UNIVERSIDAD VERACRUZANA
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA TESIS: “DETERMINACIÓN DE FLORA MICROBIANA EN VÍAS RESPIRATORIAS ALTAS DE DELFINES NARIZ DE BOTELLA (Tursiops truncatus) CAUTIVOS EN CANCUN, Q.R.” QUE PARA OBTENER EL TITULO DE MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: ARTURO MIGUEL NOGUEIRA MORALES ASESOR: MVZ NICOLAS A. DE MIGUEL VALERA H. VERACRUZ, VER A ABRIL DEL 2003. 2 INDICE 1.- INTRODUCCIÓN_______________________________________3 2.- JUSTIFICACIÓN________________________________________6 3.- ANTECEDENTES_______________________________________6 4.- OBJETIVO GENERAL___________________________________ 7 5.- OBJETIVOS PARICULARES______________________________7 6.- HIPÓTESIS_____________________________________________8 7.- MATERIAL Y METODOS_________________________________9 7.1.- TOMA DE MUESTRAS_______________________________9 7.2.- AISLAMIENTO_____________________________________10 7.3.- OBSERVACIÓN_____________________________________10 7.4.- IDENTIFICACIÓN___________________________________ 10 8.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN______________________________11 8.1.-TABLA 1 Y GRAFICO 1 _______________________________12 8.2.-TABLA 2 Y GRAFICO 2 _______________________________13 8.3.-TABLA 3 Y GRAFICO 3 _______________________________14 9.- CONCLUSIONES_________________________________________15 10.- BIBLIOGRAFÍA_________________________________________16 11.- ANEXOS_______________________________________________18 11.1.-ANEXO 1 __________________________________________18 11.2.-ANEXO 2 __________________________________________19 11.3.-ANEXO 3 __________________________________________20 11.4.-ANEXO 4 __________________________________________21 3 A LA MEMORIA DE MIS QUERIDOS ABUELOS SRA. BLANCA LILIA DEL ROSARIO MORALES HERNÁNDEZ. (Q.E.P.D.) “ MADRE ADORADA, INFINITAMENTE TE DOY LAS GRACIAS POR DERRAMARNOS TODO EL AMOR DE TU INMENSO CORAZON, LOS ULTIMOS AÑOS DE TU VIDA” SR. FACUNDO NOGUEIRA JIMÉNEZ. (Q.E.P.D.) “ABUELO: SIEMPRE SERAS EJEMPLO DE SERIEDAD, FORTALEZA, HONESTIDAD Y TRABAJO, CUALIDADES QUE ALGUNOS IGNORAN Y QUE REPRESENTAN TU MEJOR HERENCIA” “ ALGUN DIA NOS VOLVEREMOS A ENCONTRAR” 4 “TAMBIEN DEDICO ESTE TRABAJO A MIS PADRES: SRA. LILIA PATRICIA MORALES MORALES Y EL SR. ARTURO NOGUEIRA MATIANO, GRACIAS POR TODO SU APOYO A PESAR DE TODO” “A MI ABUELO EL SR. MIGUEL MORALES GONZALEZ, QUE SIN SU AYUDA NO HUBIERA SIDO POSIBLE LA REALIZACIÓN DE ESTE PROYECTO” “A MI QUERIDO HERMANO: DENEB EDUARDO NOGUEIRA MORALES, QUIEN CON SU SONRISA HA VENIDO A ALEGRAR LOS MOMENTOS MAS DIFÍCILES Y CON LA LUZ DE SUS OJOS TODO LUCE MEJOR” A TODA MI FAMILIA: “A MI ABUELA, SRA. CATALINA MATIANO LOZANO, A MIS TIOS: CARLOS, MARIO, CELIA, JORGE, MIGUEL, ROSA MARIA, NELSA, SILVIA, LUZ DEL CARMEN Y FERMIN, A MIS PRIMOS: CARLOS MIGUEL, ERICA(Q.E.P.D.), YAMEL, XOCHITL, MARIO, GUADALUPE, ADRIANA, DORINDA, MARIA DE LOS ANGELES, YOLOTZIN, ALEJANDRO, ITZEL GUADALUPE, LILIA YAZMIN, NELIDA RUTH, ADRIANA BERENICE Y MIGUEL ANGEL. A MI HONORABLE JURADO: MVZ NICOLAS A. DE MIGUEL VALERA MVZ MIGUEL CANALES RUBIO MVZ NELLY DEL J. IBARRA PRIEGO MVZ DORA ROMERO SALAS MVZ MIGUEL ANGEL LEANO ORTIZ 5 RINDO UN SINCERO AGRADECIMIENTO A LAS SIGUIENTES PERSONAS E INSTITUCIONES: GRUPO DISCOVERY EN ESPECIAL A: BIOL. MAURICIO CORTEZ AGUILAR. DR. RENATO LENZI MVZ ROBERTO SÁNCHEZ OKRUCKY. HARBOR BRANCH OCEANOGRAPHIC INSTITUTION EN ESPECIAL A : DR. GREGORY D. BOSSART. RED DE VARAMIENTOS DEL ESTADO DE VERACRUZ EN ESPECIAL A: BIOL. BLANCA E. CORTINA JULIO. BIOL. GIBERTH GORDILLO MORALES. UNIVERSIDAD VERACRUZANA: EN ESPECIAL A: MVZ NICOLAS A. DE MIGUEL VALERA MVZ ERICKA LANDA CANSIGNO BIOL. CARLOS ALBERTO MARTINEZ HERNÁNDEZ 6 RESUMEN El presente trabajo se realizó en tres delfinarios localizados en Cancún, Quintana Roo, de donde se tomaron 16 ejemplares de delfines nariz de botella (Tursiops truncatus), ocho hembras y el mismo número de machos de diferentes edades y clínicamente sanos, todos estos condicionados (entrenados) para la toma de muestras biológicas. La toma de muestras se realizó mediante el uso de dos técnicas de recolección de esputo, una invasiva y otra no invasiva, para aislamiento y citología respectivamente. Para el aislamiento se sembró en estría en varios medios de cultivo y a diferentes temperaturas, se utilizó la técnica de Gram para mostrar morfología y tinción. Se utilizaron las tablas de identificación basadas en el medio de Triple Azúcar Hierro, así como las fermentaciones de azúcares para identificar las bacterias, las observaciones microscópicas se compararon con las ilustraciones de un manual de citología de cetáceos, el cual presenta algunas de las bacterias saprofitas y patógenas de las vías respiratorias de estos animales. Posteriormente se practicaron pruebas bioquímicas a las bacterias Gramnegativas que se lograron aislar para determinar el género de las mismas, estas pruebas fueron: Agar de triple azúcar y hierro, urea, citrato de sodio, oxidasa, sim, rojo de metilo y Voges-Proskauer. Para poder determinar el género y especie se utilizaron tablas de identificación bacteriológica de Biberstein, E.L., Jang, S. y Barajas, J.A. 7 INTRODUCCIÒN. A lo largo del tiempo, los delfines y el hombre han mantenido una estrecha relación la cual permanece hasta nuestros días, misma a la que se le atribuyen varias explicaciones, pero a ciencia cierta no se sabe que es lo que mantiene tan cerca de los humanos a estos cetáceos, existen relatos que narran cómo estos cetáceos han rescatado a varios náufragos en peligro de morir ahogados trasladándolos hasta tierra firme. (4) En la cultura griega, eran considerados como deidades, ellos tenían la creencia de que eran almas de personas que habían muerto recientemente y de esta manera aguardaban su turno para llegar al cielo y en ese lapso de tiempo debían ayudar a los humanos en todo lo posible, cabe mencionar las experiencias de varios buzos que han sido protegidos valerosamente del ataque de tiburones por estos torpedos del mar. Sin duda alguna, son demasiadas la cualidades de estos mamíferos marinos, entre las que destacan, su excepcional inteligencia y gran nobleza, al grado que los hemos entrenado para nuestra diversión y ellos asumen su papel con humildad y sumisión en la mayoría de los casos. (5) El delfín mular o nariz de botella (Tursiops truncatus) es un mamífero marino más de la lista, pero sin duda alguna es uno de los animales más evolucionados y mejor adaptados a su elemento natural, el agua. A lo largo de su proceso evolutivo, desde que era un mamífero terrestre cubierto de pelo y de largos bigotes, parecido a un perro de talla pequeña (Mesonyx), hasta que evolucionó a un animal acuático, el cual transformó sus miembros pélvicos en una poderosa aleta caudal que le permite alcanzar velocidades de hasta 50 km/h. Sus miembros torácicos se convirtieron en un par de aletas pectorales que junto con la aleta dorsal contribuyen a mantener el equilibrio y a cambiar de dirección súbitamente, su nariz se fusionó a un solo orificio (espiráculo) y emigró hasta la parte posterior de la cabeza, inmediatamente caudal al melón, esto le facilita respirar sin necesidad de exponer toda su cabeza. Se convirtió en un excelente buzo tras desarrollar unas complicadas estructuras anatómicas denominadas "redes admirables" que intervienen para almacenar grandes cantidades de oxígeno y mioglobina, mismas que utiliza para poder permanecer 8 debajo del agua por lapsos de tiempo hasta de ocho minutos. Su oído casi se atrofió, pero en su lugar posee un poderoso sonar biológico también llamado sistema de ecolocalización que consiste en la emisión de complicados silbidos y chasquidos de alta frecuencia casi imperceptibles para el oído humano que le permite orientarse y localizar su alimento de manera extraordinaria en aguas oscuras o demasiado profundas donde la visibilidad es casi nula, incluso, pude localizar objetos tan pequeños como piezas de alambre hasta de dos milímetros de diámetro. (12) Actualmente, las poblaciones de varias especies de delfines, incluyendo al delfín mular (Tursiops truncatus) se ven notablemente amenazadas por diversos factores, en primer lugar, la contaminación, seguida de la pesca inadecuada del Atún y en ocasiones la caza inmoderada por parte de algunos países como Japón, Noruega y Perú en Suramérica. En los últimos años, la imagen del delfín se popularizó con la proliferación de zoológicos marinos o "delfinarios" uno de los primeros en el Mundo fue "Marineland of the Pacific” en California, Estados Unidos de América, mismo que fue financiado por el Ejército de ese país para realizar investigaciones sobre el sonar biológico o sistema de ecolocalización y el proceso de regeneración de su piel (mitosis acelerada) por una constante fricción con el agua. (14) En la actualidad casi todos los delfinarios se preocupan por la salud de sus ejemplares, pero son muy pocos los que practican procedimientos adecuados y sistemáticos, tomando en cuenta que en la mayoría de los casos, éstos se encuentran en un espacio muy reducido y poco profundo, con una mala calidad del agua por el hecho de ser salada artificial y tratada con varios químicos como: hipoclorito de sodio, permanganato de potasio, ozono, entre otros. En el caso de los delfinarios al aire libre o descubiertos el problema se complica si están localizados en grandes urbes, puesto que en ocasiones la contaminación atmosférica alcanza cifras alarmantes, teniendo como consecuencia la formación de lluvias ácidas que directamente alteran el pH del agua, por consiguiente un pH menor a 7 representa una amenaza para la salud de los delfines. (10) 9 En este caso la opción mas adecuada la engloban los delfinarios localizados en playas, costas, rivieras o lagunas, con agua salada natural, fresca y casi sin contaminantes o en algunas ocasiones sin estos, con el objeto de que los delfines se encuentren en condiciones lo mas semejante a la libertad (semicautiverio), con todo esto es posible disminuir el estrés y prolongar la longevidad de los ejemplares, además de facilitar alguna posible liberación de aquellos individuos inadaptables a las condiciones de cautividad.(1) Por último, se puede agregar que estos animales han sido utilizados en diversas disciplinas, como es el caso de un grupo de científicos extranjeros, que han propuesto aplicarlos en beneficio de pacientes humanos con alguna afección del sistema nervioso central, como el síndrome de Down, parálisis cerebral, parálisis muscular, autismo y en últimas fechas se han comenzado a utilizar en la estimulación temprana de niños recién nacidos y en los cursos de parto psicoprofiláctico, todo esto dentro de un programa denominado “Delfinoterapia” que actualmente no atraviesa su mejor momento, puesto que se mencionan opiniones demasiado encontradas por parte de algunos especialistas en cuanto a las aplicaciones y resultados de dicho programa. (1) 10 JUSTIFICACIÓN En la actualidad, el área de mamíferos marinos en Medicina Veterinaria, es un terreno poco incursionado en nuestro país, por lo tanto, existe un número muy reducido de especialistas en la misma y por consiguiente existen muy pocas publicaciones al respecto, por todo esto el objeto de esta investigación, es ampliar los conocimientos en la materia, mismos que permitan establecer programas de medicina preventiva así como dar a conocer algunos de los procedimientos clínicos utilizados en esta área. Identificar y revisar constantemente la flora microbiana de las vías respiratorias altas puede prevenir brotes de graves enfermedades respiratorias de estos cetáceos, o alguna posible transmisión de agentes infecciosos a seres humanos (ZOONOSIS), a los propios entrenadores, manejadores e incluso a los turistas que estén en contacto directo (nado interactivo) con delfines, así como también determinar el origen de un caso inverso. ANTECEDENTES Dentro de la medicina mastozoológica marina se cuenta con varios trabajos realizados por especialistas en otros lugares del orbe. Algunos estudios sobre neumonías bacterianas en cetáceos cautivos que terminaron en muertes, fueron realizados por Medway y Schryver en 1973; Sweeney y Ridgway en 1975; Buck y Spott en 1986 (citados por Dunn, L., Buck J. D., y Robeck T. R. 2001), ellos reportaron: Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Sweeney en 1978 reportó: Pasteurella multocida y P. hemolítica en necropsias realizadas a 45 delfines que murieron por neumonía. Bernardelli et al en 1990, Castro Ramos et al en 1998 y Dunn et al en el 2000 reportaron: Mycobacteruim bovis, M. Avium, M. smegmatis, M. fortuitum, M. chelonei y M. Marinum. Kinoshita et al en 1994, reportó Staphylococcus aureus en necropsias realizadas a varios delfines nariz de botella que murieron por neumonía (6-7-8-9). 11 OBJETIVO GENERAL Identificar y determinar la patogenicidad de los organismos microbianos de las vías respiratorias altas de delfines nariz de botella (Tursiops truncatus) en cautiverio, para tratar de diseñar programas de medicina preventiva que garanticen en gran medida la salud de los ejemplares. OBJETIVOS PARTICULARES - Determinar los géneros y especies de las bacterias presentes. - Determinar la frecuencia de las mismas. 12 HIPÒTESIS Las bacterias aisladas de la vías respiratorias altas de los delfines, no son potencialmente patógenas, para estos, ni para las personas que permanezcan en contacto directo con los mismos. 13 MATERIAL Y METODOS TOMA DE MUESTRAS Para la toma de muestras, se utilizó una técnica invasiva para recolección de esputo, misma que se practicó en ocho ejemplares hembras y el mismo numero de machos todos estos condicionados (entrenados) para este fin. La cuál consiste en colocar a los ejemplares en flotación mediante una señal (de estación) hecha por el entrenador, para evitar la contaminación por el agua, posteriormente se les da otra señal para provocar el surtidor, soplido o “chuff “ (exhalación) y de esta manera conseguir la abertura del respiráculo, que es el orificio por el cual respiran estos animales, esta segunda señal consiste en realizar un ligero golpe alrededor de este orificio con los dedos pulgar, índice y mayor formando una C invertida, acto seguido, se introdujo un hisopo en este lugar a una distancia no mayor a tres centímetros y se realizó un ligero movimiento de fricción en el interior del mismo, procurando no demorar mas de dos segundos durante este procedimiento (13). Una vez colectadas las muestras, éstas se introdujeron en tubos con medio de transporte de Stuart para su posterior traslado al laboratorio. Simultáneamente, se tomaron muestras de citología de las vías respiratorias de los mismos animales, esta vez utilizando una técnica no invasiva, la cual consiste en colocar a los individuos en la posición antes mencionada mediante la misma señal de estación. Después, sujetar un portaobjetos entre los dedos pulgar, índice y mayor como se indicó anteriormente, para de ésta manera, darles la segunda señal a los animales condicionados para provocar el surtidor y al mismo tiempo colectar la muestra de esputo, directamente del respiráculo (13). Posteriormente, las muestras se fijaron con CITOSPRAY® para su traslado al laboratorio. 14 Para la toma de éstas y otras muestras en animales no condicionados, es necesario realizar maniobras para retirar a los animales del agua y, una vez afuera y bajo contención física (nunca química) se procede a la toma de las mismas.(6) AISLAMIENTO Se utilizó la técnica tradicional que consiste en sembrar por estría y practicando la dilución de la muestra, calentando el asa de platino entre cada siembra, todo esto en cajas de Petri con agar entérico de Hektoen, agar sangre, agar Bordette Gengou, agar de gonococos y agar micótico a 37º C en una estufa de cultivo y a temperatura ambiente durante 48 horas, para el establecimiento y aislamiento de bacterias aeróbias mesófilas. OBSERVACIÓN Todas las muestras de citología fijadas con anterioridad se tiñeron mediante el uso de la técnica de Gram para demostrar morfología y tinción. De las muestras sembradas en los diversos medios de cultivo, se tomaron algunas colonias y se extendieron en porta-objetos y luego se tiñeron por el método de Gram. IDENTIFICACIÓN Se utilizaron las tablas de identificación basadas en el medio de Triple Azúcar Hierro, así como las de fermentaciones de azúcares para identificar Cocos y Bacilos. Las observaciones microscópicas se compararon con las ilustraciones de un manual de citología de cetáceos el cual presenta algunas de las bacterias saprofitas y patógenas de las vías respiratorias de estos animales. Asimismo se practicaron pruebas bioquímicas a las bacterias Gramnegativas que se cultivaron, para determinar el genero de las mismas, estas pruebas fueron: Agar de triple azúcar y hierro, urea, citrato de sodio, oxidasa, sim, rojo de metilo y Voges-Proskauer. Para determinar el género y especie se utilizaron las tablas de identificación bacteriológica de Biberstein, E.L., Jang, S. y Barajas, J.A. (2). 15 RESULTADOS Y DISCUSION Mediante las pruebas bacteriológicas se logró aislar un total de 22 agentes infecciosos, los cuales al hacer la identificación se determinó que pertenecen al menos a cinco géneros y dos especies.(Ver cuadro 1 y gráfico 1). De ellos se destaca la presencia de una levadura identificada como del género Candida spp.; también la presencia de un agente saprofito perteneciente el género Simonsiella spp. De los organismos aislados, Staphylococcus aureus, Gramnegativo (3) representa una etiología de varias muertes por neumonía, sin embargo la muestra no es representativa dada la frecuencia que presentó. En cuanto a la presentación bacteriana por sexo del hospedero, se observó un mayor número de agentes infecciosos y de su frecuencia en las hembras en comparación con los machos. (ver cuadros 2 y 3, y gráficos 2 y 3). Dunn et al (6) citan, que se ha determinado la presencia de diversos patógenos en varias especies de cetáceos, incluyendo al delfín nariz de botella (Tursiups truncatus), los cuales no fueron hallados en esta investigación, quizá debido a que la muestra analizada corresponde a delfines mantenidos en condiciones controladas por al menos dos años. A excepción de uno de los animales, del cual se aisló Candida spp. que había llegado al delfinario hacía un par de meses y se encontraba enfermo, presentando un absceso subcutáneo en el pedúnculo de la cola, al cual se le mantenía en aislamiento. Como resultado de las muestras tomadas por la técnica no invasiva, es decir la citología de lo espirado y adherido al porta-objetos, se logró identificar morfológicamente a los mismos agentes infecciosos aislados, además de algunos protozoarios ciliados (Kyaroikeus cetarius) comensales comunes de las vías respiratorias de cetáceos, así como la presencia de una especie de parásito de importancia clínica del género Halocercus spp. en su fase adulta y estadios larvarios. El cual es un parásito pulmonar frecuentemente observado y de gran importancia clínica como indican (15-16) (ver ANEXOS.) 16 Tabla 1. Aislamientos bacterianos de vías respiratorias altas de delfines (Tursiops truncatus) cautivos en Cancún, Q. R. BACTERIA N % Candida sp. 3 13.6 Diplococcus sp. 1 4.6 Simonsiella sp. 11 50.0 Staphyloccocus aureus 3 13.6 Staphyloccocus epidermidis 3 13.6 Tetradas 1 4.6 22 100 TOTAL Gráfico 1. Porciento de aislamientos bacterianos de delfines cautivos en Cancún Q. R. 5% 14% 13% Candida sp. 5% Diplococcus sp. Simonsiella sp. S.aureus 14% S. epidermidis 49% Tetradas 17 Tabla 2. Agentes infecciosos observados en muestras de machos BACTERIA N % Simonsiella sp. 7 70 Candida sp. 1 10 Staphylococcus epidermidis 2 20 10 100 TOTAL Gráfico 2. Porciento de aislamientos bacterianos de delfines cautivos en Cancún Q. R. (Machos) 20% 10% 70% Simonsiella sp Candida sp. S. epidermidis 18 Tabla 3. Agentes infecciosos observados en muestras de hembras BACTERIA N % Simonsiella sp. 4 33.4 Candida sp. 2 16.7 Staphylococcus aureus 3 25.0 Staphylococcus epidermidis 1 8.3 Diplococcus sp. 1 8.3 Tetradas 1 8.3 12 100 TOTAL Gráfico 3. Porciento de aislamientos bacterianos de delfines cautivos en Cancún Q. R. (Hembras) Simonsiella sp. 8% 8% 34% 8% Candida sp S. aureus S. epidermidis 25% 17% Diplococcus sp. Tetradas 19 CONCLUSIONES En este trabajo se determinó la presencia de diversos agentes infecciosos y aunque algunos de ellos son potencialmente patógenos, también es posible que sean identificados dentro de la flora microbiana normal de órganos, aparatos y superficies corporales del hombre y los animales, incluyendo al delfín nariz de botella (Tursiups truncatus). La patogenicidad de estos agentes infecciosos normalmente se pone de manifiesto cuando el hospedero se encuentra inmunocomprometido en forma natural o inducida y esto trae como consecuencia el desarrollo de una neumonía con resultados fatales en la mayoría de los casos si no se diagnostica para ser tratada a tiempo. Se puede decir que la mayoría de las bacterias aisladas de las vías respiratorias altas de delfines nariz de botella (Tursiops truncatus) cautivos en Cancún Q. R, no son potencialmente patógenas para estos, así como para las personas que interactúan con ellos de manera cotidiana, a excepción de Staphylococcus aureus, puesto que este organismo es la principal etiología de la mayoría de los decesos de delfines y otros cetáceos por neumonías, sin embargo, se considera que por las condiciones clínica y corporal de los individuos muestreados, se le puede incluir como parte de la flora microbiana normal de las vías respiratorias altas de estos individuos. El género Simonsiella spp. es miembro de la familia Neisseriaceae y se considera saprófito para las especies de donde se ha aislado (17). En la mayoría de los delfinarios el control bacteriano esta basado en la observación de lo que arroje la muestra tomada mediante la vía no invasiva (citología) y no consideran importante el hacer cultivos bacterianos para establecer sus programas de medicina preventiva y de control de enfermedades. La técnica no invasiva resultó muy útil para la observación de agentes no bacterianos permitiendo la observación e identificación de parásitos, como el Halocercus spp, o como el protozoario saprofito de la especie Kyaroikeus cetarius.(ver ANEXOS) 20 BIBLIOGRAFÍA 1. Alanis, Y. Castello, H. Vega, C. Los Delfinarios en México un informe crítico (2000) http://www.csiwhalesalive.org/csimexcapsp.pdf consultado en Octubre 2002 2. Biberstein, E. L., Jang, S. y Barajas, J. A. (1980). Manual de prácticas de Microbiología de la FMVZ-UNAM. Mimeografiado. 3. Carter, W. (2000). Microbiología Veterinaria. Editorial McGraw Hill, México. Págs. 112-115. 4ª, Edición. 4. Carwardine, M., Hoyt, E., Fordyce, E., Gill, P.(1999). Ballenas, Delfines y Marsopas. Ediciones Omega, España. Págs. 60-79, 82-93. 5. Cousteau, J. I.(1995). Enciclopedia del Mar, Editorial Océano, España. Tomo VIII, Págs. 112-156. 6. Dunn, L., Buck J. D., y Robeck T. R. (2001). Bacterial diseases of cetaceans and pinnipeds, en CRC Handbook of Marine Mammal Medicine, editado por Dierauf, L. A., y Gulland F. M. D. Editorial CRC Press, USA. Págs. 309-325. 2ª. Edición. 7. Fowler, M. E. (1986). Cetaceans, in Zoo & Wild Animal Medicine Editorial W.B. Saunders Company, USA. Págs. 778-779,783-785. 8. Lilly, J. Rice, E.D. Breland, H. Aronson, T. (1966). Whales Dolphins and Porpoises, Editorial W.B. Saunders Company, USA. Págs 277-319,718-754. 9. Merck, (2000). Manual de Veterinaria. Editorial Océano, España. Págs. 1523-1530. Quinta Edición. 10. Pérez, M. Denuncia de la Explotación de los delfines en acuarios (2000) (consultado en http://www.zihuatanejo-ixtapa-mexico.com/spaz/delfines.html Octubre 2002). 21 11. Silvani, L. Ballenas y delfines: Esos desconocidos (2001) http://www.telesat.com.co/fedecas/contenidos/2-cc/byd.html (consultado en Octubre 2002). 12. Sironi, M. La Evolución de los Cetáceos (1999) http://www.icb.org.ar (consultado en Octubre 2002). 13. Sweeney, C. Reddy, M.L. Limpscomb, T. P. Bjorneby, J. M. Ridgway, S. H. (1999). Handbook of Cetacean Citology. Editorial Dolphin Quest. USA. Pags 1115, 37-39. 14. The Dolphin Proyect. Informe de los delfines en cautiverio (2001) http://www.addaong.org/informedelfines.html (consultado en octubre 2002) 15. Rosas F. C. W., Monteiro-Filho E. L. A., Marigo J., Santos R. A., Andrade A. L.V., Rautenberg M. Oliveira M. R. y Bordignon M. O. (2002). The striped Dolphin, Stenella coeruleoalba, (Cetacea: delphininidae), in the coast of Sao Paulo state, southeastern Brazil. Aquatic Mammals 28 (1): 60-66. 16. Abollo E., López A., Gestal C., Benavente P., Pascual S. (1998). Macroparasites in cetaceans stranded on the northwestern Spanish Atlantic coast. DAO 32: 227-231. 17. Hedlund B. P., Staley J. T. (2001). Phylogeny of the genus Simonsiella and other members of the Neisseriaceae. IJSEM Papers in press. Published on line 14 (consultada en diciembre del 2002). december 2001. www.dx.doi.org 22 ANEXO 1 Aspecto Simonsiella spp. en el medio entérico de Hektoen. Luz incidente Luz transmitida Aspecto Simonsiella spp. en el medio Bordet Gengou Luz incidente Luz transmitida Microfotografía de Candida spp, 100X Microfotografía de Simonsiella spp, 100X 23 ANEXO 2 ANATOMIA DEL DELFÍN NARIZ DE BOTELA (Tursiops truncatus) 24 ANEXO 3 FILOGENIA DEL GENERO Simonsiella Y OTROS MIEMBROS DE LA FAMILIA Neisseriaceae. Phylogeny of the genus Simonsiella and other members of the Neisseriaceae. Brian P. Hedlund and James T. Staley Simonsiella phylogeny www.dx.doi.org/10.1099/ijs.0.01952-0 Correo electronico brian.hedlund@biologie.uni-regensburg.de 25 ANEXO 4 Microfotografía de Simonsiella spp (Citología) 100 X Microfotografía de Simonsiella spp (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar con vacuolas (Citología) 100 X 26 Microfotografía de Macrófago alveolar en fagocitosis (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar en fagocitosis (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar con vacuolas (Citología) 100 X 27 Microfotografía de Macrófago alveolar en fagocitosis (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar en fagocitosis con vacuolas (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar en fagocitosis (Citología) 100 X 28 Microfotografía de Halocercus spp estadio adulto con células epiteliales (Citología) 100 X Microfotografía de Halocercus spp estadio adulto con células epiteliales (Citología) 100 X Microfotografía de Halocercus spp estadio adulto con células epiteliales (Citología) 100 X 29 Microfotografía de Macrófago alveolar con materia extraña (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar con materia extraña (Citología) 100 X Microfotografía de Macrófago alveolar en fagocitosis (Citología) 100 X 30
