Determinación del efecto de la maduración de la lechosa (Carica Papaya L.) sobre la concentración de la Papaína Gutiérrez M., Geraldine S.; Velásquez S., Virginia E. y Ferrer, José R. Universidad Rafael Urdaneta. Facultad de Ingeniería. Escuela de Ingeniería Química. Maracaibo. Venezuela. E-mail: geraldine_gutierrez@hotmail.com y josferrer1@mail.com Resumen La papaína es una enzima proteolítica que ayuda a digerir las proteínas de los alimentos, que bien merece ser estudiada por la serie de beneficios que aporta a la salud y a la industria en sí. Este trabajo fue de Tipo Correlacional con Diseño Experimental, basado en Observación Directa y Documental. Se estudio el efecto de la maduración de la lechosa sobre la concentración de papaína, extrayendo esta directamente de la pulpa de la lechosa (Carica Papaya L.) de la Variedad Red Lady, a partir de cada uno de sus 6 estados de maduración, definidos por la consistencia del fruto y el color de la cáscara del mismo; se les realizaron pruebas físico-químicas a las muestras, midiendo pH, Sólidos Solubles, Contenido de Cenizas y Humedad. Se purificó la papaína por precipitación de la sal en dos pasos, se refinó por diálisis donde se utiliza una membrana de diálisis que permite que las impurezas de las muestran fluyan hacia el exterior a través de sus microporos; y por ultimo se cuantificó por el método Nº 971.16 de la A.O.A.C, concluyendo así que a medida que la maduración del fruto transcurre hay menos concentración de papaína en la pulpa. Palabras claves: Lechosa, Papaína, Concentración, Maduración. Abstract Papain is a proteolytic enzyme that helps to digest food proteins, and it deserves to be studied because of its benefits to health and industry as well. This kind of research was Correlacional and its design was Experimental, based on Direct and Documentary Observation. The effect of Papaya ripening over Papain concentration was studied by extracting papain directly from papaya (Carica Papaya L.) Red Lady Variety pulp, from each of its 6 ripening states, defined by its consistency and skin color; some physical- chemical tests were made to the samples, measuring pH, Soluble Solids, Ash Contents and Humidity. Papain was purified by two-step salt precipitation, refined by dialysis where a dialysis membrane was used to make flow impurities to the outside by its pores; and finally papain was quantified by Nº 971.16 method recommended by A.O.A.C., concluding that as the fruit ripening passes there is less papain concentration on the pulp. Key Words: Papaya, Papain, Concentration, Ripening. Introducción La lechosa también llamada papaya es apetecible por su suave y agradable sabor y por tener propiedades nutritivas, digestivas y medicinales. La papaya es solicitada por consumidores que tienen preferencias por frutas tropicales. Además de ser agradable, posee altos nutrientes, vitaminas, minerales y proteínas que le hacen sobresalir entre otras frutas por sus características medicinales, principalmente en el tratamiento de enfermedades gástricas. Su valor nutritivo es alto 100grs de pulpa suministran los requerimientos mínimos diarios de vitamina C y la mitad de vitamina A, posee vitaminas de complejo B (B1, B6, B12). También las flores poseen propiedades febrífugas y pectorales cuando es consumida en infusiones. Su aprovechamiento es total, hojas, frutas y tallos, poseen alcaloides calpainas y la enzima papaína utilizada ampliamente en la medicina. La calpaina que se encuentra en las hojas en concentración hasta de 0.4% es usada en tratamientos de disentería y tuberculosis. La papaína que se encuentra en los tejidos de la planta posee la cualidad de disolver y digerir los albuminoides y por tal motivo es usada en medicinas para el control de insuficiencias gástricas, en la digestión de tejidos putrefactos, en heridas gangrenosas y para estudios citológicos en la determinación de cáncer estomacal. En la industria textil se usa la papaína para suavizar la lana y la seda; en la industria de pieles para la batiente de cueros; en la industria del caucho para el envejecimiento artificial del látex, también es usada para la fabricación de chicles y en las industrias cerveceras para mejorar las maltas. Se emplea para ablandar carnes mediante la inyección a la res antes de su sacrificio o en la cocción. El procedimiento habitual para obtener la papaína, consiste en secar el zumo lechoso que exuda la corteza de la papaya verde, pero en el día a día, el consumo de lechosa se realiza cuando la misma se encuentra en su máximo estado de maduración. Lo que se desea estudiar es qué sucede con la papaína cuando la lechosa llega a su máximo estado de maduración. Ya que el aprovechamiento de la lechosa es total según la teoría, es necesario saber que sucede con la concentración de papaína en cada parte del fruto, y en una de sus partes más utilizadas como lo es la pulpa a diferentes estados de maduración, para así conocer mas a fondo, en que momento es de mejor aprovechamiento el consumo de la misma. Por consiguiente, en este trabajo se plantea como objetivo general : Determinar el efecto de la maduración en la lechosa (Carica papaya L.) sobre la concentración de Papaína. Metodología Experimental Fase I: Estudio de los diferentes métodos para la extracción y la purificación de papaína a partir de lechosa (Carica Papaya L.) Se analizarán diferentes métodos para la obtención de papaína a partir de lechosa en todos sus estados de maduración. La papaína a partir de lechosas verdes regularmente se obtiene por purificación del zumo lechoso (látex) coagulado, proveniente de ligeras incisiones longitudinales que se practican en la superficie de los frutos; mientras que a partir de lechosas maduras, donde no se puede extraer látex, se debe tomar pulpa y concha de la fruta para su posterior purificación. Algunos procedimientos descritos para Purificar papaína a partir de lechosa son: Método de la precipitación de la sal en dos pasos, Método de extracción en un sistema acuoso de dos fases. Para la Refinación se realizará la descripción del procedimiento de diálisis, mientras que para la Cuantificación se describirán los métodos de Biuret, Bradford, Lowry y el procedimiento Nº 971.16 de la A.O.A.C. Fase II: Selección del método experimental más apropiado para la cuantificación de la papaína. Luego de haber estudiado los diferentes métodos experimentales para la obtención, purificación y cuantificación de la enzima, con las respectivas ventajas y desventajas de cada procedimiento, se logrará escoger el método experimental más apropiado para esta investigación. Fase III: Caracterización de las propiedades físico-químicas de las muestras de lechosa. Previo a la caracterización se realizará la toma de muestras de la enzima a partir de lechosas (Carica Papaya L.) verdes y maduras de la Variedad Red Lady facilitadas por el Centro Frutícola del Estado Zulia, ubicado en el Municipio Mara. De estas lechosas se retirararán tanto la cáscara como las semillas para así obtener solo la pulpa de las frutas. Las mismas se clasificararán según el estado de maduración y serán almacenadas a 4 o C en envases previamente esterilizados y etiquetados. Se analizarán las muestras por duplicado, separando las mismas en muestras A y muestras B para cada estado de maduración. Para cada muestra se realizarán los siguientes análisis por duplicado: Determinación de pH Se colocaron las muestras en vasos precipitados y se midió el pH con un pHmetro (HANNA Instruments, USA) previamente calibrado. Determinación de sólidos solubles La determinación de sólidos solubles se realizó utilizando un refractómetro portátil (Bausch & Lomb, USA), que expresa los resultados en °Brix, colocando parte de las muestras sobre el lente de dicho equipo y leyendo el valor en la escala. Determinación de % de Humedad Se pesaron 1-2 grs. de muestra en crisoles previamente secados y pesados. Se colocaron en la estufa a 105-110 ºC por 5 horas hasta obtener peso constante. Se enfriaron las muestras en un desecador y se pesaron al alcanzar la temperatura ambiente. Se calculó el % de Materia Seca con la siguiente ecuación: %MS peso.muestra. sec a, g 100 peso.de.muestra. parcialmen te. sec a, g Se calculó el % de Contenido de Humedad por diferencia: %Humedad = 100 %MS Determinación de Contenido de Ceniza Se colocaron los crisoles limpios en un horno de incineración a 550ºC durante 1 hora. Luego se trasladaron los crisoles al desecador y se enfriaron a la temperatura del laboratorio. Se pesaron 1-2 grs. de muestra en los crisoles y se colaron de nuevo en el horno incinerador a 550ºC durante 5 horas. Se trasladaron los crisoles a una estufa a 105ºC y se dejaron por una hora. Se colocaron de nuevo en el desecador hasta alcanzar la temperatura ambiente y se anotó el peso. Por último, se obtuvo el % de Cenizas mediante la siguiente ecuación: %CEN peso.de.ceniza , g 100 peso.de.muestra. parcialmen te. sec a, g Fase IV : Cuantificación de la concentración de papaína en la lechosa a diferentes estados de maduración. Primero la papaína se debió purificar, y refinar para posteriormente cuantificarla. Entonces la obtención de la Papaína a partir de las muestras de las pulpas de lechosas se realizó, por duplicado, de la siguiente manera: Purificación de la Papaína Método de la precipitación de la sal en dos pasos Se generó una suspensión agregando a la muestra Cistina 40mM en relación 3:1 y el pH fue regulado a 5.6 con NaOH 6M. La muestra se agitó en una plancha de agitación magnética por 15 min. a 4 oC. Se filtró la mezcla y el pH del filtrado se ajustó a 9 con NaOH 6M. El material insoluble se retiró por centrifugación a 4oC por 30 min. Se ajustó con agua, y se le agregó (NH4)2SO4 45% para precipitar. Se agitó lentamente por 30 min. a 4oC. Se disolvió con Cistina 20mM y se sometió de nuevo a centrifugación a las mismas condiciones anteriores. Las muestras se mantuvieron a 4oC y se agregó NaCl 10%. Se agitó lentamente por 30 min. a 4oC. Y por último, se separa el precipitado de papaína por centrifugación a las mismas condiciones. Refinación de la Papaína Se implemento el proceso de diálisis a nivel de laboratorio, con el uso de un equipo compuesto de una plancha de agitación, un cilindro de vidrio, una membrana de diálisis de 29mm de diámetro, un magneto y un soporte universal (Figura 2). Se observó como la membrana de diálisis estuvo en contacto continuo con el agua, permitiendo que las impurezas de la muestra fluyeran hacia el exterior a través de sus microporos, debido al gradiente de concentración. El proceso tuvo lugar por 12 horas aproximadamente, con lo que se buscaba eliminar las impurezas y residuos desechables y así obtener pura papaína. Cada refinado de las muestras se mantuvo almacenado a 4ºC, para la posterior lectura en el espectrofotómetro. Cuantificación de la Papaína Para cuantificar esta enzima, se realizó una curva patrón o curva de calibración de Absorbancia versus Concentración de la Papaína. Para realizar esta curva se llevaron a cabo los siguientes pasos correspondientes al método Nº 971.16 de la A.O.A.C: Se pesó correctamente 100 mg. de Papaína de referencia estándar y se colocó en un balón aforado de 100mL de volumen y se adicionó solución buffer hasta disolver. Se etiquetaron 6 matraces de 100 ml como S1, S2 y S3 por duplicado para solución estándar de papaína comercial. Otros 3 matraces correspondieron a los blancos etiquetados como S1B, S2B y S3B. A cada uno de los matraces volumétricos de vidrio tapados de 100ml, se le pipetearon 25 ml de Sustrato de Caseína. Se adicionaron 5, 2.5 y 0 ml de Solución Buffer respectivamente a los matraces S1, S2 y S3 y también a sus respectivos blancos S1B, S2B y S3B. Se ubicaron todos los matraces en un baño de agua a 40 ºC dejando pasar 10 minutos hasta alcanzar la temperatura del baño. Dentro de cada matraz duplicado S1, se pipetearon 5 ml de la solución estándar de papaína seguido con agitación simultánea para mezclar, se taparon y ubicaron en un baño. Dentro de dos matraces etiquetados S2, se pipetearon 7.5 ml de solución estándar de papaína y se procedió de la manera anterior. Y finalmente se adicionaron 10 ml de la solución estándar a los dos matraces S3. Luego de exactamente 60 minutos se adicionan 15 ml de TCA (Ácido Tricloroacético) al 30% a todos los matraces y se mezclaron vigorosamente. Se prepararon los blancos pipeteando respectivamente 5 ml a S1B, 7.5 ml a S2B, y 10 ml a S3B de solución estándar de papaína. Todos los matraces se reubicaron en un baño a 40 ºC y se permitió que el precipitado coagulara completamente. Se filtró a través de papel filtro hasta obtener un filtrado totalmente transparente. Finalmente se leyó la absorbancia de los filtrados a 280nm versus el blanco respectivo para realizar la grafica correspondiente. Luego de obtener la curva patrón se procedió a medir cada muestra previamente almacenada a 4ºC en un Espectrofotómetro UV visible, en donde se observaron los valores de absorbancia a 280nm para luego ir a la curva (Gráfico Nº1) y obtener el valor de concentración de papaína correspondiente. Fase V: Comparación las concentraciones de papaína en relación a los diferentes estados de maduración de la lechosa. Para llevar a cabo la última fase de la investigación se elaboró un cuadro comparativo y una gráfica en donde se incluyeron los estados de maduración de la lechosa con respecto a su índice de madurez y los resultados obtenidos a partir de los procedimientos experimentales realizados para cada muestra, en los cuales, se pudo observar la tendencia de la concentración de papaína con respecto a el estado de maduración de la lechosa. Se implemento el proceso de diálisis a nivel de laboratorio, con el uso de un equipo compuesto de una plancha de agitación, un cilindro de vidrio, una membrana de diálisis de 29mm de diámetro, un magneto y un soporte universal. Se observó como la membrana de diálisis estuvo en contacto continuo con el agua, permitiendo que las impurezas de la muestra fluyeran hacia el exterior a través de sus microporos, debido al gradiente de concentración. El proceso tuvo lugar por 12 horas aproximadamente, con lo que se buscaba eliminar las impurezas y residuos desechables y así obtener pura papaína. Cada refinado de las muestras se mantuvo almacenado a 4ºC, para la posterior lectura en el espectrofotómetro Análisis de resultados Fase I: Estudio de los diferentes métodos para la extracción y la purificación de papaína a partir de lechosa (Carica Papaya L.) Los estudios realizados sobre cada método experimental para la obtención de papaína a partir de lechosas en la presente de investigación fueron avalados por aquellos ya realizados en otros trabajos anteriores, con diferentes frutas o en otras variedades del fruto de lechosa, lo cual indica que dichos métodos proveen resultados confiables y precisos. Fase II: Selección del método experimental más apropiado para la cuantificación de la papaína. El método experimental seleccionado para la cuantificación de la papaína es confiable ya que depende de la absorbancia cuyo valor es medido por el espectrofotómetro y su grado de precisión es bastante alto, por lo tanto es recomendable para posteriores estudio. Fase III: Caracterización de las propiedades físico-químicas de las muestras de lechosa. Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009). Tabla 4: Resultados de Análisis Físico-Químicos. El símbolo Χ se refiere a la media de los valores obtenidos y el símbolo σ se refiere a la desviación estándar de los mismos. Haciendo referencia al pH obtenido para cada muestra no se encuentran diferencias significativas entre las mismas expresadas en desviación estándar. Se observa un pH ligeramente ácido, en cada muestra lo que lleva a concluir que para la pulpa de la lechosa (Carica Papaya L.) de la Variedad Red Lady posee un pH ácido y la Papaína puede tener actividad proteolítica a su pH óptimo de actividad. Para los Sólidos Solubles, expresados en grados ºBrix, se observa un aumento a medida que la fruta va madurando. Los ºBrix miden el cociente total de sacarosa disuelta en un líquido, lo que quiere decir que mientras más madura la fruta, más contenido de azucares contiene en su pulpa. Para el % de Humedad en la pulpa, se observan números bastante altos, que van aumentando a medida que la fruta madura; lo que indica que las muestras están conformadas por agua casi en su totalidad, lo que nos deja un pequeño porcentaje de compuesto de proteínas y enzimas entre las cuales se encuentra la papaína. El % de Contenido de Cenizas se midió con referencia al producto en seco y se refiere al residuo sólido que persiste tras una combustión total. Los porcentajes resultaron ser bastante bajos y regulares con respecto a los estados de maduración. Fase IV: Cuantificación la concentración de papaína en la lechosa en diferentes estados de maduración. La curva de calibración que se muestra a continuación fue construida con los valores de absorbancia medida en laboratorio y las diferentes concentraciones de papaína comercial, es decir, se presenta la relación entre la absorbancia, que es la cantidad de luz que absorbe una muestra, y la concentración en términos de gramos por litro. Se observa un comportamiento lineal. Curva de Calibración 0,8 Y= 136.66x+ 0.016 2 R = 0.9954 0,6 0,5 0,4 0,3 a Absorbancia 0,7 0,2 0,1 0 0 1 2 3 Concentración (g/l) 4 5 6 Grafica 1: Curva de Calibración. Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009). Fase V: Comparación las concentraciones de papaína en relación a los diferentes estados de maduración de la lechosa. Concentración (g/l) Estados de Muestra Muestra Χ σ 2.50 2.55 0.25 2.21 2.18 2.20 0.02 3 1.82 1.80 1.81 0.01 4 1.22 1.31 1.27 0.05 5 0.71 0.92 0.82 0.11 6 0.20 0.25 0.23 0.25 Maduración A B 1 2.60 2 Tabla 5: Resultados de Concentración de Papaína. Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009). Con respecto a la Concentración de Papaína no se muestran diferencias significativas entre las muestras A y B para cada estado. Lo que si queda claro es una tendencia descendente para los valores de concentración con respecto a la maduración de la lechosa, donde se puede decir que mientras más cercana a su máximo estado de maduración, la lechosa contiene menos cantidad de papaína, más se aclara el punto de que si esta presente la enzima Papaína en las pulpas de Lechosas (Carica papaya L.) de la Variedad Red Lady, aunque en pocas concentraciones. Concentración de Papaína vs. Estado de Maduración 3 2,5 2 Concentración 1,5 Muestra A 1 Muestra B 0,5 0 1 2 3 4 5 6 Estados de Maduración Grafica 2: Concentración de Papaína vs. Estado de Maduración. Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009). Para la Gráfica 2 se observa, al igual que en el cuadro anterior, una tendencia descendente con respecto a la concentración para cada estado de maduración. Lo que quiere decir, que mientras la lechosa se encuentra verde, contiene una cantidad considerable de papaína, la cual disminuye a medida que el fruto madura, pero no desaparece. En las muestras analizadas se tomaron aproximadamente 60 grs. de pulpa de cada estado de maduración de las lechosas, y se obtuvieron resultados de concentración de papaína en un aproximado de 0.23 g/l para las lechosas maduras en estado 6, lo que representa un 0.375% de la totalidad de la pulpa estudiada. También se determino que, comparado con el Estado 1, en el Estado 6 hubo una disminución del 90.98% en la concentración de papaína, lo que quiere decir que se perdió gran cantidad de la enzima pero la misma no desapareció. Tomando en cuenta que en el Estado 6 es en donde la fruta es consumida normalmente, se puede decir, que si brinda los beneficios a la salud por los cuales es tan conocida. Añez e Iriarte (2008) obtuvieron resultados similares a los de la presente investigación al concluir que a mayor tiempo de almacenamiento de las muestras de látex, menor era la cantidad de papaína pura que obtenían y de actividad Proteolítica de la misma. Ellos explican que por el hecho de que la recolección no se hizo directamente de la planta sino mediante cortes longitudinales al fruto a nivel de laboratorio, se aceleró el proceso de maduración de las lechosas y se perdió parte de la enzima. Debido a dichos resultados, se puede decir, que en general para una lechosa, referido a su pulpa y látex, mientras mayor sea su estado de maduración, menor va a ser su concentración de papaína. Cabe destacar que industrialmente se extrae la papaína directamente del látex de lechosa verde, y de acuerdo a estos resultados se debe hacer inferencia en el porque no extraerla de lechosas maduras. Sin embargo, lo más debido seria hacer una evaluación económica acerca de si de extraer papaína de lechosas maduras es más ventajoso que solamente comercializarlas en fruterías y supermercados como se hace en la actualidad. Conclusiones La concentración de Papaína disminuye en la pulpa de la lechosa de acuerdo al estado de maduración del fruto. Comparado con el Estado de maduración 1, en el Estado 6 hubo una disminución del 90.98% en la concentración de papaína, lo que quiere decir que se perdió gran cantidad de la enzima, pero la misma no desapareció. En cuanto al estudio de los Sólidos Solubles y el % Humedad estos aumentan a medida que transcurren los estados de maduración, lo que quiere decir que la lechosa va adquiriendo mas porcentaje de azucares y agua y perdiendo porcentaje en otros nutrientes a medida que madura. El pH de las muestras se mantuvo ligeramente ácido con valores en un rango de entre 5 y 7 aproximadamente; por lo tanto la lechosa mantiene un ambiente propicio para que la Papaína no se degrade a medida que el fruto va madurando. Los métodos utilizados para la purificación, refinación y cuantificación de la papaína permiten inferir que los resultados son confiables, ya que son métodos avalados por instituciones de químicos e ingenieros químicos, además de haber sido utilizados en otros trabajos anteriores para la determinación de la papaína en lechosa. Se puede concluir que la ingesta de pulpa de lechosa si es beneficiosa para el ser humano, ya que además de suplir los requerimientos mínimos diarios de vitaminas A, C y de complejo B; se demuestra que la fruta en su máximo estado de maduración (Estado 6, donde es completamente amarilla o naranja y de consistencia blanda), posee una cantidad considerable de Papaína que, de ser consumida, actuaría en el organismo positivamente. Recomendaciones Realizar un estudio de purificación alternativo, con un método diferente para comparar resultados en cuanto a pureza o calidad del producto. Almacenar las muestras de la pulpa de la lechosa aproximadamente a 4ºC para no alterar las propiedades de la misma. Cuantificar la Papaína a través de otro método experimental. Hacer una comparación de las concentraciones de la Papaína en la pulpa vs. látex de la fruta, para los primeros estados de maduración. Utilizar la pulpa de la fruta sin agregarle agua para no alterar las concentraciones. Estudiar otra variedad de lechosa (Carica Papaya L.) para estudiar si hay alguna variación en el efecto de la maduración sobre la concentración de papaína; en lo que se refiere a las concentraciones como tal. Calcular la actividad Proteolítica de la Papaína para cada estado de maduración de la lechosa, para conocer el comportamiento de dicha actividad con respecto al tiempo. Referencias bibliográficas Textos PAMPLONA Jorge; (1997) “Enciclopedia de las plantas medicinales”. Editorial Safeliz. 1ra Edición. Tomo 2. Pg: 435 AVILAN Luis, RENGIFO Carmelo; (1986) “El Lechosero”. 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