatasas) entre otras.Tanto los insecticidas organofosforados como los carbamatospresentan una estructura química de esteres y son hidrolizados por estas enzimas(Karunaratne, et. al 1998). De acuerdo a la capacidad que tengan estas enzimas de hidrolizar los diferentes tipos de sustratos, se clasifican en alfa – esterasas y beta – esterasas, el primer tipo hidroliza al sustrato 1- naftilacetato y el segundo tipo al sustrato 2naftilacetato (Bisset J, 2002). Generalmente en más del 90% de los casos de resistencia a insecticidas, se encuentran niveles elevados de esterasas (Ranson et. al 2000). La esterasas se codifican como un grupo de genes ubicados en el mismo cromosoma, en el que cada uno de sus miembros puede sufrir modificaciones que confieren resistencia a insecticidas en insectos del orden Díptera, estas modificaciones pueden obedecer a cambios en un aminoácido que alteran la especificidad del sustrato, presencia de copias génicas múltiples que son amplificadas en insectos resistentes, mutaciones o sobreproducción enzimática (Ranson et. al 2000). Glutatión S transferasas: La familia de las enzimas glutatión S transferasas (GST) es uno de los mayores grupos de enzimasde gran importancia en mecanismos de desintoxicación celular, eliminando xenobióticos o substancias nocivas para las células. Estas enzimas catalizan la conjugación del glutatión endógeno a una variedad de compuestos electrofílicos, protegiendo las macromoléculas biológicas como las proteínas y los ácidos nucleicos de las consecuencias tóxicas de una reacción covalente con el insecticida. Se conocen 4 clases de enzimas GTS: alfa (A), mu (M), pi (P) y teta (T) (Castillo et.al 18 2007), esta última ha sido identificada en insectos, se ha propuesto a esta clase como precursora de las clasesalfa,muypi, basados en la distribución aparente de esta en un rango diverso de organismos que incluyen bacterias, levaduras, plantas e insectos (Díaz et.al 2004). Diferentes estudios han correlacionado la resistencia a insecticidas con elevados niveles de actividad GST (Ku et.al 1994 y Ranson et.al 2002). Este sistema enzimático generalmente está involucrado en la resistencia a insecticidas organofosforados y proveen la forma más importante de resistencia metabólica al organoclorado DDT a través de la dehidroclorinación a DDE, en insectos (Ortelli et.al 2003 y Rodríguez et.al 1998). La resistencia cruzada (RC) es el mecanismo que utilizan especies de insectos resistentes para sobrevivir a la exposición de insecticidas relacionados químicamente, usando un patrón de detoxificación genérico. Por ejemplo el insecticida organoclorado DDT y los piretroides no se relacionan químicamente, sin embargo ambos actúan en el mismo sitio de acción: el canal de sodio dependiente de voltaje. El uso prolongado durante años de DDT ha dado lugar a varias especies de insectos resistentes a este insecticida debido a la mutación del gen kdren el sitio de destino. (WHO 1957). Cuando estas mutaciones se han mantenido en la población, los insectos tienen una cierta resistencia a todos los piretroides, además del DDT. La resistencia cruzada también puede ocurrir entre organofosforados y carbamatos cuando se presentan resultados de resistencia por AchEalterada. La resistencia múltiple (RM) se define como la utilización de varios mecanismos hacia la acción de varias clases de insecticidas no relacionados químicamente (Metcalf et.al 1989). Esta definición no necesariamente involucra el término de resistencia cruzada debido a que un insecto puede desarrollar resistencia a dos insecticidas por diferentes mecanismos. Los tres vectores de malaria más importantes en el país, reportan resistencia al DDT, aunque ha sido encontrada en áreas muy delimitadas. An. albimanus ha mostrado susceptibilidad al DDT con la metodología de papeles impregnados de la OMS en la mayoría de las regiones en las que se han realizado estas evaluaciones, pero en algunas áreas como en el caso de las localidades de los municipios del Carmen, Bolívar; Codazzi y Robles, Cesar y localidades al norte en el municipio de Acandí, Chocó, los resultados de estas pruebas han sido compatibles con la presencia de individuos resistentes. Se observó que los An. albimanus del municipio de Acandí, en las localidades de Capurganá y Sapzurro presentaron los porcentajes de sobrevivencia más altos, 54% y 47.2% respectivamente. Así mismo, las poblaciones de Codazzi recolectadas en la Hacienda Dalia y las de Robles en la localidad Los Guayacanes mostraron 61% y 74% de mortalidad respectivamente a la dosis diagnóstica de DDT, la cual corresponde al 4%. En los An. albimanus recolectados en una de diez localidades del municipio el Carmen de Bolívar, se presentó porcentaje de mortalidad compatible con resistencia al DDT (71%) en 60 mosquitos evaluados (Quiñones et al. 1987). En otro estudio realizado por el Programa Antimalárico del Ministerio de Salud de Colombia, se evaluó el efecto de irritabilidad al DDT en poblaciones de An. albimanus procedentes de los departamentos de Guajira, Magdalena, Bolívar, en la región del Urabá y el Pacifico Colombiano, encontrando que la población de Bolívar mostró un alto grado de 19 irritabilidad a este insecticida (Quiñones y Suárez 1989). Las pruebas con papeles impregnados con DDT en An. darlingi han mostrado resistencia de este vector en poblaciones de Tegachí, P. Salazar, de Beté a Baudó y Barranca sobre el río Atrato en el municipio de Quibdo, Chocó donde observaron mortalidades entre 18% y 80% en pruebas realizadas entre los años 1971 a 1987 (Quiñones et al. 1987). Posteriormente en otro estudio en el que se evaluaron nuevamente las poblaciones de Tegachí y Barranca y se incluyó la población de Ame – Bete del municipio de Quibdo recolectadas durante los años 1987 y 1988, se observó que estas poblaciones presentaban porcentajes de mortalidad entre 16.9% a 72.5% compatibles con resistencia al DDT a 60 y 120 minutos de exposición e incluso mortalidades entre 86.8% y 95.6% en ensayos a 240 minutos de exposición (Suárez et al. 1990). Así mismo detectaron porcentajes de mortalidad entre 15.9% y 31.5% en poblaciones del municipio de Vigía del Fuerte en el departamento de Antioquia mientras que poblaciones de los municipios de Río Sucio -Choco, Achí -Bolívar y Puerto Lleras -Meta registraron mortalidades de 97.9%, 99.2% y 100% respectivamente a una hora de exposición para DDT. Evaluaron la persistencia del DDT en superficies de madera con poblaciones de An. darlingi de Quibdo donde encontraron un rango de mortalidades entre 70.9 y 96.6% durante los primeros 4 meses y de 92.5% en los ensayos realizados en el quinto mes después de la impregnación (Suárez et al. 1990). Para An. nuneztovari procedentes del municipio de Pore, Casanare, el grupo técnico de la unidad administrativa especial de campañas directas del Ministerio de Salud, registró porcentajes de mortalidad compatibles con la presencia de individuos resistentes al DDT (datos no publicados, 1996) en tanto que en el oriente del país a lo largo de la frontera con Venezuela se observó un significativo grado de irritabilidad frente a este mismo insecticida (Quiñones y Suárez 1989). Así mismo en Santander se observó un cambio en los hábitos de reposo de este vector relacionado con resistencia comportamental frente al DDT (Quiñones y Suárez 1990). Más recientemente se registraron niveles elevados de esterasas inespecíficas y oxidasas de función mixta en An. pseudopunctipennis, vector secundario de malaria en Colombia, procedentes de los municipios de Buga y Rozo en el departamento del Valle del Cauca, donde la presión de selección a resistencia a insecticidas es alta por la utilización de éstos en la agricultura. Sin embargo en este estudio no se encontraron porcentajes de mortalidad compatibles con resistencia en bioensayos con larvas a los insecticidas Malation, permethrina y Propoxur (Ocampo et al. 2000). 4 4.1 OBJETIVOS Objetivo General Evaluar el estado de susceptibilidad de poblaciones naturales de An. darlingi, An. nuneztovari y An. albimanus, a insecticidas piretroides, organofosforados y organoclorados en localidades centinelas de los departamentos de Antioquia, Cauca, Chocó, Córdoba, Valle del Cauca y Cauca en el marco del Proyecto Malaria Colombia. 4.2 Objetivos Específicos 20 1. Seleccionar localidades centinelas representativas de cada departamento para el desarrollo de las evaluaciones de susceptibilidad sobre poblaciones de mosquitos vectores primarios de malaria en Colombia. 2. Determinar el estado de susceptibilidad de las tres principales especies de mosquitos vectores de malaria en Colombia a insecticidas empleados por los programas de ETV en sus actividades de control. 3. Realizar la identificación taxonómica de los mosquitos empleados en las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas. 5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Área de estudio. El presente estudio fue realizado el área de influencia de la ejecución del Proyecto Malaria Colombia “Uso de la inteligencia epidemiológica con participación social, para fortalecer la gestión del Programa, mejorar el acceso al diagnóstico y tratamiento y ejecutar intervenciones eficaces para la prevención y control de la malaria, Colombia 2010-2015” que fue financiado por el Fondo Mundial de lucha contra el SIDA, la Tuberculosis y la Malaria. Los departamentos blanco de este proyecto fueron Antioquia, Chocó, Córdoba, Valle del Cauca y Cauca, los cuales concentran cerca del 80% de los casos de malaria del país. 5.1.1 Criterios de selección de las localidades de estudio. Las localidades en donde se llevaron a cabo estas evaluaciones fueron seleccionadas de manera conjunta con los entomólogos departamentales y del INS teniendo en cuenta criterios epidemiológicos de manera que se seleccionaran localidades con reportes de transmisión activa de malaria, en donde se hayan realizado actividades de control vectorial por medio del uso de insecticidas en los últimos años, que fueran zonas sin mayores dificultades de orden público, y que fueran representativas de áreas geográficas o subregiones en cada departamento. De esta manera se seleccionaron las localidades centinelas Yarumal del municipio de Turbo en el área del Urabá Antioqueño, Corrales El Playón y Asturias del municipio de Cáceres en el Bajo Cauca de Antioquia, Beté Cabecera para el municipio de Medio Atrato y Tagachí del municipio Quibdó en la zona del Atrato Chocuano y La Italia de San José del Palmar en departamento de Chocó, La Bonga y Juan José del municipio Puerto Libertador para la zona del alto San Jorge y San Rafael del Pirú de Valencia, Brasil y Quebrada de Torres del municipio de Tierralta en la zona del alto Sinú en el departamento de Córdoba; en el departamento del Valle del Cauca se desarrollaron evaluaciones con mosquitos colectados en las localidades del área costera Punta Soldado y Punta Bonita del distrito de Buenaventura y para el departamento de Cauca se desarrollaron las evaluaciones en poblaciones de mosquitos An. albimanus de la cabecera municipal de Guapi. Figura 4. Área de estudio donde se realizaron evaluaciones de resistencia a insecticidas 21 en el marco del proyecto malaria Colombia. 5.2 Recolección de Material Biológico. Los especímenes fueron recolectados principalmente con atrayente humano protegido y en donde las densidades de mosquitos fueron muy bajas se realizó recolección de mosquitos sobre abrigo animal o recolección de larvas en criaderos para obtener adultos con los que se realizaron los bioensayos (Service 1976). Foto 2. Métodos de recolección de material biológico empleados. a. b. c. Colecta de mosquitos Anopheles con atrayente humano protegido (a), abrigo animal (b) y recolección de larvas (c). Las localidades donde se realizaron estas evaluaciones fueron seleccionadas teniendo en cuenta criterios epidemiológicos y conocimiento previo de las unidades de entomología departamentales con relación a la presencia y a la densidad de vectores primarios de malaria. Estas colectas fueron realizadas por personal del Proyecto Malaria Colombia con apoyo de los coordinadores de las unidades de entomología departamentales y auxiliares de ETV de cada uno de los departamentos. 5.3 22 Insecticidas Evaluados: Los insecticidas que se evaluaron fueron seleccionados teniendo en cuenta la presión de selección que se ha ejercido con estos en programas de control y que sean insecticidas usados en el tratamiento de toldillos de larga duración. Las dosis y tiempo diagnósticos para cada insecticida que fueron usados en las evaluaciones son establecidos por la RNVRI la cual es liderada por el Instituto Nacional de Salud para el caso de las evaluaciones con la metodología de CDC de botellas impregnadas y para las evaluaciones realizadas con la metodología de papeles impregnados de la OMS se emplearon las concentraciones establecidas por esta metodología. Tabla 2. Insecticidas, dosis y tiempo diagnóstico empleados en las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad con la metodología OMS y CDC en Anopheles spp. Tipo de insecticida Piretroides Organofosforados Organoclorados 5.4 Insecticida Deltametrina Lambdacialotrina Alfacipermetrina Permetrina Fenitrotión DDT Concentración diagnóstica CDC OMS 12,5 µl/botella 50 µl/botella 100 µl/botella 0,05 % 0,75 % 1% 4% Tiempo diagnóstico CDC OMS 30 minutos 1 hora 45 minutos 2 horas 1 hora Pruebas Biológicas: Los bioensayos se realizaron en campo y los insecticidas que se evaluaron en cada una de las localidades estuvieron sujetos a la disponibilidad de material biológico recolectado. Los bioensayos se realizaron siguiendo la metodología propuesta por el CDC, método de la botella, descrito por Brogdon & McAllister (1998), con algunas adaptaciones las cuales son sugeridas en el método de ensayo elaborado por el laboratorio de entomología RNL del Instituto Nacional de Salud (MEN-R01.001.5010.004) y para algunas poblaciones se realizaron evaluaciones empleando la metodología de papeles impregnados propuesto por la OMS (WHO/CDS/CPE/PVC/2001.2). a) Bioensayo CDC. 15 a 20 mosquitos adultos fueron transferidos a una botella impregnada con el insecticida a evaluar usando un aspirador bucal y posteriormente cerrada. Cada 5 min se registró el número de mosquitos vivos o muertos presentes en la botella. Este proceso se llevó a cabo hasta que todos los mosquitos se encontraron muertos. Se calculó el porcentaje de mortalidad por cada intervalo de 5 minutos. Posteriormente se graficó el porcentaje de mortalidad (eje Y) contra el tiempo (eje X) usando la escala logarítmica para el porcentaje de mortalidad. Para cada prueba se realizó un mínimo de 4 botellas tratamiento y 1 botella control (solo acetona o alcohol absoluto). Para el tratamiento de las botellas se utilizaron soluciones de insecticida grado técnico diluido en acetona o alcohol absoluto. Un volumen de 1 ml de la dilución en su concentración diagnóstica del insecticida fue transferido a las botellas Wheaton de 250 ml. Las botellas fueron rotadas de tal forma que todas sus paredes fueron expuestas al insecticida (Brogdon y McAllister 1998). b).Bioensayo OMS (adultos): entre 15 a 25 mosquitos adultos hembras fueron expuestos sobre papeles impregnados con DDT, Fenitrotión, Permetrina, Lambdacialotrina, Alfacipermetrina, y Deltametrina. Para cada prueba se usaron por lo menos 5 tubos, 1 control y 4 tratamientos. Los tubos tratamiento llevan papeles impregnados con la dosis23 del insecticida más el solvente propio, mientras los tubos controles llevan papeles de filtro impregnados con el solvente sin insecticida. Los insectos se expusieron al tiempo diagnostico dentro de los tubos en posición vertical; posteriormente, fueron transferidos a los tubos de reposo que contenían algodones empapados con solución de azúcar al 10%. Se registraron los mosquitos caídos cada 10 minutos durante el tiempo de exposición. Las mortalidades se registraron a las 24 horas post-exposición. Se tomaron las precauciones indicadas por la OMS (WHO 1981) para garantizar el control de calidad de los papeles impregnados, principalmente las relacionadas con la conservación, almacenamiento, usos y fechas de expiración. Foto 3. Desarrollo de evaluaciones de susceptibilidad a insecticidas con la metodología CDC y OMS. a. b. Desarrollo de evaluaciones de vigilancia de resistencia a insecticidas con la metodología CDC (a) y OMS (b). 5.5 Determinación taxonómica de los especímenes La identificación taxonómica de mosquitos Anopheles spp se llevó a cabo a través de la observación de caracteres morfológicos en la quetotaxia de adultos, relacionados principalmente con la medición u observación de manchas claras y oscuras en las patas, venas de las alas, presencia o ausencia y forma de cerdas y escamas; estos son comparados con las características descritas en claves taxonómicas propuestas por Faran & Linthicum (1981), Suárez et al. (1987) y González & Carrejo (2009). Foto 4. Identificación de mosquitos Anopheles spp por taxonomía clásica. Una muestra de los mosquitos que fueron clasificados morfológicamente como An. nuneztovari, An. rangeli y An. oswaldoi se le realizó reconfirmación taxonómica por biología molecular empleando la técnica de PCR – RFLP para el espaciador transcrito24 intergénico 2 – ITS2- siguiendo la metodología propuesta por Ruiz et al., en 2005, debido a que los patrones de medición de los caracteres morfológicos diagnósticos en alas y patas de estas especies se sobrelapam, lo cual pude llevar a errores en los diagnósticos de estas especies. A cada espécimen procesado por esta técnica se le retiró una pata y se colocó directamente en la mezcla de PCR que contenía 2 µM de dNTPS, 25 mM de MgCl2, Taq polimerasa 5 Unidades por muestra, Buffer 10X y los primers descritos por Ruiz et al., (2005) para ITS-2 (5´ATG CTT AAA TTT AGG GGG TAG TC 3´ (28S) y 5´ ATC ACT CGG CTC GTG GGA TCG 3´(5,8S) a una concentración de 5 µM. Las condiciones y tiempos utilizados en el termociclador fueron: 94ºC durante 2 minutos para la denaturalización, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 57ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 30 segundos y finalmente 72ºC por 10 minutos para la extensión. El producto de la PCR se visualizó en un gel de Agarosa (SEAKEM) al 1% y fue teñido con 1% de bromuro de etidio. Para la RFLP Se utilizó la enzima HpyCH4III (BioLabs®) como endonucleasa de restricción la cual permitió diferenciar An. (N.) nuneztovari, An. (N.) oswaldoi y An. (N.) rangeli obteniendo un patrón de bandas característico para cada una de las especies. El sitio de corte de esta enzima es 5'...ACN/GT...3' y 3'...TG/NCA...5'; Se adicionaron 7 µl del producto de PCR, 2 µl de Buffer, 0,5 µl de enzima (10U/µl) y 10,5 µl de agua ultra pura estéril para un volumen total de 20 µl. La mezcla se incubo durante 16 horas a 37°C. El producto de la digestión fue visualizado en un gel de agarosa (SEAKEM) al 2%, conteniendo 1% de bromuro de etidio. Las bandas esperadas, luego de la digestión con la enzima HpyCH4III, para An. (N.) nuneztovari eran de 320 y 220 pb, para An. (N.) oswaldoi de 281, 233 y 18 pb y para An. (N.) rangeli de 229, 104, 98 y 76 pb. Figura 5. Esquema de los productos de PCR-RFLP ITS2 esperados para cada una de las especies según la metodología de Ruiz et al. 2005. 5.6 Análisis e Interpretación de Resultados Los resultados de estas evaluaciones fueron tabulados y analizados en Excel 2013 y notificados a través del Sistema de Vigilancia Entomológica SIVIEN del INS. Para la interpretación final de resultados se tuvieron en cuenta los parámetros descritos por la OMS en el que se indica que poblaciones de mosquitos con una mortalidad menor al 98% a las dosis y tiempos diagnósticos de cada insecticida serán consideradas como resistentes o si la mortalidad observada es superior a este 98% serán consideradas susceptibles. En los bioensayos se usó la fórmula de Abbott para corregir la mortalidad observada de la 25 pruebas cuando las mortalidades en el control se encontraban entre 5-20%: Formula de Abbott: % de mortalidad de la prueba - % mortalidad del control 100 - % mortalidad del control x 100 Cuando los porcentajes de mortalidad de los controles estuvo por debajo del 5% no se realizaron correcciones ya que se considera que esta es una mortalidad máxima esperada como resultado de la manipulación de los mosquitos y en el caso en donde las mortalidades de los controles estuvieron por encima del 20%, estos resultados no fueron tomados en cuenta y por lo tanto se tomaba la decisión de repetir la prueba. Los datos obtenidos en los bioensayos son graficados como tiempo vs porcentaje de mortalidad. Los mosquitos que sobreviven a la dosis y el tiempo diagnóstico establecido por la RNVRI son considerados como resistentes. 6 RESULTADOS A continuación de presentan los resultados de la identificación taxonómica del material biológico empleado en las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas y los resultados de los bioensayos OMS y/o CDC por cada departamento. En los gráficos de estas evaluaciones con la metodología CDC, las flechas punteadas indican los tiempos diagnósticos que para el caso de insecticidas piretroides es de 30 minutos y para DDT y Fenitrotion es de 45 minutos y en los gráficos de evaluaciones con metodología OMS estas flechas indican los tiempos diagnósticos los cuales son de 60 minutos para todos los insecticidas a excepción de Fenitrotión que es de 120 minutos y también indican la hora de lectura final de la prueba que en todos los casos es a las 24 horas. 6.1 Antioquia Las especies de mosquitos vectores de malaria más abundantes para las dos localidades evaluadas del municipio de Cáceres y para Yarumal del municipio de Turbo son An. nuneztovari y An. albimanus respectivamente. Durante el año 2010, antes de iniciar el proceso de entrega e instalación de TILD por parte del Programa Departamental de ETV y el Proyecto Malaria, se realizaron las primeras evaluaciones frente a los insecticidas piretroides Deltametrina, Permetrina, Lambdacialotrina y Alfacipermetrina, al organofosforado Fenitrotión y el organoclorado DDT con la metodología del CDC en las localidades Corrales El Playón y Yarumal realizando colectas de mosquitos sobre atrayente humano protegido. Para el año 2014, posterior a la entrega e instalación de TILD se realizaron evaluaciones de vigilancia de resistencia al mismo grupo de insecticidas en la localidad Asturias por medio de la metodología OMS realizando colecta de mosquitos sobre abrigo animal (corrales de ganado bobino) debido a las bajas densidades de mosquitos que se lograban colectar sobre atrayente humano (menos de 10 mosquitos por noche entre 3 colectores). A continuación se presentan los resultados de la identificación taxonómica clásica que se realizó del material biológico con el que se desarrollaron las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad los insecticidas en las localidades centinelas de Antioquia. 26 1 2 1 2 1 1 1 Total general 17 13 3 3 Anopheles sp 1329 1268 173 95 19 3 3 An. costai & forattnii Total general 2 2 9 9 4 3 An. braziliensis 17 13 17 13 3 1 7 3 11 An. punctimacula 1268 173 93 19 634 173 37 114 19 7 95 28 19 136 26 6 95 38 81 24 2 113 38 3 634 56 19 106 15 3 100 8 107 10 103 8 10 112 9 4 106 6 2 1329 2 1329 2 191 208 251 1 213 240 1 226 An. neomaculipalpus Localidad / Especie Cáceres Corrales el playón Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Permetrina Fenitrotion DDT Asturias Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Permetrina Fenitrotion DDT Turbo Yarumal Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Permetrina Fenitrotion DDT An. albitarsis sl An. oswaldoi An. rangeli An. marajoara An. triannulatus An. darlingi An. nuneztovari An. albimanus Tabla 3. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las centinelas de Antioquia. 1 33 1 32 6 8 10 3 53 53 2 4 6 20 3 18 1632 922 154 162 196 137 110 163 710 124 108 117 122 125 114 1394 1394 194 214 261 233 246 246 1 86 3026 1 5 1 1 8 8 2 2 1 2 3 9 2 1 1 8 5 3 En total fueron procesados en estas evaluaciones de susceptibilidad a insecticidas del departamento de Antioquia 3026 mosquitos Anopheles spp (sin incluir los mosquitos empleados en los controles) de los cuales el 30,5% fueron de la localidad Corrales El Playón, el 23,5% de Asturias y el 46,1% restante de la Localidad Yarumal. En las localidades de la zona del Bajo Cauca (Corrales El Playón y Asturias) se procesaron 1632 mosquitos (53,9%) dentro de los que se identificaron por taxonomía clásica 10 especies siendo An. nuneztovari la más abundante con 1268 mosquitos que corresponden al 77,7% de los anofelinos de esta región y el 41,9% de los mosquitos de las tres localidades. Para la localidad de la zona del Urabá (Yarumal) se procesaron 1394 mosquitos dentro de los que se identificaron 4 especies y fue An. albimanus la más abundante con 1329 mosquitos que corresponde al 95,3% del material procesado de esta localidad. Se identificaron por morfología 30 mosquitos de las especies An. oswaldoi (n: 13) y An.27 rangeli (n: 17), todos ellos procedentes de la localidad Corrales El Playón, de los cuales una muestra mínima del 10% fue procesada por PCR-RFLP ITS2 para reconfirmar este diagnóstico así como para algunos mosquitos que no se pudo llegar a un diagnóstico de especie (Anopheles spp) debido a la falta de patas traseras y/o alas que se pudieron deteriorar o perder en el proceso de manipulación. De los mosquitos procesados (15 mosquitos) por biología molecular para reconfirmación de especies, se logró amplificar ADN del ITS2 en el 33,3% de ellos (5 mosquitos) de los cuales 2 habían sido identificados inicialmente con An. oswaldoi, 1 como An. rangeli y 2 como Anopheles spp pero todos ellos resultaron ser An. nuneztovari según esta prueba molecular; por lo tanto los análisis de resultados de vigilancia de susceptibilidad para la localidad Corrales El Playón se ajustaron en cuanto al número de mosquitos An. nuneztovari ya que todos los que fueron identificados por morfología como An. oswaldoi y como An. rangeli inicialmente, fueron considerados como An. nuneztovari más los 2 mosquitos Anopheles sp que se reconfirmaron para esta especie. De la identificación morfológica de los mosquito de la localidad Yarumal resultaron 53 Anopheles spp que representan el 3,8% del total de mosquitos procesados de esta localidad en las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a los insecticidas realizadas frente a 1329 mosquitos de la especie An. albimanus que representan el 95,3%; por lo tanto las interpretaciones de las pruebas se ajustaron en cuanto al número de mosquitos al considerar que los que fueron identificados como Anopheles spp pertenecían a la especie An. albimanus. Los resultados de las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas con pruebas OMS y CDC en las localidades centinelas del departamento de Antioquia son presentados a continuación. Figura 6. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de la localidad Corrales El Playón y An. albimanus de la localidad Yarumal a insecticidas piretroides, DDT y Fenitrotion por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Septiembre de 2010. a. An. nuneztovari de la localidad Corrales El Playón b. An. albimanus de la localidad Yarumal Los resultados de las evaluaciones con la metodología del CDC indican que ambas poblaciones de mosquitos vectores de malaria presentaron porcentajes de mortalidad compatibles con susceptibilidad a todos los insecticidas evaluados para el año 2010. 28 Figura 7. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de la localidad Asturias del municipio de Cáceres a insecticidas piretroides, DDT y Fenitrotión por medio de la metodología de papeles impregnados de la OMS. Mayo de 2014. Las evaluaciones realizadas con la metodología OMS en la población de mosquitos An. nuneztovari de la localidad Asturias en el municipio de Cáceres mostraron porcentajes de mortalidad compatibles con susceptibilidad frente a todos los insecticidas evaluados para el año 2014. 6.2 Chocó Las especies de mosquitos vectores de malaria más abundantes en las evaluaciones realizadas en el departamento de Chocó fueron An. nuneztovari para La Italia y An. darlingi para Beté y Tagachí. Durante el año 2010, antes de iniciar el proceso de entrega e instalación de TILD por parte del Programa Departamental de ETV y el Proyecto Malaria, se realizaron las primeras evaluaciones frente a los insecticidas piretroides Deltametrina, Alfacipermetrina y Lambdacialotrina en las localidades de la Italia y Beté más al insecticida Permetrina en La Italia con la metodología del CDC realizando colectas de mosquitos sobre atrayente humano protegido. Para el año 2014, posterior a la entrega e instalación de TILD se realizaron evaluaciones de vigilancia de resistencia a Deltametrina, Alfacipermetrina y Lambdacialotrina, así como al organofosforado Fenitrotion y el organoclorado DDT en la localidad Tagachí por medio de la metodología OMS realizando colecta de mosquitos sobre atrayente humano protegido. A continuación se presentan los resultados de la identificación taxonómica clásica que se realizó del material biológico con el que se desarrollaron las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas en las localidades centinelas de Chocó. Anopheles sp Total general An. oswaldoi An. rangeli An. punctimacula An. triannulatus 11 An. apicimacula 322 An. nuneztovari Localidad / Especie Medio Atrato An. darlingi Tabla 4. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las localidades centinelas de Chocó. 2 4 339 Beté Cabecera Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina 322 103 97 122 San José del Palmar La Italia Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Permetrina 11 2 4 5 314 314 79 74 101 60 21 21 5 4 1 10 1 65 65 10 21 14 20 78 78 14 18 13 22 11 1 12 1 12 4 1 3 3 2 Quibdó Tagachí Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Fenitrotion DDT 376 376 91 35 69 101 80 2 2 Total general 698 335 78 65 14 12 2 2 4 2 1 1 339 107 104 128 29 29 7 4 3 15 421 421 100 103 121 97 1 1 478 478 110 58 83 135 92 1 2 29 2 34 1238 En total fueron procesados en estas evaluaciones de susceptibilidad a insecticidas del departamento de Chocó 1238 mosquitos Anopheles spp (sin incluir los mosquitos empleados en los controles) de los cuales el 27,4% fueron de la localidad Beté, el 34% de La Italia y el 38,6% restante de la Localidad Tagachí. En la localidad de Beté se identificaron por morfología mosquitos Anopheles de 3 especies siendo An. darlingi la más abundante con 322 mosquitos que corresponden al 95% de los anofelinos de esta localidad seguido por An. triannulatus con el 3,2% y A. apicimacula con 2 individuos que corresponden al 0,6%. Cuatro mosquitos de esta localidad no fue posible identificarlos hasta especie por morfología debido al deterioro en el que se encontraban, sin embargo en los análisis de las pruebas de vigilancia de susceptibilidad fueron asumidos como An. darlingi dada la probabilidad del 95% que hay para que sean de esta especie. De la localidad La Italia se identificaron inicialmente por taxonomía clásica anofelinos de 4 especies siendo An. nuneztovari el más abundante con 314 individuos que corresponden al 74,6% seguido de An. rangeli con 65 mosquitos (15,4%), An. oswaldoi con 12 mosquitos (2,8%) y un An. triannulatus (0,2%). Así mismo, un total de 29 mosquitos no fue posible identificarlos hasta especie por morfología debido al deterioro pero una muestra del 55% (n 16) de estos más un 70% de los An. rangeli y An. oswaldoi (n 54) fueron procesados para reconfirmación de especie por PCR-RFLP de ITS2 de los cuales el 73% (n 51) se logró obtener ADN amplificado y los patrones de bandas indican que todos ellos corresponde a la especie An. nuneztovari. Debido a estos resultados, los análisis de las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad se realizaron ajustando los números de mosquitos An. nuneztovari empleados al determinar que todos los mosquitos identificados inicialmente por morfología como An. rangeli, An. oswaldoi y Anopheles spp corresponden a An. nuneztovari. De la localidad Tagachí también se identificaron por morfología mosquitos Anopheles de 4 especies siendo An. darlingi la más abundante con 376 mosquitos que corresponden al 78,7% seguido por An. punctimacula con 78 mosquitos (16,3%), An. nuneztovari con 2130 mosquitos (4,4%) y dos mosquitos identificados como An. triannulatus para un 0,4% Los resultados de las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas por medio de pruebas OMS y CDC en las localidades centinelas del departamento de Chocó son presentados a continuación. Figura 8. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de la localidad La Italia y An. darlingi del municipio de la localidad Beté a insecticidas piretroides por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Septiembre y noviembre de 2010 respectivamente. a. An. nuneztovari de la localidad La Italia b. An. darlingi de la localidad Beté Los resultados de las evaluaciones con la metodología del CDC indican que ambas poblaciones de mosquitos vectores de malaria presentaron porcentajes de mortalidad compatibles con susceptibilidad a los insecticidas Deltametrina, Alfacipermetrina y Lambdacialotrina mientras que se observaron porcentajes de mortalidad del 96% el cual es compatibles con resistencia frente al insecticida Permetrina en la población de mosquitos An. nuneztovari de la localidad La Italia en el municipio San José del Palmar. Figura 9. Evaluaciones de susceptibilidad de An. darlingi de la localidad Tagachí del municipio de Quibdó a insecticidas Deltametrina, Alfacipermetrina, Lambdacialotrina, DDT (a) y Fenitrotion (b) por medio de la metodología de papeles impregnados de la OMS. Junio 2014. a. b. En cuanto a las evaluaciones realizadas a la población de mosquitos An. darlingi de la localidad Tagachí en el año 2014, se observaron porcentajes de mortalidad compatibles con resistencia a los tres insecticidas piretroides evaluados (Deltametrina, Alfacipermetrina y Lambdacialotrina) así como al organoclorado DDT mientras que las mortalidades observadas en las evaluaciones del insecticida organofosforado Fenitrotión fueron 31 compatibles con susceptibilidad. 6.3 Córdoba Para el departamento de Córdoba, la especie de mosquito vector de malaria más abundante en las evaluaciones realizadas para todas las localidades fue An. nuneztovari. Antes de iniciar el proceso de entrega e instalación de TILD por parte del Programa Departamental de ETV y el Proyecto Malaria, se realizó la mayoría de evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas con la metodología de botellas impregnadas del CDC realizando colectas de mosquitos sobre atrayente humano protegido y en algunas ocasiones en abrigo animal debido a las bajas densidades de mosquitos. Para el año 2014, posterior a la entrega e instalación de TILD se realizaron evaluaciones de vigilancia de resistencia a Deltametrina, Lambdacialotrina y Fenitrotion en la localidad indígena Quebrada de Torre en la zona del embalse de la hidroeléctrica Urra en el municipio de Tierralta por medio de la metodología OMS realizando colecta de mosquitos sobre atrayente humano protegido. A continuación se presentan los resultados de la identificación taxonómica clásica que se realizó del material biológico con el que se desarrollaron las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas en las localidades centinelas de este departamento. 2 12 4 3 2 3 20 20 9 5 6 1 8 15 1 3 3 3 3 6 1 3 4 5 4 5 1 2 2 2 1 1 3 1 2 1 2 1 1 1 2 2 1 1 1 2 1 An. albitarsis sl An. darlingi 5 3 2 1 Total general 15 12 15 3 4 1 3 An. neomaculipalpus An. punctimacula An. rangeli An. oswaldoi 32 32 13 6 13 169 44 27 11 6 125 30 26 52 17 9 9 6 1 2 Anopheles sp. 537 281 90 98 93 256 79 61 52 64 246 246 92 79 75 725 An. triannulatus Puerto Libertador Juan José Deltametrina Lambdacialotrina Fenitrotion La Bonga Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Fenitrotion Valencia San Rafael del Pirú Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Tierralta An. albimanus Localidad / Especie An. nuneztovari Tabla 5. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las localidades centinelas de Córdoba. 3 21 3 14 2 2 3 1 9 7 3 2 2 780 353 125 116 112 427 121 98 119 89 339 339 131 101 107 725 20 20 8 4 8 Brasil 376 Deltametrina 198 Fenitrotion 178 Quebrada de Torre 349 Deltametrina 123 Lambdacialotrina 119 Fenitrotion 107 Total general 1508 32 178 35 16 20 6 5 376 198 178 349 123 119 107 3 41 1844 32 Un total de 1844 mosquitos Anopheles spp fueron utilizados en las evaluaciones de susceptibilidad a insecticidas del departamento de Córdoba (sin incluir los mosquitos empleados en los controles). 1119 mosquitos de las localidades Juan José, La Bonga y San Rafael del Pirú fueron identificados en su totalidad por morfología clásica encontrando un total de 9 especies de Anopheles dentro de los que se encontraban 35 An. oswaldoi (3,1%) y 16 An. rangeli (1,4%) de los cuales se procesó por biología molecular para su reconfirmación una muestra de 25 An. oswaldoi (71,4%) y 6 An. rangeli (37,5%) así como 21 de 43 (49%) mosquitos Anopheles spp que no fue posible identificar hasta especie por su deterioro. El 72% de los mosquitos An. oswaldoi (n 18) procesados se logró reconfirmar su diagnóstico inicial de especie resultando en un mosquito efectivamente An. oswaldoi (5,6%) y 17 An. nuneztovari (94,4%), el 28% restante no se logró amplificar el ADN del ITS2. El 100% de los mosquitos An. rangeli (n 6) que se procesaron por biología molecular se reconfirmaron como An. nuneztovari; así mismo, 10 mosquitos Anopheles spp se logró la amplificación exitosa del ADN del ITS2 resultando todos ellos como An. nuneztovari. Debido a estos resultados, los análisis de las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad se realizaron ajustando los números de mosquitos An. nuneztovari empleados al determinar que todos los mosquitos identificados inicialmente por morfología como An. rangeli y Anopheles spp corresponden a An. nuneztovari mientras que para los mosquitos que fueron identificados por morfología como An. oswaldoi y que presentaron mediciones de la mancha oscura basal menor del 20% con respecto a la longitud del tarsomero posterior 2, siguieron siendo considerados como efectivamente de esta especie ya que el único mosquito que se logró reconfirmar para esta especie por PCR-RFLP del ITS2 presentaba un porcentaje de esta medida inferior a esta medida y todos los que se reconfirmaron como An. nuneztovari presentaban este porcentaje de medida por encima del 20%. Para los mosquitos de las localidades Brasil y Quebrada de Torre solo se identificó por morfología una muestra encontrando que más del 97% de estos mosquitos son An. nuneztovari. Los resultados de las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas por medio de pruebas OMS y CDC en las localidades centinelas del departamento de Córdoba son presentados a continuación. Figura 10. Evaluaciones de susceptibilidad de An. nuneztovari de las localidades Juan José, La Boga, San Rafael del Pirú, Brasil y Quebrada de Torre en Córdoba a los insecticidas Deltametrina, Lambdacialotrina, Alfacipermetrina, DDT y Fenitrotion por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Agosto - diciembre de 2010, noviembre33 de 2012 y Julio de 2014. a. An. nuneztovari - Juan José. Diciembre – 2010. b. An. nuneztovari - La Bonga. Agosto – 2010. c. An. nuneztovari - San Rafael Del Pirú. Agosto - 2010 d. An. nuneztovari - Brasil. Noviembre – 2012. e. An. nuneztovari - Quebrada de Torre. Julio de 2014 Los resultados de estas evaluaciones indican que las poblaciones de mosquitos An. nuneztovari de las localidades Juan José y La Bonga del municipio de Puerto Libertador así como la de la localidad San Rafael del Pirú del municipio de Valencia y Brasil de Tierralta se comportaron como susceptibles a los insecticidas evaluados entre los años 2010 y 2012 antes de entregar TILD por parte del Programa Departamental de ETV y el Proyecto Malaria; mientras que para la población de esta misma especie de mosquito vector de la localidad Quebrada de Torre en la zona indígena del municipio de Tierralta se observaron porcentajes de sobrevivencia de mosquitos en las evaluaciones de los insecticidas Deltametrina y Lambdacialotrina que son compatibles con resistencia a ambos insecticidas y mortalidades del 100% al Fenitrotion lo cual indica susceptibilidad a este insecticida34 organofosforado. 6.4 Valle del Cauca. Las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas desarrolladas en el departamento de Valle del Cauca se realizaron en localidades ubicadas en la parte costanera del distrito de Buenaventura en donde An. albimanus es la especie responsable de la transmisión. En agosto de 2010, antes de iniciar el proceso de entrega e instalación de TILD por parte del Programa Departamental de ETV y el Proyecto Malaria, se realizaron las primeras evaluaciones frente a los insecticidas piretroides Deltametrina, Alfacipermetrina, Lambdacialotrina y Permetrina, al organoclorado DDT y el organofosforado Fenitrotión en la localidad Punta Soldado por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC empleando mosquitos colectados sobre cebo humano protegido y obtenidos a partir de larvas colectadas en un criadero de la localidad. Posteriormente en junio de 2011 se realizaron evaluaciones en la localidad Punta Soldado con la metodología OMS frente a los insecticidas Deltametrina, Lambdacialotrina, DDT y Fenitrotion empleando mosquitos colectados sobre cebo humano protegido. Por último, en el mes de mayo de 2014 se volvieron a realizar evaluaciones sobre la población de mosquitos An. albimanus de la localidad Punta Soldado frente a los insecticidas Deltametrina y Fenitrotión pero en esta ocasión por medio de la metodología de papeles impregnados de la OMS sobre mosquitos obtenidos de colectas sobre cebo humano protegido y a partir de larvas de criaderos. A continuación se presentan los resultados de la identificación taxonómica clásica que se realizó del material biológico con el que se desarrollaron las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas en las localidades centinelas del distrito de Buenaventura. Tabla 6. Resultado de la identificación taxonómica por morfología de mosquitos Anopheles spp de las localidades centinelas de Buenaventura, Valle del Cauca. Localidad / Especie Punta Bonita DDT Deltametrina Fenitrotion Lambdacialotrina Punta soldado 2010 Alfacipermetrina DDT Deltametrina Fenitrotion Permetrina Punta soldado 2014 Deltametrina Fenitrotion An. albimanus An. neivai Total general 483 483 101 101 176 176 112 112 94 94 1335 9 1344 282 282 292 292 248 248 264 6 270 249 3 252 186 19 205 96 16 112 90 3 93 Total general 2004 28 2032 35 En total se procesaron 2032 mosquitos Anopheles spp en las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas de las localidades centinelas del distrito de Buenaventura sin contar los mosquitos empleados en los controles y teniendo en cuenta que los reportes de las evaluaciones de la localidad Punta Bonita solo se realizaron teniendo en cuenta los mosquitos identificados de la especie de interés, An. albimanus. La otra especie de mosquito identificada fue An. neivai pero en una baja proporción, 2,1% de los mosquitos con los que se realizaron las evaluaciones en la localidad Punta Soldado. Figura 11. Evaluaciones de susceptibilidad de An. albimanus de las localidades Punta Soldado del distrito de Buenaventura a insecticidas por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC y papeles impregnados de la OMS. Agosto de 2010 – Mayo de 2014. a. An. albimanus – Punta Soldado CDC. Agosto – 2010. b. An. albimanus – Punta Soldado OMS. Mayo – 2014. Los resultados de estas evaluaciones indican que para el año 2010, antes de iniciar la intervención masiba con TILD para la prevención y control de malaria, la poblacion de mosquitos An. albimanus de la localidad centinela Punta Soldado se comportó como susceptible a los insecticidas evaluados (Deltametrina, Alfacipermetrina, Permetrina, Fenitrotion y DDT) y en las evaluaciones realizadas en el 2014, posterior a la entrega e instalación de TILD se observaron porcentajes de mortalidad compatibles con resistencia frente al insecticida Deltametrina y susceptibilidad al insecticida Fenitrotion. Tabla 7. Evaluaciones de susceptibilidad de An. albimanus de las localidades Punta Bonita del distrito de Buenaventura a insecticidas por medio de la metodología papeles impregnados de la OMS. Junio de 2011 Para la población de mosquitos An. albimanus de la localidad centinela Punta Bonita las evaluaciones realizadas en el año 2011 mostraron porcentajes de mortalidad compatibles con susceptibilidad frente a los insecticidas Deltametrina, Lambdacialotrina, DDT y Fenitrotion. 6.5 Cauca. 36 En los municipios costeros del departamento del Cauca como es el caso de Guapi, la especie de mosquito responsable de la transmisión de malaria es An. albimanus aunque no se descarta que An. neivai juegue un papel importante en algunas épocas del año cuando sus densidades son las más abundantes y la circulación del parásito en las poblaciones humanas es alta. Como se mencionó anteriormente, el mayor número de evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas relacionadas en este informe fueron desarrolladas en el año 2009 por parte de la Unidad de Entomología de este departamento, antes de iniciar el Proyecto Malaria Colombia se ejecución técnica; sin embargo en el año 2010, de manera articulada con el INS, el Proyecto y la Unidad de Entomología del departamento se realizaron nuevamente evaluaciones frente al insecticida Permetrina y Deltametrina aunque con muy pocos mosquitos probados debido a las bajas densidades de anofelinos que se lograron obtener. Estas evaluaciones fueron desarrolladas con la metodología de botellas impregnadas del CDC con mosquitos Anopheles obtenidos a partir de larvas colectadas en criaderos del área periurnana del municipio de Guapi por lo tanto, los resultados que se mostrarán a continuación hacen referencia únicamente a mosquitos que posterior a las evaluaciones fueron identificados por morfología como An. albimanus. Figura 12. Evaluaciones de susceptibilidad de An. albimanus del municipio de Guapi en el departamento de Cauca a insecticidas por medio de la metodología de botellas impregnadas del CDC. Julio - agosto de 2009 (a) y julio de 2010 (b). Los resultados de estas evaluaciones indican que la población de mosquitos An. albimanus de la cabecera municipal del municipio de Guapi para el año 2009 se comportaron como susceptibles frente a todos los insecticidas evaluados (Deltametrina, Alfacipermetrina, Lambdacialotrina, Permetrina, Fenitrotion y DDT) pero en las evaluaciones realizadas en el año 2010 mostraron porcentajes de mortalidad compatibles con resistencia frente al insecticida Alfacipermetrina y susceptibilidad a Deltametrina aunque la cantidad de mosquitos evaluados fueron muy bajos. 37 7 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Con respecto a la confirmación de especies, un total de 137 individuos identificados como An. (N.) nuneztovari, An. rangeli, An. oswaldoi y An. spp procedentes de los municipios de Cáceres en Antioquia, Puerto Libertador y Valencia en Córdoba y San José del Palmar en Chocó fueron procesados por PCR – RFLP del ITS 2 del ADN ribosomal con la enzima de restricción HpyCH4III (BioLabs®), con el fin de esclarecer su determinación morfológica. En 47 especímenes no se logró amplificación por PCR, esto, debido en algunos casos, a que los especímenes no estaban bien preservados y presentaban hongos. De los 90 especímenes a los que se les logro hacer PCR-RFLP, en 89 se observaron las bandas esperadas para la especie An. (N.) nuneztovari (320 y 220 pb) y en uno se observó el patrón de corte esperado para An. (N.) oswaldoi s.l. (281, 233 y 18 pb) el cual proviene de una localidad del departamento de Córdoba. Basados en estos resultados se puede sugerir a los coordinadores de las unidades de entomología de los departamentos de Antioquia, Chocó y Córdoba que los análisis de las actividades de vigilancia entomológica de tipo operativo que realicen con mosquitos de estas zonas los realicen teniendo en cuenta que los mosquitos que tengan medidas de patrones diagnósticas compatibles con especies como An. rangeli y An. oswaldoi pueden ser interpretaos como An. nuneztovari. En cuanto a las evaluaciones de resistencia a insecticidas en términos generales se observó que de las evaluaciones realizadas entre los años 2009 y 2012 las poblaciones de An. darlingi, An. nuneztovari y An. albimanus de la localidad, Beté, San Rafael del Pirú, La Bonga, Juan José, Broqueles, Brasil, Punta Soldado y Punta Bonita son susceptibles a los insecticidas evaluados. La población de An. nuneztovari de La Italia mostró pérdida de susceptibilidad a permetrina con una mortalidad de 96%, sin embargo los demás piretroides evaluados (Deltametrina, Lambdacialotrina y Alfacipermetrina) mostraron porcentajes de mortalidad compatibles con susceptibilidad. La población de mosquitos An. albimanus de la cabecera municipal de Guapi presentó porcentajes de mortalidad compatibles con susceptibilidad a todos los insecticidas evaluados en el año 2009 dentro de los que se encuentra Alfacipermetrina, sin embargo, para el año 2010 se realizaron otros ensayos frente a este insecticida observando mortalidades compatibles con resistencia (95,9%) aunque el número de mosquitos evaluados fue bajo (n: 51). Respecto a las evaluaciones realizadas en el 2014, luego de implementar la estrategia de entrega e instalación de TILD para el control de vectores de malaria, se realizaron pruebas en las localidades Asturias, Tagachí, Quebrada de Torre y Punta Soldado, observando resultados compatibles con susceptibilidad para An. nuneztovari de Asturias a todos los insecticidas evaluados. Con respecto a las evaluaciones realizadas en la localidad Tagachí frente a mosquitos An. darlingi se encontraron resultados compatibles con resistencia frente a todos los insecticidas piretroides evaluados así como al organoclorado DDT y susceptibilidad frente al insecticida organofosforado Fenitrotión. Las evaluaciones realizadas para An. nuneztovari de la localidad Quebrada de Torre indican resistencia a los insecticidas piretroides evaluados, Permetrina y Deltametrina y susceptibilidad al insecticida organofosforado Fenitrotión. Finalmente las evaluaciones realizadas con An. albimanus para la localidad Punta soldado muestran resultados compatibles con resistencia al insecticida 38 piretroide evaluado Deltametrina y susceptibilidad frente al organofosforado Fenitrotión. A continuación muestran los resultaos de estas actividades de vigilancia entomológica de susceptibilidad a insecticidas de manera consolidada. Municipio Dpto. Tabla 8. Consolidado de resultados de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas en los departamentos de Antioquia, Chocó, Córdoba, Valle del Cauca y Cauca. Localidad Cáceres Turbo Yarumal San José del Palmar Asturias La Italia Medio Atrato Quibdó Valencia Alfacipermetrina La Bonga Juan José San Rafael del Pirú Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Fenitrotion DDT Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Fenitrotion Deltametrina Lambdacialotrina Fenitrotión Deltametrina Alfacipermetrina Metodología de evaluación CDC OMS CDC Septiembre de 2010 CDC Permetrina Tagachí Tierralta CÓRDOBA Fecha de evaluación Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Septiembre de 2010 Permetrina Fenitrotion DDT Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Abril y Mayo Permetrina de 2014 Fenitrotion DDT Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Septiembre de 2010 Permetrina Fenitrotion DDT Deltametrina Lambdacialotrina Beté Cabecera Puerto Libertador CHOCÓ ANTIOQUIA Corrales El Playón Insecticidas evaluados Noviembre de 2010 Julio de 2014 OMS Agosto de 2010 Diciembre de 2010 CDC Agosto de 2010 Lambdacialotrina Brasil Quebrada de Torre Deltametrina Fenitrotion Deltametrina Lambdacialotrina Fenitrotión Noviembre de 2012 Julio de 2014 OMS N % mortalidad Diagnóstico compatible con: 118 102 152 95 83 116 106 100 107 104 112 106 193 212 257 233 243 244 100 100% 100% 100% 100% 100% 100% 99% 99% 100% 100% 100% 99% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible 102 100% Susceptible 121 98% Susceptible 97 96% Resistente 105 98 123 91 36 69 101 80 87 69 58 68 95 101 105 135 100% 100% 100% 76% 50% 84% 100% 89% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Susceptible Susceptible Susceptible Resistente Resistente Resistente Susceptible Resistente Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible 111 100% Susceptible 106 100% Susceptible 198 178 123 119 107 100% 100% 91% 89% 100% Susceptible Susceptible Resistente Resistente Susceptible Especies de Anopheles evaluada An. nuneztovari An. albimanus An. nuneztovari An. darlingi An. darlingi An. nuneztovari Buenaventura VALLE 39 Punta Soldado Guapi CAUCA Punta Bonita Cabecera municipal Deltametrina Alfacipermetrina Permetrina Fenitrotion DDT Deltametrina Fenitrotion Deltametrina Lambdacialotrina Fenitrotion DDT Deltametrina Alfacipermetrina Lambdacialotrina Permetrina Fenitrotion DDT Deltametrina Alfacipermetrina Agosto de 2010 CDC Mayo de 2014 Junio de 2011 OMS Julio y Agosto de 2009 CDC Julio de 2010 CDC 248 282 249 264 292 96 90 176 94 112 101 188 181 194 205 190 231 20 51 100% 100% 100% 99,3% 100% 84% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 95,9% Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Resistente Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Susceptible Resistente An. albimanus An. albimanus 40 8 RECOMENDACIONES I. Se recomienda que de ser necesario realizar actividades de control químico para An. darlingi en las zonas aledañas a la localidad Tagachí en el municipio de Quibdó Chocó y para An. nuneztovari en localidades cercanas a Quebrada de Torre en zona indígena del embalse de Urra en el municipio de Tierralta Córdoba, no se empleen insecticidas piretroides debido a los resultados observados. El uso del insecticida organofosforado Fenitrotión es una alternativa adecuada de control químico para estos vectores. II. De acuerdo con los lineamientos nacionales, se sugiere continuar con las evaluaciones de vigilancia de susceptibilidad a insecticidas de mosquitos vectores de malaria en localidades centinelas donde se realizaron intervenciones masivas con TILD para la prevención y control de malaria haciendo énfasis en las evaluaciones frente al insecticida Deltametrina que es el ingrediente activo de los TILD que han sido implementados masivamente durante estos últimos 5 años por parte de los programas de ETV con el apoyo del Proyecto Malaria Colombia. Aquellas localidades en donde se observaron resultados compatibles con resistencia, deben ser priorizadas de manera que se realice un monitoreo que será de gran utilidad para la toma de decisiones por parte del programa de ETV para la selección de las estrategias más adecuadas para la prevención y control químico de vectores. III. Para las poblaciones de mosquitos donde se observaron resultados compatibles con resistencia, se recomienda realizar evaluaciones que permitan determinar los mecanismos bioquímicos o moleculares responsables de esta condición en los mosquitos vectores. IV. Este estudio ofrece información útil desde el punto de vista operativo al programa de prevención y control de malaria en estos departamentos. 41 9 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BISSET, J. 2002. Uso correcto de insecticidas: control de la resistencia. Revista Cubana de Medicina Tropical 54 (3): 202-19. BISSET, J.; RODRÍGUEZ, M.; DÍAZ, C.; ORTIZ, E.; MARQUETTI, M.; HEMINGWAY, J. 1990. The mechanisms of organophosphate and carbamate resistance in Culex quinquefasciatus (Diptera:Culicidae) from Cuba. Bulletin of Entomological Research 80: 245 -50. BISSET, J.; RODRÍGUEZ, M.; SOCA, A.; PASTEUR, N.; RAYMOND, M.1997. Cross resistance to pyrethoids and organophosphates insecticides in the southern house mosquito (Diptera: Culicidae) from Cuba. 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