Tutor: Dr. Luis Iván Tapia Calvopiña, MSc. E- mail
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CARATULA UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Determinación de cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav) en la comunidad de Tababela-Pichincha - Ecuador Autora: Ávila Ramírez Mireya Cristina e-mail: avilamireya2ab@hotmail.com Tesis para optar por el título profesional de QUÍMICA DE ALIMENTOS Tutor: Dr. Luis Iván Tapia Calvopiña, MSc. E- mail: ivan_tapia_c@hotmail.com Quito, Noviembre de 2015 Ávila Ramírez, Mireya Cristina (2015), Determinación de cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav) en la comunidad de TababelaPichincha – Ecuador. Trabajo de Investigación para optar por el grado de Químico de Alimentos. Carrera de Química de Alimentos. Quito: UCE. 114 pág. ii Dedicatoria Todo el crédito es para Dios, al darme la vida me dio la oportunidad de concluir esta meta y ha sido gracias a su infinito amor que pude continuar esta carrera y así trabajar por su obra y por mi país. A mi madre, Sra. María Erlinda Ramírez, por ser incondicional en todos los aspectos, es mi ejemplo a seguir. A mi padre, Sr. Melecio Draucín Ávila, que siempre confió en mis decisiones. Gracias por apoyarme. Todo lo que he logrado ha sido gracias a su constante amor, paciencia y lucha. A mis hermanos Carlos, Miguel y Cristhian por su amor y alegría son mi más grande regalo y una de mis razones más importantes…..LOS AMO. iii Agradecimiento Mi más sentido agradecimiento a toda mi familia que de manera desconocida y en privado han sido un apoyo incomparable en mi vida. Este trabajo no hubiese sido posible sin la cooperación de personas e instituciones que han proporcionado apoyo de manera desinteresada .Siendo así, es para mí un gran placer utilizar este espacio para hacer llegar a ellos un justo saludo y agradecimiento. Mi reconocimiento para la Universidad Central del Ecuador en especial a la Facultad de Ciencias Químicas que me ha brindado una excelente formación profesional y una visión objetiva para lograr mis metas. Agradezco a la Dra. Blanca Estela Bravo, Dr. Marco Moran y el Dr. Alejandro Dutan por su apoyo y confianza durante mis estudios universitarios. Por ser profesores e investigadores dedicados y comprometidos. De manera especial y sincera a mi tutor de Tesis; Dr. Oscar Luzuriaga, por su experiencia y su tiempo invertido durante el desarrollo de mi proyecto en sus etapas iniciales. Al Dr. Arturo Batidas que aceptó sin problema colaborar en esta investigación desde el papel de tutor, sin usted la culminación de mi proyecto no habría sido posible. A mi tribunal de tesis, los doctores; Dr. Jorge Moncayo y Dr. Wilmer Narváez, por contribuir con sus observaciones y recomendaciones, su experiencia y su participación ha beneficiado e enriquecido el trabajo realizado. Al Laboratorio OSP por prestar los medios, equipos e infraestructuras para llevar a cabo las actividades programadas durante el desarrollo de esta tesis. De manera personal y muy afectuosa, a los doctores Dr. Geovany Garofalo y Dr. Fernando Mazón por su amistad, ayuda y paciencia durante mi estancia en los laboratorios, estoy en deuda con ustedes eternamente. iv Por último con un gran cariño quiero agradecer a esas personas que siendo mis amigos se han mantenido siempre mi lado brindándome apoyo, alegría y concejo .Al padre Henry Calderón , sor Gertrudis y Sra. Lourdes Martínez han sido los mejores guías para mí , siempre con las palabras precisas en el momentos más difíciles . Al grupo Juvenil “Misioneros Reina de la Paz” ; Israel, Jorge, Danny, Fátima, Estefanía, María Belén , Cristina, Tamara, Jean Carlos, Ariel , Oscar, Vanessa, Jasmina ,Estrellita, Aray, Diego, Juan ,Majo, Ricardo , Edison , Misahel y especialmente a Charlie Damihan gracias a su compañía y oraciones , cada cual a su manera hicieron de esta etapa una de las más bellas de mi vida al servicio de Dios . A mis amigos y amigas con las que compartí los primeros días en estas aulas; Sandy, Johnny, Cesar, Iván, Eddy, Andre, Consu y Caro. A mis amigas y amigos; Emily Aguirre, Isabel Carrillo, Ma. Gabriela Salazar, Alexandra García, Valeria Reinoso, Jimena Cahuasqui, Danny Farías, Mauricio Mosquera, Jorge, Juan Ochoa y Andrés Granda , Lorena, Vero y Nathaly que siempre estuvieron apoyándome mientras éramos estudiantes y mientras realizábamos paralelamente nuestras tesis. Un agradecimiento de todo corazón a mis amigos que se han mantenido conmigo hasta el día de hoy Alfredo Moncayo, Stalin Segura, Diego Pacheco de manera muy especial a Jorge Regalado, mi mejor amigo, tu apoyo y tu cariño son una bendición, Gracias a cada uno de ustedes porque cuando las cosas parecían ponerse difíciles su alegría y cariño me llenaba de fuerzas para seguir adelante. v UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS ESCUELA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Yo, Mireya Cristina Ávila Ramírez en calidad de autora del trabajo de investigación o tesis realizada sobre “Determinación de cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav) en la comunidad de Tababela-Pichincha – Ecuador”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. Quito, a 27 de Octubre del 2015 Mireya Ávila CI: 1716418361 vi vii viii Contenido . pág. CARATULA ....................................................................................................................................... i Dedicatoria ........................................................................................................................................iii Agradecimiento .................................................................................................................................. iv Contenido ......................................................................................................................................... viii CAPÍTULO I...................................................................................................................................... 1 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................... 1 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................... 3 1.3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 3 1.3.1 Objetivo general ................................................................................................................. 3 1.3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 3 1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ................................. 3 CAPÍTULO II .................................................................................................................................... 6 2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 6 2.1 ANTECEDENTES. ............................................................................................................ 6 2.2 EL CULTIVO DEL TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum Cav) ............................ 7 2.2.1. Clasificación botánica .............................................................................................................. 7 2.2.2. Orígenes y distribución ............................................................................................................ 8 2.2.3. Requerimientos agroecológicos ............................................................................................... 8 2.2.4. Producción en el Ecuador ........................................................................................................ 9 2.2.5. Morfología ............................................................................................................................... 9 2.2.6. Composición nutricional del tomate de árbol. ....................................................................... 10 2.2.7. Siembra y cosecha.................................................................................................................. 10 2.2.8. Control fitosanitario del tomate de árbol ............................................................................... 11 2.2.9. Restricciones en el uso de pesticidas y legislación. ............................................................... 11 2.3 GENERALIDADES DE LOS PESTICIDAS .................................................................. 12 2.3.1. Clasificación .......................................................................................................................... 12 2.3.2. Origen .................................................................................................................................... 12 2.3.3. Toxicidad ............................................................................................................................... 13 2.3.4. Naturaleza química ................................................................................................................ 13 2.3.5. Según el hospedante............................................................................................................... 13 2.4 PESTICIDAS REPRESENTATIVOS ............................................................................. 13 ix 2.4.1. Pesticidas organoclorados ...................................................................................................... 13 2.4.2. Pesticidas organofosforados ................................................................................................... 14 2.4.3. Carbamatos ............................................................................................................................ 14 2.5 PESTICIDAS EN ESTUDIO: PIRETRINAS Y PIRETROIDES ................................... 15 2.5.1. Introducción ........................................................................................................................... 15 2.5.2. Estructura ............................................................................................................................... 16 2.5.3. Clasificación de piretroides.................................................................................................... 17 2.5.4. Propiedades físico-químicas. ................................................................................................. 18 2.5.5. Toxicocinética ........................................................................................................................ 18 2.5.6. Farmacodinamia..................................................................................................................... 18 2.5.7. Toxicidad ............................................................................................................................... 19 2.5.8. Sintomatología y tratamiento ................................................................................................. 20 2.6 CARACTERÍSTICAS DE LA CIPERMETRINA .......................................................... 20 2.6.1. Estructura química y nomenclatura........................................................................................ 20 2.6.2. Plaguicidas en los Alimentos ................................................................................................. 21 2.7 MÉTODOS DE ANALISIS DE PESTICIDAS EN ALIMENTOS ................................ 22 2.7.1. Muestras ................................................................................................................................. 23 2.7.2. Métodos de extracción de pesticidas en alimentos ................................................................ 23 2.7.3. Extracción en fase sólida (QuEChERS)................................................................................. 24 2.7.4. Técnicas de separación, identificación y cuantificación ........................................................ 25 2.7.5. Cromatografía de Gases ......................................................................................................... 25 2.8 VALIDACIÓN ................................................................................................................. 29 2.8.1. Importancia de validar un método ......................................................................................... 30 2.8.2. Aplicación .............................................................................................................................. 30 2.8.3. Parámetros.............................................................................................................................. 30 2.8.4. La selectividad ....................................................................................................................... 30 2.8.5. Linealidad .............................................................................................................................. 31 2.8.6. Intervalo lineal ....................................................................................................................... 32 2.8.7. Sensibilidad ............................................................................................................................ 32 2.8.8. Límites ................................................................................................................................... 33 2.8.9. Exactitud ................................................................................................................................ 34 2.8.10. Incertidumbre ................................................................................................................... 37 2.8.11. Normalización de un método ........................................................................................... 38 2.8.12. Acreditación de un laboratorio ......................................................................................... 39 x CAPÍTULO III ................................................................................................................................. 40 3. METODOLOGÍA ................................................................................................................ 40 3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN........................................................................................... 40 3.2 PRIMERA FASE: validación del método para análisis de cipermetrina ......................... 40 3.3 SEGUNDA FASE Determinación de la persistencia de cipermetrina en muestras de tomate de árbol. ................................................................................................................................ 50 3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICO ............................................................ 56 3.4.1. Análisis de la muestra. ..................................................................................................... 56 3.4.1.1. Método ............................................................................................................................. 56 3.4.1.2. Método de extracción QuEChERS para la determinación de pesticidas en tomate de árbol y su cuantificación por cromatografía de gases................................................................................ 56 3.4.1.3. Equipos – materiales y reactivos. ..................................................................................... 56 3.4.1.4. Preparación de la muestra ................................................................................................ 57 3.4.2. Análisis cromatografíco ................................................................................................... 57 3.4.2.1. Condiciones ...................................................................................................................... 57 3.4.3. Aplicación del método. .................................................................................................... 59 3.4.4. Diagrama de flujo general de la investigación. ................................................................ 59 CAPÍTULO IV ................................................................................................................................. 60 4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS .................................................... 60 4.1 PRIMERA FASE: ............................................................................................................ 60 4.1.1. Análisis de resultados para la obtención de las curvas de calibración de cipermetrina ... 60 4.1.2. Límites de confianza ........................................................................................................ 65 4.1.3. Límite de detección (LOD) .............................................................................................. 66 4.1.4. Límite de cuantificación (LOQ) ....................................................................................... 67 4.1.5. Precisión ........................................................................................................................... 67 4.1.6. Incertidumbre. .................................................................................................................. 70 4.2 SEGUNDA FASE: ........................................................................................................... 74 4.2.1 Registro de resultados para la determinación de cipermetrina en tomate de árbol (Solanum betaceum Cav). ................................................................................................................................. 74 4.2.2 Análisis estadístico................................................................................................................. 75 4.2.2.1 Con respecto a los días: .................................................................................................... 75 4.2.2.2 Con respecto a las fumigaciones: ..................................................................................... 76 4.2.2.3 Con respecto a la interacción entre fumigaciones y tiempo ............................................. 77 4.2.2.4 Resultado del análisis sobre el cumplimiento del LMP para cipermetrina en tomate de árbol 78 4.2.2.5 Cinética de degradación ................................................................................................... 79 xi CAPÍTULO V .................................................................................................................................. 81 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 81 PRIMERA FASE ............................................................................................................................. 81 SEGUNDA FASE: ........................................................................................................................... 82 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 86 7. ANEXOS.............................................................................................................................. 94 xii Lista de tablas Pág. Tabla 2.1 Clasificación botánica del tomate de árbol ........................................................................ 8 Tabla 2.2 Propiedades de un adecuado grado de madurez ............................................................... 11 Tabla 2.3 Clasificación de los pesticidas según su toxicidad. .......................................................... 13 Tabla 2.4 Propiedades fisicoquímicas de cipermetrina. ................................................................... 21 Tabla 2.5 Tamaño mínimo de muestra para el ensayo, según el producto....................................... 23 Tabla 2.6. Técnicas de extracción de pesticidas ............................................................................... 23 Tabla 2.7 Ecuaciones para el análisis de varianza............................................................................ 35 Tabla 2.8. Ecuaciones para la determinación del coeficiente de repetitividad y reproducibilidad .. 36 Tabla 3.1. Relación entre el número de árboles a muestrear. ........................................................... 51 Tabla 3.2 Variables dependiente e independiente ............................................................................ 52 Tabla 3.3 Matriz de datos para el análisis de cipermetrina en tomate de árbol. ............................... 53 Tabla 3.4 Análisis de Varianza para dos factores con submuestras por grupo ................................ 54 Tabla 3.5 Ecuaciones cinéticas......................................................................................................... 55 Tabla 3.6 Condiciones cromatografías establecidas para la cipermetrina. ....................................... 58 Tabla 4.1 Datos experimentales para la obtención de curvas de calibración de cipermetrina ......... 60 Tabla 4.2: Concentraciones obtenidas de las curvas de calibración ................................................. 63 Tabla 4.3: Valores de desviación estándar de a y b, coeficiente de determinación (r2) y error típico (Syx) ................................................................................................................................................. 64 Tabla 4.4: Análisis de las curvas de calibración de cipermetrina..................................................... 64 Tabla 4.5: Ecuación de la curva global ............................................................................................ 65 Tabla 4.6: Valores para a y considerados para los intervalos de confianza ..................................... 65 Tabla 4.7 Limites de confianza ........................................................................................................ 66 Tabla 4.8 Límite de detección del método ....................................................................................... 66 Tabla 4.9 Límite de cuantificación del método ................................................................................ 67 Tabla 4.10 Datos experimentales para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad. .... 67 xiii Tabla 4.11 Análisis ANOVA para nivel N °1 concentración 0,2 ppm............................................. 68 Tabla 4.12. Reproducibilidad (R) expresados en coeficiente de variación.. .................................... 69 Tabla 4.13. Parámetros de aceptación para el método por precisión. ............................................. 69 Tabla 4.14. Datos para el cálculo del sesgo ..................................................................................... 70 Tabla 4.15. Incertidumbre por respuesta analítica (uFR). ................................................................ 70 Tabla 4.16. Se Incertidumbre por resolución del equipo (Ur) . ........................................................ 71 Tabla 4.17. Incertidumbre por reproducibilidad (UR) ..................................................................... 71 Tabla 4.18. Incertidumbre por recuperación (U recp) ...................................................................... 71 Tabla 4.19. Incertidumbre del peso de la muestra (Upm) ................................................................ 71 Tabla 4.20. Cálculo de la incertidumbre del Patrón .......................................................... 72 Tabla 4.21 Cálculo de la incertidumbre por dilución U (FD). ......................................................... 72 Tabla 4.22 Incertidumbre balón (10, 5ml). ...................................................................................... 72 Tabla 4.23 Incertidumbre micropipeta (Umicrp). ............................................................................ 72 Tabla 4.24 Cálculo de la incertidumbre combinada (Uc) y la expandida (U) .................................. 73 Tabla 4.25. Datos obtenidos en el estudio del contenido de cipermetrina en los tomates de árbol.. 74 Tabla 4.26. Análisis de varianza para dos factores con submuestras por grupo. ............................. 75 Tabla 4.27. Pruebas de Rangos Múltiples de DMS para cipermetrina en ppm por días. ................. 76 Tabla 4.28. Pruebas de Rangos Múltiples para cipermetrina en ppm por fumigación. .................... 76 Tabla 4.29 Residuos de cipermetrina en muestras de cosecha ......................................................... 78 xiv Lista de Figuras pág. Figura 2.1.Porcentaje de superficie plantada y producción, según región y provincia ..................... 9 Figura 2.2. Tomate de árbol. ............................................................................................................ 10 Figura 2.3 Estructura del DDT ......................................................................................................... 14 Figura 2.4 Estructura del Paratión. ................................................................................................... 14 Figura 2.5 Estructura del IPC. .......................................................................................................... 15 Figura 2.6 Fotografía de la planta Chrysanthemum cinerariaefolium, ............................................. 15 Figura 2.7 Estructura general de los piretrinas ................................................................................. 16 Figura 2.8 Estructura general de los piretroides. .............................................................................. 17 Figura 2.9.- Identidad química de los piretroides tipo I. .................................................................. 17 Figura 2.10.- Identidad química de los piretroides tipo I.. ............................................................... 17 Figura 2.11.- Estructura de la neurona ............................................................................................. 18 Figura 2.12 El mecanismo de acción de los piretroides sobre el axón ............................................ 19 Figura 2.13 Molécula de cipermetrina. ........................................................................................... 20 Figura 2.14 Diagrama esquemático de un cromatografía de gases ................................................. 25 Figura 2.15 Esquema de in inyector para columnas empaquetadas. .............................................. 26 Figura 2.16 Espectrómetro de masas............................................................................................... 29 Figura 2.17 Función respuesta o recta de calibrado. ....................................................................... 31 Figura 2.18 Limites del intervalo lineal .......................................................................................... 32 Figura 2.19 Intervalo lineal de un método analítico. ....................................................................... 33 Figura 3.1. Localización de parcela del cultivo de Tomate de árbol ................................................ 50 Figura 3.2 Cromatógrafo Agilent 5975C Series GC ........................................................................ 58 Figura 3.3 Determinación de cipermetrina en muestras de tomate de árbol. ................................... 59 Figura 4.1 Curva de calibración Nº1. Método cromatográfico ........................................................ 61 Figura 4.2 Curva de calibración Nº2. Método cromatográfico ........................................................ 61 xv Figura 4.3 Curva de calibración N3º. Método cromatográfico ........................................................ 62 Figura 4.4 Curva de calibración Nº4. Método cromatográfico ........................................................ 62 Figura 4.5 Curva de calibración Nº5. Método cromatográfico ........................................................ 63 Figura 4.6 Límites de confianza y curva global de calibración........................................................ 66 Figura 4.7 Comportamiento de la concentración de cipermetrina en el tiempo luego de cada fumigación........................................................................................................................................ 74 Figura 4.8 Comparación del contenido de cipermetrina en el tiempo y el número de fumigación con respecto a lo establecido por la INEN 1 1909 .................................................................................. 78 xvi Lista de Ecuaciones pág. Ecuación 2.1 Ecuación de la recta de calibración ........................................................................... 31 Ecuación 2.2 Criterio de aceptación adecuado de los límites .......................................................... 34 Ecuación 3.1 Límite superior e inferior de la intersección (a) ......................................................... 41 Ecuación 3.2 Límite superior concentración 1 ( ............................................................... 42 Ecuación 3.3 Límite inferior concentración 1 ( ................................................................. 42 Ecuación 3.4. Límite de detección (LOD) ..................................................................................... 42 Ecuación 3.5 LODppm.................................................................................................................... 43 Ecuación 3.6 Limite de cuantificación (LOQ) ................................................................................. 43 Ecuación 3.7 LOQppm ....................................................................................................................... 43 Ecuación 3.8 Porcentaje de recuperación. ........................................................................................ 44 Ecuación 3.9 Prueba t-student .......................................................................................................... 44 Ecuación 3.10 Promedio de la desviación estándares o error tipo ( Ecuación 3.11 Promedio de la pendiente ( ) ........................................ 45 .................................................................................. 45 Ecuación 3.12 Desviación función de la respuesta analítica ( ) ................................................ 45 Ecuación 3.13 Incertidumbre FR .................................................................................................... 46 Ecuación 3.14 Incertidumbre resolución del equipo ....................................................................... 46 Ecuación 3.15 Incertidumbre estándar o de reproducibilidad .......................................................... 46 Ecuación 3.16 Incertidumbre por recuperabilidad ........................................................................... 47 Ecuación 3.17 Incertidumbre de las observaciones.......................................................................... 47 Ecuación 3.18 Incertidumbre del patrón .......................................................................................... 47 Ecuación 3.19 Incertidumbre por peso de la muestra ...................................................................... 47 Ecuación 3.20 Incertidumbre del patrón (umrc) ............................................................................. 48 Ecuación 3.21 Incertidumbre por dilución U (FD). ......................................................................... 48 xvii Ecuación 3.22 Incertidumbre (balón) ............................................................................................... 48 Ecuación 3.23 Incertidumbre (micropipeta) ..................................................................................... 49 Ecuación 3.24 Incertidumbre ........................................................................................................... 49 Ecuación 3.25 Incertidumbre combinada estándar........................................................................... 49 Ecuación 3.26 Valor DMS para fumigaciones ................................................................................. 55 Ecuación 3.27 Valor DMS para tiempo ........................................................................................... 55 Ecuación 4.1 Comportamiento de degradación de la cipermetrina .................................................. 79 xviii Lista de Anexos pág. Anexo 1 .- Norma INEN 1.1990 Para frutas frescas. Tomate de árbol. (Requisitos) ...................... 94 Anexo 2.- Residuos de plaguicidas en alimentos y piensos detalles sobre el plaguicida cipermetrina .......................................................................................................................................................... 98 Anexo 3 . Información del cultivo de tomate de árbol y su manejo ................................................. 99 Anexo 4 . Hoja de seguridad química –cipermetrina ..................................................................... 100 Anexo 5.- Cromatógrama de cipermetrina .................................................................................... 105 xix Lista de Siglas IAASTD La Evaluación Internacional De Las Ciencias Y Tecnologías Agrícolas Para El Desarrollo CIATOX Centro de Información y Asesoramiento Toxicológico UE Unión Europea LMRs Límites máximos residuales. ESPAC Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua dSPE Fase Sólida Dispersiva OMS Organización Mundial de la Salud FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación ONG organización no gubernamental SAICM Enfoque Estratégico para la Gestión de Productos Químicos a Nivel Internacional CAN Comunidad Andina de Naciones DDT dicloro difenil tricloroetano BHC hexachlorociclohexano INEC El Instituto Nacional de Estadística y Censos CORPEI Corporación de Promoción de Exportaciones e Inversiones IICA Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura MAGAP Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca AGROCALIDAD Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de Calidad del Agro PAN Pesticides Action Network INSHT Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo de España INECC Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático CEN Comité Europeo de Normalización AOAC Association of Official Agricultural Chemists Asociación de Químicos Analíticos Oficiales GC Cromatografía De gases LC Cromatografía liquida ua unidades arbitrarias FSOT Fused –silica open tubular FID Detector de ionización de llama ISO International Organization for Standardization xx ICONTEC El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación ASECAL Asesoría y Consultoría de Calidad. LOQ límite de cuantificación LOD límite de detección IUPAC La Unión Internacional de Química Pura y Aplicada OSP Oferta de Servicios y Producto EN Comité Europeo de Normalización. ANOVA análisis de varianza SC suma de cuadrados g.l grados de libertad MC mínimos cuadrados F F de Fisher-Snedecor t t-student desviación de la repetividad variabilidad intermedia variabilidad total coeficiente de variación de repetibilidad coeficiente de variación de reproducibilidad xxi Lugar donde se realizó la investigación El presente tema “DETERMINACIÓN DE CIPERMETRINA MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE GASES EN CULTIVOS DE TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum Cav) EN LA COMUNIDAD DE TABABELA-PICHINCHA – ECUADOR”, se realizará en la provincia de Pichincha, Parroquia Quinche, los análisis se realizarán en la ciudad de Quito, en las instalaciones de los laboratorios de Oferta de Servicios y Productos (OSP) Área de Alimentos, de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, calle Francisco Viteri s/n y Gato Sobral. xxii Resumen documental En el presente trabajo se evaluó en contenido del pesticida cipermetrina en muestras de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav) provenientes de una parcela de ensayo ubicada en el barrio Tababela, Parroquia del Quinche, provincia de Pichincha. La extracción del pesticida se realizó por la técnica de extracción en fase solida QuEChERS y el análisis cuantitativo por cromatografía de gases (CG) acoplado a un detector de masas (MSD). Previo a este proceso se validó el método de análisis con el fin de brindar confiabilidad a los resultados conseguidos. De un total de 6 cosechas investigadas 4 presentaron residuos de cipermetrina que superaron el límite máximo permisible (LMP). Como variables de estudio se tomaron el número de fumigaciones y el tiempo transcurrido después de estas. El análisis estadístico mostró que el tiempo desde de la última aplicación y la cosecha, así como la frecuencia de aplicación y la interacción entre estos dos factores influyen drásticamente en la presencia de residuos. Tomando en cuenta los resultados obtenidos, se estudió persistencia de la cipermetrina en el cultivo lo que brindo información sobre su cinética de degradación esto ayudo a concluir resultados que permitirían asegurar que el control químico aplicado no adicionaría pesticida en el producto a niveles que irrespeten la norma. Palabras Clave: CIPERMETRINA, PICHINCHA, PESTICIDA, QUECHERS, RESIDUOS DE PESTICIDA, PERSISTENCIA, VALIDACIÓN. xxiii Document Summary This research paper evaluated the cypermethrin pesticide in tree tomato plant samples, a variety of local fruit (solanum betaceum cav) which came from a trial lot located in the Tababela region Quinche sector, Pichincha Province in the country of Ecuador. The extraction technique of the pesticide was accomplished in a solid stage QuEChERS and the quantitative analyses was made by the process of chromatography of gases (CG) connected to a mass detector (MSD). Previous to this process we evaluated the analyses method with the objective to bring forward the reliability of the obtained results. A total of six crop harvested researched, four of them showed remains of Cypermethrin which went above the maximum limit permitted. As research variables we took the number of fumigations as well at the time lapsed after these applications. The statistical analyses showed that the time from the last application and the last crop harvested, the application frequency, including the interaction between these two factors, drastically influenced in the presence of these residues. Taking in consideration the results obtained, we studied the persistence of the cypermethrin on the crop which gave us information over a kinetic energy degradation. This helped us to conclude the results which will allow us to ensure that the chemical control applied will not add the pesticide on the crop to levels which will deviate from the norm. Key words: CYPERMETHRIN, PICHINCHA, PESTICIDE, QUECHERS, PERSISTENCE, VALIDATION, KYNETIC. xxiv PESTICIDE REMAINS, “Y enseñándoles a guardar todo lo que yo os he mandado. Y he aquí que yo estoy con vosotros todos los días hasta el fin del mundo.” Mateo 28, xxv CAPÍTULO I 1. INTRODUCCIÓN 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El uso de compuestos orgánicos sintéticos como los pesticidas es en la actualidad imprescindible para satisfacer las necesidades de la industria alimentaria. Lo que se evidencia en el crecimiento de las importaciones de agroquímicos durante los primeros cuatro meses del 2012, respecto al año 2011, aumentaron en un 6% y sumaron cerca de 70 millones de dólares, hubo un mayor dinamismo en el mercado interno de agroquímicos en el que, por línea de productos, los fungicidas dominaron con un 55%, seguidos de los herbicidas (25%) e insecticidas (15%), entre otros (GÓMEZ, 2012) El uso de plaguicidas aporta muchos beneficios para la agricultura ya que mejoran el rendimiento y la calidad de los productos agrarios, reducen la necesidad de mano de obra, además contribuyen a limitar la erosión del suelo al reducir los cultivos de laboreo y ayudan a garantizar el suministro fiable de una amplia variedad de productos agrícolas a precios razonables. Estos productos constituyen como medio importante para cumplir los requisitos fitosanitarios que permiten el comercio internacional. Sin embargo a pesar de los beneficios que da la utilización de pesticidas, estos han generado problemas debido principalmente a sobredosis y aplicación inadecuada; como resistencia de la plaga, además de daños causados a especies benéficas que conduce alteraciones en el ecosistema afectando el medio ambiente y la salud humana, dado que algunos de estos compuestos se acumulan en la biosfera (aire, agua o suelo) y pueden entrar en la cadena alimentaria de animales, llegando en último término a alcanzar la cadena alimenticia humana, donde varios de ellos se acumulan en algunos órganos vitales y provocando intoxicaciones de distinta gravedad (Cardona, Chaparro, Calderón, Peláez, & García, 2011) . Los riesgos alcanzan a los agricultores y todas las personas que trabajan en contacto con pesticidas llegando a los consumidores de productos agrícolas, expuestos diariamente a la ingesta de dosis combinadas es estas sustancias presentes en los alimentos como de los tratamientos de siembra, cosecha y pos cosecha. El mayor costo social son las muertes y las intoxicaciones agudas y crónicas. Según La evaluación Internacional de las ciencias y tecnologías agrícolas para el desarrollo (IAASTD) se estima que las enfermedades transmitidas por los alimentos afectan anualmente al 30% de la población de los 1 países industrializados y son responsables de aproximadamente 2,1 millones de muertes en los países en desarrollo. Se conocen más de 200 enfermedades transmitidas por los alimentos entre las que se encuentran las intoxicaciones agudas y las muertes asociadas a los residuos de plaguicidas. En Ecuador el Centro de Información y Asesoramiento Toxicológico (CIATOX) reporta que la tasa de intoxicaciones por 100.000 habitantes subió de 14,4 en 2010 a 17,4 en 2011, en ese mismo año el 49% de las intoxicaciones registradas –por cualquier agente– lo fueron por plaguicidas. Un informe elaborado por investigadores de la Universidad de Río Cuarto, Córdoba, confirmó la que la vinculación entre daño genético y cáncer es clara”, El estudio revelo que los productos más encontrados y que provocan más daño son el glifosato, atrazina, cipermetrina, clorpirifós y endosulfan. “En diversas investigaciones confirmamos daños genéticos en personas expuestas a agroquímicos. (Marubanta, 2014) Como consecuencia de esta problemática, las normativas legales respecto a su uso son cada vez más estrictas, en particular en Estados Unidos, Canadá y países de la Unión Europea. El Comité del Codex sobre Residuos de Plaguicidas se encarga de establecer los límites máximos residuales (LMRs,) y en estos se basan numerosos países para el comercio internacional como es el caso de Ecuador, en donde hace muy poco se comenzaron los estudios sobre esta problemática; sin embargo, no existe seguimiento de la aplicación de la normativa existente. El cultivo del tomate de árbol en Ecuador, constituye una actividad agrícola en desarrollo, según la ESPAC para el 2013 se sembraron 4462 hectáreas; 4233 en monocultivo y 229 en asociación, cosechándose 12.260 y 327 toneladas métricas respectivamente. Este fruto es atacado por diversas plagas, las cuales son controladas mediante la aplicación de productos entre ellos piretroides, carbonatos y organofosforados principalmente, solos o en mezclas, sin existir un programa de manejo establecido. Las aplicaciones de estos productos dependen de la presencia de las plagas según la experiencia de productores de la zona y recomendaciones de los fabricantes de las pesticidas. La cipermetrina es uno de los piretroides más usados para controlar una gama amplia de insectos en campos agrícolas, invernáculos, tratamiento de poscosecha y en viviendas. (Fortin, Bouchard, Carrier, & Dumas, 2008). El objetivo de este estudio fue documentar la presencia de cipermetrina en un cultivo de tomate de árbol desde el día de su fumigación hasta el día de su cosecha, tiempo en el cual se considera listo para el consumo. 2 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Inexistencia de estudios en cuanto al nivel residual del cipermetrina presente en tomate de árbol Solanum betaceum Cav. 1.3 OBJETIVOS 1.3.1 Objetivo general 1.3.1.1 Determinar residuos de cipermetrina en tomate de árbol, empleando el método QuEChERS que se basa en la extracción en Fase Sólida Dispersiva (dSPE), seguida de cromatografía de gases , y comparar las concentraciones detectadas con los LMRs establecidos por la norma INEN 1 909: REQUISITOS PARA FRUTAS FRESCAS. TOMATE DE ARBOL. 1.3.2 Objetivos Específicos 1.3.2.1 Validar el método analítico para la determinación de cipermetrina en tomate de árbol, estableciendo las condiciones de laboratorio óptimas necesarias por el método de cromatografía de gases. 1.3.2.2 Procesar las muestras del tomate de árbol para el análisis según el método QuEChERS. 1.3.2.3 Determinar cuantitativamente la persistencia de cipermetrina en las muestras en un tiempo de 15 y 30 días después de cada fumigación. 1.3.2.4 Comparar los resultados de los residuos encontrados en tomates de árbol con el límite máximo residual según el Codex Alimentarius. 1.3.2.5 1.4 Determinar la cinética de degradación para la cipermetrina en tomates de árbol. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN El presente trabajo se realizó con la intención de evaluar el cumplimiento de la norma INEN 1 909:2009 REQUISITOS PARA FRUTAS FRESCAS. TOMATE DE ARBOL en una plantación ubicada al norte de la ciudad de Quito, esta norma menciona los parámetros en cuanto al contenido de pesticidas en la fruta para ser considerada como apta para el consumo. Las normas INEN son documentos normativos necesarios acorde con el avance tecnológico, estos constituyen el punto de referencia técnico-legal que garantiza orden en las actividades a 3 desarrollarse y se elaboran tomando en cuenta normas internacionales como las del Codex Alimentario. La Comisión del Codex Alimentarius es un organismo subsidiario de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Actualmente estos organismos y los gobiernos además de varias ONG´s como el Enfoque estratégico para la gestión de productos químicos a nivel internacional (SAICM ) trabajan por mantener la vigilancia de residuos de plaguicidas en los alimentos y en el medio ambiente. Comunidades como la Comunidad Andina de Naciones (CAN) forman comisiones para tratar este tema y elaborar acuerdos. En la Unión Europea se ha prohibido la aplicación pesticidas como el Fipronil, un pesticida que ha disminuido la población de abejas se suma a otros que ya están fuera de los cultivos por la misma causa. Investigaciones efectuadas por la Universidad Regional de los Andes mencionan a los pesticidas como el Furadán (principio activo: carbofurano), Curacrón (profenofos) y Manzate (mancozeb) como causantes de envenenamientos a nivel según nacional (Andrade, 2011) . En ese mismo aspecto la cipermetrina se ha convertido en uno de los insecticidas más importantes de uso a gran escala, tiene amplitud de usos en el algodón, los cereales, los vegetales y las frutas, para el almacenaje de la comida, en salud pública y en la cría de los animales. Su actividad biológica es alta y es muy estable, tóxicamente está clasificada por la Organización Mundial de la Salud (WHO), como "moderadamente dañina" (clase II)5. (1. Leahey, 1985) Debido al alto grado de consumo de cipermetrina se pone en evidencia un potencial riesgo para el consumidor, según el Centro de información y Asesoramiento Toxicológico del Ministerio de Salud Pública en Ecuador (CIATOX) , ha asesorado un total de 374 casos, lo que significa un promedio de 65 casos mensuales en materia de intoxicaciones en el primer semestre del año 2009, causados por sustancias químicas diversas. Los productores de tomate de árbol se encuentran con un sin número de complicaciones entre ellas la alta incidencia de plagas y enfermedades, sumado a la escasa asistencia técnica e inadecuados controles fitosanitarios que conllevan bajos rendimientos y esto afecta directamente a la población que consume ampliamente este producto Del tomate de árbol es elaboran jugos y conservas y se la consume como fruta fresca o como complemento de ensaladas de frutas, helados, jaleas, mermeladas, dulces y en platos de carne (Lucas, Maggi, & Yagual, 2010).Por ello es de gran importancia la información obtenida en este 4 estudio, ya que permitirá conocer el estado real en el cual se consume este producto, y al no registrar estudios previos en este tema servirá de base para futuras investigaciones y como referencia para entidades pertinentes y a la sociedad en general. 5 CAPÍTULO II 2. MARCO TEÓRICO 2.1 ANTECEDENTES. La era de los insecticidas modernos en la agricultura inicia inmediatamente después de terminada la Segunda Guerra Mundial en donde insecticidas como el DDT (1939) y el BHC (1941) permitieron combatir insectos vectores de enfermedades que afectaron a las tropas aliadas, rápidamente su uso se extendió al combate de plagas agrícolas y del ganado (Cisneros, 2003). Así se inicia el desarrollo, la producción y el uso de plaguicidas a gran escala, años más tarde su uso se generalizó en casi todos los países del mundo. A este grupo de insecticidas clorados pronto se unió el grupo de los fosforados; posteriormente los carbamatos y más recientemente los piretroides estables. Lo que no se imaginó fue que en muchos de los países en donde se dio el uso intensivo y masivo de estos productos sintéticos se comenzará a cuestionar su eficacia y rentabilidad a corto plazo lo que luego llevaría a prohibir y restringir la venta de muchos plaguicidas (ILA, 2006). Habitualmente, el uso estos agentes de control deja residuos en los alimentos pero al ser aplicados adecuadamente estos no se convierten en un riesgo para la salud. En Ecuador el mercado interno y el de las exportaciones de tomate de árbol se rige por la norma INEN 1 909: “Requisitos para frutas frescas. Tomate de árbol”, en esta se menciona que los residuos de plaguicidas no deben exceder los niveles máximos establecidos en el Codex Alimentarius que es de 0.2 mg por Kg de tomate, limite que se adoptó en el 2009. Aunque en el país no exciten estudios acerca de los posibles efectos de los piretroides investigaciones afines mencionan que pruebas hechas con ratones han sugerido que los piretroides en general pueden tener un efecto de supresión inmunológica en ratas. La WHO concluye que "se debería poner más atención a ese aspecto, pero a la fecha, no se puede formular ninguna opinión acerca de su relevancia en la extrapolación de esta información para el ser humano. En este aspecto cabe mencionar el reporte sobre una epidemia de ginecomastia (hinchazón del pecho en el sexo masculino) entre los refugiados de Haití que toma en cuenta el contacto con fenotrón, un piretroide sintético, como una posible causa para este padecimiento, de la misma 6 manera se vincula a la leucemia y al cáncer linfoide con los insecticidas piretroides, aun y cuando sólo se encontraron índices muy bajos de actividad carcinogénica en estudios toxicológicos. Más de 20% de los casos de leucemia en mujeres y 10% en hombres estaban posiblemente ligados al contacto con los piretroides (Pesticides News , 1995) Una realidad más cercana es la de Colombia, en donde se realizó una investigación similar en la que se evaluaba el nivel residual de permetrina en tomate riñón, se observó que un 96% de las muestras presentaron residuos que superaron el límite máximo de residuos (LMR). El análisis estadístico mostró que la frecuencia de aplicación es el factor de uso que más influye en la presencia de residuos, así como su interacción simple con el tiempo transcurrido entre la última aplicación y la cosecha (Farias, Gerrero, Lozano, & Piedrahita, 2004) Sin embargo la gran mayoría de investigaciones se fundamenta en técnicas de extracción y análisis tradicionales en donde la extracción en su mayoría utiliza solventes orgánicos con sus consabidas particularidades. La separación y la determinación se sirven en particular de la cromatografía de gas acoplada con una variedad de detectores específicos. Este estudio se vale de un novedoso método de extracción denominado QuEChERS que se está extendiendo muy rápidamente en el análisis de residuos de pesticidas para alimentos simplificando enormemente los procedimientos analíticos volviéndolos más económicos y rápidos. 2.2 EL CULTIVO DEL TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum Cav) Se cree que el tomate de árbol es originario de los Andes. en América del Sur es sembrado extensamente en Colombia y Ecuador, y de manera secundaria en Perú, Chile, Bolivia, Argentina, Brasil, Venezuela, Costa Rica, Guatemala, Jamaica, Puerto Rico y Haití. Los principales productores de este producto son: Nueva Zelanda, Kenia, Sri Lanka, India, Colombia, Zambia y Zimbabwe. 2.2.1. Clasificación botánica El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav) pertenece a la familia de las Solanáceas. Es una especie perenne y suculenta, de hoja persistente. Ha sido descrito en tres cepas de acuerdo al color de piel y pulpa de sus frutos: amarillo, rojo (piel roja y pulpa amarilla-naranja) y púrpura (piel rojapúrpura y pulpa suavemente anaranjada. (Boyes & Strubi, 1997). En la tabla 2.1 tenemos la clasificación botánica del tomate de árbol de manera completa. 7 Tabla 2.1 Clasificación botánica del tomate de árbol Taxón Nombre Reino Vegetal División Fanerógamas Subdivisión Angiospermas Clase Dicotiledóneas Subclase Metaclamideas Orden Tubiflorales Familia Solanaceae Género Solanum Especie Solanum betaceum Cav Fuente: Tomado de Bohs (1995) Transfer of Cyphomandra (Solanaceae) and Its Species to Solanum. 2.2.2. Orígenes y distribución Se creía que era una planta procedente de la región andina, principalmente de la vertiente oriental del Ecuador con el Perú sin embargo investigaciones recientes señalan que el tomate de árbol cultivado está estrechamente relacionado con un complejo de materiales silvestres bolivianos de acuerdo a evidencias moleculares, estudios morfológicos y datos de campo, por lo cual los ecotipos cultivados se cree se originaron en esa región (Bohs y Nelson, 1979, citados por León J, et al., 2004) También se cultiva en las zonas montañosas de África, India y Australia. Los frutos del tomate de árbol se han hecho tan populares que en Nueva Zelanda han desplazado al kiwi fruit, lo que demuestra el potencial internacional de esta fruta. (Calvo I. , 2009) 2.2.3. Requerimientos agroecológicos Es una planta de climas templados y fríos. La temperatura la óptima esta entre 16° y 19°C. La humedad debe ser de alrededor del 70 %, razón por la cual se cultiva frecuentemente en zonas altas entre los 1,800 a 2,200 msnm. El suelo debe ser del tipo franco arenoso con un pH entre 5,5 – 6 ,5. (García, 2008) La distancia de siembra recomendada es de 3×3 metros, lo cual conduce a una densidad de siembra de 1.111 árboles por hectárea (Rivera J., 2001). La producción empieza a los ocho meses o un año después de la siembra, siendo intensa solamente por 4 ó 5 años (5 meses /año) pudiendo durar de 10 a 12 año (Amaya & José, 2006) 8 2.2.4. Producción en el Ecuador En el Ecuador las provincias donde se cultivan esta fruta son: Tungurahua, Carchi, Imbabura, Pichincha, Chimborazo, Bolívar, Cañar, Azuay y Loja. Según la gráfica elaborada por la ESPAC la mayor producción se encuentra en la región de la sierra como observamos en la figura 2.1. .Estos datos fueron obtenidos de la Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua, ESPAC actualizada al 2103. Figura 2.1.Porcentaje de superficie plantada y producción, según región y provincia Fuente: .ESPAC ( 2013). Ecuador se proyecta como un principal competidor, pues cuenta con condiciones adecuadas de suelo y temperatura demás de que las organizaciones gubernamentales buscar vincularse activamente al mercado internacional. (García, 2008) 2.2.5. Morfología Planta arbustiva de una altura de 2 a 3 m. Las hojas son cordiformes. Las flores son de color rosa y lavanda, agrupadas en racimos terminales, las cuales florecen de manera escalonada. Los frutos son solitarios Y se encuentran agrupados de colores variables, del amarillo al rojo, de forma ovoidal con ápices puntiagudos ver figura 2-2. (Calvo I. , 2009). 9 Figura 2.2. Tomate de árbol. Fuente: CORPOICA.2010. 2.2.6. Composición nutricional del tomate de árbol. El tomate de árbol tiene e buenas cualidades físicas, nutritivas y organolépticas (Encavalada & Larriva, 1999) Esta fruta tiene un alto contenido de ácido ascórbico (más de 60 mg/100g) y es rico en pectinas. Además, es una excelente fuente de vitamina A, B6 y E (Boyes & Strubi, 1997) Los frutos de tomate de árbol son fuente excelente de provitamina A (caroteno-150 UI por 100 g), vitamina B6, vitamina C (25 mg. por 100 g), vitamina E, e hierro. Esta especie es baja en hidratos de carbono, una media fruta contiene menos de 40 calorías .Es rico en minerales, especialmente calcio, hierro y fósforo; contiene niveles importantes de proteína y caroteno. Fortalece el sistema inmunológico y la visión, además de funcionar como antioxidante. Es además una buena fuente de pectina. (Amaya & José, 2006). 2.2.7. Siembra y cosecha La siembra conlleva prácticas eficientes y eficaces se recopilo toda la información correspondiente en el anexo 3. Previo al consumo; la cosecha es una operación de mucha importancia al ser la fruta es apartada de su fuente de alimento. Para alcanzar tiempos extendidos sin deterioro en la calidad, se deben considerar aspectos tanto inherentes a la fruta como también aspectos logísticos que aseguren la disminución de posibles causas de daño. Para esta investigación en particular se estableció el cumplimiento de la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1 1909:2009 Frutas Frescas Tomate de árbol. En esta norma se toma en cuenta el carácter climatérico de la fruta, la tasa de respiración, estado sanitario y mecánico de la fruta 10 además del grado de madurez , este último cuenta con los parámetros que se mencionan en la tabla 2.2 (García, 2008) Tabla 2.2 Propiedades de un adecuado grado de madurez Propiedades Rangos Tiempo Desde la semana 23 a la 25 Peso mayor a los 120 g Diámetro mayor a 55 mm Longitud 65-75 mm sólidos solubles °Brix 8 ° de a 10 ° firmeza entre 4 y 5 kgf/cm2 acidez 1.5 y 1.4 índice de madurez Entre 6 y 8. ( Según Norma ) color morado o naranja intenso con visos verdes Fuente: Requisitos de la madurez del fruto .;INEN 1 1909. 2.2.8. Control fitosanitario del tomate de árbol Según el Censo Nacional Agropecuario (CNA) se perdieron por estas causas 36,00 hectáreas (ESPAC, 2013). Este cultivo responde muy bien a la aplicación de productos pesticidas y prácticas culturales de tipo fitosanitario. Entre las plagas y enfermedades más comunes que afectan a este cultivo se puede nombrar el gusano trozador, pulgones, mosca blanca y la lancha. Para controlar estos factores se aplica controles biológicos y químicos entre ellos la cipermetrina. 2.2.9. Restricciones en el uso de pesticidas y legislación. La Constitución de la República del Ecuador es considerada como la norma de máxima jerarquía, en ella se hace mención sobre las responsabilidades en la regulación de los plaguicidas y sustancias químicas, en ella “se reconoce el derecho de la población a la salud y a vivir en un ambiente sano y ecológicamente equilibrado que garantice la sustentabilidad y el buen vivir, sumakkawsay" (Constitución De La Republica Del Ecuador, 2008) Otro parámetro legal es la Ley Orgánica de la Salud Ecuatoriana 2008 que regula las actividades encabezadas por el Ministerio de Salud en coordinación con el MAGAP, y más Organismos competentes como AGROCALIDAD, dictarán e implementarán las normas de regulación para la utilización y control de Plaguicidas, fungicidas y otras sustancias químicas de uso doméstico, agrícola e industrial. 11 Dicha ley consta del artículo 115 que habla acerca del cumplimento de las normas y regulaciones nacionales e internacionales para la producción, importación, exportación, comercialización, uso y manipulación de plaguicidas, fungicidas, y otro tipo de sustancias químicas cuya inhalación, ingestión o contacto pueda causar daño a la salud de las personas. Entre las normas nacionales se pueden mencionar el Código de la Salud, Ley para la Prevención y Control de la Contaminación Ambiental, Ley del Codex alimentario y las Normas Técnicas del INEN. Las regulaciones específicas de Ecuador para tomate de árbol Solanum betaceum Cav están regidas por la norma INEN 1 909, esta establece los requisitos que debe cumplir el producto destinado para consumo en estado fresco acondicionado o envasado para su comercialización dentro del territorio nacional, en su literal 6.1.3 menciona que los residuos de plaguicidas no deben exceder los límites máximos establecidos en el Codex Alimentarius que es de 0,2 mg por kilogramo de fruta. Después de la cosecha, cada fruta se limpia manualmente con un paño ligeramente húmedo y se la deja secar al aire libre. Por tener una cáscara gruesa, es una fruta relativamente resistente al tiempo y almacenamiento. Sin embargo, si se mantiene bajo temperaturas menores a 5º C, sufrirá de daños por enfriamiento sin refrigeración la fruta se mantiene hasta por 2 semanas, bajo atmósfera controlada se prolonga la vida de la fruta hasta por 10 semanas (IICA, 2001). 2.3 GENERALIDADES DE LOS PESTICIDAS Los términos pesticidas o plaguicidas son sinónimos, su única diferencia es una traducción incorrecta de la palabra del idioma inglés al español (pesticida), ambos términos provienen de la palabra “plaga” (Zhunaula, 2011). Según el diccionario de la Real Academia Española el término pesticida se refiere “a algo que se dedica a combatir plagas”. Desde un punto de vista operacional esta definición se amplía al incluir aspectos como el control, la prevención, la atenuación y la regulación de cualquier forma de vida animal o vegetal que afecte las plantas útiles sus productos y derivados. (Trujillo, 2006) 2.3.1. Clasificación Los pesticidas son utilizados principalmente en el sector agrícola para el manejo de suelos, cultivos y protección de animales y se clasifican en función de diferentes factores como: 2.3.2. Origen Pueden clasificarse en insecticidas naturales que se elaboran a partir de plantas que contengan metabolitos secundarios capaces de ser utilizados como agentes de control, y en plaguicidas 12 sintéticos que son el resultado de un proceso industrial de síntesis química que poseen alta estabilidad química y de óptima producción. 2.3.3. Toxicidad Para el año de 1987 la OMS implantó la clasificación basada en su grado de toxicidad aguda, definida como la capacidad del plaguicida de producir daño agudo a la salud a través de una o múltiples exposiciones, en un período de tiempo relativamente corto. (OMS, 1993). La toxicidad se encuentra en función de la Dosis letal media como se observa en la ver tabla 2.3. Tabla 2.3 Clasificación de los pesticidas según su toxicidad. Dosis letal 50 Categoría Definición I Extremadamente tóxicos 0 - 50 mg/Kg II Altamente tóxicos 5 - 50 mg/Kg III Medianamente tóxicos 50 - 500 mg/Kg IV Ligeramente tóxicos Mayor de 500 mg/Kg (oral aguda en Ratas) Fuente: Modificado de Instituto Nacional de Salud Colombia – Subdirección de Vigilancia y Control. Intoxicación aguda por plaguicidas. Primer semestre de 2007. 2.3.4. Naturaleza química Se basa en los diversos grupos químicos. Esta clasificación es sumamente compleja como extensa, entre los principales están los organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides y entre otros. 2.3.5. Según el hospedante Según el organismo sobre el cual actúa el agroquímico, se clasifica en: acaricidas fungicidas, bactericidas, herbicidas, nematicidas, molusquicidas, rodenticidas, alguicidas, esterilizantes, defoliantes atrayentes. 2.4 PESTICIDAS REPRESENTATIVOS 2.4.1. Pesticidas organoclorados La importancia ambiental de los pesticidas organoclorados estriba en su persistencia ambiental y su capacidad de dañar al hombre, razones por las cuales han sido prohibidos o severamente restringidos en muchos países (Trujillo, 2006). Uno de los más representativos es el DDT cuyo nombre técnico es 2,2-bis (p- clorofenil)-1 tricloroetano (ver figura 2.3). 13 Figura 2.3 Estructura del DDT Fuente: Trujillo, 2006 Son de bajo costo y amplio espectro sus residuos se encuentran en el ambiente y en los seres vivos. Son liposolubles, solubles en compuestos orgánicos de baja polaridad. Se acumulan en el tejido graso y se metabolizan lentamente. Son estables química y bioquímicamente. Se caracterizan por tener una estructura cíclica y átomos de cloro (Zhunaula, 2011). 2.4.2. Pesticidas organofosforados Poco persistentes en el medio ambiente, son esteres orgánicos de ácidos fosforosos (ver figura 2.4) la mayoría son líquidos de carácter lipofílico y de baja volatilidad, en general son menos estables que los organoclorados y se rompen fácilmente por agentes químicos y biológicos, tienen un tiempo de vida en el ambiente relativamente corta y la peligrosidad ambiental está asociada con toxicidad aguda. Figura 2.4 Estructura del Paratión. Fuente: Trujillo, 2006 2.4.3. Carbamatos Estos compuestos son amidas que tienen la tienen la formula general RHNCOOR (ver figura 2.5). Uno de los más conocidos es el IPC o isopropil N- fenilcarbamato que se utiliza como herbicida en el control de pastos sin afectar las cosechas de hoja ancha. 14 Figura 2.5 Estructura del IPC. Fuente: Trujillo, 2006 2.5 PESTICIDAS EN ESTUDIO: PIRETRINAS Y PIRETROIDES 2.5.1. Introducción Las propiedades insecticidas de las piretrinas, de las cuales se derivan los piretroides, se conocen desde alrededor de 2 000 años en la antigua China; pero no fue hasta los años 70 y 80 del siglo XX cuando comenzó a incrementarse el uso de estos compuestos (Cullen & F., 1999) Figura 2.6 Fotografía de la planta Chrysanthemum cinerariaefolium, Fuente : Pam, 2000 De las flores secas del Chrysanthemum cinerariefolium (Ver figura 2-6) se obtiene un pesticida natural llamado pelitre, una oleorresina con 6 ingredientes activos llamados piretrinas. Estas moléculas constan de una parte acida y otra alcohólica a la cual se pueden hallar acoplados ácidos (R1) y cetonas (R2). La estructura general de las piretrinas así como las cadenas laterales (r1, r2) se muestran en la figura 2.7. 15 Figura 2.7 Estructura general de los piretrinas Fuente: González Machín, 2003 Nota: R1 y R2 son ácidos o cetonas. Las piretrinas individuales son piretrina I, piretrina II, jasmolina I, jasmolina II, cinerina I y cinerina II , que resultan de la combinación de dos ácidos (crisantemico y pirétrico) y tres cetonas, piretrolona, cinerolona y jasmolona, derivadas de la ciclopentanona, con pequeñas diferencias de cadena lateral. (Juan, Picó, & Font, 2003) Uno de los principales inconvenientes es su inestabilidad en la luz y al aire, esto limita su efectividad si se refiere a efectos en su residualidad. Así en los esfuerzos por incrementar su fotoestabilidad, manteniendo la actividad insecticida y la baja toxicidad, se provocó el desarrollo de los piretroides. Estos se producen partiendo de la sustitución secuencial de los elementos estructurales de las piretrinas. Actualmente, uno de los piretroides más usados es la cipermetrina, insecticida sintetizado en 1974 e introducido al mercado en 1977. Según la OMS está clasificado como “moderadamente peligroso” (clase II); sin embargo, estudios recientes muestran que los efectos de la cipermetrina y de los piretroides en la salud pueden ser más severos de lo que indican evaluaciones toxicológicas previas (Jiménez, Quilodrán, & Miranda, 2008). 2.5.2. Estructura Generalmente los piretroides se consideran como ésteres sintéticos derivados de las piretrinas, aunque también hay un grupo de éteres oxima (ver figura 2.8) que exhiben una actividad insecticida similar a la de las piretrinas y los ésteres piretroides, pero se dispone de escasos datos acerca de estos compuestos y no se han elaborado productos comerciales de los mismos (ATSDR, 2003) Se clasifican según su química y su actividad en dos grupos: Tipo I y Tipo II. (Fernández, 2009). 16 Figura 2.8 Estructura general de los piretroides. Fuente: Modificado de (Loayza, 2007) 2.5.3. Clasificación de piretroides Tipo I.- Carentes de grupo α - ciano en su molécula. En la figura 2.9 se incluye un ejemplo de la estructura química de los piretroides tipo I, su nombre común, su número y nombre CAS. El número de registro CAS es una base de datos elaborada por la American Chemical Society, otorga una identificación numérica única para compuestos químicos, secuencias biológicas, preparados y aleaciones. Nombre común [nº CAS] Aletrina [584-79-2] Nombre CAS Estructura química 2-metil-4-oxo-3-(2-propen-1-il)-2-ciclopenten-1-il éster del ácido2,2-dimetil-3-(2-metil-1-propenil)ciclopropanocarboxílico Figura 2.9.- Identidad química de los piretroides tipo I. Fuente: (Fernández, 2009) Tipo II.- Poseen el grupo α - ciano en su molécula .En la figura 2.10 se incluye un ejemplo de la estructura química de los piretroides tipo I I, su nombre común , su número y nombre CAS. Nombre común [nº CAS] Cifenotrina [39515-40-7] Nombre CAS Estructura química ciano(3-fenoxifenil)metil éster del ácido 2,2dimetil-3-(2-metil-1-propen-1il)ciclopropanocarboxílico Figura 2.10.- Identidad química de los piretroides tipo I.. Fuente: (Fernández, 2009) 17 2.5.4. Propiedades físico-químicas. Dentro de las características (Junquera, 2013) se pueden destacar que: Son insecticidas sintéticos Se disuelven mejor en agua Su fórmula química modificada para mejorar la estabilidad Son más persistentes. poseen bajas presiones de vapor Se hidrolizan por álcalis En las formulaciones se utilizan derivados del petróleo como disolventes. 2.5.5. Toxicocinética Son absorbidos en un 40 a 60 % de la dosis de exposición por vía oral ,y por vía dérmica es absorbida menos del 2 %. Son de naturaleza lipófilica por lo que se distribuyen a los tejidos grasos, como los tejidos nerviosos central y periférico, además del hígado y el riñón. En estos tejidos se secretan las enzima llamadas oxidadas de función mixta que producen una la hidrólisis del enlace central éster, la oxidación de varios sitios, y reacciones con glicina, sulfato, glucurónido, o conjugados de glucósido para originar metabolitos solubles en agua que se eliminan fácilmente (Mahecha, 2013). Los piretroides muestran una cinética de primer orden de eliminación, con la mayoría eliminado entre las 12 a 48 horas. Las rutas principales de excreción son la orina y las heces en una mezcla de compuesto original y metabolito. 2.5.6. Farmacodinamia Son neurotóxicos que se adhieren a la membrana de las células nerviosas (ver figura 2.11) llamadas neuronas y principalmente a nivel del axón, que es una prolongación de estas. El axón se especializa en conducir el impulso nervioso entre neuronas. . Figura 2.11.- Estructura de la neurona Fuente: Fernández, 2009 . 18 Los piretroides se introducen en la membrana ocasionando que los canales de Na+ se mantengan abiertos permanentemente, esto provoca una transmisión del impulso nervioso permanente. Este efecto es más intenso con los piretroides con grupo “ciano”. El mecanismo de acción de los piretroides sobre el axón se observa en la figura 2.12. Figura 2.12 El mecanismo de acción de los piretroides sobre el axón Elaborado por: Mireya Ávila (2015). Los efectos se diferencian entre piretrinas y piretroides tipo I y tipo II , estas últimas son más potentes al inducir al canal de Na+ por más tiempo, lo que conlleva un mayor grado de potencial de membrana en reposo y dan lugar a un importante bloqueo final de la conducción nerviosa. 2.5.7. Toxicidad La toxicidad de los piretroides es mayor que la de las piretrinas (la DL5s del deltametrín en ratas es de 80 mg/kg). Se hallan dentro de los grupos de plaguicidas Categoría Toxicológica III y IV. (SESVER, 2012). La baja toxicidad en los mamíferos de estos compuestos en comparación con los insectos se debe a diversas causas (Mahecha, 2013). Los piretroides son más potentes en el canal de sodio a baja temperatura que a alta temperatura(Los insectos poseen alrededor de 25 ° C y los mamíferos a 37 ° C). Los canales de sodio de mamíferos son al menos 1.000 veces menos sensible a los piretroides que los canales de los insectos, rápidamente de la despolarización. 19 haciendo que estos se recuperen más El Tamaño corporal, los mamíferos son mucho más propensos a desintoxicar piretroides antes de que alcancen su sitio de acción a diferencia de insectos. 2.5.8. Sintomatología y tratamiento Las piretroides del tipo I y II presentan diferente sintomatología (Bonne Hernadez, Peréz Infante, Rojas Vasques, & Marín Sánchez, 2003): Tipo I: desarrollan el síndrome “T”, reflejo de hiperexcitabilidad y temblores, excitabilidad del sistema nervioso central o convulsiones. Tipo II: como la cipermetrina, producen salivación, hiperexcitabilidad, coreoatetosis (estado caracterizado por movimientos coreicos y atetóticos), además de ser sensibilizantes, lo cual se conoce como el síndrome “CS”. 2.6 CARACTERÍSTICAS DE LA CIPERMETRINA La cipermetrina pertenece al grupo de los piretroides sintéticos que posees el grupo -ciano. 2.6.1. Estructura química y nomenclatura Su nombre ISO es Cipermetrina, comprende un compuesto racémico de ocho estereoisómeros, donde las relaciones de isómeros cis-trans varían de 50:50 a 40:60. En análisis cromatográfico se asocia fragmentación junto al grupo ciano, también se abserva la relación de iones característica de moléculas conteniendo cloro (m/z=206,5; m/z=208,5), por la abundancia isotópica 35Cl/37Cl presente en la naturaleza En la Figura 2.13 se presenta la molécula general de cipermetrina. Figura 2.13 Molécula de cipermetrina. Fuente: Álvarez ,2009 Según los datos recopilados de la tesis doctoral realizada por Marino Damián en marzo de 2009, las Fichas Internacionales de Seguridad Química del INSHT, el INECC 20 además de la hoja de seguridad de los productos de PROFICOL fabricante y distribuidor de RAMBLER (ver anexo 4) producto utilizado en esta investigación se resumió la siguiente información en la tabla 2.4. (INSHT, 2012). (Proficol, 2011), (INECC, 2013) Tabla 2.4 Propiedades fisicoquímicas de cipermetrina. Propiedad Valor Carboxilato de RS-9-alfa-ciano-3-fenoxibenzil Nombre IUPAC (1RS)cis-trans-3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropano Estado físico Líquido Color Ambar Olor Solvente Formula Molecular C22H19O3NCl2 Peso Molecular 416,3 Densidad ≈ 0.944 gr/l Solubilidad en agua (200°C) 4 ppb (μg/litro) Forma una emulsión Presión de agua (200°C) 1,3x10-9 mmHg Coeficiente de partición octanol- agua (Kow)° 3,98x106 Categoría toxicológica Clase III Medianamente tóxico Fuente: Modificado de ficha técnica de cipermetrina (Proficol, 2011) Es especialmente tóxica en el caso de especies acuáticas las concentraciones letales del medio que afectan al 50% de la población (CL50), como por ejemplo las truchas, caen al orden de la ppb (1ppb=0,001ppm=μg/litro). Para los peces, mientras para especies terrestres como ratas los valores de dosis letales que afectan al 50% de la población (DL50, patos o pollos los valores están en el orden porcentual (10.000ppm =1%) (Siegfried, 1993) 2.6.2. Plaguicidas en los Alimentos Los pesticidas en los alimentos se encuentran normados por el Límite Máximo Permitido (LMP), conocido también como Límite Máximo Residual (LMR), estas sustancias se presentan como consecuencias del uso de estos en su cadena de producción. Incluye cualquier tipo de compuesto derivado como producto de conversión, degradación y reacción, metabolitos e impurezas que pueden ser consideradas tóxicamente significativas (Trujillo, 2006). 21 Los residuos de plaguicidas que contienen los alimentos varían según la dosis aplicadas, la naturaleza del plaguicida, morfología y naturaleza de la superficie vegetal, naturaleza de la formulación, características de la aplicación y condiciones climáticas (Zamora, 2004) Según la Organización Mundial de la Salud la cipermetrina, está clasificada como moderadamente peligroso (clase II); sin embargo, estudios recientes muestran que los efectos de los piretroides en la salud pueden ser más severos de lo que indican evaluaciones toxicológicas previas (Jiménez, Quilodrán, Miranda, & Rodríguez, 2008) Con la cipermetrina se presentan los típicos problemas de la aplicación de pesticidas, por ejemplo se encuentra en los pastos donde se observa el aumento en las dosis y las aplicaciones a frecuencias innecesarias, así como la utilización incorrecta de las formulaciones, lo que convierte a estas sustancias en un riesgo potencial para la salud humana (Loaiza, 2003). Se sabe por investigaciones que se ha encontrado residuos de 0,2 ppm a los 21 dias despues de la aplicación en lechugas y según (Colange & et, 2002) demostrando una cinetica de primer grado . El límite máximo permitido (LMP) para la cipermetrina es 0,2 ppm y esta normado por el codex alimentario ver anexo 2. 2.7 MÉTODOS DE ANALISIS DE PESTICIDAS EN ALIMENTOS Los métodos de análisis de residuos deberán proporcionar una precisión y exactitud adecuadas siendo a la vez rápidos y simples de manera que proporcione resultados fiables para el análisis de alimentos complejos en un tiempo razonable. (Juan, Picó, & Font, 2003) La preparación de la muestra es el paso más complejo en la determinación de residuos, representando más de 50% del tiempo del análisis. Este proceso se compone de extracción de los plaguicidas desde la matriz y purificación del extracto (Seiber, 1999). La selección del método depende de la naturaleza del pesticida estudiado, sin embargo una gran mayoría de procedimientos se fundamenta en las técnicas cromatografías, en particular la cromatografía de gases acoplada con una variedad de detectores. (Trujillo, 2006) En las siguientes secciones se describen los procesos de extracción y los métodos de separación e identificación de residuos de pesticidas en diversas matrices alimentarias. 22 2.7.1. Muestras El procedimiento se aplica a muestras de tomate de árbol, las mismas que fueron recogidas al azar cubiertas con papel aluminio en cajas térmicas o “coolers” diferentes y debidamente rotulados, el tamaño mínimo necesario se indica en la tabla 2.5, valor del cual se tomará 20 gr para el análisis. Tabla 2.5 Tamaño mínimo de muestra para el ensayo, según el producto. Tamaños y Nombre Tamaño mínimo de cada formas Vulgar Científico Frutas medianas Tomate de árbol Familia :solanáceae Género: Cyphomandra Especia : Betaceae Sendt muestra para el ensayo 2kg Fuente: Modificado de INEN 1 1909:2009 2.7.2. Métodos de extracción de pesticidas en alimentos Debido a que los pesticidas se encuentran en los alimentos en concentraciones mínimas y las muestras son complejas, es imprescindible someterlas a un proceso en el cual se obtengan fracciones concentradas con los compuestos de interés y libres de sustancias como lípidos proteínas, carbohidratos y pigmentos, que pueden causar interferencia. Fácilmente puede deducirse que la etapa determinante del análisis lo constituye la extracción esta debe ser selectiva basada en las diferentes características de la matriz además de las propiedades químicas y físicas del analíto como: peso molecular, carga, solubilidad, polaridad, volatilidad. En la tabla 2.6 se mencionan las técnicas de extracción más utilizadas en el análisis cromatográfico Tabla 2.6. Técnicas de extracción de pesticidas Técnica de Extracción QuEChERS Sólido - Líquido Disolvente Pasos de Limpieza Acetonitrilo Acetato de Etilo Extracción dispersiva en fase sólida Acetonitrilo Diclorometano Acetona Extracción dispersiva en fase sólida 23 Tabla 2.6 Técnicas de Extracción de pesticidas. Continuación Técnica de Extracción Fluidos Supercríticos Asistida en microondas Disolvente CO2 Pasos de Limpieza --- Micro extracción en fase sólida Fuente: Modificado de determinación de pesticidas en vegetales mediante cromatografía de gasesespectrometría de masa/masa (GC-MS/MS) Ramírez L. , 2009 --- 2.7.3. Extracción en fase sólida (QuEChERS) La determinación de pesticidas en frutas y vegetales ha sido simplificada mediante el método de preparación de muestras, QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe). Actualmente se emplean de manera habitual dos métodos tamponados: 1. Norma Europea (EN) disponible a través de los distintos países miembros del Comité Europeo de Normalización (CEN). 2. Un estándar reconocido por la asociación de comunidades analíticas (AOAC 2007.01) que se emplea en los Estados Unidos y otros países. El método según la norma europea se realiza en dos etapas: la preparación y la extracción, en esta última se homogeneiza con el solvente de extracción. Se añaden sales, ácidos, tampones para mejorar le eficacia de la extracción y proteger compuestos sensibles, se pueden añadir estándares de fortificación o patrones internos para comprobar la eficiencia de la extracción. Le sigue la limpieza de la muestra, una alícuota del extracto se limpia mediante extracción en fase sólida dispersiva (dSPE). Se preparan unos tubos de polipropileno de centrífuga con cantidades precisas de MgSO4 y solventes de extracción en fase sólida para eliminar el exceso de agua y contaminantes no deseados de las muestras, de tratarse de alimentos que contengan altos niveles de pigmentos y esteroles se utiliza además C18 para eliminar estos compuestos del disolvente de extracción. Se transfiere la muestra a un vial para inyector y se analiza por GC o LC. Este método se está extendiendo tan rápidamente, presenta también una gran ventaja ambiental pues disminuye sustancialmente el consumo de solventes orgánicos y acorta los tiempos de preparación de la muestra lo, esto simplifica enormemente el procedimiento de extracción y purificación de residuos de pesticidas volviéndolo efectivo y económico además de ser u producto fiable en un formato cómodo. 24 2.7.4. Técnicas de separación, identificación y cuantificación Una vez obtenido el extracto orgánico, la mezcla de pesticidas se separa analiza mediante métodos clásicos como gravimétricos y volumetría, además de métodos instrumentales como espectrometría y diversas formas de cromatografía. La identificación y cuantificación de los pesticidas se realiza con detectores selectivos que se encuentran acoplados al equipo. Las técnicas cromatografías permiten una aproximación eficiente en el análisis. (Rubinson & Rubinson, 2001) 2.7.5. Cromatografía de Gases La cromatografía de gases es de las técnicas analíticas de separación que ha experimentado un desarrollo espectacular desde sus inicios en los años cincuenta. En esta se hace pasar un analíto en forma gaseosa a través de la columna, arrastrado por una fase móvil gaseosa, llamada gas portador. En cromatografía gas líquido de reparto la fase estacionaria es un líquido no volátil que recubre la pared interior de una columna o un soporte sólido. En gas -solido de adsorción el analíto se adsorbe directamente sobre las partículas sólidas de la fase estacionaria. (Harris, 2003) Figura 2.14 Diagrama esquemático de un cromatografía de gases Fuente Requena, y otros, 2015 En la figura 2.14, se muestra un diagrama esquemático de un equipo de cromatografía de gases. Para el análisis de la muestra de un líquido volátil o de un gas se inyecta a través de un septo en un inyector caliente, en cuyo interior se evapora rápidamente. El vapor es arrastrado a través de la columna por el gas portador que puede ser helio, hidrógeno o nitrógeno los analítos se separan de acuerdo a su afinidad entre la fase estacionaria y la móvil, después de esta separación llegan al detector, cuya respuesta aparece en la pantalla de ordenador. 25 La columna y el detector deben estar lo suficiente calientes para que los analítos alcances en la columna la presión necesaria y se produzca una elución adecuada y en los detectores se encuentren en forma gaseosa. Sistema de inyección de la muestra La eficacia de la columna demanda un volumen adecuado de muestra. La inyección de muestras de volúmenes grandes conlleva un ensanchamiento de las bandas y una inadecuada resolución. En la figura 2-15 muestra un modelo de cámara de inyección para columnas empaquetadas. . Figura 2.15 Esquema de in inyector para columnas empaquetadas. Fuente :Requena, y otros, 2015 El uso de micro jeringas para la inyección de muestras a través del septum es el método más eficaz. La muestra se traslada a una cámara de vaporización instantánea ubicada en la cabeza de la columna. Gas portador El gas portador tiene la función de trasladar el analíto por la fase estacionaria, debe ser químicamente inerte además de no reaccionar con los analítos en estudio ni con la fase estacionaria de la columna, frecuentemente se utiliza el helio, el nitrógeno y el hidrógeno. La elección del gas portador queda establecida por el tipo de detector a utilizar y por la eficiencia de la separación. Siendo así el hidrógeno al tener la más baja viscosidad de todos los gases proporciona una mejor movilidad originando tiempos de análisis cortos, sin embargo es el helio el que suministra en la mayoría de los análisis las mejores resoluciones por ello es el más usado. La pureza es otro limitante en la elección del gas portador. Los hidrocarburos originan ruido en análisis reduciendo la sensibilidad y los límites de detección de la separación, las trazas de agua y el oxígeno suelen dañar la fase estacionaria en la columna. Es importante la correcta adaptación 26 de materiales necesarios para la incorporación de los gases al cromatógrafo (reguladores de presión, manómetros y caudalímetros). (MNCN, 2015) Columnas: Las columnas del GC se encuentran dentro de un horno de temperatura controlada. Por lo general, un extremo de la columna está unido al inyector y el otro extremo está unido al detector. Las columnas varían en longitud, diámetro y recubrimiento interno. (Trujillo, 2006) Cada columna está diseñada para su uso con diferentes compuestos por una fase estacionaria y de acuerdo a como está se encuentra dentro del su envase contenedor se clasifica en: Columnas empacadas: tienen de dos a tres metros de largo con un diámetro de 2 a 4 mm, se enrollan en espiral y se instalan dentro de un horno termostatizado. La fase empacada puede ser de dos clases :sólida, como la sílice gel y, líquida que va adherida a un soporte inerte que no intervine en la separación , así cuando la muestra es polar y la carga de fase liquida es baja , se debe desactivar completamente . Columnas capilares o tubulares abiertas: estas columnas contienen la fase estacionaria adherida a las paredes de un tubo dejando abierto el centro de la columna. Actualmente las más usadas son el tipo FSOT estas columnas se preparan cuidadosamente y requieren tratamientos de superficie para mejorar su desempeño. El propósito de la columna y del horno es separar la muestra inyectada en sus compuestos individuales a medida que pasa por la columna. Para contribuir a este proceso, el horno del GC. Puede programarse para acelerar el flujo de la muestra a través de la columna (Trujillo, 2006). Detectores: Los detectores identifican la presencia de compuestos cuando éstos salen de la columna. A medida que cada uno de los compuestos entra en el detector, se genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad de compuesto detectada. Esta señal se envía normalmente a un sistema de análisis de datos, como ChemStation de Agilent, donde aparece como pico de un cronograma. El GC 7890A de Agilent llevo un detector MS de cuadrupolo triple y ICP-MS). El requisito fundamental de un detector para CG es que su perfil de repuesta electrónica coincida con el perfil de concentración del analíto a la salida de la columna. Teóricamente el funcionamiento del detector no debe afectar el número de platos, los tiempos de retención ni las características del flujo. Dependiendo del uso que brinde (Trujillo, 2006) cada detector, se tiene la siguiente clasificación: 27 Detector de ionización de llama FID: funciona a partir de una llama de aire e hidrógeno que descompone las moléculas orgánicas produciendo iones que son atraídos hacia un electrodo cargado dando como resultado una corriente eléctrica. Detector de captura de electrones: se manipula casi de la misma forma que un contador proporcional para la medida de radiación X. El efluente de la columna pasa por un emisor β. Un electrón del emisor provoca la ionización del gas portador y la producción de una ráfaga de electrones de esto resulta una corriente constante entre un par de electrodos y esta señal se registra Detector de nitrógeno y fosforo o detector de emisión termoiónica: utiliza una boquilla y un colector semejante a los del FID, sin embargo el colector contiene una pequeña cerámica recubierta con sal alcalina colocada encima de la boquilla y calentada eléctricamente entre 600 y 800 °C . que Detector de fotométrico de llama (FPD):s detector específico para azufre y fosforo dado aquellos hidrocarburos que contienen estos elementos producen una especie quimioluminiscente en un quemador similar al FID. Conductor de conductividad eléctrica: funciona con base en el aumento de conductividad eléctrica en el agua desionizada , causada por electrolitos como NH3, HCl o H2S que son generados a partir de los analítos orgánicos originales. Detector de fotoionización (PID): basa su funcionamiento en la ionización de los componentes de la muestra por medio de una lámpara UV. Las partículas cargadas resultantes se detectan entre dos electrones con un potencial entre 50 y 200 V. Detector de emisión atómica (AED): permite la detección de cierto tipo de elementos con base en la radiación emitida por estos al regresar a su estado fundamental de energía después de haber sido excitados apropiadamente. Espectrómetro de masas (MSD): es considerado como un excelente detector, permite registrar los espectros de masas de los picos a medida que emergen de la columna. En el espectrofotómetro de masas de sector magnético, las moléculas vaporadas se bombardean con electrones rompiendo enlaces y produciendo la ionización de la molécula. La clase y cantidad de los fragmentos obtenidos son características de cada compuesto. 28 En la figura 2.16 tenemos un diagrama de un espectrómetro de masas. Figura 2.16 Espectrómetro de masas Fuente :Gómez,Santiago; Sierra , María Isabel, 2010 A continuación, los fragmentos con carga positiva se aceleran por medio de un campo magnético en una trayectoria curva cuyo radio depende de la raíz cuadrada de las masas iónicas. Al cambiar el campo magnético se logra que los iones de igual relación masa / carga lleguen sucesivamente al colector donde los iones se descargan produciendo una corriente que depende de la abundancia de los iones. Al registrar estas corrientes se obtiene el espectro de masas correspondiente al compuesto que género iones. 2.8 VALIDACIÓN Según la norma ISO 17025 que tiene por título Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración, define a la validación como “ la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico”. El alcance de la validación o la revalidación requerida dependerá de la naturaleza de los cambios hechos al aplicar un método a diferentes laboratorios, instrumentación, operadores y circunstancias en las cuales el método va a ser utilizado. Siempre es apropiado algún grado de validación, aun cuando se usan métodos aparentemente bien caracterizados ya sean de referencia o publicados. 29 Está implícito que los estudios para determinar los parámetros de aptitud del método se hacen usando equipamiento que funciona y que está calibrado correctamente, y contando con operadores competentes en el campo de trabajo y que posean el conocimiento suficiente. 2.8.1. Importancia de validar un método Es importante validar un método por cuanto esto permite a cualquier entidad asegurar los resultados que emite a la vez que se brinda al analista datos acerca de un método, sin contar con el hecho de que este procedimiento es una obligación profesional, hoy en día todo cliente espera confiar en los resultados analíticos. 2.8.2. Aplicación Un método debe validarse cuando sea necesario verificar que sus parámetros de desempeño son adecuados para el uso en un problema analítico específico. El laboratorio deberá validar: (ICONTEC, 2005) métodos no estandarizados métodos diseñados o desarrollados internamente métodos estandarizados usados fuera del alcance propuesto ampliaciones o modificaciones de métodos estandarizados cuando se realizan algunos cambios en los métodos no estandarizados ya validados. 2.8.3. Parámetros Para demostrar que un método es adecuado para la aplicación es preciso determinar algunos parámetros, estos difieren según el alcance del método de ensayo a validar. Los ensayos o mediciones realizadas (ASECAL, 2005) serán con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de: Selectividad Precisión Linealidad Robustez Sensibilidad Aplicabilidad Limites 2.8.4. La selectividad La selectividad (ASECAL, 2005) es el “grado en que un método puede cuantificar o cualificar al analíto en presencia de interferentes”. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en la matriz de interés. . 30 Una prueba de selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo de tres testigos , tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de concentración conocida del analíto de interés. Se deben comparar las lecturas (señales de medición) obtenidas para cada caso, y observar si existen variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o muestras con analíto. 2.8.5. Linealidad La linealidad es la capacidad de un método dentro de un determinado intervalo, de dar resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analíto que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio. Figura 2.17 Función respuesta o recta de calibrado. El rango lineal se puede realizar mediante un gráfico de concentración versus respuesta función respuesta o curva de calibración (figura 2.17) Se establece cada día con una cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de trabajos limpios de valor teórico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. Se recomienda incluir valores cercanos al cero y valores superiores al valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser establecido por el analista, se deben evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico es decir la pendiente (b), el coeficiente de correlación (r) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (a), según la ecuación 2.1 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 Ecuación 2.1 Ecuación de la recta de calibración 31 Dónde: y respuesta x concentración b pendiente de la curva a intersección con el eje, cuando x=0 rcoeficiente de correlación r2 coeficiente de determinación El valor de los coeficientes de correlación es muy importante debe ser igual o mayor a 0.999, esto indica que existe una relación lineal entre áreas de los picos y la concentración de cipermetrina. (ISPCH, 2010). Se efectúa la evaluación estadística de prueba t-student, como un indicador del modelo lineal en donde se espera que exista correlación significativa entre concentración vs señal. 2.8.6. Intervalo lineal Se ilustra en la figura 2-18 la definición del intervalo lineal de un método analítico, que va desde la concentración más pequeña a la que se puede realizar medidas cuantitativas (límite de cuantificación, LOQ) hasta la concentración en la que la curva de calibrado se desvía de la linealidad (límite de linealidad, LOL). LOQ= límite de cuantificación, LOL = límite de linealidad. Figura 2.18 Limites del intervalo lineal Fuente: Skoog, Douglas. 2001. 2.8.7. Sensibilidad La sensibilidad (ISPCH, 2010) es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de medición y el cambio en el valor de la cantidad objeto de la medición. 32 En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (b) de la recta de calibración. Figura 2.19 Intervalo lineal de un método analítico. Fuente: Skoog, Douglas. 2001. El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminación de los valores de concentración en base a la lectura. En figura 2.19, se puede observar que mientras más próxima al eje de las Y este la recta, significa que a ligeros cambios en las concentraciones esperadas habrá grandes variaciones en los resultados de las lecturas observadas [m2] En el caso de [m3] grandes cambios en la concentración no son significativos para la lectura. Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación de concentración determina una gran variación de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta instrumental frente a una determinada cantidad de analíto. En el tiempo, visualiza cómo se comporta el instrumento. 2.8.8. Límites Límite de detección (LOD): cuando se realizan mediciones a niveles bajos del analíto o de la propiedad relacionada, como en el análisis de trazas, es importante saber cuál es la concentración más baja del analíto o el valor de su propiedad relacionada, que puede detectarse confiablemente por el método. La importancia de determinar esto y los problemas implícitos, surgen del hecho que la probabilidad de detección no cambia repentinamente de cero a la unidad cuando se cruza un umbral. Los problemas han sido investigados estadísticamente con detalle y se ha propuesto una gama de criterios de decisión. Surgen confusiones adicionales debido a que no existe actualmente 33 un acuerdo universal sobre la terminología aplicada “valor mínimo detectable de la variable de estado definida” el cual en química se traduce como “concentración neta mínima detectable”. La IUPAC es cautelosa en el uso de “límite de detección” prefiriendo “valor (verdadero) mínimo detectable”. (Eurachem, 2005). Límite de cuantificación (LOQ): el límite de cuantificación se define como la magnitud mínima que puede estimarse con un nivel aceptable de exactitud. 2.8.9. Exactitud El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el “grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia”. Un criterio de aceptación adecuado de los límites es se expresa en la ecuación 2.2, donde LPM es límite máximo permisible (ISPCH, 2010) 𝐿𝑂𝐷 < 𝐿𝑂𝑄 < 𝐿𝑃𝑀 Ecuación 2.2 Criterio de aceptación adecuado de los límites Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una combinación de: precisión y veracidad. Precisión La precisión se podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. Estos factores permiten calcular la variabilidad dentro de cualquier tipo de proceso y determinar si esta variación es aceptable o no, se calcula como desviación estándar de los resultados (Manual Codex Alimentarius 18o Ed.). Existen varios métodos para realizar el estudio de repetividad y reproducibilidad pero el método ANOVA es el más exacto para calcular la variabilidad dentro de un proceso. Método de Análisis de Varianza (ANOVA): conocido también como análisis de varianza es el método más exacto para calcular la variabilidad debida a la interacción simultanea entre los diferentes factores que participan de un sistema de medición (Botero, Arbelaez, & Mendoza, 2007). Se analizan los datos obtenidos por un estudio en niveles. El análisis de varianza se calcula aplicando las fórmulas que se mencionan en la tabla 2.7. 34 Tabla 2.7 Ecuaciones para el análisis de varianza. Origen de Suma de las cuadrados variaciones Grados de libertad Promedio de los cuadrados Entre grupos SC inter r-1 * = Dentro de grupos SC intra n-r * = Total SC total n-1 * Fcal Valor crítico para F = F tabla Nota: F se distribuye según F con repeticiones (r), lecturas (n) y probabilidad al 99%. Fuente: (Conexionismo, 2015) Se utiliza la prueba estadística de F o F de Fisher-Snedecor que se considera como el cociente de la varianza entre grupos respecto a la varianza dentro de los grupos a lo que se llama Fcalculada, este valor se compara con cierto valor crítico o F critica que se encuentra en tablas y que servirá para evaluar las hipótesis formuladas. Hipótesis nula H 0: = Hipótesis alternativa H 1: > Normalmente en una validación se acepta debería aprobarse la hipótesis alternativa al cumplirse que y en caso contrario debería existir razones que lo justifiquen (ASECAL, 2005). Calculados los valores de F se verifica que si F calculada < F critica, se demuestra la linealidad entre los resultados obtenidos, no hay diferencia significativa y como conclusión el grupo es homogéneo. Con los datos de varianza se calculan la desviación de la repetividad ( , variabilidad total ( , coeficiente de variación de r , variabilidad intermedia , coeficiente de variación de R aplicando las fórmulas que se mencionan en la tabla 2.8. Se considera que por efectos aleatorios la variabilidad intermedia ; debe asumirse 35 = . Tabla 2.8. Ecuaciones para la determinación del coeficiente de repetitividad y reproducibilidad Parámetro =√ Desviación de la repetividad = Variabilidad intermedia = √ Variabilidad total Coeficiente de variación de r * = Coeficiente de variación de R* = + + *Nota: x =promedio de las mediciones por cada nivel. Repetibilidad (r): se estima mediante el coeficiente de variación de la repetibilidad (% CVr), es una medida de dispersión de la distribución bajo condiciones de análisis bajo donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método, en ítems de análisis idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador y utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se calcula dividiendo la desviación estándar de la repetibilidad para la media y por 100. Para esta investigación se registró las mediciones en seis niveles diferentes de concentración con 5 repeticiones bajo las mismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de tiempo) de un analíto en un material de referencia durante 4 días. Los criterios de aceptación son un % CVr < 12 % en análisis de pesticidas en alimentos (Gómez & Sierra, 2010) Reproducibilidad (R): se estima mediante el coeficiente de variación de la reproducibilidad (% CVR), es una medida de dispersión de la distribución de resultados de análisis bajo condiciones donde los resultados de los análisis se obtienen, con el mismo método, en ítems idénticos de análisis en distintos laboratorios, con diferentes operadores y usando distintos equipos. Se calcula dividiendo la desviación estándar de la reproducibilidad para la media y por 100. Se puede determinar registrando a lo menos 5 mediciones en días distintos, o en un mismo día cambiando a lo menos una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo intervalo de tiempo). Los criterios de aceptación son un % CVR reproducibilidad < 20 % en análisis de pesticidas en alimentos. (Gómez & Sierra, 2010) 36 Veracidad Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado. La veracidad puede ser determinada por el sesgo y la recuperación Sesgo: Desviación consistente de valores calculados a partir del valor verdadero, causada por errores sistemáticos a lo largo de un procedimiento. Se determina por medio de material de referencia se debe medir un analíto de concentración conocido y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Se espera que no exista diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa) Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del análisis, .permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extracción y la cantidad del analíto existente en la muestra original. La recuperación esta intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la muestra. Los porcentajes de recuperación de muestras fortificadas generalmente deben oscilar entre 95 – 105 %. Se recomienda realizar a lo menos 5 mediciones de cada uno en lo posible en niveles. Se debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibración del método, el LOD y el LMP establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor información posible respecto a la capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos valores críticos. 2.8.10. Incertidumbre La incertidumbre de una medición es el parámetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando. En este sentido, es importante que para un método validado o verificado por el laboratorio, se realice la determinación de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la medición presentes. Algunos de estos pueden ser evaluados por tipo. Para este fin el laboratorio realiza una evaluación de las incertidumbres tipo A y B que están presentes en el método. (CEM, 2008) Evaluación de incertidumbre tipo A: Evaluación de un componente por un análisis estadístico de los valores de mediciones obtenidos en condiciones de medición definidas, por ejemplo realizar varias mediciones en condiciones de repetibilidad. 37 Evaluación de incertidumbre tipo B: Evaluación de un componente incertidumbre de la medición realizada por otros medios distinto a los del tipo A. Ejemplos: La evaluación basada en la información, obtenidos a partir de un certificado de calibración. Esta metodología requiere que se identifiquen todas las posibles fuentes de incertidumbre asociadas con el proceso de medición y que se estime su valor. Los parámetros para la estimación de incertidumbre son: incertidumbre estándar, incertidumbre estándar combinada e incertidumbre expandida. Parámetros para la estimación de incertidumbre Incertidumbre estándar (u): cada componente de la incertidumbre (y‟), expresada como desviación estándar. Incertidumbre estándar Combinada (Uc): para el resultado y (Ley de propagación de errores) Incertidumbre expandida (U) Proporciona un intervalo dentro del cual se cree que está el valor del mesurando, cuando por razones de seguridad o salud se necesite expresar la incertidumbre con un alto nivel de confianza, se multiplica esta incertidumbre combinada por un factor de cobertura o seguridad (K). Componentes de la incertidumbre. La incertidumbre de un resultado puede originarse por diferentes causas, algunas de ellas son: • Inadecuada definición del mesurando • Muestreo • Efectos de la matriz e interferencias • Contaminación durante el muestreo o la preparación de la muestra • Incertidumbre de pesas y material volumétrico • Pureza de reactivos • Valores asignados a patrones y materiales de referencia • Calibración de equipos, etc. 2.8.11. Normalización de un método RAMOS Ramis, (2001. p 109) especifica que es una actividad colectiva que consiste en la elaboración, difusión y aplicación de normas referidas a situaciones repetitivas. Las normas son documentos con las siguientes características: Contiene aplicaciones técnicas. Son elaboradas por consenso entre las partes interesadas: fabricantes, administraciones públicas, usuarios y consumidores, centros de investigación, laboratorios de servicios etc. 38 Están basados en los resultados de la experiencia y el desarrollo tecnológico. Son aprobados por un organismo nacional, regional o internacional de normalización reconocido. Están disponibles al público. Las normas ofrecen un lenguaje común de comunicaciones entre las empresas, las administraciones, y los usuarios, proporcionando mecanismos de referencia en los que se fundamenta la confianza entre el cliente y el proveedor del servicio. 2.8.12. Acreditación de un laboratorio Es la acción llevada a cabo por una entidad independiente de las partes interesadas, por ejemplo una empresa de acreditación, mediante la cual se manifiesta que se dispone de la confianza adecuada en que un producto, proceso o servicio es conforme a una norma, los laboratorios analíticos prestan servicios, y como tales servicios pueden beneficiarse de las ventajas de la acreditación. Existe un gran número de empresas públicas y privadas, independientes y sin ánimo de lucro, reconocida en ámbitos nacionales y supranacionales, que desarrollan actividades de acreditación. Gran parte de las actividades de estas empresas consiste en certificar la adecuación de otras empresas incluyendo los laboratorios a las normas de gestión de calidad ISO 9001, 9002 y 9003. 39 CAPÍTULO III 3. METODOLOGÍA 3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN El presente trabajo fue una investigación de tipo científico – experimental se realizó en dos fases de ensayo en el laboratorio, una en la que se validó el método analítico y otra en la que se identificó y determinó la persistencia de cipermetrina en tomate de árbol. La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Alimentos Oferta de Servicios y Productos (OSP) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador. 3.2 PRIMERA FASE: validación del método para análisis de cipermetrina La intención principal de este documento es apoyar en la cuantificación de cipermetrina por cromatografía de gases utilizando el método QuEChERS mediante la implementación de la Norma Europea (EN 15662). 3.2.1 Linealidad Procedimiento Se realizaron 5 curvas de calibración con 5 niveles distintos de concentración (Gómez & Sierra, 2010): Se registró la señal obtenida en función de la concentración Se ha calculado con cada curva los siguientes parámetros: a Intersección b Pendiente R2 Coeficiente de determinación r Coeficiente de correlación Para el análisis estadístico de linealidad se calculó el valor promedio y la desviación estándar de a y b. Mediante el programa de excel (Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales); el valor de t exp con (n-2) grados de libertad y se comparó con el valor t de tablas para el nivel de confianza requerido (α=0.05), para dos colas, en este caso para un “n” que depende de los niveles de calibración. 40 Hipótesis: Hipótesis nula Ho: no existe correlación entre concentración vs señal Hipótesis alternativa Ha: existe correlación significativa entre concentración vs señal Se aprobará la hipótesis correspondiente tomando en cuenta la siente afirmación: T-calculado > t-tablas se rechaza la hipótesis nula Ho, siendo aceptada la Ha correlación lineal significativa al 95%. Calcular los criterios de aceptación y rechazo para la curva global. Se realizó un análisis de estimación lineal empleando Excel con los datos de concentración (ppm ) y áreas (ua) de las 5 curvas de calibración y se obtuvo los parámetros de la recta global de calibración siendo n número de total de observaciones (25) al 95% de confianza: Intersección a Pendiente b Desviación de a Sa Desviación de b Sb Coeficiente de correlación r Coeficiente de determinación R2 Error Tipo Syx Grados de libertad 3.2.2 n -2 Límites de confianza Procedimiento Se calculó los valores del límite superior de a (Lsup. a) y límite inferior de a ( Linf. a) utilizando las ecuaciones 3.1. Donde a es la ordenada origen, Syx error tipo de la curva global de calibración. Se calculó t ( gl = N -2) ;N =25. 𝐿𝑠𝑢𝑝. 𝑎 = 𝑎 + 𝑡𝑆𝑦𝑥 𝐿𝑖𝑛𝑓. 𝑎 = 𝑎 𝑡𝑆𝑦𝑥 Ecuación 3.1 Límite superior e inferior de la intersección (a) 41 Límite superior nivel estándar 1 ( 𝐶 𝐿𝑠𝑢𝑝 𝐶1 = 𝐿𝑠𝑢𝑝. 𝑎 + 𝑏 𝑥 𝐶 1 Ecuación 3.2 Límite superior concentración 1 ( Dónde: . . Límite inferior nivel estándar 1 ( 𝐶 𝐿𝑖𝑛𝑓. 𝐶1 = 𝐿𝑖𝑛𝑓. 𝑎 𝑏𝑥 𝐶1 Ecuación 3.3 Límite inferior concentración 1 ( Dónde: . . Se calcularon los límites superiores e inferiores por cada concentración de la curva de calibración y se graficaron los resultados. 3.2.3 Límite de detección. Procedimiento Se estimó el límite de detección (ua) con los parámetros de la curva global de calibración: intersección (a) y la desviación estándar de la intersección (Sa) y el valor de t de Student ( t ) con grados de libertad (n-2), aplicando la ecuación 3.4. 𝑳𝑶𝑫 = 𝒂 + 𝒕𝑺𝒂 Ecuación 3.4. Límite de detección (LOD) 42 Calculando la pendiente (b) de la curva global, utilizando la ecuación 3.5 se reportó los límites estimados estadísticamente en las unidades establecidas por el método (ppm). 𝐿𝑂𝐷𝑝𝑝𝑚 = 𝐿𝑂𝐷 𝑎 𝑏 Ecuación 3.5 LODppm 3.2.4 Límite de cuantificación Procedimiento Se estimó el límite de cuantificación (ua) con los parámetros de la curva global de calibración: intersección (a) y la desviación estándar de la curva (Syx) y el valor de t de Student (t) con grados de libertad (n-2) aplicando la ecuación 3.6. 𝑳𝑶𝑸 = 𝒂 + 𝒕 𝑺𝒚𝒙 Ecuación 3.6 Limite de cuantificación (LOQ) Calculando la intersección con el eje (a) y la pendiente (b) ;utilizando la ecuación 3.7 se reportó los límites estimados estadísticamente en las unidades establecidas por el método (ppm). 𝐿𝑂𝑄𝑝𝑝𝑚 = 𝐿𝑂𝑄 𝑎 𝑏 Ecuación 3.7 LOQppm 3.2.5 Exactitud Precisión: Repetibilidad (r) y reproducibilidad (R) Procedimiento Se analizaron seis niveles diferentes de concentración (0,2 ppm; 0,5 ppm; 0,8 ppm; 1.00 ppm; 1,5 ppm; 2,00 ppm) estimados en el intervalo de trabajo, cada nivel por quintuplicado. Se analizaron por medio de un ANOVA de un factor con Excel.. 43 Porcentaje de recuperación. Procedimiento Se analizaron de 10 muestras con concentración conocida ( valor esperado) y se registró la concentración medida (valor obtenido ) Se determinó la recuperación expresada en porcentaje aplicando la ecuación 3.8 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑥 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 Ecuación 3.8 Porcentaje de recuperación. Se reportó los datos de coeficiente de variación de r R , coeficiente de variación de y % recuperación como intervalos acompañado del análisis ANOVA considerando la uniformidad de grupos o niveles, se reporta el % CVR mas alto . Veracidad Sesgo Procedimiento Se calculo el valor promedio de las lecturas obtenidas̅̅̅̅ y su desvicion estándar (Sr med) Aplicando la ecuación 3.10 Se realizó una evaluación estadística de prueba t-student. Se calculó un t exp con (n-2) grados de libertad y se comprará con el valor t de tablas para el nivel de confianza requerido (α=0.05), en un análisis bilateral, en este caso para un “n” que depende de los numero de mediciones y xa corresponde al valor esperado 𝑡𝑒𝑥𝑝 = 𝑥 𝑥𝑎 𝑛 𝑆𝑟 𝑚𝑒𝑑 Ecuación 3.9 Prueba t-student Hipótesis Hipótesis nula Ho: no existe diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa) Hipótesis alternativa Ha: existe diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa) 44 Se comprobó la hipótesis correspondiente tomando en cuenta la siguiente afirmación Si el valor observado es: T-calculado < t-tablas se acepta la hipótesis nula Ho, no existe diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa) significativa al 95%. 3.2.6 Incertidumbre CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO A Incertidumbre por respuesta analítica (UFR) Procedimiento Se calculó el promedio de la desviación estándares o error tipo (̅ ) y pendiente (b), tomando en cuenta Syx y b de cada una de las 5 curvas de calibración aplicando la ecuación 3.10 y 3.11 : 𝑆𝑦𝑥 = 𝑆𝑥𝑦 + ⋯ + 𝑆𝑦5 5 Ecuación 3.10 Promedio de la desviación estándares o error tipo (̅ 𝑏̅ = 𝑏 ) + ⋯ + 𝑏5 5 Ecuación 3.11 Promedio de la pendiente ( Se calculó la desviación de la respuesta analítica (Sxy) a partir del error tipo ( ̅ pendiente ( ̅) aplicando la ecuación 3.12: 𝑆𝐹𝑅 = ̅̅̅̅̅̅ 𝑆 𝑦𝑥 𝑏̅ Ecuación 3.12 Desviación función de la respuesta analítica ( 45 ) ) y la Se tomó el valor de como incertidumbre de la ecuación global (u) aplicando la ecuación 3.13 en donde (n) es el número de observaciones realizadas para la determinación de linealidad (n=25) 𝑈 𝐹𝑅 = 𝑆𝐹𝑅 𝑛 Ecuación 3.13 Incertidumbre FR Incertidumbre por resolución del equipo (Ur) Procedimiento Con resolución de equipo (r-eqp) se calculó la u resolución aplicando la ecuación 3.14. donde como r-eqp se toma el valor del límite de detección. 𝑟 𝑒𝑞𝑝 𝑈𝑟 = Ecuación 3.14 Incertidumbre resolución del equipo Incertidumbre por reproducibilidad Procedimiento Se analizaron seis niveles diferentes de concentración (0,2) ppm; 0,5 ppm ; 0,7 ppm; 1.00 ppm; 1,5 ppm ; 2,00 ppm )estimados en el intervalo de trabajo, cada nivel por quintuplicado . Se analizaron las muestras por un mismo analista (analista 1) en 4 días diferentes Se calculó el % de recuperación para cada nivel y el promedio final. Se calculó la desviación estándar para cada nivel y se tomó el más alto en valor absoluto (SR). Se calculó la incertidumbre estándar promedio aplicando la ecuación 3.15 en donde (n) es el número de observaciones por nivel que se analizó. 𝑈𝑅 = 𝑆𝑅 𝑛 Ecuación 3.15 Incertidumbre estándar o de reproducibilidad 46 Incertidumbre por recuperación. Procedimiento Al momento de calcular el % de recuperación (Apartado 3.2.5 Exactitud. pág. 69) se determinó la incertidumbre por recuperación con la ecuación 3.16; la incertidumbre de las observaciones (u obs) conociendo la desviación estándar de las observaciones (S), número de observaciones (n) aplicando la ecuación 3.17. . La incertidumbre del patrón ( u mrc) con la ecuación 3.18. 𝑈 𝑟𝑒𝑐𝑝 = √𝑢 𝑜𝑏𝑠 + 𝑢 𝑚𝑟𝑐 Ecuación 3.16 Incertidumbre por recuperabilidad 𝑢 𝑜𝑏𝑠 = 𝑠 𝑛 Ecuación 3.17 Incertidumbre de las observaciones 𝑢 𝑚𝑟𝑐 = 𝑈 𝑈 = 𝑐𝑒𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 Ecuación 3.18 Incertidumbre del patrón CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO B Procedimiento Incertidumbre del peso de la muestra. Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%. Se calculó de incertidumbre atribuida al peso de la muestra aplicando la ecuación 3.19. 𝑈𝑝𝑚 = 𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎 𝐾 Ecuación 3.19 Incertidumbre por peso de la muestra 47 Cálculo de la incertidumbre del patrón ) Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración ( y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%. Se calculó de incertidumbre atribuida al estándar aplicando la ecuación 3.20 𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎 𝑈𝑚𝑟𝑐 = Ecuación 3.20 Incertidumbre del patrón (umrc) Cálculo de la incertidumbre por dilución U (FD). A partir de la ecuación 3.21 se calculó la u de incertidumbre por dilución, siendo u de material de dilución (u ), volumen total (vt), volumen aforado (Va) 𝑈 𝐹𝐷 = 𝑉𝑡 √𝑢 𝑢/𝑉𝑡 𝑉𝑎 +……+ 𝑢 𝑢/𝑉𝑎 Ecuación 3.21 Incertidumbre por dilución U (FD). Incertidumbre balón (10,5ml). Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración ( y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%. Se calculó de incertidumbre aplicando la ecuación 3.22. 𝑈𝑏𝑎𝑙𝑜𝑛 = 𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎 𝐾 Ecuación 3.22 Incertidumbre (balón) Incertidumbre micro pipeta (Umicrop). Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración ( y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%. 48 Se calculó de incertidumbre aplicando la ecuación 3.23. 𝑈𝑚 = 𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎 𝐾 Ecuación 3.23 Incertidumbre (micropipeta) CÁLCULO DEL INCERTIDUMBRE COMBINADA: Uc(y) Procedimiento Los valores de la incertidumbre tipo A como la de tipo B se encuentran en sus respectivas unidades (incertidumbre estándar). Se procede a volverlas adimensionales dividiendo las incertidumbres obtenidas por su factor correspondiente transformándolas a incertidumbres relativas, luego de esto se aplicó la ecuación 3.24. 𝑈𝑐 = 𝑢 𝑡𝑖𝑝𝑜 𝐴 𝐴 + 𝑢 𝑡𝑖𝑝𝑜 𝐵 𝐵 Ecuación 3.24 Incertidumbre CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (U) Procedimiento Calculando el resultado de la incertidumbre combinada estándar (uc) se pudo calcular la incertidumbre expandida (U) tomando K (factor de cobertura) aproximadamente K=2 para un nivel de confianza del 95%. Se calculó de incertidumbre expandida aplicando la ecuación 2.25: 𝑈 = 𝐾 𝑥 𝑢𝑐 Ecuación 3.25 Incertidumbre combinada estándar 49 3.3 SEGUNDA FASE Determinación de la persistencia de cipermetrina en muestras de tomate de árbol. Para la cuantificación de cipermetrina en muestras de tomate de árbol por el método de cromatografía de gases previamente validado, se trabajó con la siguiente población y muestra 3.3.1 3.3.2.1. Población y muestra. Población Esta investigación se realizó en una plantación ubicada en las coordenadas geográficas latitud 0.192069 y longitud -78.339190, proveedor para la COMPANIA LA FAVORITA S.A., ubicada en el barrio de Tababela, Parroquia del Quinche, Provincia de Pichincha. La parcela fue localizada por medio de equipo de posicionamiento satelital (GPS) como se muestra en la figura 3-1. Figura 3.1. Localización de parcela del cultivo de Tomate de árbol Fuente: Directorio Cartográfico de España 2014 50 3.3.2.2. Control de la siembra. El ensayo se desarrolló cuantificando los residuos de pesticida en una parcela modelo, sin control de factores ambientales simulando la situación real del cultivo. A la parcela se le dieron tres aplicaciones de pesticida, la primera y segunda fueron en los meses de noviembre y diciembre del 2012 y culminó en febrero del 2013. Las cosechas se realizaron 15 y 30 días después de cada fumigación, al cabo de 6 cosechas se culmina la recolección de la plantación. La información detallada acerca de la plantación se muestra en el anexo 3 3.3.2.3. Muestra analítica La obtención de las muestras se realizará representativa mediante un muestreo aleatorio simple los frutos deben cumplir con las siguientes características físicas: Enteros, sanos y exentos de podredumbre o deterioro que hagan que no sean aptos para el consumo así como de cualquier materia extraña visible. Exentos de plagas que afecten es aspecto general del producto Exentos de humedad anormal Ser de consistencia firme, tener aspecto fresco, tener piel brillante Encontrarse en el valor 4 a 6 de la escala de color del tomate para determinar su madurez (ver norma INEN 1 1909, Anexo 1) Procedimiento De Muestreo 3.3.2.4. Selección de las unidades de muestreo Para determinar el número de muestras que se debieron tomar por parcela total se tomó en cuenta el número de árboles que se habían sembrado en ella. La plantación poseía 2500 árboles de tomates ver tabla 3.1. Tabla 3.1. Relación entre el número de árboles a muestrear. N° de árboles /parcela total Relación N° Arboles a muestrear/ N° arboles parcela <150 1/3 150-250 1/5 251-450 1/9 451-750 1/15 751-1500 1/30 1501-2500 1/50 Fuente: (Legaz, . Serna, Ferrer, & Primo-Millo1, 1995). 51 Una vez determinada el número de árboles para tomar la muestra se procedió a la selección de los árboles en los que se efectuó el muestreo de los tomates. Estos se tomaran al azar procurando que estén suficientemente distribuidos y no se concentren en una determinada zona. El número total de árboles seleccionados para el muestreo de la parcela homogénea fue de 50 y de cada uno, se tomaron cuatro frutos por árbol, dando un total de 200 tomates, estos fueron tomados aproximadamente a la mitad de la altura del árbol y orientados en la dirección de los cuatro puntos cardinales. 3.3.2.5. Recolección y transporte de muestras. El trabajo de investigación se realizó durante los cuatro meses de noviembre del 2012 a febrero del 2013. Cada muestra fue adquirida aleatoriamente tomando en cuenta que cada fumigación cuenta con 2 cosechas (cada 15 días). Las muestras fueron envueltas en papel aluminio luego en fundas plásticas además de ser rotuladas con un número asignado dentro de la parcela con la respectiva fecha, número de cosecha y fumigación después fueron almacenados en culers, cubiertos y etiquetados. Una vez que las muestras llegaron al laboratorio se las sometió a un proceso de homogenización. Se formaron 20 subgrupos cada uno de estos tenía 10 tomates por medio de un sorteo seleccionamos 3 subgrupos, estos se designaron para el estudio de persistencia a los 0, 7 15, 22 y 30 días después de la fumigación. 3.3.2 Variables de investigación En la tabla 3.2 Se observa el detalle de las variables dependiente e independiente . Tabla 3.2 Variables dependiente e independiente VARIABLE INDEPENDIENTE VARIABLE DEPENDIENTE Fumigación 1 (F1) Número de fumigaciones Fumigación 2 (F2) Fumigación 3 Tiempo de evaluación (días) (F3) Concentración de Cipermetrina Día 2 (mg Cipermetrina/kg tomate) Día 8 Día 15* Día 22 Día 30* * Día de madurez optima del tomate de árbol y cosecha para destinarla a su venta. 52 3.3.3 Diseño experimental Para evaluar el efecto de las fumigaciones y los tiempos de cosecha en la concentración de cipermetrina de muestras de tomate de árbol de la parcela, se realizó un arreglo factorial A x B con replica. Dónde: Factor T = tiempo (Días) Factor F = fumigaciones (número de fumigaciones) n = número de repeticiones por fumigación-tiempo La matriz de datos se detalla en la tabla 3.3. Tabla 3.3 Matriz de datos para el análisis de cipermetrina en tomate de árbol. Tiempo (Días) Número de Fumigaciones (F) (T) Fumigación 1 Fumigación 2 Fumigación 3 1 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R3 R3 R3 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R3 R3 R3 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R3 R3 R3 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R3 R3 R3 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R3 R3 R3 8 15 22 30 53 La investigación conto con las siguientes hipótesis. Hipótesis: Con respecto a F (fumigaciones) = Ho: Ha: Con respecto a T (tiempo) = Ho: Ha: Con respecto a interacción FxT (tiempo) Ho: = Ha: Los datos fueron evaluados por el programa Microsoft Excel 2010, la tabla 3.4 muestra la metodología de análisis de datos, en un ANOVA de dos factores con replica o submuestreo. Tabla 3.4 Análisis de Varianza para dos factores con submuestras por grupo = FV ∑ SC Fumigaciones = GL ∑ ∑ GLA = a-1 CM Fcal* = (F) = Tiempo (T) = ∑ ∑ GLB = b – 1 = = Interacción = ∑ ∑ GLAB = (a-1) (b-1) = FxT Error = = GLEx = GLT – GLA – = GLB - GLAB Total GLT = (a x b x n ) - 1 = ∑ *Si la Fcal > Ftabulada(95% ó 99%) se considerada estadísticamente significativo al 95% o 99% Adaptado de: (Gutierrez Pulido & De la Vara Salazar, 2004) 54 Se aplicó la prueba de la diferencia mínima significativa (DMS) expresada en las ecuaciones 3.17 y 3.18 para la comparar entre medias de los factores fumigación y tiempo. .. 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐷𝑀𝑆−𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = 𝐹 𝑎 𝑔𝑙𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑥 𝐶𝑀𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑇𝑥𝑛 Ecuación 3.26 Valor DMS para fumigaciones 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐷𝑀𝑆−𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑇 = 𝑎 𝑔𝑙𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑥 𝐶𝑀𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝐹𝑥𝑛 Ecuación 3.27 Valor DMS para tiempo Dónde: = Valor tabulado al 95% que depende de: a = número de tratamientos de cada factor; glerror = determinados en el ADEVA. CME = Cuadrado medio del error experimental, determinado en el ADEVA F ó T = número de tratamientos de cada factor que influye significativamente en los resultados. n= repeticiones por muestra 3.3.4 Estudio de la persistencia de la cipermetrina Se evaluó el comportamiento cinético que posee la degradación de la cipermetrina en el tiempo de cosecha, de manera que se pueda conocer los días aptos de cosecha en los que el contenido de cipermetrina estén bajo los valores que exigen la normativa INEN 1 1909. Se utilizó la metodología de análisis de regresión lineal bajo las ecuaciones que se muestran en la tabla 3.5. En donde Q es el factor de estudio entre valores inicial ) y final , cinética de velocidad y es el tiempo. Tabla 3.5 Ecuaciones cinéticas Orden de reacción Ecuación cinética Cinética de orden cero = Cinética de primer orden = Cinética de segundo orden = Fuente: (Casp & Abril, 2003) 55 + es la la constante 3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICO En el procedimiento analítico para la determinación de pesticidas piretroides se tiene las siguientes etapas: 3.4.1. Análisis de la muestra. 3.4.1.1. Método La determinación se basó en el Método de la Norma Europea 15662 (Anexo 8), utilizando como técnica de extracción QUECHERS y como método de separación e identificación por Cromatografía de Gases, adaptado y validado en las condiciones de laboratorio del OSP de Alimentos que pertenece a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador. 3.4.1.2. Método de extracción QuEChERS para la determinación de pesticidas en tomate de árbol y su cuantificación por cromatografía de gases. La muestra se extrae con acetatonitrilo y por adición de sulfato de magnesio, de cloruro de sodio y de un tampón de sales de citrato. A continuación el extracto es purificado con ayuda de un aminoadsorbente (SPE) y sulfato de magnesio. El extracto final puede ser utilizado directamente para los análisis de determinación por GC/MS y LC/MS-MS. 3.4.1.3. Equipos – materiales y reactivos. Equipos • Cromatógrafo de gas Agilent 5975C Series GC/MSD • Sistema de detección MSD • Computadora -Software • Balanza analítica de apreciación: 0,1 mg • Centrifuga Hettich • Licuadora Oster • Generador de Hidrógeno, Marca Perkin Elmer Materiales. • Pipetas automáticas de volumen variable (100μl a 1ml) • Tubos de ensayo • Probetas de vidrio de 10 • Viales para cromatografía color ámbar de 2 ml. • Cuchillo con mango de plástico negro 56 Reactivos • Acetato de etilo: Pureza 98.5%, Grado HPLC, Marca Registrada EM SCIENCE, Merck KGaA, Darmstdt, Alemania. 3.4.1.4. • MgSO4 , NaCl , NaCitrato , citrato disodico , PSA ,carbón activado. • CIPERMETRINA 20 % Preparación de la muestra Según el manual Kits Agilent SampliQ QuEChERS( Anexo 8) el proceso de extracción se realiza de acuerdo a la Norma Europea 15662 Versión 2007-10 – 24, alimentos de origen vegetal. Determinación de residuos de pesticidas utilizando GC-MS y/o LC-MS (/MS) seguido de extracción/ división de acetonitrilo y método de purificación dispersiva SPE-QuEChERS. (CEN.EU). Esta norma la elaboró la Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR). Según la norma se mencionan dos etapas que son: Extracción por método QuEChERS.- Anadir 2 g de producto triturado en un tubo de extracción de 2 ml, añadir 10 ml de acetonitrilo como solvente de extracción. Se añade 1 g de MgSO4, 0,5 NaCitrato, 0.5 g citrato disodico sesquihidratado estas sales y ácidos, tamponados mejoran le eficacia de la extracción y protegen compuestos sensibles cerrar herméticamente agitar a mano durante 30-60” y centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el material sólido. Limpieza de la muestra .Tomar un 1 ml del sobrenadante y mezclarla con 0,15 g PSA, con 0.9g MgSO4 y 15 mg de carbón activado. Agitar a mano durante 30” y centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el material sólido. Transferir con pipeta volumétrica 1 ml de sobrenadante a un vial para inyector. 3.4.2. Análisis cromatografíco Uno de los objetivos de esta investigación fue analizar la influencia de los diversos parámetros instrumentales en la identificación y cuantificación de cipermetrina en tomate de árbol. 3.4.2.1. Condiciones La cipermetrina fue cuantificada mediante cromatografía gaseosa con un espectrómetro de masas. El uso y manejo del equipo se describen en el instructivo correspondiente (Instructivo de uso y manejo de equipo cromatógrafo de gases). 57 Las condiciones instrumentales para la cuantificación de cipermetrina en las muestras de tomate de árbol se recogen en la tabla 3.6. Tabla 3.6 Condiciones cromatografías establecidas para la cipermetrina. Detector Gas portador Espectrómetro de masas Agilent Technologies modelo serie 5975 Helio con un flujo constante de 1 ml/min Inyector Se inyectó 1 µl de muestra en modo splittles a150ºC. Columna Columna capilar: HP-5 (5% Fenil. Metil Siloxano) de 30 m de longitud, diámetro interno de 320 µm y espesor de película de 0,25 µm Rampa de horno Inicial 50ºC durante 2 min. 1 A continuación, 10 °C / min hasta los 200 °C durante 8 minutos 2 A continuación, 10 c / min hasta 270 °C durante 8 min Tiempo de lectura Identificación 40 min espectros de masas registrados en la biblioteca espectral El equipo de análisis fue un cromatógrafo Agilent 5975C Series GC, equipado con un detector de masas (MSD) y un sistema de inyección automática como se muestra en la figura 3.2, El Programa informático fue Agilent MSD Productivity ChemStation distribuida conjuntamente con el quipo Figura 3.2 Cromatógrafo Agilent 5975C Series GC 58 3.4.3. Aplicación del método. Los valores de concentración son interpolados y se obtiene la concentración correspondiente a mg /L de cipermetrina. Este análisis es realizado en el equipo de cromatografía y los resultados se obtienen de directamente en ppm, concentración en mg cipermetrina /Kg de tomate. 3.4.4. Diagrama de flujo general de la investigación. La figura 3.3 muestra el diagrama de flujo del procedimiento para la determinación de cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de árbol. Añadir 2 ml de acetonitrilo como solvente de extracción. Añadir 2 g de producto triturado en un tubo de extracción de 50 ml ácidos, tamponados mejoran le eficacia de la Se añade 1 g de MgSO4, 0,5 NaCitrato ,0.5 g citrato disodico Extracción de la muestra Agitar a mano durante 30-60”. Centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el material sólido Tomar un 1 ml del sobrenadante Mezclarlo con 0,15 g PSA, con 0.9g MgSO4 Limpieza de la Muestra Agitar a mano durante 30” Centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el Limpieza de la Muestra material sólido. Transferir con pipeta volumétrica sobrenadante a un vial para inyectar 1 ml de Análisis de la muestra Figura 3.3 Determinación de cipermetrina en muestras de tomate de árbol. 59 CAPÍTULO IV 4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS 4.1 PRIMERA FASE: VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA ANÁLISIS DE CIPERMETRINA De acuerdo al objetivo 1.2.2.1 se planteó las condiciones adecuadas de columna, temperatura y gases necesarios para el método cromatográfico, al igual que se plantearon las condiciones necesarias para realizar la extracción del analíto. Para lo cual a continuación se indicarán los resultados obtenidos en las lecturas de los estándares, usando el método cromatográfico. 4.1.1. Análisis de resultados para la obtención de las curvas de calibración de cipermetrina Registro de resultados para la obtención de las curvas de calibración de cipermetrina. Tabla 4.1 Datos experimentales para la obtención de curvas de calibración de cipermetrina Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Concentración Área Área Área Área Área (ppm) (ua) (ua) (ua) (ua) (ua) Promedio Desviación Sensibilidad Estándar analítica 0,2 176012 175985 179470 178780 179985 178046 1917,754 92,841 0,5 341061 351002 345963 336590 331002 341124 7810,359 43,676 1,0 679902 671002 689992 700835 699925 688331 12892,557 53,390 1,5 1110689 1177296 1159925 1113132 1177296 1147668 33414,265 34,347 2,0 1499200 1477296 1457489 1504669 1557489 1499229 37573,615 39,901 Pendiente 746214,7 748382,6 735262,9 748853,5 787439,1 Intersección -14690,54 -7801,73 -1894,41 -12006,49 -29797,24 R 0,998 0,996 0,997 0,998 0,997 R2 0,996 0,991 0,994 0,997 0,994 En la tabla 4.1 se presentan las áreas obtenidas que identifican los picos de cipermetrina y en el análisis de estándares a 5 niveles de concentración, las áreas de las lecturas están expresadas en (Ua), de la misma manera se muestran los valores de pendiente (b), intersección con el eje (a), R2 correspondiente a cada curva de calibración; se indica también la desviación estándar y la sensibilidad analítica. Se grafican las cinco curvas y se obtienen las ecuaciones correspondientes a cada una de ellas según la ecuación 2.1. 60 A continuación se indican las gráficas de las 5 curvas de calibración realizadas para el método Señal (ua) cromatográfico. Curva 1 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 1,5 2 Concentración (ppm) y = 746215x - 14691 R² = 0,9957 Figura 4.1 Curva de calibración Nº1. Método cromatográfico Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de tendencia de la gráfica. Curva 2 1600000 1400000 Señal (ua) 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 Concentración (ppm) 1,5 2 y = 748383x - 7801,7 R² = 0,9915 Figura 4.2 Curva de calibración Nº2. Método cromatográfico Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y tendencia de la gráfica. 61 corresponde a la línea de Curva 3 1600000 1400000 1200000 Señal (ua) 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 1,5 2 y = 735263x + 1894,4 R² = 0,994 Concentración (ppm) Figura 4.3 Curva de calibración N3º. Método cromatográfico Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de tendencia de la gráfica. Curva 4 1600000 1400000 1200000 Señal (ua) 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 Concentración (ppm) 1,5 2 y = 748854x - 12006 R² = 0,9967 Figura 4.4 Curva de calibración Nº4. Método cromatográfico Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y tendencia de la gráfica. 62 corresponde a la línea de Curva 5 1800000 1600000 1400000 Señal (ua) 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 1,5 2 y = 787439x - 29797 R² = 0,994 Concentración (ppm) Figura 4.5 Curva de calibración Nº5. Método cromatográfico Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de tendencia de la gráfica. En las figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4,5 se muestra las curvas de calibración individuales de cipermetrina, con las respectivas ecuaciones lineales (ecuación 2.1) y el coeficiente de determinación r2 que en cada curva es r2 > 0.99, este valor demuestra la linealidad del método y la correlación entre la concentración y señal. Se calcularon las concentraciones de los estándares con las ecuaciones de la recta obtenidas en cada curva de calibración: Tabla 4.2: Concentraciones obtenidas de las curvas de calibración No Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Calculada Calculada Calculada Calculada Calculada (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) 1 0,2 0,22 0,22 0,25 0,22 0,19 2 0,5 0,44 0,46 0,47 0,43 0,38 3 1 0,89 0,89 0,94 0,92 0,85 4 1,5 1,47 1,56 1,58 1,47 1,46 5 2 1,99 1,96 1,98 1,99 1,94 63 Luego de haber obtenido las ecuaciones correspondientes a cada curva de calibración en la tabla 4-1, se pudo calcular las concentraciones corregidas de cipermetrina en (ppm), usando la ecuación de la recta indicada en la ecuación 2-1, se reemplazaron las lecturas de las áreas en y para despejar x. De esta forma los resultados se indican en la tabla 4-2. Tabla 4.3: Valores de desviación estándar de a y b, coeficiente de determinación (r2) y error típico (Syx) Pendiente Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Desviación Estándar (Sb;Sa) 28464,574 r2 Syx 0,996 b 746214,747 a -14690,537 34954,682 41562,177 b 748382,627 40103,957 0,991 a -7801,732 49247,921 58557,271 b 735262,871 33021,623 0,994 a 1894,415 40550,769 48216,093 b 748853,546 25037,867 0,997 a -12006,488 30746,663 36558,715 b 787439,081 35313,860 0,994 a -29797,244 43365,650 51563,073 La tabla 4.3 indica los valores obtenidos para las pendientes (b), la ordenada al origen(a) con sus respectivas desviaciones estándares (S). Además se encuentra el error tipo S (yx) de las curvas que representa la incertidumbre por curva de calibración, es decir el grado de dispersión de los datos respecto al valor esperado. Tabla 4.4: Análisis de las curvas de calibración de cipermetrina Curvas Intersección a (ua) Pendiente b (mg ua/Kg) Valor R2 1 -14690,54 746214,7 0,996 2 -7801,73 748382,6 0,991 3 -1894,41 735262,9 0,994 4 -12006,49 748853,5 0,997 5 -29797,24 787439,1 0,994 Promedio Desviación estándar (σ) -13238,082 4773,376 0,998 9338,79 306074,63 0,003 -76,2475268 t calculada T tablas 64 2,44691185 La tabla 4.4 indica los valores de la pendiente (m) que representa la sensibilidad del método, como se sabe a mayor sensibilidad, factor importante al efectuar nuevas calibraciones. Al realizar la Prueba t a dos colas en donde t calculado > t tablas, se acepta la hipótesis alternativa Ha , que menciona que existe una correlación significativa entre concentración vs señal Curva global de calibración Tabla 4.5: Ecuación de la curva global Ecuación 2.1 y= a + bx Intersección (a) -12480 Pendiente (b) 753231 Valor R2 0,995 41757 Syx La tabla 4-5 indica los datos obtenidos del análisis de estimación lineal correspondiente a la ecuación de la curva global, para obtener esta ecuación se usaron los datos de áreas (ua) y concentraciones (ppm) de las 5 curvas de calibración indicadas en la tabla 4-1. Se observa los datos de pendientes (m) que representa la sensibilidad del método, la ordenada al origen (a) que está relacionado con el error sistemático propio del método, además se encuentra el error típico Syx que representa la incertidumbre de calibración, es decir el grado de dispersión de los datos respecto al valor esperado. 4.1.2. Límites de confianza Los valores del límite superior de a (Lsup. a) y límite inferior de a (Linf. a) utilizando las ecuaciones 3.1. Tabla 4.6: Valores para a y considerados para los intervalos de confianza a L sups. L inf. 73900.97 -98861.6 65 Los datos de la tabla 4-6, se indican los valores de límite superior e inferior de la ordenada (a), estos valores se tomaron para obtener los limites superior e inferior según las ecuaciones 3.2 y 3.3. Tabla 4.7 Limites de confianza C L sup. L inf. 0.2 224547,1111 51784,4844 0,5 450516,2833 277753,6566 1.0 827131,5704 654368,9437 1.5 1203746,857 1030984,231 2.0 1580362,144 1407599,518 Los datos de la tabla 4-7 indican los valores de límite superior e inferior de la ordenada (a) en cada nivel de la curva de calibración. A continuación se representan en la figura 4.6 los límites de confianza acompañados de la ecuación de la curva global de calibración. Límites de confianza y curva de global de calibración 2500000 y = 753231x - 12480 R² = 0,9952 Área (ua) 2000000 LS 1500000 Curva global 1000000 LI Lineal (Curva global) 500000 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentración Figura 4.6 Límites de confianza y curva global de calibración. 4.1.3. Límite de detección (LOD) Tabla 4.8 Límite de detección del método Límite de detección (ua) Límite de detección (ppm) 20009 0,04 0,02 Señal del blanco (xb) 66 La tabla 4.8 indica los valores obtenidos para el límite de detección del método de acuerdo a las ecuaciones 3.4 y 3.5. Además se observa la media de las lecturas del ruido o señal del blanco (Anexo 5) que muestra que no hay interferencia con el valor del límite de detección. 4.1.4. Límite de cuantificación (LOQ) Tabla 4.9 Límite de cuantificación del método Límite de cuantificación (ua) Límite de cuantificación (ppm) 73901 0,12 La tabla 4.9 indica los valores obtenidos para el límite de cuantificación del método de acuerdo a las ecuaciones 3.6 y 3.7. En las tablas 4.8 y 4.9 se presentan los límites de detección y cuantificación respectivamente, al tomar en cuenta la consideración al LMP que se menciona en la página 33. podemos indicar que se cumple con los parámetros de validación. 𝐿𝑂𝐷 < 𝐿𝑂𝑄 < 𝐿𝑀𝑃 4𝑝𝑝𝑚 < 𝑝𝑝𝑚 < 𝑝𝑝𝑚 4.1.5. Precisión Tabla 4.10 Datos experimentales para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad. Niveles 1 2 Valor Teórico ppm 0,2 0,5 Día 1 Dia2 Día 3 0,21 0,19 0,20 0,21 0,20 0,20 0,21 0,19 0,20 0,21 0,20 0,20 0,19 0,20 0,19 0,20 Promedio Total 0,20 0,21 0,20 0,21 0,201 0,53 0,52 0,50 0,48 0,48 0,47 0,49 0,49 0,52 0,47 0,46 0,47 0,48 0,50 0,50 0,51 Promedio Total 0,47 0,54 0,51 0,50 0,49 67 Día 4 Tabla 4,10 Datos experimentales para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad. Continuación. Valor Teórico ppm Niveles 0,8 3 4 1,0 5 1,5 2 6 Día 1 Dia2 Día 3 Día 4 0,71 0,71 0,70 0,71 0,71 0,71 0,72 0,71 0,71 0,72 0,72 0,71 0,73 0,70 0,71 0,72 Promedio Total 0,71 0,73 0,73 0,72 0,715 1,00 1,01 1,02 1,02 1,00 1,01 1,00 1,02 1,10 1,00 1,03 1,01 1,02 1,00 1,00 1,00 Promedio Total 1,00 1,01 1,00 1,01 1,013 1,53 1,49 1,53 1,48 1,49 1,51 1,54 1,53 1,50 1,51 1,49 1,53 1,52 1,53 1,51 1,53 Promedio Total 1,51 1,51 1,49 1,52 1,513 2,00 2,00 2,00 2,00 2,01 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 Promedio Total 2,001 Nota: repetibilidad (r); reproducibilidad (R). Por niveles y por días. Los cálculos que se presentan a continuación deben realizarse por cada nivel que consta en la tabla 4.10. Tabla 4.11 Análisis ANOVA para nivel N °1 concentración 0,2 ppm. Elaborada según tabla 3.1. Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados 0,000180 3 0,0000600 0,000800 16 0,0000500 0,00098 19 F cal Valor crítico para F 1,2000 3,238 Dentro de los grupos Total En la tabla 4.11 se observa tenemos F, cal < F tabulada tablas esto demuestra la linealidad entre los resultados obtenidos, no hay diferencia significativa y como conclusión el grupo es uniforme. Se igual manera se observa los valores propósitos de la validación. 68 y cumple con los Tabla 4.12. Reproducibilidad (R) expresados en coeficiente de variación.. Valores Parámetros Desviación de la repetividad 0,0071 Variabilidad intermedia 0,0000 Variabilidad total 0,0072 Coeficiente de variación de R(%CVr) 3,51 Coeficiente de variación de R(%CVR) 3,52 En la tabla 4 .12 reporta los datos obtenidos por reproducibilidad (R) expresados en coeficiente de variación para nivel N °1 concentración 0,2 ppm. Cálculo de recuperación para nivel N °1 concentración 0,2 ppm Se determinó la recuperación expresada en porcentaje aplicando la ecuación 3.9. bl = bl = x 5 Tabla 4.13. Parámetros de aceptación para el método por precisión. Parámetro %CvR %CVr Nivel 1 0,2 ppm 3,52 3.51 Nivel 2 0, 5 ppm Nivel 3 0,7 ppm Nivel 4 1,0 ppm Nivel 5 1,5 ppm Nivel 6 2, ppm 2,36 2.26 1,13 1.13 0,74 0,70 0,67 0,66 0,39 0,39 % Recuperación 100,50 98,90 102,07 100,60 99,60 99,93 Test GRUPO GRUPO GRUPO GRUPO GRUPO GRUPO ANOVA UNIFORME UNIFORME UNIFORME UNIFORME UNIFORME UNIFORME En la tabla 4.13 se reporta los datos de coeficiente de variación de Repetitividad , coeficiente de reproducibilidad (% CVr) y % recuperación como intervalos acompañado 69 del análisis ANOVA considerando la uniformidad de grupos o niveles, obteniendo un criterio de control para la validación. Tabla 4.14. Datos para el cálculo del sesgo X= 0.7 ppm Cipermetrina Mediciones n 1 2 3 4 5 Xa s u U Concentración ppm 0,68 0,69 0,69 0,69 0,70 0,69 0,01 0,003 0,002 Valor t t exp. -0,0003557 t tablas 2,4708068 En la tabla 4.13 se observa el análisis de t. Por t-exp < t-tablas se acepta la hipótesis nula Ho, no existe diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa) significativa al 95%, obteniendo un criterio de control para la validación. 4.1.6. Incertidumbre. CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO A Tabla 4.15. Incertidumbre por respuesta analítica (uFR). U DE FR Curvas Desviación estándar (Sxy) Pendiente (b) 1 41562,17708 746214,7467 2 58557,27129 748382,6266 3 48216,09334 735262,8705 4 36558,71485 748853,546 5 51563,07308 787439,0807 X 47291,46593 753230,5741 SFR 0,062784846 U FR 0,013 En la tabla 4.15 se observan los cálculos de obtención de la incertidumbre por respuesta analítica (UFR) calculada a partir de la ecuación 3.13. 70 Tabla 4.16. Se Incertidumbre por resolución del equipo (Ur) . Resolución Ur ppm 0,04 0,012 En la tabla 4.16 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por resolución del equipo (Ur) calculada aplicando la ecuación 3.14. Tabla 4.17. Incertidumbre por reproducibilidad (UR) SR UR ppm 0,0117 0,0026 En la tabla 4.17 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por reproducibilidad calculada aplicando la ecuación 3.15. Tabla 4.18. Incertidumbre por recuperación (U recp) u obs ,ppm u mrc, ppm U recp 0,003 0,115 0,013 % En la tabla 4.18 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por recuperación calculada aplicando la ecuación 3.16. CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO B Tabla 4.19. Incertidumbre del peso de la muestra (Upm) U balanza, mg U recp 0,005 2,5x10-4 En la tabla 4.19 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por peso de muestra calculada aplicando la ecuación 3.19. 71 Tabla 4.20. Cálculo de la incertidumbre del Patrón u mrc Umrc 0,03 0,087 En la tabla 4.20 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por el estándar calculada aplicando la ecuación 3.20. Tabla 4.21 Cálculo de la incertidumbre por dilución U (FD). Vt ml Va ml u balón ml u micropipeta, ml 10 5 0,05 1,0x10-3 0,01 En la tabla 4.21 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por dilución calculada aplicando la ecuación 3.21. Tabla 4.22 Incertidumbre balón (10, 5ml). Balón ml u, certificado U, balón 5 0,025 0,215 10 0,075 0,375 Tabla 4.23 Incertidumbre micropipeta (Umicrp). u pipeta, ul Umicrop 0,001 0,0005 En las tablas 4.22 y 4.23 se observan los cálculos de obtención de la incertidumbre por precisión de material volumétrico y por la micropipeta calculada aplicando la ecuaciones 3.22, 3.23. 72 Tabla 4.24 Cálculo de la incertidumbre combinada (Uc) y la expandida (U) COMPONENTE Unidades UFR ppm U Resol. pm U. mrc % Factor U U Estándar Relativa U2 2 0,013 0,006 3,942E-05 0,2 0,012 0,058 3,333E-03 0,150 0,087 7,500E-03 0,010 0,010 1,002E-04 VOLÚMEN AFORO Factor de dilución peso de la muestra g 2 0,00025 0,000125 1,563E-08 pipeta ul 100 0,0005 0,00001 0,010 V balón 10ml ml 10 0,0375 0,004 1,406E-05 V balón 5ml ml 5 0,125 0,025 6,250E-04 REPRODUCIBILIDAD ppm 2 0,0026 0,001 1,719E-06 RECUPERACION ppm 0,7 0,013 0,019 3,632E-04 MUESTRA ∑ 2,2 E-02 Uc 0,15 C1 (curva) ppm 0,2 Uc (ppm) 0,030 ppm U 0,06 ppm En la tabla 4.24 se observa el cálculo de obtención para incertidumbre combinada y expandida aportada al método aplicando las ecuaciones 3.24 y 3.25. El informe de validación se presenta en el anexo 7. 73 4.2 SEGUNDA FASE: DETERMINACIÓN DE LA PERSISTENCIA DE CIPERMETRINA EN MUESTRAS DE TOMATE DE ÁRBOL. 4.2.1 Registro de resultados para la determinación de cipermetrina en tomate de árbol (Solanum betaceum Cav). Tabla 4.25. Datos obtenidos en el estudio del contenido de cipermetrina en los tomates de árbol Fumigación Fumigación 1 Fumigación 2 Fumigación 3 Días R1 R2 R3 Promedio Desv. (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) Estándar 1 0,73 0,71 0,69 0,71 0,02 8 0,48 0,48 0,61 0,52 0,08 15 0,26 0,26 0,21 0,24 0,03 22 0,19 0,25 0,21 0,22 0,03 30 0,15 0,13 0,17 0,15 0,02 1 0,91 0,86 0,94 0,90 0,04 8 0,6 0,65 0,72 0,66 0,06 15 0,38 0,42 0,46 0,42 0,04 22 0,23 0,29 0,33 0,28 0,05 30 0,18 0,2 0,19 0,19 0,01 1 0,98 0,94 0,91 0,94 0,04 8 0,71 0,75 0,64 0,70 0,06 15 0,37 0,39 0,32 0,36 0,04 22 0,27 0,29 0,29 0,28 0,01 30 0,25 0,24 0,23 0,24 0,01 En la tabla 4.25 se presentan los resultados obtenidos en el estudio del contenido de cipermetrina en ppm en los tomates de árbol, luego del análisis de cromatografía de gases. Los datos encontrados se ilustran para su mejor interpretación en la figura 4.7. Concentracio cipermetrina (ppm) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 Fumigación 1 0,50 Fumigación 2 0,40 Fumigación 3 0,30 0,20 0,10 Tiempo (días) 0,00 0 15 30 Figura 4.7 Comportamiento de la concentración de cipermetrina en el tiempo luego de cada fumigación 74 La figura 4.7 muestra como el contenido de cipermetrina en tomates de árbol va disminuyendo en el tiempo después de cada fumigación. Para evaluar la diferencia significativa o no del tiempo y de las fumigaciones sobre la concentración se realizó el análisis estadístico que a continuación se detalla. 4.2.2 Análisis estadístico Tabla 4.26. Análisis de varianza para dos factores con submuestras por grupo. Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados Tiempo 2,762 4 0,690 Fumigaciones 0,147 2 0,074 Valor crítico Valor crítico para F para F (95%) (99%) 4.018 414,83** 2,690 5,390 44,22** 3,316 Interacción: Tiempo x fumigaciones 0,042 8 0,005 3,183** Error 0,050 30 0,002 F calculada 2,266 3,172 Total 3,001 44 **Existe una diferencia estadísticamente significativa con un nivel del 95,0% y 99,0% de confianza. 4.2.2.1 Con respecto a los días: En la tabla 4.26 se muestra la información del análisis de varianza, se observa que existe un efecto altamente significativo del tiempo sobre la concentración de cipermetrina en los tomates luego de la fumigación, debido a que la F calculada tiene un valor de 414,83 que es mayor a la Fcrítica tanto para el 95% cómo para el 99%, lo que indica que el tiempo de cosecha es un factor clave a ser tomado en cuenta para evaluar el contenido de cipermetrina que será dirigido a la comercialización, y que cumpla los valores permitidos por la INEN 1 1909 Se acepta entonces la Ha, la que menciona que el cambio en el contenido de cipermetrina entre los días es significativamente diferente. Se evaluó entonces que días después de la fumigación son diferentes entre sí, con el uso de la prueba DMS. La tabla 4.27 muestra los rangos obtenidos para dicho factor 75 Tabla 4.27. Pruebas de Rangos Múltiples de DMS para cipermetrina en ppm por días. Días Casos Media contenido de cipermetrina (ppm) Valor DMS 30 22 15 8 1 9 9 9 9 9 0,193 0,261 0,348 0,633 0,852 0,039 0,039 0,039 0,039 0,039 Grupos Homogéneos E D C B A Cómo se observa los datos proporcionan 5 grupos diferentes entre sí, es decir que el contenido de cipermetrina es diferentes en cada día, a un nivel d significancia del 95%, de manera que durante el periodo de estudio no existe una fase estacionaria en el cambio de concentración de cipermetrina. 4.2.2.2 Con respecto a las fumigaciones: El número de fumigaciones ejerce un efecto altamente significativo sobre la concentración de cipermetrina pues la F calculada tiene un valor de 44,22 que es mayor a la F crítica tanto para el 95% cómo para el 99%, lo que da cuenta que la concentración de cipermetrina en los tomates de la misma parcela es diferentes, al realizar la segunda y tercera fumigación, que provoca un aumento de la concentración inicial de cipermetrina y que al tiempo de cosecha este contenido sobrepase los niveles permitidos en la norma después de la segunda y tercera fumigación, lo que no asegura que después de cada una de ellas las concentraciones de cipermetrina se mantengan a niveles adecuados. El análisis de rango múltiples de DMS mostró los siguientes resultados que se detallan en la tabla 4.28 Tabla 4.28. Pruebas de Rangos Múltiples para cipermetrina en ppm por fumigación. Fumigación Casos Media Concentración Valor DMS cipermetrina (ppm)/ Grupos Homogéneos fumigación Fumigación 1 15 0,377333 0,0304 Fumigación 2 15 0,490667 0,0304 A Fumigación 3 15 0,505333 0,0304 A 76 B Según el análisis de rango múltiples se observan dos grupos homogéneos A y B, el grupo A está conformado por las fumigaciones 2 y 3, donde las concentraciones de cipermetrina entre los días no se diferencian significativamente entre sí, pero dichas fumigaciones provocan un incremento significativo de la concentración de cipermetrina después de la primera fumigación, lo que provocará posteriormente que en los días de cosecha el contenido final de cipermetrina no cumpla con la normativa. Esto permite presumir que al momento de preparar la solución de pesticida sea acorde a la concentración final luego de la primera fumigación, de manera que el contenido de la segunda y tercera aplicación sean aditivas a los residuos de la fumigación anterior. Tras ellos se acepta la Ha la que menciona que el contenido de cipermetrina es diferente luego de cada fumigación. 4.2.2.3 Con respecto a la interacción entre fumigaciones y tiempo Con respecto a la interacción fumigación x tiempo se observa un efecto significativo sobre la concentración de cipermetrina, debido a que la F calculada tiene un valor de 3,18 que es mayor a la F crítica tanto para el 95% cómo para el 99%, lo que indica que la concentración de cipermetrina está influenciada por el tiempo y el número de fumigaciones, confirmándose al análisis anterior, pues lo óptimo debería ser que únicamente se vea afectada por el tiempo y no por el número de fumigaciones. Debido a los resultados anteriormente mencionados, se evaluó la cinética de degradación de cipermetrina para poder establecer los días óptimos de cosecha, en los que la concentración de cipermetrina sea menor a 0,2ppm, así como predecir el contenido final de cipermetrina al finalizar los 30 días de cosecha, de manera que la preparación de la solución de cipermetrina para la segunda fumigación no adicione pesticida a niveles que irrespeten la norma. En primero instancia se comparó cada dato obtenido con el valor normado en la INEN 1 1909 como máximo, obteniéndose los resultados que se muestran en la figura 4.8. 77 Comparacion del contenido de cipermetrina con respecto a la norma INEN 1 1909 Concentracio cipermetrina (ppm) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 Fumigación 1 0,50 Fumigación 2 0,40 Fumigación 3 0,30 Limite permitido INEN 0,20 0,10 0,00 0 15 30 Tiempo (días) Figura 4.8 Comparación del contenido de cipermetrina en el tiempo y el número de fumigación con respecto a lo establecido por la INEN 1 1909 La figura 4.8 muestra cómo la degradación de la cipermetrina en la primera fumigación en la primera cosecha dada a los 15 días incumplen la normativa establecida en la INEN 1 1909, lo contrario sucede a los 30 días de cosecha, donde la concentración de cipermetrina cumple con la normativa. Lo mismo sucede con la fumigación 2, mientras que con la fumigación 3, en ninguno de los dos días de cosecha (15 y 30 días) el contenido de cipermetrina cumple con la normativa establecida. Por ello se debe considerar en primera instancia que la concentración inicial de cipermetrina a ser aplicada en la fumigación debe ser menor a la que actualmente se coloca. 4.2.2.4 Resultado del análisis sobre el cumplimiento del LMP para cipermetrina en tomate de árbol Tabla 4.29 Residuos de cipermetrina en muestras de cosecha Fumigación F1 F1 F2 F2 F3 F3 Tiempo días 15 30 15 30 15 30 Cosecha 1 2 1 2 1 2 Tratamiento T3 T5 T8 T10 T13 T15 Cipermetrina ,ppm Contenido LMP residual INEN 0,27 0,15 0,35 0,2 ppm 0,19 0,46 0,25 En la tabla 4.29 se registran las concentraciones medias de cipermetrina para cada tratamiento de cosecha en negrita las cosechas que no cumplen con la norma INEN 1 1909. 78 4.2.2.5 Cinética de degradación Según la tabla 3.7 de la pág. 54 se evaluó la cinética de degradación para la cipermetrina en frutos de tomate de árbol en la primera aplicación por observarse ya en está un alto contenido de cipermetrina que excede el valor permitido por la norma. Los cálculos permitieron determinar que se ajusta a una cinética de segundo orden, donde el coeficiente de correlación de Pearson (r) fue de 0,9787 y el coeficiente de determinación (R2) fue del 0,9572, la figura 4.9 muestra la linealización de la cinética. Cinética de degradación cipermetrina en la fumigacion 1 1/concentración cipermetrina (1/ppm) 7 6 y = 0,1829x + 0,9618 R² = 0,9572 5 4 Cinética de degradación cipermetrina 3 Lineal (Cinética de degradación cipermetrina) 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (días) Figura 4-1: Linealización de la degradación de cipermetrina bajo una cinética de segundo orden. La ecuación 4.5 describe el comportamiento de degradación de la cipermetrina: 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑐𝑖𝑝𝑒𝑟𝑚𝑒𝑡𝑟𝑖𝑛𝑎 = 96 8 + 8 9×𝑡 Ecuación 4.1 Comportamiento de degradación de la cipermetrina De esta manera se procedió a estimar la concentración de cipermetrina en tomates de árbol destinados a la venta en el momento de su fumigación y en la primera y segunda cosecha, el tiempo en el cual el contenido de pesticida disminuiría a niveles permisibles así como la concentración que debió ser aplicada en la primera fumigación, de manera que permita al producto cumplir con los parámetros establecidos por la INEN 1 1909. 79 El contenido de cipermetrina aplicada en la primera fumigación se calcula en 1,04 ppm que disminuye a 0,27 ppm en la primera cosecha, se estimó además que el tiempo en el cual el producto alcanzaría la concentración máxima residual es de 22 días llegando a la segunda cosecha con un contenido de pesticida de 0,16 ppm. La concentración que se debe preparar es de 0,44 ppm, con la que se asegura que en la primera cosecha la concentración de cipermetrina en los tomates no exceda los 0,2 ppm y la concentración final sea de 0,16 ppm en la segunda cosecha. Posteriormente se debe aplicar en la segunda y tercera fumigación soluciones de 0,28 ppm para evitar un incremento de la concentración de cipermetrina. . 80 CAPÍTULO V 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1. Conclusiones PRIMERA FASE VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA ANÁLISIS DE CIPERMETRINA En la presente investigación se establecieron las condiciones óptimas para el método de Cromatografía de Gases/detector de masas MSD condiciones de columna capilar: HP5 ( 5% Fenil. Metil Siloxano) de 30 m de longitud, diámetro interno de 320 µm y espesor de película de 0,25 µm; temperatura límite: - 50ºC a200ºC; temperatura de 270ºC, un flujo de helio de 1 ml/min, con un volumen de inyección de 0,1µl modo splittles a150ºC. Y las condiciones necesarias para la preparación de reactivos y tratamiento previo de las muestras tomate de árbol. A través del desarrollo de los parámetros de validación establecidos, se establece que el método para la determinación de cipermetrina por cromatografía de gases con detector MDS puede ser validado por el método de la Norma Europea 15662 en un intervalo de trabajo bajo de 0,12 ppm y alto de 2 ppm. Los parámetros establecidos para la determinación de cipermetrina fueron: Límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ), linealidad y exactitud, establecida por repetibilidad (r), reproducibilidad (R), recuperabilidad. A partir del análisis del límite de detección (LOD) 0,04 ppm, el método es capaz de detectar cantidades mínimas cipermetrina, siempre que estén sobre dicha concentración, el límite de cuantificación (LOQ) 0,12 ppm de esta forma se estableció que el método es capaz de cuantificar con precisión y exactitud aceptables concentraciones iguales o mayores que la dicha concentración. Se comprobó el cumplimiento de la linealidad del método por su valor del coeficiente de determinación r2 > 0,99. Existe repetibilidad y reproducibilidad en el método de determinación de cipermetrina para los rangos altos y bajos con un % 3,59 y un % CVr de 3,53 valores que se encuentra dentro de los límites aceptables de 20 y 12 % respectivamente. 81 La exactitud del método analítico cumple con los parámetros y criterios de aceptación teniendo un rango de recuperación del 95 -105 %, indicado por el MRC utilizado. La incertidumbre del método está dada por la U expandida de ±0,06 ppm. SEGUNDA FASE: DETERMINACIÓN DE LA PERSISTENCIA DE CIPERMETRINA EN MUESTRAS DE TOMATE DE ÁRBOL. La parcela en estudio se localizó en una zona ampliamente conocida como productora de tomate de arbol, esto conlleva que este producto abastesca a una gran cantidad de mercados de Quito . El ensayo se desarrolló cuantificando los residuos de pesticida en una parcela modelo, sin control de factores ambientales a la cual se le dieron tres aplicaciones de pesticida, la primera fue en el mes de noviembre del 2012 y culminó en febrero del 2013. La AOAC recomienda utilizar la técnica QuEChERS para la cuantificación de pesticidas en alimentos, por lo tanto esta investigación se acogió a las recomendaciones de este organismo adaptando el método a las necesidades del laboratorio de analisis. Para la determinación cuantitativa de cipermetrina se estableció como método de análisis el propuesto por la Norma Europea (EN 15662), utilizando como técnica de separación la cromatografía de gases . Dicho metodo fue adaptado y validado en las condiciones del Laboratorio de Analisis de Alimentos que pertenece a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, en el Cromatógrafo de gas (GC) AGILENT TECNOLOGIES. Se determinó cipermetrina en un cultivo de tomate de árbol durante tres meses, mediante un muestreo completamente al azar. Cada muestra fue adquirida aleatoriamente en cada una de las tres fumigaciones en un intervalo de tiempo de 0, 7 15, 22 y 30 días después de la aplicación, en total se obtuvierón 15 tratamientos con tres repeticiones. Para comparar el contenido de cipermetrina en tomate de árbol obtenido de las lecturas de las muestras recolectadas, se realizó una gráfica en la cual se pudo observar que la concentración decayó en función del tiempo. Para estudiar este comportamiento se realizó 82 un análisis de varianza de dos factores con tres muestras por grupo, en el cual se analizaron las fumigaciones, los tiempos después de cada aplicación y la interacción entre ellos. Al evaluar los resultados obtenidos por el el análisis de varianza de las lecturas obtenidas ese determinó que existe un efecto altamente significativo del tiempo sobre la concentración de cipermetrina en los tomates luego de la fumigación, debido a que la Fcalculada tiene un valor de 414.83 que es mayor a la F crítica tanto para el 95% cómo para el 99%, por ello el tiempo de cosecha se consideró como un factor clave a ser tomado en cuenta para evaluar el contenido de cipermetrina en tomate dirigido a la comercialización, y que cumpla los valores permitidos por la INEN 1 1909. Con el uso de la prueba DMS se obtuvo los rangos A, B, C, D y E por contenido de cipermetrina a los largo de los cinco días de análisis, a un nivel d significancia del 95%, por lo que se concluyó que durante el periodo de estudio no existió una fase estacionaria en el cambio de concentración de cipermetrina a lo largo del tiempo. Con respecto a las fumigaciones, el análisis de varianza muestra que existe un efecto altamente significativo del número aspersiones sobre la concentración de cipermetrina en los tomates, debido a que la Fcalculada tiene un valor de 44,22 que es mayor a la Fcrítica tanto para el 95% cómo para el 99%, por ello el número de cosechas se consideró como un factor clave a ser tomado en cuenta para evaluar el contenido de cipermetrina en tomate dirigido a la comercialización, y que cumpla los valores permitidos por la INEN 1 1909. Con el uso de la prueba DMS para fumigaciones se observó los rangos homogéneos A y B, la fumigación 1 se encuentra en el rango B siendo la que contiene mayor concentración de cipermetrina (0,37 ppm) mientras las fumigaciones 2 y 3 se encuentran en el mismo rango A debido a la concentración residual es semejante entre ellas: 0,49 ppm y 0,5 ppm respectivamente. Es por ello que la concentración de cipermetrina entre ellas no produjo una diferencia significativa alta en el análisis de varianza. Al estudiar conjuntamente la acción de fumigaciones y tiempo se observó un efecto significativo sobre la concentración de cipermetrina, debido a que la Fcalculada tuvo un valor de 3,18 que es mayor a la Fcrítica tanto para el 95% cómo para el 99%, por esta razón se concluye que la concentración de cipermetrina está influenciada por el número de fumigaciones y el tiempo. 83 Las fumigaciones 2 y 3 provocaron un incremento significativo de la concentración de pesticida después de la primera aplicación, lo que ocasionó posteriormente que en los días de cosecha el contenido final de cipermetrina no cumpla con la normativa. Esto permite concluir que, al momento de preparar la solución de pesticida, su concentración debe calcularse tomando en cuenta la cantidad residual existente luego de la primera fumigación, esto debido que su valor final es aditivo. De la misma manera se estudió los 6 tratamientos de cosecha considerados como aptos para el consumo (días 15 y 30) y se determinó que únicamente dos de ellos cumplen con el LMP de 0,2. ppm. Puede indicarse entonces que, para el caso en estudio, producción de tomate de árbol que ha utilizado las técnicas de aplicación no cumplió con la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1 1909:2009 Frutas Frescas Tomate de árbol (Requisitos). El estudio de la cinética aplicado a la primera fumigación permitió determinar que se ajusta a una cinética de degradación de segundo orden, donde el coeficiente de correlación de Pearson (r) es de 0,9787 y el coeficiente de determinación (R2) es de 0,9572. Según lo anterior el contenido de cipermetrina aplicada en la primera fumigación se calculó en 1,04 ppm que disminuyó a 0,27 ppm en la primera cosecha, se estimó además que el tiempo en el cual el producto alcanzaría la concentración máxima residual es de 22 días llegando a la segunda cosecha con un contenido de pesticida de 0,16 ppm. 5.2. Recomendaciones Como se puede observar, en este trabajo se pudo estimar la concentración de cipermetrina en tomates de árbol destinados a la venta en el momento de su fumigación y en la primera y segunda cosecha, tiempo en el cual el contenido de pesticida se consideró disminuiría a niveles permisibles, además de la concentración que debió ser aplicada en la primera fumigación, en estas condiciones podría considerarse que el producto llegue a cumplir con los parámetros establecidos por la INEN 1 1909, sin embargo es pertinente indicar algunas recomendaciones importantes: El modelo encontrado para la determinación de la cinética de degradación de cipermetrina puede aplicarse para calcular las concentraciones residuales de este pesticida, a partir de la ecuación generada, por ejemplo, se pudo estimar que la concentración inicial para la primera fumigación debía ser 0,44 ppm para que en la primera cosecha el valor máximo residual llegase 0,2 ppm y a la segunda cosecha fuese de 1,6 ppm. Después de este 84 tratamiento se puede fumigar con soluciones de concentración de 0,28 ppm, de esta forma se puede considerar que segunda y tercera fumigación no generen una acumulación de esta molécula en valores resuduales superiores a los establecidos en la norma. Se recomienda continuar con la investigación analizando totas las cosechas que se dan a lo largo del periodo productivo de la parcela que es de 6 meses, tomando en cuenta las caracteristicas ambeintales de la zona. Se sugiere el uso de un invernadero como una alternativa para controlar los factores ambientales lo que deriba en beneficios desde el punto de vista fitosanitario. Tanto para controlar plagas y enfermedades y por consuguiente contenido de pesticidas . También es recomendable implementar un sistema de control para residuos de pesticidas en los lugares de producción, así se podría hacer un estudio más amplio de esta problemática. 85 6. BIBLIOGRAFÍA Pesticides News . (Diciembre de 1995). 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Fecha de trasplante: Diciembre 2011 Inicio de la cosecha: Noviembre 2012 Vida económica: 4ños Estacionalidad de la cosecha: disponible todo el año Técnica de cultivo Características del terreno: terreno plano alejado de vertientes o fuentes hídricas Preparación del terreno: con acceso a riego e incorporación de materia orgánica Trazado de la plantación: La plantación tiene una forma rectangular y su dimensión es de una hectárea Hoyado: 20 x 20 x 20 cm Fertilización de fondo: abono orgánico desinfectado con cal al 40% Podas: NO Deshierbado: si Manejo integrado de plagas Nombre Nombre Tratamiento Principio común científico Producto activo Chinche de Lrgtoglossus RAMBLER cipermetrina las flores y zonatus 200 EC dosis Periodos 0,6 Cada mes ml/Litro del fruto 99 ANEXO 4 . Hoja de seguridad química –cipermetrina 100 101 102 103 104 ANEXO 5.- Cromatógrama del blanco (ruido) Lectura: Blanco 4 Ion M/C Método: Cromatografía de Gases. Muestra :Tomate de árbol ( productos vegetales con bajo contenido de grasa ) X = mg/Kg (ppm) A: ua . Blanco 1 Lectura ppm 0,02 2 3 0,02 4 0,02 5 6 0,03 7 ND 8 0,02 9 0,02 10 0,02 x 0,02 0,02 0,02 105 Anexo 6 Cromatógrama cipermetrina Lectura: Concentración 1.0 ppm. Ion M/C Método: Cromatografía de Gases. Muestra :Tomate de árbol ( productos vegetales con bajo contenido de grasa ) X = mg/Kg (ppm) A: ua . 106 ANEXO 7 Registró de validación de métodos PESTICIDAS – CIPERMETRINA RESUMEN DE VALIDACION Método Cromatografía de Gases Analíto Cipermetrina Matriz Tomate de árbol ( productos vegetales con bajo contenido de grasa ) Unidades mg/Kg (ppm) LIMITES Limites Valor Unidades Detección 0,04 mg/Kg (ppm) Cuantificación 0,12 mg/Kg (ppm) Recuperación % En cada nivel entre 80 % a 110 % INCERTIDUMBRE valor Porcentaje Acumulada 0,03 0,3% CUMPLE Expandida 0,05 0,05% CUMPLE CRITERIOS DE ACEPTACION O RECHAZO % SDr ≤ 12 % Menor al 5 % en todos los niveles CUMPLE Reproducibilidad % SDR ≤ 20% Menor al 5 % en todos los niveles CUMPLE Repetibilidad Incertidumbre ≤ 30 % en todos los Total intervalos válidos CUMPLE 0.3% CUMPLE Recuperabilidad Linealidad 95 -105 % 0,995% 105 0,99 CUMPLE El método de análisis de CIPERMETRINA en tomates de árbol ha cumplido con todos los criterios de aceptación por lo que el método se considera como validado 107 ANEXO 8.- Manual kits AGILENT QUECHERS 108 ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación. 109 ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación. 110 ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación. 111 ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación. 112 ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación. 113 ANEXO 9. Certificación de traducción 114
