UFSC CC V LABFITOP ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PLANTAHONGOS PATOGÉNICOS Marciel J. Stadnik Preguntas? > Respuestas Cual órgano y tejido es infectado por el hongo? Como ocurre la infección? directa o indirecta? Cuales células del huésped son colonizadas? (epidermis, mesófilo, etc.) Cuáles son los mecanismos involucrados con la defensa de la planta contra el hongo? Clase I - conceptos stadnik@cca.ufsc.br Clasificación de hongos: Cuanto a la relación parasitaria: Parásitos obligados: Ciclo de vida ocurre exclusivamente en el tejido vivo del huésped Parásitos no obligados Saprófitos facultativos Patógenos facultativos Clasificación de hongos Cuanto a las relaciones nutricionales (Luttrell,1974): Necrotrófico (Pertotrofico): patógeno mata las células do huésped antes de colonizarlas Alternaria spp. Hemibiotrófico: patógeno forma inicialmente una asociación con células vivas del huésped, y mas tarde se vuelve necrotrófico Ex: Colletotrichum spp. Biotrófico: patógeno se nutre de tejido vivo Oídios, Rojas Características organismos biotróficos estructuras de infección altamente desarrolladas baja actividad de enzimas líticas camadas interfaciales que separan las membranas plasmáticas del hongo y planta mecanismos de supresión de defensa del huésped haustórios (Mendgen & Hahn, 2002). 1 Modo de infección y colonización Rojas (biotróficos del mesófilo) Rojas (basidiomycota) Oídios (ascomycota) Colletotrichum lindemuthianum y Colletotrichum gloeosporioides = presentan diferentes tipos y grados de desarrollo biotrófico. Uromyces appendiculatus Formación de apresório en respuesta a características topográficas Allen et al. (1991) Roja de la soja (Phakopsora pachyrhizi) Penetración directa ! Microscopía de luz Tests in vitro sobre papel celofán Koch et al. (1983) 2 Análisis inmunocitológicas y geles Padrón de expresión de ARD1 - Arabitol Desidrogenase (A) Representación de las estructruras de infección de la roja: 1, uredósporo (SP); 2, tubo germinativo (GT) 4 h después de la germinación; 3–6, estructuras de infección in vitro en estadíos siguientes: 3, apresório (AP) (6 h); 4, vesícula subestomatal (SV) (12 h); 5, hifa de infección (IH) (18 h); 6, célula-madre haustorial (HM) estadío (21 h); 7, haustório (HA); 8, hojas infectadas; 9, no infectadas (estructuras 2–6 obtidas in vitro).; NB, gola do pescoço; EM, matriz extrahaustorial. (B) Gele de agarosa (C) Northern blot de geles descritos en (B). Link et al. (2005) Oídios (biotróficos de la epidermis) Blumeria graminis Proceso de infección de Blumeria graminis MICROSCOPÍA DE FLUORENCIA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE VARREDURA COMPUESTOS FENÓLICOS SUPERFICIE Microscopia de fluorescencia (MF) Luz incidente 100 a 400nm Filtro antes de la lente objetiva permite apenas el pasaje de luz excitada Componentes autofluorescentes (ex. compuestos fenólicos) Fluorocromos como sondas En materiales fijados y no fijados Proteínas fluorescentes (expresadas o microinyectadas) en células vivas. 3 Técnicas microscópicas para la evaluación de anastomosis conidial Electron microscopy Live‐cell imaging Labelling Scanning Staining Transmission GFP Carboxy‐DFDA DiCO6 Calcofluor White DAPI Electron microscopy Spores collected by touching a 15-day old culture with nylon hybridisation membrane, or fixed and mounted directly from de bean pod. Live-cell imaging 1- Staining - Conidia collected from 7-16 old cultures and suspended in water (1x106 conidia/mL)→ inoculate PDB in slide culture chamber. - Incubated for 24h,48 and 72h. - Calcofluor White(0,12 M)→ for cell wall DAPI→ for nuclei DiCO6 → for mitochondria Carboxy-DFDA → for vacuoles - Inverted microscope equipped with blue diode and argon ion lasers Microscópio óptico & GUS e GFP Expresión génica a nivel celular mediante el uso de genes repórteres visualmente detectables GUS (β-D-glucoronidasa) Marcadores histoquímicos y genes repórteres Son introducidos em el hongo de interés. Amuestras son colectadas y colocadas para reaccionar con el substrato de GUS(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-Dglucorónido (X-GlcA) → precipitado azul http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4 0/fulltext.pdf 2- Labelling with GFP - Protoplast obtained from young mycelia in NaCl as osmotic stabilizer - Incubation of protoplasts for 3h with Lyzing Enzymes. - Tranformation of protoplasts with the plasmid pMF357 which carried hH1-sgfp gene and hph gene for hygromycin resistance - Mixture transfered to regeneration agar and hygromycin B - Conidia obtained from transformants were spread onto PDA containing hygromycin. - Single conidia expressing hH1-sFGP were selected using a fluorescence stereo microscope with GFP filter set 4 Metodología básica Propidium iodide (nuclei) DAPI (nuclei) Carboxy‐DFDA (vacuoles) Calcofluor White (cell walls) DISCOS FOLIARES hH1 ‐GPF SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN Metodologia SOLUCIÓN PARA CLAREAMENTO Stadnik e Buchenauer (2000): 1) Colecta de discos de tejido foliar después de la inoculación 1) Solución I: (etanol/ácido acético glacial; 3:1, v/v) para fijación y clareamento de los tejidos. - 24 -48 h/ cambios de soluciones 2) Solución II: lactoglicerol (ác. lático, glicerol y agua) para continuar el clareamento y conservación. 4) Visualización al microscopio óptico (hasta 3 meses) Puntos importantes: - Conducción con máximo cuidado para evitar el desprendimiento de esporas adheridos suavemente en las hojas. - Las estructuras del hongo son teñidas con azul de anilina en lactofenol (0,1%) o Coomansie blue o tripan blue. - El porcentaje de germinación, la formación de apresórios y la penetración son evaluados sobre cada disco foliar, observando-se 100 esporas/disco. Crecimiento del hongo in planta Weigel e Glazebrook (2002) Incubación con solución de coloración (azul de tripan 2,5 mg/mL em lactofenol + 2 volúmenes de etanol) a 100°C por 1 min. Resfriar el material por 1 h a temperatura ambiente. Fitopatologia Brasileira, 31 (supl.) 79-80, 2006 Detección de la reacción de hipersensibilidad en Arabidopsis Incubar en solución de diaminobenzidina (1 mg/mL) por 8 h Weigel e Glazebrook (2002) Decoloración en etanol 100% por 3h. Solución de conservación (glicerol 70%) Incubar por 12 h y substituir la solución de clareamento por glicerol 70%. Incubar por 6 h y substituir la solución de clareamento por una nueva. Remover la solución de coloración y adicionar cloral hidratado (2,5 g/mL). 5 Detección de la reacción de hipersensibilidad en poroto Hϋckelhoven (1999) Fotos: Crecimiento del hongo in planta Plantas inoculadas con una gota de 10uL de una suspensión de esporas de A. brassicicola (106 conídios/mL) Evaluación realizada a los 4 dias después de la inoculación Conservación en ácido láctico: glicerol: agua (1:1:1, v/v/v) Decoloración en ácido tricloroacético 0,15% p/v; en etanol: clorofórmio (4:1) Solución de diaminobenzidina (1mg/mL) Foto: Reacción de hipersensibilidad Metodología básica DISCOS FOLIARES SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN Desarrollo biotrófico de los oídios SOLUCIÓN PARA CLAREAMIENTO Técnicas histoquímicas Johansen (Capítulo IX) Clareamiento y tinción de los tejidos A 6 Tipos de haustórios Oídio del Pepino Podosphaera xanthii Hemibiotróficos Hemibiotróficos (dos “faces” de un patógeno) Colletotrichum lindemuthianum (Colletotrichum lindemuthianum) Antracnose del frijol 7 Colletotrichum lindemuthianum (24 hai) Colletotrichum gloeosporioides (48 hai) Colletotrichum gloeosporioides Manzano ? 8