CAMBIOS MACROSCOPICOS Y MICROSCOPICOS PRODUCIDOS

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CAMBIOS PATOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIÓN DE UNA
CEPA PATÓGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus)
MARITZA AMPARO CÁRDENAS FIGUEROA
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
Bogotá D.C.
2006
CAMBIOS PATOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIÓN DE UNA
CEPA PATÓGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus)
MARITZA AMPARO CÁRDENAS FIGUEROA
Código: 14961037
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de
MÉDICO VETERINARIO
Director
Dr. DIEGO ORTÍZ ORTEGA. MV
Codirector
Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL. MV
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
BOGOTÁ
2006
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
DIRECTIVOS
RECTOR
Hno. FABIO GALLEGO ARIAS
Vice-Rector Académico
Hno. CARLOS GABRIEL GÓMEZ
RESTREPO
Vice- Rector de Promoción y
Hno. EDGAR FIGUEROA ABRAJIM
Desarrollo Humano
Vice –Rector Administrativo
Dr. MAURICIO FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ
Decano de la Facultad
Dr. PEDRO PABLO MARTÍNEZ MÉNDEZ
Secretaria Académica
Dra. MARÍA TERESA URIBE MALLARINO
Director Clínica Veterinaria
Dr. HUMBERTO VASQUÉZ ROMERO
APROBACIÓN
DIRECTOR
____________________________________
Dr. DIEGO ORTÍZ ORTEGA
CODIRECTOR
_____________________________________
Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL
JURADO
_____________________________________
Dr. CÉSAR AUGUSTO DÍAZ ROJAS
JURADO
_____________________________________
Dra. IOVANNA CASTELLANOS LONDOÑO
SECRETARIA ACADÉMICA
____________________________________
Dra. MARÍA TERESA URIBE MALLARINO
COMPROMISO
Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la doctrina
de la iglesia católica en asuntos de dogma y moral.
Ni la universidad, ni el asesor, ni el jurado calificador son responsables de las
ideas expuestas por el graduando.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Diego Ortiz Ortega por su apoyo y paciencia incondicional, mil
agradecimientos; al Dr. Jorge Humberto Ossa Aristizabal, quien aporto su
conocimiento durante el desarrollo de este estudio.
Un agradecimiento muy especial a César Díaz quien fue mi bastón durante estos
años en la universidad, a la Dra. Iovanna Castellanos le agradezco el valioso
tiempo que me dedicó durante la realización de esta investigación
A la Universidad de La Salle, Corpoica CEISA y a la Empresa Colombiana de
Productos Veterinarios (VECOL S.A.) por su aporte financiero para la elaboración
de esta investigación.
A todas las personas que me brindaron su apoyo en las diferentes etapas de la
carrera y a todas aquellas personas que directa o indirectamente brindaron su
ayuda para la culminación de este trabajo.
DEDICATORIA
Con todo cariño a mi mami Amparo Figueroa por apoyarme en cada uno de los
pasos que he dado en la vida para lograr cada una de mis metas.
A mi papi Alfredo Cárdenas quien anhelaba estar junto a mi en este momento de
mi vida.
TABLA DE CONTENIDO
Pág
GLOSARIO
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN
1
1.
REVISIÓN LITERARIA
3
1.1.
HISTORIA
3
1.1.1.
Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio
5
1.1.2.
Sangre
7
1.1.2.1.
Morfología e índices de las células sanguíneas periféricas
7
1.1.2.1.1
Eritrocitos
7
1.1.2.1.2. Trombocitos
9
1.1.2.1.3. Leucocitos
9
1.2.
ETIOLOGÍA
11
1.2.1.
Tamaño y estructura
11
1.2.2.
Estabilidad a la temperatura y pH
11
1.2.3.
Relación con el oxígeno
12
1.2.4.
Caracterización del Clostridium
12
1.2.5.
Toxinas
13
1.2.5.1.
Exotoxinas
14
1.3.
EPIDEMIOLOGÍA
16
1.4.
RESERVORIO
18
1.5.
PATOGENIA
19
1.6.
SIGNOS CLÍNICOS
21
1.7.
LESIONES
22
i
Pág
1.8.
NECROPSIA
23
1.9.
DIAGNÓSTICO
24
1.10.
TRATAMIENTO
26
1.11.
PREVENCIÓN Y CONTROL
26
1.11.1
Estudios realizados con la producción de vacunas
27
2.
MATERIALES Y MÉTODOS
29
2.1.
POBLACIÓN
29
2.2.
DISEÑO EXPERIMENTAL
30
2.3.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
31
2.3.1.
Muestras de sangre
31
2.3.1.1.
Examen cuantitativo
33
2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos
33
2.3.1.1.2. Índices eritrocitarios
34
2.3.1.1.3. Volumen corpuscular media (VCM)
34
2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM)
34
2.3.1.1.5. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH)
34
2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos
35
2.4.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
35
2.5.
EXAMEN MACROSCÓPICO
36
2.6.
Inclusión de parafina, coloración hematoxilina y eosina
37
2.7.
EXAMEN MICROSCÓPICO
38
2.8.
DESECHO DE MATERIAL
38
3.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
40
3.1.
Muestra de sangre
40
3.1.1.
Hematocrito
40
3.1.2.
Hemoglobina
42
3.1.3.
Hemoglobina corpuscular media
43
3.1.4.
Concentración media de hemoglobina
44
ii
Pág
3.1.5.
Eritrocitos
45
3.1.6.
Proteína plasmática
46
3.1.7.
Proteína Sérica
47
3.1.8.
Creatinin kinasa
48
3.1.9.
Leucocitos
49
3.1.10.
Neutrófilos
50
3.1.11.
Linfocitos
52
3.1.12.
Eosinófilos
54
3.1.13.
Monocitos
56
3.1.14.
Células Foa – Kurloff
58
3.2.
TEMPERATURA
59
3.3.
OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LESIONES
60
3.4.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LESIONES
62
4.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
68
5.
BIBLIOGRAFÍA
71
6.
ANEXOS
80
iii
INDICE DE TABLAS
Pág
Tabla 1.
Parámetros hematológicos de cobayos (Cavia porcellus).
8
Tabla 2.
Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia
porcellus).
31
Tabla 3.
Escala subjetiva del grado de lesión producida por
Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus)
inoculados experimentalmente.
39
Tabla 4.
Resultados de Hematología, promedio de datos grupos A,
B, C, D, E, F y G, de cobayos (Cavia porcellus).
41
Tabla 5.
Resultados estadísticos de la calificación de lesiones
histopatológicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus)
inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei.
64
iv
INDICEDE FIGURAS
Pág
Figura 1. Enrejado del hematocitómetro.
33
Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad toráxica y peritoneal de
cobayos (Cavia porcellus).
61
Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculación.
61
Figura 4. Clostridiosis. Bacilos de Clostridium chauvoei en músculo
estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus).
65
Figura 5. Clostridiosis. Músculo estriado esquelético de cobayo
(Cavia porcellus). Infiltración polimorfonucleares y necrosis
de coagulación.
65
Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium
chauvoei, leucocitos polimorfonucleares y neutrófilos en
músculo estriado esquelético.
B) Corte longitudinal de músculo estriado esquelético animal
testigo, el cual no presenta cambios patológicos aparentes.
66
v
INDICE DE GRÁFICAS
Pág
Gráfica 1.
Valor promedio
inoculación.
del
hematocrito
post
40
Gráfica 2.
Valor promedio de la hemoglobina por horas post
inoculación.
42
Gráfica 3.
Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por
horas post inoculación.
43
Gráfica 4.
Valor promedio la concentración media de hemoglobina
por horas post inoculación.
44
Gráfica 5.
Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculación.
45
Gráfica 6.
Valor promedio de proteína plasmática por horas post
inoculación.
46
Gráfica 7.
Valor promedio de proteína sérica por horas post
inoculación.
47
Gráfica 8.
Valor promedio de creatinin kinasa por horas post
inoculación.
48
Gráfica 9.
Valor promedio de leucocitos por horas post inoculación.
49
Gráfica 10.
Valor promedio de neutrófilos (valor absoluto) por horas
post inoculación.
50
Gráfica 11.
Valor promedio de neutrófilos (valor relativo) por horas
post inoculación.
51
Gráfica 12.
Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas
post inoculación.
52
Gráfica 13.
Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas
post inoculación.
53
Gráfica 14.
Valor promedio de eosinófilos (valor absoluto) por horas
post inoculación.
54
vi
por
horas
Pág
Gráfica 15.
Valor promedio de eosinófilos (valor relativo) por horas
post inoculación.
55
Gráfica 16.
Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas
post inoculación.
56
Gráfica 17.
Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas
post inoculación.
57
Gráfica 18.
Valor promedio de células Foa – Kurloff (valor absoluto)
por horas post inoculación.
58
Gráfica 19.
Valor promedio
inoculación.
59
de
temperatura
vii
por
horas
post
INDICE DE ANEXOS
Pág
Anexo 1.
Resultados de Hematología, grupo A (3 horas post
inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
80
Anexo 2.
Resultados de Hematología, grupo B (6 horas post
inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
81
Anexo 3.
Resultados de Hematología, grupo C (9 horas post
inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
82
Anexo 4.
Resultados de Hematología, grupo D (12 horas post
inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
83
Anexo 5.
Resultados de Hematología, grupo E (15 horas post
inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
84
Anexo 6.
Resultados de Hematología, grupo F (18 horas post
inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
85
Anexo 7.
Resultados de Hematología, grupo G (Control), cobayos
(Cavia porcellus).
86
Anexo 8.
Resultados estadísticos de la Temperatura de los
cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa
patógena de Clostridium chauvoei.
87
Anexo 9.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
88
Anexo 10.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
89
viii
Pág
Anexo 11.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
90
Anexo 12.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
91
Anexo 13.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
92
Anexo 15.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
94
Anexo 16.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
95
Anexo 17.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
96
Anexo 18.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
97
Anexo 19.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
98
Anexo 20.
Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos
(Cavia porcellus).
99
Anexo 21.
Resultados estadísticos de la calificación de lesiones
histopatológicas en tejido de Cavia porcellus inoculados
con la cepa patógena de Clostridium chauvoei
100
Anexo 14.
ix
93
GLOSARIO
AGENTE INFECCIOSO: Organismo capaz de producir una infección o
enfermedad infecciosa.
ANTICUERPOS: Compuesto proteico producido en el organismo, que
pertenece al grupo de las globulinas, se origina por exposición a un antígeno
que se ha introducido en el organismo y que es extraño a él.
BACTERIA: Microorganismo del grupo de los protistas inferiores caracterizado
por presentar organización celular procariótica. Pueden ser inmóviles ó móviles
para lo cual necesitan flagelos.
EDEMA: Aumento anormal de la cantidad de líquido intersticial situado en el
interior de los tejidos y en la acumulación de líquido trasudado en las diversas
cavidades serosas del organismo.
ENZOÓTICO: Peculiar de una localización, o presente constantemente en ella.
EPIZOÓTICO: Que ataca a muchos animales en cualquier región al tiempo; de
amplia difusión y rápida extensión.
INFECCIÓN: Penetración y desarrollo en un ser vivo de microbios patógenos,
que invaden al organismo por vía sanguínea vertiendo sus toxinas y causando
enfermedad.
INOCULACIÓN:
Introducción
de
microorganismos
patógenos,
material
infectado, suero u otras sustancias en tejidos de organismos vivos o en medios
x
de cultivo, introducción de un productor de enfermedad en un animal sano,
para producir una forma suave de la enfermedad, seguida por inmunidad.
TOXINA: Sustancias venenosas de tipo diverso que tienen un efecto activo
sobre el organismo animal y que en cantidades moderadas pueden provocar
su muerte o la presentación de cuadros patológicos mas o menos graves.
TOXOIDE: Toxina que ha perdido sus propiedades deletéreas por un
tratamiento con calor o con un agente químico pero que conserva su
capacidad para estimular la formación de anticuerpos (antitoxinas) y para
unirse a ellos.
xi
RESUMEN
El Clostridium chauvoei causa Pierna Negra ó carbón sintomático, una enfermedad
fatal en bovinos y ovinos. Se presenta en forma esporádica en áreas donde el
microorganismo esta presente en el suelo. Los animales presentan toxemia,
tumefacciones crepitantes en la musculatura y muerte. Los síntomas son confundidos
con edema maligno causado por Clostridium chauvoei, Clostridium septicum,
Clostridium novyi o Clostridium perfringes. Este estudio describe hallazgos
histopatológicos en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con Clostridium
chauvoei. Los cobayos fueron inoculados vía intramuscular con 0.5 mililitros de una
solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de
Clostridium chauvoei; y se sacrificaron cada tres horas. Los tejidos fijados en
formaldehído se procesaron por la técnica de inclusión en parafina, coloreados con
Hematoxilina y Eosina. Los cambios severos se observaron en animales de 18 horas
post inoculación, las lesiones fueron tumefacciones crepitantes en musculatura
estriada esquelética, tejidos color rojo, marrón oscuro, con estrías negras; algunas
áreas aparecieron húmedas, desprendieron exudado oscuro mezclado con gases. Se
encontró marcada infiltración de neutrófilos polimorfonucleares y se observó necrosis
de coagulación. La muerte de los cobayos comienza a presentarse entre las 15 y 18
horas post inoculación. La técnica de inclusión en parafina, coloreado con
Hematoxilina y Eosina permite ver el agente causal y relacionarlo con lesiones
anatomopatológicas, su uso permite un diagnóstico económico para ésta
enfermedad.
Palabras clave: Clostridium chauvoei; Pierna Negra; Carbón sintomático;
Histopatología.
xii
ABSTRACT
Clostridium chauvoei causes Blackleg, a fatal disease of bovine and ovine species. It
appears in a sporadic form in areas where the microorganism is present in the soil.
The animals present toxemia, crepitant swellings in the muscle and died. The
symptoms are confused with malignant edema caused by Clostridium chauvoei,
Clostridium septicum, Clostridium novyi o Clostridium perfringes. The present study
describes histopathologic findings in Guinea pigs (Cavia porcellus) tissues inoculated
with the bacterium Clostridium chauvoei. The Guinea pigs were inoculated
intramuscular with 0.05 millilitres of solution of calcium Chloride (CaCl2) to 5% content
100 infecting doses of Clostridium chauvoei followed by sacrifice every three hours.
The tissues were fixed in formaldehyde and processed by the paraffin inclusion
technique, colored with Eosin and Hematoxylyn. Severe changes were observed in
animals after 18 hours post inoculation, the lesions were crepitant swellings in skeletal
muscle, coloured spotted tissues from dark red to brown along with black grooves; a
dark exudation mixed with gas was also released in some areas. Neutrophilic
infiltration was marked. And coagulation necrosis was observed. The death of the
Guinea pigs begins to appear between the 15 and 18 hours post inoculation. The
paraffin inclusion technique, colored with Eosin and Hematoxylyn allows to see the
causal agent and to relate it to anatomopathologycs, injuries, its use allows an
economic diagnostic for this one disease.
Keys words: Clostridium chauvoei, black leg, gas gangrene, histopathology.
xiii
INTRODUCCIÓN
Esta investigación se realizó con el fin de describir los cambios secuénciales
hematológicos, anatomopatológicos e histopatológicos producidos por la
inoculación experimental en cobayos (Cavia porcellus) por la cepa de
Clostridium chauvoei (ATCC), para determinar que tipo de tejido es el más
afectado y relacionar dichos hallazgos con los valores hematológicos
correspondientes, para clasificar que tipos de tejidos se podrían utilizar en otras
técnicas diagnósticas.
En 1865 Feser observó el germen por primera vez en el tejido conjuntivo
subcutáneo de un bóvido enfermo. Lo describió con el nombre Bacillus
sarcophysematos. El carbunco sintomático fue separado por vez primera
etiológicamente por Bollinger (1875) y Feser (1876) del carbunco bacteridiano,
constituyendo una enfermedad independiente. Arloing y col. aclararon la
etiología de manera incontrovertible en los años 1879 – 1884, desarrollando ya
un procedimiento de vacunación preventiva. Roux (1887) cultivó el bacilo sobre
medios nutricios artificiales. Entre el gran número de científicos que estudiaron
el germen y la enfermedad hay que mencionar en especial a Foth, Kitasato, Kilt
y Zeissler 1 .
El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia esporulada, que produce
una enfermedad fatal en rumiantes y es conocida como carbunco sintomático o
1
BEER, Joachim. 1981. Enfermedades infecciosas de los animales domésticos. Tomo II.
Enfermedades producidas por bacterias y hongos e intoxicaciones. p. 194.
1
“pierna negra 2 ”; es de distribución mundial, ataca con preferencia a bóvidos
jóvenes menores de 3 años y bien alimentados 3 .
Se considera que esta enfermedad genera un desequilibrio económico al
ganadero y por consiguiente al país 4 , debido al costo de los tratamientos que
se deben instaurar para su control y finalmente con la pérdida de los animales 5 ,
por esta razón lo que se desea es que el ganadero y las personas que estén
directamente relacionadas con bovinos, ovinos y cerdos conozcan los
síntomas, los cambios macroscópicos y microscópicos que presentan los
animales afectados con esta patología.
2
CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. Protective antigenicity of protoplasts and
sphaeroplasts of a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General
Microbiology. p. 179.
3
BIBERSTEIN, E. 1994. Tratado de microbiología veterinaria. p. 345.
4
CARABALLO, Luis Carlos. 1973. Identificación y clasificación de cepas de Clostridium. p. 46.
5
PORTILLA, Guillermo; FRANCO, Orlando. Carbón sintomático ¡una enfermedad que mata!.
ICA Instituto Colombiano Agropecuario. p. 2.
2
1. MARCO TEÓRICO
1.1. HISTORIA
El Clostridium comienza a estudiarse cuando Koch, le demuestra a los amigos
de Davaine, los errores en las experiencias de Jaillard y Leplat, quienes en
realidad habrían inoculado conejos "con otro virus", arremete contra Signol,
asfixiando caballos sanos y recuperando de sus cadáveres ese "otro virus",
largo, translúcido, flexuoso y móvil, era un "vibrión séptico", probablemente el
Clostridium septicum o el Clostridium chauvoei 6 .
Feser observó en 1865 el germen por primera vez en el tejido conjuntivo
subcutáneo de un bóvido enfermo. Lo describió con el nombre Bacillus
sarcophysematos 7 . El carbunco sintomático fue diferenciado del bacteridiano
por Charbert a base de síntomas y lesiones. Bollinger (1875), fue el primero en
demostrar que el carbunco bacteridiano y el sintomático tenían agentes
etiológicos distintos. Está conclusión fue confirmada por Feser en 1876.
Arloing, Cornevin y Thomas, en 1887, realizaron aportaciones interesantes
sobre el carbunco sintomático, lo que explica que con frecuencia hayan sido
considerados como los descubridores del germen. Aunque han contribuido
considerablemente al conocimiento de la enfermedad, su causa e inmunidad, el
primero en cultivar el germen en medios artificiales fue Roux, en 1887. Kitasato
aportó nuevos perfeccionamientos a la técnica del cultivo de Clostridium
chauvoei en 1889 8 .
6
BULLOCH, W. 1930. Bacillus anthracis. I: 6
BEER, Joachim. Op. cit., p. 194.
8
MERCHANT, I; PACKER, R. 1980. Bacteriología y virología veterinaria. p. 411.
7
3
A partir de 1885, empiezan las clases del doctor Claude Vericel. Entre los
alumnos que conformarían la primera promoción de egresados con el título de
Maestro en veterinaria, se cuenta a Federico Lleras Acosta, quien fue su
discípulo preferido y a su lado vio los primeros microbios. Lleras Acosta, se
dedicó a la práctica de laboratorio aplicado a la clínica y fundó el primer
laboratorio de diagnóstico privado en Bogotá 9 .
En 1905, aparece en el país el carbón sintomático. El doctor Claude Vericel
hace el estudio clínico y anatomopatológico y su discípulo Federico Lleras
Acosta aísla el agente causal y prepara la primera vacuna contra la
enfermedad 10 .
El diagnóstico bacteriológico de los Clostridium se estableció teniendo en
cuenta: forma de crecimiento y aspecto de las colonias según Zeissler,
reacción bioquímica sobre azúcares, acción proteolítica en la leche, inoculación
en curí y observación de lesiones diferenciales. Las especies caracterizadas
fueron
los
Clostridium
chauvoei,
septicum,
perfringens,
novyi,
y
haemolyticum 11 .
Históricamente, la inoculación en animales de laboratorio se ha empleado
como ayuda diagnóstica en muchas enfermedades causadas por Clostridios.
La tipificación de las toxinas que dichas bacterias producen producto de su
metabolismo se realiza mediante neutralización de los efectos letales de la
toxina en cobayos y ratones utilizando antisueros específicos para cada tipo
de clostridio. Este método no es aceptado ya en muchos países por bioética y
9
GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. 2002. Medicina veterinaria y zootecnia en Colombia.
Trayectoria durante el siglo XX y perspectivas para el siglo XXI. p. 256.
10
En: www.veterinaria.unal.edu.co/historia_mv.html
11
GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. Op. cit., p. 255.
4
no todos los laboratorios de diagnóstico están equipados o preparados para
realizar estas pruebas 12 .
1.1.1. Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio
Los aspectos más importantes de uso que se le da a este animal en el
laboratorio dada su economía, sensibilidad y fácil manejo son:
En la preparación de sueros hiperinmunes.
En la preparación de reactivos para serología.
En el diagnóstico de enfermedades (infecciones virales, infecciones bacteriales
o por protozoarios).
En el control de calidad de productos biológicos de uso humano y veterinario 13 .
Kerrin (1934) comprobó que el Clostridium chauvoei en condiciones adecuadas
puede producir toxina que, a dosis de 0.025 – 0.5 ml intravenosa, al ratón le
produce síntomas respiratorios y la muerte en unos minutos. La inyección
subcutánea de la toxina a cobayos y ratones no es mortal, pero produce
edema. Es bastante admisible la producción de exotoxina por este germen,
aunque no sea tan potente como la de otras especies del grupo del edema
gaseoso, como Clostridium septicum, Clostridium perfringens y Clostridium
novyi 14 .
Ryff y Lee observaron que el hámster es más receptivo al Clostridium chauvoei
que el cobayo y muere con la quinta parte de la dosis mortal precisada por
éste. La inoculación de cultivos puros a los animales de laboratorio produce la
12
RASDOSTITS, O; et al. 2002. Medicina Veterinaria, Tratado de las enfermedades del
Ganado bovino, ovino, porcino, caprino y equino. Vol I. p. 894.
13
PARRA, Danilo; CORREDOR, Hugo. 1970. Estudio del curí (Cavia cobaya). Contribución al
estudio del curí como animal de laboratorio en Colombia. p. 16.
14
MERCHANT, I; PACKER, R. Op cit., p. 412.
5
muerte con muchos de los síntomas característicos del carbunco sintomático.
Los cobayos, conejos, ratones blancos y ratas albinas pueden ser infectados,
siendo el cobayo el animal más susceptible, empleándose corrientemente
como animal de experimentación para este germen 15 .
Entre otros estudios encontramos las observaciones halladas por Ernesto
Sáenz, en el cual realiza inoculaciones para hallar diagnósticos sospechosos
de carbón sintomático; por ejemplo, un curí recibe 1 centímetro cúbico de
cultivo Tarozzi de 24 horas por vía intramuscular, y muere en 24 horas. Al
realizar la necropsia se observa un extenso edema sero-hemorrágico de pierna
y abdomen. Los órganos internos permanecen normales. Los frotis de la
superficie de hígado muestran un bacilo corto y delgado, gram positivo, sin
esporos. El agente se recupera del hígado y de la sangre del corazón,
reproduciendo en la superficie de agar sangre los mismos caracteres culturales
de los cultivos primitivos.
Después otros dos curies, con inoculaciones de 0.5 cc IM y de 1 centímetro
cúbico (la mitad por vía IM y la mitad por vía intraperitoneal) reaccionan de
idéntica manera al anterior, recobrándose de su sangre cardíaca y del hígado
el mismo bacilo 16 .
Aparte de la diferenciación del Clostridium septicum con las reacciones de los
azúcares, la inoculación del Clostridium chauvoei en el cobayo no muestra
largos filamentos en la superficie del peritoneo o el hígado, que es una prueba
diagnóstica cuando se inocula con Clostridium septicum 17 . En la superficie del
hígado de cobayas que murieron tras el contagio con Clostridium chauvoei, el
germen aparece por lo regular aislado y en cadenas cortas 18 .
15
Ibid., p. 413.
SÁENZ, Ernesto. 1944. Consideraciones e identificación de los principales anaerobios del
género Clostridium patógenos para los animales domésticos. Tesis, Universidad Nacional de
Colombia. p. 66.
17
BAKER, F.J.; BREACH, M.R. 1990. Manual de técnicas de microbiología medica. p. 214.
18
BEER, Joachim. Op. cit., p. 195.
16
6
Aunque en muchos casos la identificación final de los clostridios patógenos no
recae en la inoculación de animales es, sin embargo, imprescindible para otros
tales como el Clostridium botulinum. Se efectúa la inoculación de los cultivos
líquidos en los cobayos uno de los cuales se ha protegido con la antitoxina
específica. Se aconseja la adición de cloruro cálcico al cultivo antes de la
inyección para que actúe como agente necrosante, de esta manera se facilita la
multiplicación de los gérmenes y la subsiguiente producción de toxina. Método:
inocular por vía IM 0.2 ml de un cultivo en caldo glucosado del día anterior en
los cobayos, uno protegido por antitoxina. La muerte del no protegido tiene
lugar en uno o dos días 19 .
1.1.2. Sangre
1.1.2.1. Morfología e índices de las células sanguíneas periféricas
Los valores hematológicos de cobayos (Cavia porcellus) reportados, se
encuentran en la tabla 1.
1.1.2.1.1. Eritrocitos
Los eritrocitos del Cavia porcellus, tienen una moderada anisocitosis, con un
diámetro entre los 6.6 – 7.9 µm 20 , algunos microcitos, cuando están presentes
pueden tener un diámetro de 3.5 µm, los eritrocitos de los cobayos son células
sanguíneas rojas largas, comparadas con otras especies comunes de
laboratorio 21 , los eritrocitos policromáticos pueden estar alrededor del 25% de
19
BAKER, F.J.; BREACH, M.R. Op. cit., p. 214.
SCHERMER, S. 1967. The blood morphology of laboratory animals. p. 23
21
JAIN, N.C. 1986. Schalm´s veterinary hematology. 4 ed. Philadelphia: Lea de Febiger. p. 18.
20
7
los eritrocitos circulantes en neonatos, 4.5% en los jóvenes, y 1.5% en
adultos 22 . Los índices eritrocitarios en los cobayos (i.e, número de eritrocitos,
hemoglobina y volumen de células empaquetadas. Tabla 1), son relativamente
mas bajas comparados con valores observados en otras especies de roedores
de laboratorio 23 .
Tabla 1. Parámetros hematológicos de cobayos (Cavia porcellus)
1
1
2
3
RBC (x 106/mm3) Rango
4,2 - 7,0
4,5 - 7,0
3,2 - 8,0
PCV (%) Rango
37 - 48
37 - 48
32 - 50
Hb (g/dL) Rango
11 - 15
11 - 15
10 - 17,2
MCV (µ3) Rango
-
-
71 - 96
MCH (µµg) Rango
-
-
23 - 27
MCHC (%) Rango
-
-
26 - 39
WBC (x 103/mm3) Rango
7 - 18
7 - 18
5.5 – 17.5
Neutrófilos (%) Rango
28 - 44
28 - 44
22 – 48
Linfocitos (%) Rango
39 - 72
39 - 72
39 - 72
Eosinófilos (%) Rango
1-5
1-5
0–7
Basofilos (%) Rango
0-3
0-3
0 – 2.7
Monocitos (%) Rango
3 - 12
3 - 12
1 - 10
Harkness, J.E.1995. 2 Johnson – Delaney, C.A. 1996. 3 Hillyer, E.V.1996.
22
ALBRITTON, A.B. 1958. Standard values in blood. p. 30.
MANNING, P.J; WAGNER, J.E; HARNESS, J.E. 1984. Biology and diseases of guinea pigs.
p. 54
23
8
1.1.2.1.2. Trombocitos
Las plaquetas de los cobayos tienen una forma ovalada irregular (2 – 3 µm de
longitud), y la periferia del citoplasma es pálida en comparación con la
coloración intensa dentro de la célula Los rangos numéricos observados de
plaquetas circulantes reportadas en algunas referencias: 120 – 132 x103 /mm3
24
, 161 – 368 x103 /mm3 25 , 530 +/- 149 x103 /mm3 26 , 250 – 850 x103 /mm3 27 ,
250 – 850 x103 /mm3 28 , y 260 – 740 x103 /mm3 29 .
1.1.2.1.3. Leucocitos
Los neutrófilos de los cobayos tienen aproximadamente de 10 – 12 µm de
diámetro, son picnóticos, tienen un núcleo segmentado (con un numero de 5 ó
mas segmentos), los gránulos eosinofilicos dentro del citoplasma, pareciendo
en algunos casos seudoesinofilia un “Drumstick” lóbulo de cromatina sexual
puede estar presente en el núcleo de los neutrófilos de los cobayos hembras,
los eosinófilos son mas largos que los neutrófilos (alrededor de 10 – 15 µm en
diámetro). Los basófilos son raramente encontrados, son del mismo tamaño de
losa neutrófilos o ser más largos, el núcleo tiene una coloración púrpura, y en el
citoplasma se encuentran gránulos violetas de diferentes tamaños 30 . Los
linfocitos son los leucocitos predominantes (Tabla 1), y los linfocitos pequeños
están presentes en mayor cantidad, tienen forma alargada, no son más largos
24
SCHERMER, S. Op. cit., p. 24.
MITRUKA, B.J; RAWNSLEY, H.M. 1977. Clinical biochemical and haematological reference
values in normal experimental animals and normal humans. p. 33.
26
BENIRSCHKE, K; GARNER, F.M; JONES, T.C. 1978. pathology of laboratory animals. New
York: Springer – Verlag. Nº 1. p. 45.
27
HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. Op. cit., p. 89
28
JOHNSON – DELANEY C.A. 1996. Exotic companion medicine handbook. Lake Worth, FL:
Wingers Publishing. P. 43
29
HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Biology, husbandry, and
clinical techniques (of guinea pigs and chinchillas). In: Hillyer E.V., Quesenberry K.E, eds.
Ferrets, rabbits, and rodents clinical medicine and surgery. Philadelphia: WB Saunders. p. 58
30
SCHERMER, S. Op. cit., p. 25
25
9
que los eritrocitos. Los linfocitos pequeños de los cobayos son redondos, de
núcleo picnótico, rodeado por una banda en el citoplasma. Los linfocitos
pueden ser dos veces mas largos con menos picnosis, con un núcleo mas
ovalado y brillante y una zona extensa del citoplasma que en algunos casos
puede contener pequeños y largos gránulos azurofílicos, los monocitos de los
cobayos son usualmente mas largos que los linfocitos, tienen un núcleo
ovalado con una pequeña cantidad de cromatina y tiene un citoplasma azulgrisáceo.
Ocasionalmente las células Foa-Kurloff (KC cells), las cuales son especificas
de los cobayos, pueden ser observadas en la circulación en una proporción
mayor del 3 – 4% del conteo diferencial de los leucocitos 31 . No hay una
diferencia significativa en el número de KC en machos y hembras después de
los 2 a 3 meses de edad. Las células KC, son leucocitos especializados y
contienen un cuerpo de inclusión intracitoplasmático formado por un
mucopolisacárido, este tipo de células pueden ser encontradas en sangre
periférica y en la glándula del timo, se encuentran en mayor proporción en
pulmón, bazo y placenta bajo estimulación estrogénica y preñez 32 . El origen
exacto y función de estas células es desconocida, sin embargo se especula
que pueden tener una función de células asesinas en la circulación general o
como protector de antígenos fetales en la placenta 33 .
31
JAIN, N.C. 1986. Op. cit., p. 1110.
IZARD, J; BARRELLIER, M.T; QUILLEC, M. 1976. The Kurloff cell – its differentiation in the
blood and lymphatic system. Cell Tissue Res 173: p 237.
33
MARSHALL, A.H.E; SWETTENHAM, K.V; VERNON – ROBERTS, B; REVELL, P.A. 1971.
Studies on the function of de Kurloff cell. Int Arch Allergy Appl Immunol. 40: p. 137.
32
10
1.2. ETIOLOGÍA
El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia en forma de bacilo, móvil
gram positivo, agente causal del carbón sintomático 34 .
1.2.1. Tamaño y estructura
Esta bacteria es encapsulada (cápsula de ácido D poliglutámico), tiene un
diámetro de 1 µm y de 3 a 6 µm de largo, se encuentra en forma de esporas en
el suelo, siendo muy resistente. La presentación de la enfermedad, se produce
por la toxina 35 .
Necesita medios ricos en cisteina y en vitaminas hidrosolubles. Sus colonias
son redondas con contorno liso y en dos días alcanzan un tamaño de incluso
de 4 >m.
La hemólisis es variable. A diferencia de Clostridium septicum,
fermenta la sacarosa, pero no la salicina y no crece a 44 ºC 36 .
1.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH
Son microorganismos mesófilos su intervalo de crecimiento esta comprendido
entre 15 y 45ºC, aproximadamente, y su temperatura óptima de crecimiento
entre 25 y 40ºC.
34
KOJIMA, A. et al. 2000. Clonación y expresión de un gen que codifica la flagelina de
Clostridium chauvoei. Veterinary Microbiology. 76, p. 359.
35
DI GENARO, M. et al. Clostridium chauvoei: Inmunological characterization of antigenic
preparations. Anaerobe. 5, 1999. p. 301.
36
BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345.
11
El pH del medio afecta al crecimiento microbiano; por tanto, cada organismo
tiene un rango de pH que hace posible su crecimiento. Este intervalo, para la
mayoría de las bacterias, está entre 4 y 9, y el pH óptimo alrededor de 7 37 .
1.2.3. Relación con el oxígeno
Los microorganismos varían en cuanto a sus necesidades o tolerancia al
oxígeno libre. Entre los microorganismos que no toleran en absoluto el oxígeno
e incluso mueren en su presencia se encuentra el género Clostridium. La razón
de la anaerobiosis estricta es la carencia, por parte de esos microorganismos,
de enzimas como la superóxido dismutasa y catalasa, que están implicadas en
la destrucción de los radicales tóxicos, derivados de la reducción metabólica
del oxígeno (radicales superóxido, hidrófilo y peróxido de hidrogeno) 38 .
1.2.4. Caracterización del Clostridium
En 1880, Prazmowski agrupó las bacterias anaerobias capaces de producir
fermentación y esporular en el género Clostridium, Actualmente en el género
Clostridium se agrupan más de 100 especies, de las cuales aproximadamente
20 son patógenas y se asocian a infecciones en el hombre y en los animales.
El resto de las especies son inocuas, y algunas presentan aplicaciones de
interés en la industria.
La clasificación de los microorganismos pertenecientes a este género se ha
establecido, tradicionalmente, de acuerdo con las características morfológicas,
culturales y bioquímicas, asociación a determinadas enfermedades, patogenicidad, toxigenicidad y propiedades serológicas. En los últimos tiempos esta
clasificación se basa en las homologías existentes en la secuencia del ADN y
37
38
VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. 2002. Manual de microbiología veterinaria. p. 75.
Ibid., p. 76.
12
del ARN ribosómico 16 S. La amplia diversidad en el porcentaje de guanina,
citosina (G+C) de las especies del género Clostridium sugiere que éste podría
dividirse al menos en dos géneros: las especies con un contenido en G+C del
22 al 34 %, en un género, y las especies que tienen de un 40 a un 55 %, en
otro. Recientemente, el género Clostridium ha sido incluido en la sección XX,
del volumen 3 (bacterias grampositivas con bajo contenido en G+C), de la 2ª
edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, dentro de la familia
Clostridiaceae 39 .
Estas secuencias también pueden servir para:
∗ Averiguar condiciones de cultivos de los organismos,
∗ Síntesis de oligonucleótidos para la identificación de su crecimiento en
lugares donde no están aislados o para monitorizar su distribución en la
naturaleza,
∗ Identificar los orígenes de esos genes,
∗ Comprender la diversidad y la filogenia de manera rápida y fácil.
La mayoría de los Clostridium son saprofitos inocuos, pero algunos tienen
carácter patógeno para el hombre y los animales causando patologías muy
graves 40 .
1.2.5. Toxinas
Las toxinas son quienes invaden e ingieren el tejido 41 . El Clostridium chauvoei
produce cuatro toxinas:
39
VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. Op. cit., p. 467.
JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. 1974. Taxonomy of the Clostridia: Ribosomal
Ribonucleic Acid Homologies among the Species. Journal of General Microbiology. p. 229.
41
GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal.
40
13
• α hemolisina necrotoxina
• β desoxirribonucleasa
• γ hialorunidasa
• δ hemolisina
De estas 4 toxinas la más letal es la α y de ahí radica su poder patógeno. Esta
bacteria resiste a los desinfectantes tipo amonio cuaternario pero no es
resistente a la formalina ni al hipoclorito de sodio, es por eso que la vacuna
para "la pierna negra" se inactiva a base de formol 42 . El peso molecular de
estas toxinas oscila entre 22 y 600 kDA.
Desde el punto de vista médico es importante la determinación de la capacidad
de producir toxinas de un clostridio aislado de una muestra clínica, así como la
caracterización de las toxinas producidas. Las pruebas clásicas que ponen de
manifiesto e identifican las toxinas son la prueba de letalidad en el ratón y la
neutralización con sueros específicos. Actualmente, se han desarrollado
pruebas inmunoenzimáticas (ELISA, látex, etc.) y genéticas (hibridación
ADN/ADN, amplificación de ADN por PCR) que resultan mas rápidas y eficaces
para la identificación de dichas toxinas 43 .
1.2.5.1 Exotoxinas
Los clostridios invasores producen durante su multiplicación activa exotoxinas
con propiedades necrosantes (histolíticas), hemolíticas o letales. Además,
enzimas tales como la colagenasa, proteinasa, desoxirribonucleasa y
42
VEGA, Marco. Carbunco sintomático. 2000. En:
<http//www.portalveterinaria.com/sections.php?op=viewarticle&artid=8>.
43
JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. Op cit., p. 243.
14
hialuronidasa, elaboradas por microorganismos en crecimiento, causan una
acumulación de productos de degradación toxica en los tejidos 44 .
Las exotoxinas son proteínas que se secretan al medio exterior durante el crecimiento del microorganismo o la lisis de la bacteria. En general, las exotoxinas
son producidas tanto por bacterias grampositivas como gramnegativas. Por su
naturaleza proteica, son muy inmunógenas e inducen la formación de
anticuerpos específicos capaces de neutralizar su efecto. La mayoría de las
exotoxinas son muy sensibles al calor, a las condiciones ácidas y a las enzimas
proteolíticas. En algunas ocasiones, la pérdida de su actividad tóxica por acción
del calor, formol, etc; proporciona una proteína que mantiene intactas las
propiedades antigénicas de la toxina, que se denomina toxoide. Este hecho
permite la utilización del toxoide en la inmunización contra las enfermedades
cuya sintomatología se basa en la acción de la exotoxina 45 .
La acción producida por las exotoxinas es muy específica a nivel celular,
pudiendo actuar, sin embargo, sobre varios tipos de células (citotoxinas), o
producir un efecto en un determinado sistema, órgano o tipo celular, como, por
ejemplo, el sistema nervioso (neurotoxinas), el tracto gastrointestinal
(enterotoxinas), las células hepáticas (hepatotoxinas), etc. Una clasificación
más completa resulta difícil, ya que dentro de las exotoxinas se agrupan un
conjunto muy heterogéneo de proteínas con diferente actividad biológica en
las células. No obstante, en función de su estructura molecular y su
mecanismo de acción, se distinguen varios tipos distintos de exoproteínas,
entre los que destacan: las toxinas A-B, las toxinas que disgregan la
membrana celular, las neurotoxinas y los superantígenos 46 .
44
DAVIS, Bernard; DULBECCO, Renato; EISEN, Hermar; GINSBERG, Harold. 1984. Tratado
de microbiología. p. 584.
45
VADILLO, S. PINZ, S. MATEOS, S. Op. cit., p. 225.
46
Ibid., p. 225.
15
1.3. EPIDEMIOLOGÍA
El carbón sintomático es casi siempre mortal, con 1 a 3 días de duración,
infeccioso pero no contagioso; de presentación enzoótica o epizoótica 47 , como
en zonas de inundación 48 .
Todavía se debate la puerta de entrada por la que penetra la bacteria al
organismo. Se supone, sin embargo, que dicha puerta de entrada se encuentra
en la mucosa del aparato digestivo después de la ingestión de alimento
contaminado a partir de heces infectadas y de cadáveres descompuestos de
animales muertos por la enfermedad. Aparece carbunco sintomático verdadero
cuando las esporas que no se alojan en los tejidos proliferan por mecanismos
que no han sido todavía identificados 49
En el campo aparece esta enfermedad con más frecuencia en bóvidos que
crecen con rapidez por estar sometidos a un plan intensivo de nutrición. La
mejoría del estado nutricional de las ovejas al aumentar la ingestión de
proteínas en su alimentación incrementa también su susceptibilidad a esta
enfermedad. En ovejas no se observa restricción en cuanto a edad. Se
sospecha que los esfuerzos, magulladuras o las indigestiones agudas
desencadenan los hechos 50 .
El Clostridium chauvoei habita en el intestino, en el hígado de perros y bóvidos
aparentemente sanos y en otros tejidos normales de las distintas especies en
el animal adulto, tanto sensibles como resistentes. Se encontró Clostridium
47
BLAHA, Thomas. 1995. Epidemiología especial veterinaria. p. 483.
VEGA, Marco. Op. cit.
49
Ibid.
50
JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. 1985. Patología de los animales domésticos. Tomo I. p.
223.
48
16
chauvoei, en el bazo e hígado del 20% de vacunos normales. No se conocen
las vías de infección; se admite la infección endógena y la infección adquirida a
partir del suelo por ingestión o a través de heridas. El microorganismo del
carbunco sintomático vive en el suelo donde puede permanecer viable durante
muchos años, siendo este el reservorio del agente causal, pero no se sabe si
allí se multiplica o sólo vive en la forma esporulada y se multiplica en el tubo
intestinal de los animales 51
La eliminación de la bacteria es constante por la vía digestiva de animales
infectados, que por ser un anaerobio estricto esporula para mantenerse vigente
en el medio ambiente, es una infección transmitida por el suelo, pudiendo
infectar el agua de los bebederos y los pastos 52 . La multiplicación de las
bacterias y la producción de toxinas, provocan la formación de lesiones que se
caracterizan por edema, hemorragia, y necrosis de las miofibrillas musculares.
También puede llegar a la sangre a través de algunas heridas en la mucosa de
los animales y de allí diseminarse por vía hematógena a distintos tejidos del
cuerpo, y causar la muerte rápidamente 53 .
El carbunco sintomático de los bóvidos tiene incidencia estacional y se registra
el mayor número de casos durante los meses cálidos del año 54 .
En ovejas, la enfermedad depende casi siempre de la infección de una herida.
En efecto, la infección de las heridas cutáneas durante el esquileo, castración o
amputación del rabo o del ombligo al nacimiento puede propiciar la aparición de
lesiones locales. A veces, es causa de brotes graves, la infección de la vulva y
de la vagina en la oveja durante el parto; la enfermedad puede aparecer en
51
VEGA, Marco. Op.cit.
WALTER, Wiliam; McBEE, Richard; TEMPLE, Kenneth. 1980.
microbiología. p. 323.
53
VEGA, Marco. Op. cit.
54
JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op.cit., p. 223.
52
17
Introducción a la
grupos de corderos y carneros jóvenes hasta de un año de edad, casi siempre
como consecuencia de infección de las heridas cutáneas que se producen
entre ellos al pelear 55 .
1.4. RESERVORIO
Los clostridios patógenos habitualmente están presentes en suelos ricos en
humus y pueden multiplicarse en el suelo en épocas cálidas, después de
períodos de lluvias intensas 56 . Las esporas pueden vivir en el suelo por mucho
tiempo y se han visto rebrotes de la enfermedad en terrenos donde la tierra fue
removida recientemente 57 .
También se localizan en el contenido intestinal de animales sanos y solo
causan enfermedad en circunstancias especiales. El carácter ubicuo de estos
microorganismos hace que la erradicación de las enfermedades por clostridios
sea prácticamente imposible y necesite un control mediante medidas
profilácticas 58 ; en el perro se puede ver Clostridium chauvoei en el hígado,
músculos e intestinos de este animal sin causar alteraciones aparentes.
Se han visto casos de Clostridium chauvoei en combinación Clostridium
septicum o Clostridium novyi, pero para que clasifique como pierna negra
propiamente dicha debe estar presente únicamente el Clostridium chauvoei;
sino clasifica como un caso de edema maligno 59 .
55
OCÁDIZ, J. 1990. Epidemiología en animales domésticos. Control de enfermedades. p. 107.
DAVIES, R; WRAY, C. 1996. Clostridium chauvoei. Journal Veterinary Medicine. 43, p. 119.
57
VEGA, Marco. Op. cit.
58
DAVIES, R; WRAY, C. Op.cit., p. 119.
59
VEGA, Marco. Op. cit.
56
18
1.5. PATOGENIA
Entre los estudios de laboratorio realizados por Antonio García en el
Zooprofiláctico de la ciudad de Bogotá y en el Colegio Mayor de Cundinamarca,
encontramos que utilizaba cobayos (Cavia porcellus) a los cuales inoculaba
con cepas de Clostridium chauvoei para observar los cambios que producía la
bacteria en los diferentes órganos del animal. La dosis del inóculo variaba entre
medio centímetro y un centímetro, debido a la virulencia de la cepa, en estos
estudios no se utilizaba ninguna clase de potencializador. En el proceso se les
tomaba la temperatura, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y pulso. Los
cobayos morían entre las 10 a las 18 horas post-inoculación, esto dependía de
la susceptibilidad y edad del animal, como también de la virulencia de la cepa
que se utilizaba 60 .
Esta enfermedad ataca a los rumiantes, aunque se ha reportado casos en
cerdos 61 . En los vacunos, la bacteria puede ser endógena y provocar la
enfermedad de esta manera, pero en los ovinos la infección siempre es
exógena y la espora es llevada al organismo por inyección o infección de una
herida previa. La eliminación de la bacteria es constante por la vía digestiva de
animales infectados y esta al salir, por ser un anaerobio estricto esporula para
mantenerse vigente en el medio ambiente, se queda en la tierra y el suelo
pudiendo infectar el agua de los bebederos y los pastos 62 .
También puede llegar a la sangre a través de algunas heridas predispuestas en
la mucosa de los animales por ejemplo en la época de la dentición de los
60
GARCÍA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal.
OCÁDIZ, J. Op. cit., p. 107.
62
JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 221.
61
19
terneros y de allí diseminarse por vía hematógena a distintos tejidos del
cuerpo 63 .
Para que se produzca la enfermedad tiene que existir un ambiente propicio
para el desarrollo de la bacteria en el organismo, este ambiente propicio que
desencadena la enfermedad se da por magulladura del músculo, ejercicio
excesivo, indigestión aguda o cualquier proceso que desvitalice al tejido. La
bacteria necesita de un medio rico en glucógeno como fuente de su energía,
esto con una previa glucólisis anaeróbica producida en el músculo. Esto
además tiene que estar acompañado de anaerobiosis y pH alcalino; este
ambiente perfecto para el desarrollo de la bacteria determina primariamente la
forma vegetativa de este germen donde por actuación de toxinas que ya se
están produciendo, propician el desarrollo de la enfermedad y sus
consecuencias 64 .
Una vez que el ambiente es adecuado para el desarrollo de la bacteria, se
comienzan a producir toxinas y enzimas, cada una con un fin específico, por
ejemplo la β (beta) que atacan exclusivamente al ADN celular y, las γ (gamma)
que se encargan de separar el intersticio celular. Estas toxinas provocan una
reacción tisular y se desencadena una inflamación del músculo comprometido,
hemorragia y edemas gaseosos que es útil para hacer el diagnóstico de esta
enfermedad, el área es crepitante, y finalmente ocasiona necrosis del músculo
comprometido, además de presentar fiebre entre 40ºC por que las toxinas
liberadas por las bacterias son inductoras de liberación de linfoquinas que
elevan la temperatura 65 .
63
Ibid., p. 222.
Ibid., p. 223.
65
VEGA, Marco. Op. cit.
64
20
Finalmente hay una bacteriemia que se da únicamente en la fase final de la
enfermedad y que conlleva a la muerte del animal por intoxicación sistémica.
La muerte se da 1 a 3 días desde que aparecen los signos clínicos.
En ovinos, la espora ingresa conjuntamente con otros Clostridium en heridas
abiertas, esto lleva a una necrosis del tejido afectado produciendo el cuadro de
gangrena enfisematosa 66 .
En un estudio realizado se encontraron los valores de las concentraciones de
enzimas
plasmáticas
(Aldosa,
deshidrogenasa
láctica
(LHD),
glutamil
oxalacético transaminasa (GOT), glutamil piruvato transaminasa (GPT))
asociadas con el músculo esquelético incrementadas en el ganado infectado de
Clostridium chauvoei y la concentración de enzimas (LDH y GOT) asociadas al
daño cardiáco también aumentadas. Los valores del potasio del ganado que
murió aumentó, pero el valor de sodio fue normal. Los datos indicaron que el
volumen sanguíneo disminuyó en los animales que murieron. En resumen hubo
cambios en enzimas plasmáticas, valores químicos de sangre y valores
hematológicos 67 .
1.6. SIGNOS CLÍNICOS
Normalmente la afección comienza súbitamente pudiendo encontrarse algunos
animales muertos sin haberse observado signos clínicos, como cuando las
lesiones ocurren solamente en el miocardio y el diafragma.
66
Ibid.
PEMBERTON, J. et al. 1974. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium
chauvoei: Clinical relationships during infection. Am. J. Vet. Res, Vol 35, Nº 98. p. 1043.
67
21
Es común la cojera aguda y la depresión notable, inicialmente hay fiebre (hasta
42ºC) pero cuando los signos clínicos se hacen obvios, la temperatura puede
ser normal o subnormal 68 .
Aparecen tumefacciones edematosas y crepitantes características en la cadera
hombro, pecho, lomo, cuello o en otros sitios muy musculares del cuerpo.
Inicialmente, la tumefacción es pequeña, caliente y dolorosa. Conforme la
enfermedad progresa rápidamente, la tumefacción crece, hay crepitación a la
palpación y la piel está seca, agrietada, fría e insensible a medida que el
abastecimiento sanguíneo local disminuye. Los signos generales incluyen
postración y temblores. La muerte ocurre en 12 a 48 horas si el animal no ha
sido tratado; llama la atención el olor a ácido butírico 69 .
En los bóvidos se presenta éxtasis del rumen y de 100 - 120 pulsaciones
minuto. En las ovejas hay una marcha rígida (pierna). No es frecuente el
edema subcutáneo; la lesión es local, donde la infección penetró 70 .
1.7. LESIONES
Las lesiones se caracterizan por edema, hemorragia y necrosis de las
miofibrillas musculares. La parte central de las lesiones se seca, se oscurece y
se convierte en enfisematosa como consecuencia de la fermentación
bacteriana, mientras que su periferia es edematosa y hemorrágica. Los
animales afectados presentan inflamaciones crepitantes en la musculatura,
68
RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 902.
Ibid., p. 903.
70
Ibid., p. 903.
69
22
particularmente en las extremidades, con una extensión rígida característica de
los miembros 71 .
Dependiendo del momento de la muerte del animal y de la temperatura
ambiental, las tumefacciones pueden estar muy distendidas y con gas. Los
músculos afectados aparecen de marrón o rojo obscuro, con rayas negras. Con
frecuencia se encuentran lesiones similares en el corazón y ocasionalmente en
la lengua. Los tejidos subcutáneos de la zona infectada presentan un exudado
teñido de sangre que contiene grandes depósitos de burbujas de gas 72 .
1.8. NECROPSIA
Al realizar las necropsias de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa
de Clostridium chauvoei por García, presentaban exudado desde el miembro
posterior hasta la zona pectoral, inflamación desde el muslo hasta la parte
anterior del cuerpo (axila), se observaba una sustancia gelatinosa y solo se
hallaba necrosis en el sitio vecino a la inoculación 73 .
En el cadáver de un bovino se encuentra al animal con el miembro afectado
extendido y rígido, se produce putrefacción y meteorismo post mortem
rápidamente y se puede ver un exudado espumoso que sale del ano y la nariz,
los músculos afectados se ven edematosos y con el centro ennegrecido por la
destrucción, degeneración y necrosis del tejido. En las cavidades se encuentra
siempre abundante líquido que coagula con facilidad por la gran presencia de
fibrina, además se nota un olor rancio como de ácido butírico y se puede notar
la producción de gas en el hígado. Cuando un feto es afectado se puede notar
71
GÁZQUEZ, Antonio. 1991. Patología veterinaria. p. 358.
Ibid., p. 359.
73
GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C.
72
23
la distensión del abdomen de la madre posiblemente por la edematización del
feto, el feto puede o no presentar las lesiones típicas de la infección 74
Microscópicamente, se encuentran cambios degenerativos en las fibras
musculares se observan rotas por el edema, enfisema y hemorragia. La
infiltración de leucocitos es poco importante 75 .
1.9. DIAGNÓSTICO
En casos típicos puede formularse un diagnóstico basándose en los signos
clínicos y en los hallazgos de necropsia. Es dudoso por no encontrarse
lesiones típicas en ocasiones 76 .
En los frotis de tejidos infectados se pueden descubrir bacilos grampositivos,
esporulados e identificarlos con reactivos inmunofluorescentes (wellcome) 77 .
Cuando se sospecha de muerte por
Clostridiosis, se debe confirmar el
diagnóstico por medio de muestras de los tejidos mas afectados para
histopatología, esto debe hacerse en la mayor brevedad, para así evitar una
contaminación con otras bacterias que normalmente están presentes en el
animal 78 .
74
RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 906.
BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345.
76
OCÁDIZ, J. Op. cit., p. 108.
77
BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 346.
78
JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 223.
75
24
Diagnóstico diferencial: por electrocución por rayo (causa dolor), carbunco
bacteriano (diferencia la lesión esplénica), saturnismo agudo y tetania de la
lactación, este último produce muerte súbita 79 .
Entre los diferentes trabajos realizados con la bacteria Clostridium chauvoei
encontramos un estudio donde se examinaron 238 muestras de material
patológico de Clostridium, procedente de animales de diferentes especies y por
cada caso se procede a la clasificación del clostridio responsable, por medio
del estudio de sus caracteres morfológicos, culturales, bioquímicos y
biológicos. El Clostridium chauvoei es el tercero mas frecuente después del
Clostridium perfringes y el Clostridium septicum, se encontraron únicamente en
los bóvidos, mostrando su máxima incidencia en los terneros, este clostridio fue
encontrado únicamente en músculo y médula ósea 80 .
La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) detectó específicamente
secuencias de DNA de Clostridium chauvoei en muestras de músculo y
exudado obtenidos de ratones luego de 12 horas post-inoculación. En pruebas
usando muestras de músculo e hígado, el límite de detección fue cerca de 200
organismos por reacción. Estos resultados sugieren que el sistema de un paso
de PCR puede ser útil para la detección e identificación directa de Clostridium
chauvoei en especímenes clínicos 81 .
79
VEGA, Marco. Op. cit.
SÁENZ, Ernesto. Op. cit., p. 2.
81
KOJIMA, A. et al. 2001. Op. cit., 78. p. 363.
80
25
1.10. TRATAMIENTO
La administración de penicilina a los animales afectados se considera la
terapéutica lógica, si el animal no está moribundo, pero los resultados suelen
ser mediocres dada la gran extensión de las lesiones. Deben administrarse
grandes dosis (10.000 unidades/kg de peso corporal), comenzando con
penicilina cristalina por vía intravenosa para administrar después preparados
de acción prolongada, algunos de los cuales se administrarán en los mismos
tejidos afectados, si estos son accesibles. Es probable que el antisuero del
carbunco sintomático no posea gran valor, a menos que se administren dosis
masivas 82 .
Otras medidas son separar los animales enfermos y movilizar el resto del lote
fuera de los potreros contaminados; enterrar los cadáveres 83 .
1.11. PREVENCIÓN Y CONTROL
En zonas donde la enfermedad es endémica, debe hacerse vacunaciones
anuales 84 . Los bóvidos se vacunan de 3 a 6 meses de edad y después cada
año. La vacunación se debe realizar por lo menos dos semanas antes de que
tenga lugar la exposición. Durante un brote de enfermedad, se vacuna a todos
lo bóvidos y se les administra penicilina de acción retardada. Cuando se
presenta la infección, las ovejas preñadas se vacunan tres semanas antes del
parto.
Es posible que los corderos tengan que ser vacunados durante su
82
VEGA, Marco. Op. cit.
QUIROS, Joaquín; LÓPEZ, Gustavo. 1991. Curso sobre sanidad animal. p. 127.
84
URBINA, Mairo; RODRIGUEZ, Germán. 1978. sistema de vigilancia epidemiológica de
enfermedades transmisibles. ICA. p. 53.
83
26
primer año de vida. Cuando se observan animales enfermos, es aconsejable
cambiarles de pastos 85 .
1.11.1. Estudios realizados con la producción de vacunas
El flagelo de Clostridium chauvoei
presenta un antígeno protectivo 86 , este
antígeno protector es termolábil, el cual estimula la protección de no
aglutinación de anticuerpos 87 . Se ha demostrado previamente que la proteína
del flagelo de Clostridium chauvoei es importante para el desarrollo de
inmunidad protectiva en ratón: flagelos purificados provocan un efecto
protectivo, mientras mutantes de la bacteria sin flagelo causan una inmunidad
100 veces menor que la de una cepa madre que sí posee flagelo 88 .
Una variedad de exámenes de laboratorio diagnóstico y pruebas realizados con
especimenes de ganado vacunado con bacterinas de Clostridium chauvoei y
expuestos luego a inóculos del mismo, muestran que si hubo cambios, Barnes
1974, reporta que hubo algunos pequeños cambios en los valores clínicos, una
parte de la investigación fue experimental y se realizó para evaluar la
inmunidad eficaz en un experimento severo que contuviera la bacteria de
Clostridium chauvoei. El ganado se vacunó con seis diferentes potencias que
fueron determinadas con cobayos. A este ganado se le consideró que tenía
una resistencia variable a la infección con el Clostridium chauvoei, y que
presentaba una respuesta similar a la expuesta por los cobayos. Como mayor
logro se podría decir que la prueba clínica fue determinada cuando el ganado
85
BIBERSTEIN, E. op. cit., p. 347.
TAMURA, Y; MINAMOTO, N; TANAKA, S. 1984. Demonstration of protective antigen carried
by flagella of Clostridium chauvoei. p. 1325.
87
CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. The preparation of inmunogenic cell walls from a
highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology 88. p. 27
88
KOJIMA, A. et al. 2000. Op. cit., 76, p. 359.
86
27
reacciono a los cambios expuestos y esto se define como interrelaciones y
cambios de varios valores clínicos durante la infección 89 .
Los anticuerpos monoclonales fueron obtenidos del flagelo del Clostridium
chauvoei por la fusión de células mieloma de roedores y de las células del bazo
de ratones inmunizados con un flagelo purificado parcial que fueron estudiados
y analizados, mostraron que el flagelo de Clostridium chauvoei tiene tres
epitopes. Los tres anticuerpos monoclonales flagelares (1 inmunoglobulina G y
2 M) demostraron los efectos pasivos protectores en ratones. Estos resultados
sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es importante para la
inmunidad protectora en ratones 90 .
Se observó una clara relación entre la disminución de inmunogenicidad y la
pérdida total de la capacidad protectora de células en la fase estacionaria
tardía 91 .
Evidencias sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es altamente
inmunogénico, la cepa CH3, puede ser importante para estimular la inmunidad
protectiva, fue estudiada preparando una suspensión flagelar pura de un
organismo y comparando su antigenicidad protectiva de la suspensión flagelar
y las células desflageladas. La antigenicidad protectiva de la cepa CH3 no fue
de origen flagelar, pero si debido a la termolabilidad, pH sensitivo, y antígenos
somáticos no aglutinogénicos 92 .
89
PEMBERTON, John. BATES, Fern. et al. 1974. a. Changes in clinical values of cattle infected
with Clostridium chauvoei. p. 1037.
90
TANAKA, M. HIRAYAMA, N. TAMURA, Y. 1987. Production, characterization, and protective
effect of monoclonal antibodies to Clostridium chauvoei flagella. Infection ans Inmunity. Aug.
Vol. 55, Nº 8. p. 1779
91
MATTAR, M.A. CORTIÑAS, T.I. STEFANINI, A.M. 2002. Inmunogenic protein variations of
Clostridium chauvoei cellular antigens associated with the culture growth phase. Vol. 33. Issue
1, 25 march p. 9.
92
CHANDLER, H.M. and GULASEKHARAM, J. 1974. The protective antigen a highly
inmunogenic strain of Clostridium chauovoei including an evaluation of its flagella as a
protective antigen. Journal of General Microbiology. 84. p. 128.
28
2.
2.1.
MATERIALES Y MÉTODOS
POBLACIÓN
Las muestras utilizadas en el presente estudio provienen de tejidos de cobayos
(Cavia porcellus), por ser este animal el modelo biológico mas empleado en el
mundo para trabajar con bacterias del género Clostridium spp 93 . El criterio de
selección de los animales fue definido como hembras en una edad promedio de
40 días, en buena condición corporal, que no presentó cuadros febriles o
alteraciones clínico patológicas; estos animales provenían del bioterio de la
Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.)
Para el estudio se seleccionaron 18 cobayos (Cavia porcellus) los cuales se
mantuvieron en observación durante un mes, en las unidades de aislamiento
del Programa de Investigación en Salud Animal de la Corporación Colombiana
de Investigación Agropecuaria Corpoica CEISA de Bogotá, para una mejor
adaptación se dispusieron dos jaulas donde se ubicaron 9 animales en cada
una de ellas, y así minimizar conductas de estrés o tensión, el ambiente se
adecuo para los animales, teniendo en cuenta el control del ruido siendo
considerado como un plan de bienestar para los animales 94 asimismo se
manejo la luz 95 ya que podía afectar la fisiología 96 , morfología 97 , y conducta de
93
RAMIREZ, Sergio. 2002.
En: http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX0613101-121559//mgp4de5.pdf
94
PEKRUL, D. 1991. Handbook of Facilities Planning. Laboratory Animal Facilities. p. 166.
95
BRAINARD; VAUGHAN, and REITER. 1986. Effect of light irradiance and wavelength on the
Syrian hamster reproductive system. Endocrinol. 119(2):648.
96
ERKERT, and GROBER. 1986. Direct modulation of activity and body temperature of owl
monkeys by low light intensities. Folia Primatol. 47(4):171.
97
NEWBOLD; CHAPIN; ZINN, and TUCKER. 1991. Effects of photoperiod on mammary
development and concentration of hormones in serum of pregnant dairy heifers. J. Dairy Sci.
74(1):100.
29
varios animales 98 . Diariamente se le llevaba a cada animal la historia clínica,
donde se monitoreaba frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, peso y
temperatura corporal.
A la unidad de aislamiento donde se encontraban los animales se le realizaba
dos veces al día, manejo de excrementos, limpieza y desinfección, además, los
animales se beneficiaban de un fácil acceso a la comida y el agua, la
temperatura de la unidad se regulaba con calentadores.
2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL
Los 18 cobayos (Cavia porcellus) se distribuyeron al azar en seis grupos de
tres animales. Doce de estos animales se inocularon con la cepa de
Clostridium chauvoei 4408, suministrada por el laboratorio Vecol S.A. los
animales se inocularon vía intramuscular con 0.5 mililitros de una solución de
cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de
Clostridium chauvoei, y los 6 animales restantes se inocularon solamente con
CaCl2;
En cada grupo habían dos animales inoculados con la cepa de
Clostridium chauvoei, y un animal como testigo el cual fue inoculado solamente
con CaCl2; Cada tres horas se sacrificaba un grupo de animales.
Antes de realizar el sacrificio de cada animal, se les tomó una muestra de
sangre por el método de punción de la vena cava anterior con vacutainer 99 . La
eutanasia se realizó de acuerdo con los protocolos de bioética vigentes en la
legislación colombiana (LEY 84 de 1989), utilizando anestésicos volátiles para
98
TUCKER; PETITCLERC, and ZINN. 1984. The influence of photoperiod on body weight gain,
body composition, nutrient intake and hormone secretion. J. Anim. Sci. 59(6):1610.
99
En: http://www.proclave.com/servet/tomamuestras/agujas.htm
30
evitar el dolor 100 .
Una vez sacrificados los cobayos se realizaban las
necropsias donde se obtenían muestras de diferentes tejidos 101 (ver tabla 2)
Tabla 2. Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus).
MUESTRAS
Bazo
Músculo estriado cardiaco
Músculo estriado esquelético
Duodeno
Hígado
Páncreas
Pulmón
Riñón
Cerebro
Adrenal
2.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
2.3.1. Muestras De Sangre
Al realizar la recolección de sangre del Cavia porcellus, se tuvo en cuenta el
volumen de sangre para el análisis, la selección del vaso sanguíneo y el
método requerido para que no afecte el bienestar del animal. Siempre se
obtuvo sangre por punción del corazón 102 .
100
1986. Report of the AVMA panel de euthanasia. JAVMA, vol 188, Nº 3, February 1, p. 253.
ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales
domésticos. p. 21.
102
DESJARDINS, C. 1986. Indwelling vascular cannulas for remote blood sampling, infusión,
and long-term instrumentation of small laboratory animals. p. 32.
101
31
El volumen de sangre de un cobayo adulto es aproximadamente de 69 – 75
ml/kg de peso corporal 103 , y aproximadamente el 7 al 10% del volumen de
sangre (0.5 – 0.7 ml por cada 100 gr de peso corporal), pueden ser extraídos
con seguridad, sin provocar anemia 104 .
A cada cobayo (Cavia porcellus) se le tomó una muestra de sangre obtenida
por el método de punción del corazón con vacutainer, la sangre se recogió en
un tubo de EDTA y en un tubo sin anticoagulante. Las muestras se procesaron
de inmediato y se les realizó un cuadro hemático compuesto por 105 :
Un examen cuantitativo, que incluye el valor hematocrito, hemoglobina, el
recuento total de eritrocitos, el recuento total de leucocitos, el recuento
diferencial de leucocitos, el recuento de plaquetas, el volumen corpuscular
medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM), la concentración
corpuscular media de hemoglobina (CCMH) y la concentración plasmática de
proteínas totales.
Un examen cualitativo de los frotis sanguíneos para detectar alteraciones en la
morfología celular 106 .
Luego se realizó la química sanguínea (Creatinin kinasa CK 107 ).
103
HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. 1995. The biology and medicine of rabbits and rodents. p.
68
104
HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Op. cit., p. 102
BENJAMIN, Maxine M. 1991. Manual de patología clínica en veterinaria. p. 33.
106
DAVIDSON, Malcom. 2000. Manual patología clínica en pequeños animales p. 46.
107
Auto-Creatinin kinasa liquicolor. Reacción de Jaffé. Prueba fotométrica para mediciones
cinéticas de creatinin kinasa. Germany. Human.
105
32
2.3.1.1. Examen Cuantitativo
La sangre con anticoagulante se centrifugó en tubos capilares (tubos de
microhematócrito) durante 5 minutos a (12.500 – 15.000 rpm). Los eritrocitos se
concentraron en el fondo del tubo. Los leucocitos forman una capa gris crema
por encima de los eritrocitos. Las plaquetas quedan en la parte alta
distinguiéndose como una capa delgada de color crema, y el plasma aparece
por encima de aquellas. El valor de hematocrito se calculó dividiendo la
longitud de la capa de eritrocitos entre la longitud total, que esta constituida por
la capa de eritrocitos, el buffy coat y el plasma. Un examen superficial del
plasma permite detectar la existencia de ictericia, hemólisis y lipemia 108 .
2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos. Los recuentos celulares se realizaron
utilizando un hematocitómetro de Neubauer, ver figura 1.
Figura 1. Enrejado del hematocitómetro. Los cuadros marcados con una W se
utilizan para estimar el número total de leucocitos; los marcados con una R se
usan para los recuentos de eritrocitos.
108
DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47.
33
2.3.1.1.2. Índices eritrocitarios Se determinaron, la hemoglobina corpuscular
media (HCM) y la concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH)
para evaluar si los animales presentaban anemia 109 .
2.3.1.1.3. Volumen corpuscular medio (VCM) Indicó el tamaño medio de los
glóbulos rojos. Las células normocíticas se determinaron con un VCM normal,
las macrocíticas tenían un VCM elevado, y las microcíticas lo tenían bajo. El
VCM se calculó de la siguiente forma
Hematocrito %
VCM = ------------------------------ x 10 = fentolitros
Nº de eritrocitos (>)
2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM)
Indicó la cantidad (en
peso) de hemoglobina que había en un eritrocito medio. Dependió del tamaño
de los eritrocitos y de su concentración media de hemoglobina. Una
disminución en la HCM indicó deficiencia de hierro. La HCM se calculó de la
siguiente manera 110 .
Hemoglobina gr/dl
HCM = ------------------------------ x 107 = picogramos
Nº de eritrocitos (>)
2.3.1.1.5. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH)
Indico la concentración media de hemoglobina que había en cada eritrocito. La
hipocromasia nos indicó que la CCMH es baja. Se calculó de la siguiente
manera 111
109
DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47.
Ibid., p. 48.
111
Ibid., p. 49.
110
34
Hemoglobina gr/dl
CCMH = ----------------------------- x 100 = % porcentaje
Hematocrito %
2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos Se realizó contando 200
leucocitos en un frotis sanguíneo.
2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis de la información recolectada en los hemogramas consistió en
categorizar las variables (Hematocrito; recuento total de glóbulos rojos,
glóbulos blancos, recuento absoluto y recuentos relativos entre otros), los
cuales se analizaron por medio de listados, frecuencias y tablas estadísticas.
Los listados se utilizaron para depurar inicialmente la información. Una vez se
obtuvo la base de datos depurada se realizó un análisis de frecuencia en el
cual se contó cada categoría para una variable especificada y se obtuvieron los
resultados absolutos y frecuencias relativas para cada una. Se presenta
también la suma, promedio y desviación estándar. Con los resultados
obtenidos se realizaron las tablas y los gráficos 112 .
Las variables cuantitativas se evaluaron con la prueba de Barlett para
determinar si las varianzas eran homogéneas. Si esto era cierto, se procedía a
realizar el análisis de varianza paramétrico tradicional (prueba f de Fisher);
utilizando una prueba de t de Student para comparar promedios adyacentes.
En el caso de que no existiera homogeneidad entre las varianzas, se utilizó la
112
DEAN, A.; DEAN, J.; BURTON, A. & DICKER, R. 1992. Epi Info, versión 5. Epidemiología
con microordenadores. p. 243.
35
prueba de Kruskal-Wallis (prueba no paramétrica), comparando en este caso
no los promedios, sino las medianas de cada grupo. Posteriormente se utilizó la
prueba de Mann-Whitney/Wilcoxon (prueba de Kruskal-Wallis para dos grupos),
para determinar la diferencia entre medianas adyacentes 113 .
Se le realizó estadística descriptiva basada en promedio y desviación estándar
a cada una de estas variables hematocrito, hemoglobina, hemoglobina
corpuscular media, concentración media de hemoglobina, eritrocitos, proteína
plasmática, proteína sérica, creatinin kinasa, leucocitos, neutrófilos, linfocitos,
eosinófilos, monocitos, células Foa – Kurloff y de la temperatura de los grupos
experimentales (A, B, C, D, E, F, G). Los tiempos de análisis incluyen, el grupo
A animales sacrificados a las 3 horas post inoculación, el grupo B animales
sacrificados a las 6 horas post inoculación, el grupo C animales sacrificados a
las 9 horas post inoculación, el grupo D animales sacrificados a las 12 horas
post inoculación, el grupo E animales sacrificados a las 15 horas post
inoculación, el grupo F animales sacrificados a las 18 horas post inoculación, y
el grupo G es el grupo de animales control, cada uno de los seis animales que
pertenece a este grupo va a hacer parte de los grupos anteriormente descritos.
2.5. EXAMEN MACROSCÓPICO
Primero se revisó la historia clínica de cada cobayo, la cual incluía variables
como especie, edad, grupo, nº de animal, sexo, peso, hora de inoculación,
hora del sacrificio y los síntomas que presentó antes de morir; se continuó con
un examen externo (pelaje, uñas, ojos, orejas, piel, etc) 114 luego se prosiguió
con una descripción concisa, ordenada y precisa de la necropsia describiendo
profundamente las lesiones. Se llevó una secuencia sobre los diferentes
113
MARTÍNEZ, R; MARTÍNEZ, N. 1997. Diseño de experimentos. Análisis de datos estándar y
no estándar. p. 13.
114
ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales
domésticos. p. 23.
36
sistemas del cuerpo y se hizo la descripción en el sitio correspondiente, las
necropsias se comenzaron realizando una incisión longitudinal ventromedial
desde el extremo anterior de la mandíbula hasta el ano, en el siguiente orden
(se removió la lengua, laringe, traquea, esófago y vísceras, se desprendió el
bazo, se examinó el páncreas, se hizo una incisión en el estómago a lo largo
de la curvatura menor, se desprendió el hígado, los riñones y las glándulas
adrenales, por último se realizó la extracción del sistema nervioso central) 115 .
Los tejidos obtenidos en necropsia se fijaron en solución de formaldehído
(Formaldehyde solución al 37% (CH2O). SIGMA®, Chemical Company, St.
Louis, U.S.A.) tamponado al 3.7% para histopatología 116 .
2.6. Inclusión de parafina, coloración hematoxilina y eosina
Los tejidos se sometieron al proceso de deshidratación con alcohol etílico
(Alcohol Etílico. SIGMA®, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) en
concentraciones crecientes y se aclararon con xilol (Xylenes. C6H4(CH3)2)
Fischer Scientific Company, New Jersey, U.S.A.) Posteriormente se incluyeron
en parafina a una temperatura de 60ºC. Los cortes se realizaron en micrótomo
de rotación con un espesor de 4 >m. Se montaron en láminas portaobjeto y se
desparafinaron se realizó luego el proceso inverso y se coloreó con
hematoxilina (Hematoxylyn (C16H14O6). SIGMA®, Chemical Company, St.
Louis, U.S.A.) y eosina 117 (Eosin (C20H6N2O9Br2Na2). SIGMA®, Chemical
Company, St. Louis, U.S.A.). Este proceso se realizó en el laboratorio del
Centro de Investigación en Salud Animal, Corpoica CEISA, de la ciudad de
Bogotá.
115
VILLAFAÑE, Fdo; PEÑA Néstor. 1978. Manual de técnicas del program patología –
toxicología. p. 5.
116
LUNA, L. 1968. Manual of histologic stainig methods of the armed forces institute of
pathology. p. 258.
117
BANKS, William J. 1996. Histología veterinaria aplicada. p. 6.
37
2.7. EXAMEN MICROSCÓPICO
Los tejidos coloreados con hematoxilina y eosina se estudiaron en detalle para
detectar lesiones que pudieran relacionarse con la presencia de Clostridium
chauvoei, para facilitar el análisis de los hallazgos, se diseño una escala
subjetiva del grado de lesión, dependiendo de la severidad de la misma. La
escala incluyó (ver tabla 3).
2.8.
DESECHO DE MATERIAL
Al terminar el trabajo con los cobayos, se utilizaron bolsas rojas para el
desecho de residuos patológicos, entendiéndose por esto a todo elemento o
material en estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que presente
características de toxicidad y actividad biológica que puedan afectar directa o
indirectamente a los seres vivos. Estas bolsas se incineraron en el horno
crematorio de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria
Corpoica CEISA; donde se realizó el protocolo vigente de las normas de
bioseguridad 118 .
Tabla 3. Escala subjetiva del grado de lesión producida por Clostridium
chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente.
118
http://www.icronline.com/sitio/pacientes/seguridad.asp
38
VALOR
CARACTERÍSTICA DE LA LESIÓN
0
Sin Cambios Patológicos Aparentes, No se encontraron cambios
patológicos aparentes, el tejido es normal
1
Lesiones Leves, Lesiones ligeras que incluyen cambios
congestivos, hemorrágicos, depleción linfoidea, edema ligero
2
Lesiones
Moderadas,
Incluyen
cambios
congestivos,
hemorrágicos, depleción linfoidea, edema moderado, infiltrados
inflamatorios.
3
Lesiones Severas, Incluyen daños tisulares como necrosis de
coagulación,
infiltrado
inflamatorio
polimorfonuclear
y
mononuclear, zonas de hemorragia y congestión con edema
abundante.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
39
3.1. Muestra de sangre
Los resultados del hemograma se indican a continuación, analizando cada
variable en forma independiente y finalmente correlacionando los valores.
3.1.1. Hematocrito
El hematocrito de los grupos experimentales tuvo un promedio de 43.64% (LC
95% 41,40 – 45,88) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas
entre las horas (p = 0.20). Valores similares son referenciados por Harkness,
1995; quien reporta para esta especie un valor de (37 – 48% 119 ). Todos los
grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.
60
50
40
30
20
10
0
1
Co 8
nt
ro
l
15
12
9
6
b
3
%
HEMATOCRITO
HORAS
Gráfica 1. Valor promedio del hematocrito por horas post inoculación.
119
MOORE, David. 2000. Hematology of the Guinea pig (Cavia porcellus) In: Schalm`s
Veterinary hematology. p. 1108.
40
Tabla 4. Resultados de Hematología, valor promedio por horas 3, 6, 9, 12, 15 y G (grupo control) de cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
Promedio Desv. estándar
43,64
4,85
13,94
2,41
25,97
11,32
32,04
4,68
5958611
1722810
5,33
0,62
4,96
0,45
4014,14
1114,36
6985
3775
3,11
4,23
264,83
441,98
51,06
14,49
3798,87
3039,87
41,22
14,61
2667,77
1329,4
1,22
1,22
94,2
158,72
2,94
2,9
222,47
260,82
0,33
0,97
21,58
70,57
41
Mediana
43,75
14,3
20,73
33,06
6270000
5,25
4,9
4323,52
5425
1
61,5
51
2512
41
2270,5
1
48,75
2
115,45
0
0
EE
1,14
0,57
2,67
1,1
406070
0,15
0,11
262,66
890
1
104,18
3,42
716,5
3,44
313,34
0,29
37,41
0,68
61,47
0,23
16,63
LCI 95%
41,4
12,83
20,74
29,88
5162713
5,05
4,75
3499,33
5241
1,16
60,65
44,36
2394,52
34,47
2053,62
0,66
20,88
1,6
101,98
-0,11
-11,02
LCS 95%
45,88
15,06
31,2
34,2
6754509
5,62
25,75
4528,95
8729
5,06
469,02
57,75
5203,22
47,97
3281,92
1,78
167,52
4,28
342,96
0,78
54,18
P
0,2
0,2
0,31
0,65
0,06
0,8
0,23
0,12
0,15
0,02
0,24
0,32
0,33
0,25
0,02
0,36
0,07
0,1
0,29
0,26
3.1.2. Hemoglobina
La hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un promedio de 13.94 g/dL
(LC 95% 13.83 – 15.06) de acuerdo a la tabla 4, no se encontraron diferencias
significativas entre las horas (p = 0.20). Comparativamente estos resultados
son normales, según referencia dada por Wagner, 1995; quien reporta para
esta especie un valor de (11 – 15g/dL 120 ). Todos los grupos se encontraron
entre los parámetros de referencia.
17,55
15
13,95
15,4
12,9
12,1
12,87
18
C
on
tr
ol
15
12
9
b
6
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
3
g/dL
HEMOGLOBINA
HORAS
Gráfica 2. Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculación.
120
MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Wagner J.E. p. 1110.
42
3.1.3. Hemoglobina corpuscular media
La hemoglobina corpuscular media de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 25.97 µg (LC 95% 20.74 – 31.20) De acuerdo a la tabla 4, no se
encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.31).
Al comparar los resultados con los referenciados por Hillyer, 1996; quien
reporta para esta especie un valor de (23 – 27 µg
121
), se encuentran entre los
valores normales. Sin embargo al evaluar las horas individualmente se
encontró que a las 3, 9 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los
límites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre las horas,
clínicamente el descenso de este valor indica deficiencia de hierro en los
animales ó posiblemente estrés post inoculación.
50
40
30
20
10
0
Co 18
nt
ro
l
15
12
9
6
b
3
PICOGRAMOS
HEMOGLOBINA
CORPUSCULAR MEDIA
HORAS
Gráfica 3. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas
post inoculación.
121
MOORE, David. 2000. Op. cit., p. 1108.
43
3.1.4. Concentración media de hemoglobina
La concentración media de hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 32.04% (LC 95% 29.88 – 34.20) De acuerdo a la tabla 4 no se
encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.65).
Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por
Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (26 – 39%
122
). Todos
los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.
C 18
on
tr
ol
15
12
9
6
40
35
30
25
20
15
10
5
0
3
%
CONCENTRACIÓN MEDIA DE
HEMOGLOBINA
HORAS
Gráfica 4. Valor promedio la concentración media de hemoglobina por horas
post inoculación.
122
Ibid., p. 1108.
44
3.1.5. Eritrocitos
Los eritrocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5`9 x106/mm3
(LC 95% 5`1 – 6`7) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias
significativas entre las horas (p = 0.06). Comparativamente estos resultados
son normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta
para esta especie un valor de (3`2 – 8`0 x106/mm3
123
). Todos los grupos se
encontraron entre los parámetros de referencia.
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
C 18
on
tr
ol
12
15
9
6
b
3
mm3
ERITROCITOS
HORAS
Gráfica 5. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculación.
123
MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Quesenberry. p. 1108.
45
3.1.6. Proteína plasmática
La proteína plasmática de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5.33
g/dL (LC 95% 5.05 – 5.82) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron
diferencias significativas entre los grupos (p = 0.80). Comparativamente estos
resultados son normales, según referencia dada por Rawnsley, 2004; quien
reporta para esta especie un valor de (4.6 – 6.2 g/dL
124
). Todos los grupos se
encontraron entre los parámetros de referencia.
6
4
2
0
1
Co 8
nt
ro
l
15
12
9
6
b
3
g/dL
PROTEÍNA PLASMÁTICA
HORAS
Gráfica 6. Valor promedio de proteína plasmática por horas post inoculación.
124
RAWNSLEY H.M. En:
http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf
46
3.1.7. Proteína Sérica
La proteína sérica de los grupos experimentales tuvo un promedio de 4.96 g/dL
(LC 95% 4.75 – 5.17) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias
significativas entre los grupos (p = 0.23). Comparativamente estos resultados
son normales, según referencia dada por Rawnsley, 2004; quien reporta para
esta especie un valor de (4.6 – 6.2 g/dL
125
). Todos los grupos se encontraron
entre los parámetro de referencia.
5,5
5
4,5
4
3,5
C 18
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
g/dL
PROTEÍNA SÉRICA
HORAS
Gráfica 7. Valor promedio de proteína sérica por horas post inoculación.
125
Op. cit.., En:
http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf
47
3.1.8. Creatinin kinasa
En química sanguínea, la creatinin kinasa de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 4014.14 UI/L (LC 95% 3499.33 – 4528.95) Al observar la tabla 4.
No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.12).
Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los rangos de
referencia dados por Kaspareit, 2004; quien reporta (48 – 340 U/L
126
). El
valor de todas las muestras extraídas de CK, presentaron niveles elevados,
debido a la inflamación muscular causada por el trauma de la inoculación.
5000
4000
3000
2000
1000
0
ro
l
Co
nt
18
15
12
9
6
b
3
UI/L
CREATININ KINASA
HORAS
Gráfica 8. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculación.
126
KASPAREIT, J. 2004. En: http://cvm.es/analitica/vetscan/rangos.htm
48
3.1.9. Leucocitos
Los leucocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 6.9 x103/mm3
(LC 95% 5.2 – 8.7) Al estudiar la tabla 4 no se encontraron diferencias
significativas entre los grupos (p = 0.15). Comparativamente estos resultados
no se encuentra entre los parámetros normales, según referencia dada por
Donnelly, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (5.5 – 17.5
x103/mm3
127
). Al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 12 y
18 horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de
no existir diferencias significativas entre las horas; clínicamente el descenso de
estos valores indican leucopenia, es decir que uno o la totalidad de los tipos de
células blancas, puede estar afectado, debido a las fases iniciales de
infecciones agudas.
15000
10000
5000
0
C 18
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
mm3
LEUCOCITOS
HORAS
Gráfica 9. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculación.
127
MOORE, David. Op. cit., p. 1109.
49
3.1.10. Neutrófilos
El valor absoluto de los neutrófilos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 3798.87 (LC 95% 2394.52 – 5203.22) estudiando la tabla 4 no se
encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.33).
Comparativamente estos resultados se encuentran entre los parámetros
normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para
esta especie un valor de (1210 – 8400
128
), Al evaluar las horas individualmente
se encontró que a las 3 horas se presenta el valor por encima de los límites
superiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos,
clínicamente el ascenso de estos valores indican que los animales a las 3
primeras horas de inoculación presentaban neutrofilia, debido al estrés.
10000
8000
6000
4000
2000
0
tr
ol
C
on
18
15
12
9
6
b
3
mm3
NEUTRÓFILOS (Valor Absoluto)
HORAS
Gráfica 10.
inoculación.
128
Valor promedio de neutrófilos (valor absoluto) por horas post
Ibid., p. 1109.
50
El valor relativo de los neutrófilos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 51.06% (LC 95% 44.36 – 57.75) de acuerdo a la tabla 4 no se
encontraron
diferencias
significativas
entre
las
horas
(p
=
0.32).
Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los parámetros
normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para
esta especie un valor de (22 – 48%
129
), Al evaluar los grupos individualmente
se encontró que a las 3, 6, 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por
encima de los límites superiores, a pesar de no existir diferencias significativas
entre los grupos, clínicamente el ascenso de estos valores indican proceso
bacteriano debido al avance progresivo de la infección.
80
60
40
20
0
18
C
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
%
NEUTRÓFILOS (Valor Relativo)
HORAS
Gráfica 11.
inoculación.
129
Valor promedio de neutrófilos (valor relativo) por horas post
Ibid., p. 1109.
51
3.1.11. Linfocitos
El valor absoluto de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 2667.77 (LC 95% 2053.62 – 3281.92) en la tabla 4 observamos
que se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.02).
Comparando los resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por
Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (2145 – 12600
130
).
A las 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los límites
inferiores, esto indica linfopenia producida por el estrés de los animales.
6000
4000
2000
0
Co 18
nt
ro
l
15
12
9
6
b
3
mm3
LINFOCITOS (Valor Absoluto)
HORAS
Gráfica 12.
inoculación.
130
Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post
Ibid., p. 1109.
52
El valor relativo de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio
de 41.22% (LC 95% 34.47 – 47.97) de acuerdo a la tabla 4 no presentaron
diferencias
significativas entre las horas de exposición (p
=
0.25).
Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por
Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (39 – 72%
131
). Sin
embargo al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 3, 15 y 18
horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de no
existir diferencias significativas entre los grupos, clínicamente el descenso de
estos valores indican linfopenia, producida a las 3 primeras horas por estrés de
los animales.
60
50
40
30
20
10
0
18
C
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
%
LINFOCITOS (Valor Relativo)
HORAS
Gráfica 13.
inoculación.
Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post
3.1.12. Eosinófilos
131
Ibid., p. 1109.
53
El valor absoluto de los eosinófilos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 94.20 (LC 95% 20.88 – 167.52) al observar la tabla 4 no se
encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.07).
Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por
Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 – 1225
132
).
Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.
500
400
300
200
100
0
C 18
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
mm3
EOSINÓFILOS (Valor Absoluto)
HORAS
Gráfica 14.
inoculación.
132
Valor promedio de eosinófilos (valor absoluto) por horas post
Ibid., p. 1109.
54
El valor relativo de los eosinófilos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 1.22% (LC 95% 0.66 – 1.78) en la tabla 4 no se encontraron
diferencias
significativas entre las horas de exposición (p
=
0.36).
Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por
Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 – 7%
133
). Todos
los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
Co 8
nt
ro
l
15
12
9
6
b
3
%
EOSINÓFILOS (Valor Relativo)
HORAS
Gráfica 15.
inoculación.
133
Valor promedio de eosinófilos (valor relativo) por horas post
Ibid., p. 1109.
55
3.1.13. Monocitos
El valor absoluto de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 222.47 (LC 95% 101.98 – 342.96) ver tabla 4. No se encontraron
diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparando los
resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por Hillyer, 1996;
quien reporta para esta especie un valor de (55 – 1750 134 ). A las 18 horas post
inoculación se presentaron valores por debajo de los límites inferiores.
1000
800
600
400
200
0
C 18
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
mm3
MONOCITOS (Valor Absoluto)
HORAS
Gráfica 16.
inoculación.
134
Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post
Ibid., p. 1109.
56
El valor relativo de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un
promedio de 2.94% (LC 95% 1.60 – 4.28) ver tabla 4. No se encontraron
diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparativamente estos
resultados son normales, según referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta
para esta especie un valor de (1 – 10%
135
). Todos los grupos se encontraron
entre los parámetros de referencia.
10
8
6
4
2
0
18
C
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
%
MONOCITOS (Valor Relativo)
HORAS
Gráfica 17.
inoculación.
135
Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post
Ibid., p. 1109.
57
3.1.14. Células Foa – Kurloff
El valor absoluto de las células Foa – Kurloff (KC cells) de los grupos
experimentales tuvo un promedio de 21.58 (LC 95% -11.02 – 54.18) ver tabla 4.
No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.26).
El valor relativo de las células Foa – Kurloff (KC cells) de los grupos
experimentales tuvo un promedio de 0,33% (LC 95%- 0,11 – 0,78) ver tabla 4.
No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0,29).
Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por
Jain, 1986; quien reporta para esta especie un valor de (3 – 4%
136
), en
animales con una edad aproximada hasta de 4 meses.
200
150
100
50
0
Co 18
nt
ro
l
15
12
9
6
b
3
mm3
Células Foa - Kurloff
(Valor Absoluto)
HORAS
Gráfica 18. Valor promedio de células Foa – Kurloff (valor absoluto) por horas
post inoculación.
136
Ibid., p. 1109.
58
Correlacionando los valores hematológicos de los cobayos (Cavia porcellus)
inoculados con una cepa de Clostridium chauvoei podemos observar que la
mayoría de los cambios hematológicos se hicieron evidentes a partir de las 9
horas post inoculación, el hematocrito indica un leve aumento de las tres
primeras horas a las 12 horas, observándose un descenso de este entre las 15
y 18 horas, igualmente la hemoglobina comienza un ascenso de las 3 a las 12
horas para disminuir de las 15 a las 18 horas, estos cambios encontrados están
entre los parámetros de referencia.
Al evaluar por horas la hemoglobina corpuscular media se encuentra que a las
3, 9 y 18 horas post inoculación los valores disminuyeron, a causa del estrés
que presentaban los animales al ser manipulados.
La concentración media de hemoglobina, los eritrocitos, la proteína plasmática
y la proteína sérica se mantuvieron estables durante las horas de exposición a
la cepa patógena.
Aunque no se encontraron diferencias significativas en los resultados de
creatinin kinasa, se observó que los niveles son elevados obviamente a causa
del trauma de la inoculación.
Los leucocitos presentaron a las 12 y 18 horas un descenso en los valores,
esto indica leucopenia, queriendo decir que una clase de células blancas esta
afectada debido a la fase inicial de una infección aguda.
El valor de las células Foa – Kurloff se encontró bajo en comparación con lo
referenciado por Jain, 1986 quien reporta un parámetro de (3 – 4%) del conteo
diferencial de leucocitos y en el estudio nos dio un promedio de (0.33%), claro
que estas células son especificas de los cobayos menores de 2 a 3 meses de
edad.
59
3.2. TEMPERATURA
La temperatura de los grupos experimentales tuvo un promedio de 35,54ºC (LC
95% 32,42 – 38,66) Al evaluar la temperatura de los cobayos en el anexo 8 se
encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p =
0,0008). Al comparar los resultados con los referenciados por Rawnsley, 2004;
quien reporta para esta especie una temperatura de (37.2 – 39.5ºC
137
), los
grupos se encontraron fuera de los parámetros de referencia.
Al observar los tiempos individualmente vemos que a las 3, 6 y 9 horas post
inoculación los cobayos encontraban entre el rango normal de temperatura, a
las 12 horas tuvo un valor superior, debido al proceso bacteriano que
presentaron los animales; a las 15 y 18 horas mostraron valores por debajo de
los limites inferiores.
50
40
30
20
10
0
18
C
on
tr
ol
15
12
9
6
b
3
ºC
TEMPERATURA
HORAS
Gráfica 19. Valor promedio de temperatura por horas post inoculación.
137
RAWNSLEY H.M. Op. cit., En:
http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf
60
3.3. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LESIONES
Los cobayos presentaron lesiones aparentes a partir de las 6 horas postinoculación; se observó ligera tumefacción del área inoculada, lesión que no se
presentó en los animales testigos. Después de las 9 horas se acentúa la
tumefacción del miembro posterior con crepitación a la palpación e hinchazón
moderada, que produce en los animales cojera inicial y después de las 15
horas por la severidad, postración; uno de los animales inoculados murió entre
las 15 y 18 horas con lesiones anteriormente descritas pero más severas en el
músculo afectado y en la región inguinal.
Los hallazgos de necropsia permitieron observar cambios discretos en las
primeras horas, donde se observó ligero edema en la zona de inoculación;
después de las 6 horas esta lesión comenzó a ser mas notoria, con presencia
de áreas oscuras (rojo – negruzco) y de un líquido sanguinolento que paso de
ligero a severo después de las 15 horas y continuó hasta las 18 horas postinoculación, presentándose en estos últimos casos un aspecto mucoide, que se
distribuía por todo el miembro y el tejido subcutáneo del abdomen en su región
inguinal.
A nivel general se observó congestión ligera desde las 3 horas de inoculación
en órganos como pulmón, cerebro, bazo, hígado y riñón, pasando a moderada
después de las 6 horas y severa a partir de las 15 horas, cuando el animal
presentaba las lesiones vasculares más severas. La crepitación y la presencia
de gas fueron notorias a partir de las 12 horas (Figura 2) en todos los animales
inoculados.
Las lesiones principales en los animales de 18 horas fueron tumefacciones
crepitantes en la musculatura estriada esquelética, tejidos de color
rojo o
marrón oscuro con estrías negras; algunas áreas aparecían húmedas y
61
desprendían exudado oscuro mezclado con gases que le daban un particular
olor dulzón (Figura 2 y 3).
a
Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad toráxica y peritoneal de cobayos
(Cavia porcellus) a. Abundante producción de gases en intestino, cuadro
congestivo y hemorrágico, 15 horas post inoculación.
b
a
Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculación. a. Tumefacciones crepitantes
en la musculatura estriada esquelética, tejidos de color rojo o marrón oscuro
con estrías negras; b. Algunas áreas aparecen húmedas y desprenden
exudado oscuro mezclado con gases.
62
3.4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LESIONES
En la tabla 4, se muestra que las lesiones más importantes ocurrieron en el
músculo estriado esquelético (MEE), única variable que resultó significativa (p =
0,0005) demostrando que si hay diferencia entre los grupos experimentales. En
los grupos control se inyectó únicamente con cloruro de calcio (CaCl2). Estos
animales presentaron un ligero edema, el cual se evidenció por la separación
de las fibras musculares, las lesiones se valoraron entre 0 y 1(Tabla 3); A este
grupo se le inyectó solamente cloruro de calcio presentando ligero edema, el
cual se evidenció por la separación de las fibras musculares.
Los cobayos después de 3 a 15 horas de la inoculación con Clostridium
chauvoei y luego sacrificados mostraron lesiones leves a moderadas como
sigue:
A partir de las 3 horas se encontró una ligera necrosis coagulativa, infiltrado de
neutrófilos polimorfonucleares y ligero edema; después de las 6 horas se hizo
notoria la separación de fibras musculares, congestión con hemorragias ligeras
y se observa infiltración polimorfonuclear, se presentó una variación moderada;
a las 9 y 12 horas se observó necrosis de coagulación. La necrosis y el
infiltrado polimorfonuclear fueron más severos a las 18 horas, al igual que la
presencia de formas bacilares en cantidades abundantes (Figura 4). El grupo
que demostró los cambios severos fue el grupo experimental de 18 horas de
inoculadas y no fue necesario sacrificar algunos cobayos, sino que murieron
por sí solos. Las lesiones principales fueron gangrena gaseosa con marcada
necrosis de coagulación y de licuefacción con olor fétido. Se encontró una
marcada infiltración polimorfonuclear de tipo neutrófilo (Figura 5 y 6).
En órganos como el bazo se observó deplesión linfoide desde las primeras 3
horas de inoculación en todos los cobayos, al igual que congestión desde las 9
horas sin tener una tendencia específica, sin embargo en el cobayo que murió
repentinamente, fue severa la congestión con hemorragias.
63
Se observaron cambios vasculares como congestión en: pulmón, hígado,
músculo estriado, músculo cardiaco y riñón (corteza y médula), desde las 3
horas de inoculación con Clostridium chauvoei.
En el cobayo que murió entre las 15 y 18 horas post inoculación, se observó
hemorragia muy severa.
Las láminas de tejidos coloreadas con hematoxilina y eosina permiten observar
lesiones anatomopatológicas generales que hacen pensar en una clostridiosis.
64
Tabla 5. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas
en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patógena de
Clostridium chauvoei.
No.
01/01/2004
01/02/2004
01/03/2004©
02/01/2004
02/02/2004
02/03/2004 ©
03/01/2004
Hora
sacrificio
BAZO
MEC
MEE
DUODENO
HIGADO
PANCREAS
PULMON
RIÑON
CEREBRO
ADRENAL
3
1
0
1ab
0
0
0
2
1
1
0
0
1ab
0
0
0
2
0
0
0
0
1a
0
0
0
1
0
0
0
1
1abc
2
1
0
2
2
2
0
1
2abc
2
1
0
1
1
1
0
1
1a
0
2
0
1
1
1
0
1
2abc
2
2
0
3
1
1
0
0
1
0
2
1
1
0
3
3
6
6
6
9
1
1
1
0
1
3
03/02/2004
9
1
1
2abc
03/03/2004 ©
9
1
2
1a
1
1
0
3
2
0
0
04/01/2004
12
1
1
2bc
1
1
0
3
1
1
0
04/02/2004
12
0
1
3bc
1
2
0
2
3
1
0
04/03/2004 ©
12
1
1
1a
1
1
0
3
0
1
0
05/01/2004
15
1
2
2abc
1
2
0
2
2
1
0
05/02/2004
15
1
1
2abc
1
1
0
2
1
1
2
05/03/2004 ©
15
1
0
0a
1
1
0
2
1
1
0
2
3c
2
1
0
2
2
1
0
2
3c
1
1
0
2
1
1
0
0
1a
0
1
0
0,0945
0,0005
0,0769
0,1876
06/01/2004
06/02/2004
06/03/2004 ©
p
18
18
18
2
2
1
0,059
1
1
|
0
0,8084
0,4803
0,4038
0,2284
MEC: Músculo estriado cardiaco; MEE: Músculo estriado esquelético
©= Grupos control inoculados con Cloruro de Calcio
p= nivel de significancia
65
A
B
a
Figura 4. Clostridiosis. a. Bacilos de Clostridium chauvoei en músculo estriado
esquelético de cobayo (Cavia porcellus) después de 18 horas de inoculación.
H.E. 100X (A) y 400X (B).
A
B
Figura 5. Clostridiosis. Músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia
porcellus), 18 horas post inoculación. Se observa infiltración polimorfonucleares
y necrosis de coagulación. H.E. 100X (A) 400X (B).
66
A
B
Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei y
leucocitos polimorfonucleares neutrófilos en músculo estriado esquelético, 18
horas post inoculación. H.E. 1000X). B) Corte longitudinal de músculo estriado
esquelético de cobayo (Cavia porcellus) testigo, el cual no presenta cambios
patológicos aparentes. H.E. 400X).
Los cambios patológicos mas importantes se observaron en el músculo
estriado esquelético, y se encontraron alteraciones a partir de 3 horas post
inoculación que incluyen desde ligero edema hasta gangrena gaseosa severa
que se produce después de las 15 horas, por la acción de las toxinas alfa y
gamma, necrotizante e hidrolizante respectivamente que destruyen la matriz
del tejido conectivo, resultados que concuerdan con lo encontrado por
Hateway, 1990 y Titball et al. 2003. esto indica que el músculo estriado
esquelético resulta ser el adecuado para el diagnostico de carbón sintomático.
67
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La temperatura se incrementó levemente a las 12 horas post inoculación con
Clostridium chauvoei, a las 15 horas disminuyó a 28.8ºC, para continuar
bajando a las 18 horas a 21ºC, como lo referencia Pemberton, 1974.
La proteína sérica y plasmática se encontró entre los valores normales, en el
animal que murió no se encontraron diferencias significativas.
No se encontró cambios hematológicos significativos en los cobayos, tan solo
algunos grupos presentaron en las primeras horas post inoculación una
leucopenia, debido a las fases iniciales de infección aguda.
La neutrofilia se observó en todos los grupos inoculados con Clostridium
chauvoei, su valor nunca retorno al normal, debido a la agudeza de la infección.
No se hallaron diferencias significativas en sangre debido a la rapidez con la
cual se desarrolla la enfermedad.
La enzima asociada con el daño de músculo esquelético Creatinin Kinasa,
incrementó su valor por encima de los límites superiores, debido a la
inflamación muscular causada por el trauma de la inoculación. La actividad de
Gamma glutamil transferasa GGT; Alanina aminotransferasa ALAT - GPT;
Aspartato aminotransferasa AST – GOT, no se determinó ya que los datos
fueron insuficientes para dar conclusiones validas.
Los cambios patológicos mas importantes se observaron en el músculo
estriado esquelético y se encontraron alteraciones leves a partir de las 3 horas
post - inoculación
68
El músculo esquelético estriado es el único tejido que presento cambios
significativos en esta investigación, debido a que la bacteria de Clostridium
chauvoei afecta específicamente a este tejido.
El tejido muscular estriado esquelético resulta ser el adecuado para el
diagnóstico de carbón sintomático, este resultado concuerda con Assis et al.
(2005).
Los cobayos inoculados con Clostridium chauvoei mueren entre las 15 y 18
horas post inoculación, presentando las lesiones mas severas.
Importante tomar muestras del animal recién muerto, teniendo en cuenta el
protocolo de recolección de tejidos para histopatología y así evitar que estos
tejidos sean contaminados con otras bacterias que normalmente están
presentes en el animal y no poder hallar un diagnóstico certero.
La fijación del tejido en formaldehído permitió su uso posterior a la toma de la
muestra, sin presentar cambios que alteren el diagnóstico.
La utilización de tejidos fijados en formol bufferado al 10%, es una buena
opción ya que se pueden enviar muestras desde áreas remotas del país y
también estas muestras pueden ser almacenadas por el tiempo necesario sin
alterar los resultados de la técnica.
De acuerdo con los resultados obtenidos, la técnica de hematoxilina y eosina
permite observar lesiones anatomopatológicas generales que nos hacen
pensar en una clostridiosis, pero no permiten confirmar el tipo de Clostridium
involucrado tal como lo indicaron Ortiz y Benavides (2002)
69
Evitar enterrar animales presuntamente muertos por Clostridiosis, para evitar
que las esporas del Clostridium después salgan al medio ambiente y contamine
agua, pienso ó a otros animales.
Darle a conocer al ganadero la importancia de enviar muestras de los animales
muertos para tener un diagnóstico real del agente causal de la enfermedad.
Este trabajo es importante como soporte para nuevos estudios en el área de
bacterias anaerobias en Colombia
70
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Enero 2 de 2004. En: http://www.icronline.com/sitio/pacientes/seguridad.asp
Report of the AVMA panel de euthanasia. 1986. JAVMA, vol 188, Nº 3,
February 1, p. 253.
En: http://www.proclave.com/servet/tomamuestras/agujas.htm
79
6. ANEXOS
Anexo 1. Resultados de Hematología, grupo A (3 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Promedio
40,5
13,95
18,75
34,37
7475000
5,45
5,1
4293,31
12975
1
895
64,5
8791,5
29
3279,75
3
429,5
2,5
384,75
0
0
des. estándar
3,54
1,91
0,94
1,71
1393000
0,35
0,57
880,25
5692
1,41
1265,72
14,85
5598,16
16,97
551,19
1,41
354,26
2,12
417,55
0
0
80
Mediana
40,5
13,95
18,75
34,37
7475000
5,45
5,1
4293,31
12975
1
895
64,5
8791,5
29
3279,75
3
429,5
2,5
384,75
0
0
EE
2,5
1,35
0,66
1,21
985000
0,25
0,4
622,43
4025
1
895
10,5
3958,5
12
389,75
1
250,5
1,5
295,25
0
0
LCI 95%
35,6
11,3
17,45
31,99
5544400
4,96
4,32
3073,35
5086
-0,96
-859,2
43,92
1032,84
5,48
2515,84
1,04
-61,48
-0,44
-193,94
0
0
LCS 95%
45,4
16,6
20,05
36,74
9405600
5,94
5,88
5513,27
20864
2,96
2649,2
85,08
16550,16
52,52
4043,66
4,96
920,48
5,44
963,44
0
0
Anexo 2. Resultados de Hematología, grupo B (6 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Promedio
45,25
15
25,9
33,23
6075000
5,65
4,65
4727,29
5900
2
110,5
55,5
3330,75
39
2263,5
0,5
33,25
3
162
0
0
des. estándar
5,3
1,13
8,89
1,39
1647559
1,2
0,21
500,41
1061
1,41
62,23
10,61
1214,46
7,07
3,54
0,71
47,02
2,83
135,06
0
0
81
Mediana
45,25
15
25,9
33,23
6075000
5,65
4,65
4727,29
5900
2
110,5
55,5
3330,75
39
2263,5
0,5
33,25
3
162
0
0
EE
3,75
0,8
6,28
0,99
1165000
0,85
0,15
353,84
750
1
44
7,5
858,75
5
2,5
0,5
33,25
2
95,5
0
0
LCI 95%
37,9
13,43
13,58
31,3
3791600
3,98
4,36
4033,76
4430
0,04
24,26
40,8
1647,6
29,2
2258,6
-0,48
-31,92
-0,92
-25,18
0
0
LCS 95%
52,6
16,57
38,21
35,16
8358400
7,32
4,94
5420,82
7370
3,96
196,74
70,2
2897,61
58,47
2268,4
1,48
98,42
6,92
349,18
0
0
Anexo 3. Resultados de Hematología, grupo C (9 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Promedio
46
15,4
19,29
33,45
8000000
5,55
5,05
4139,05
9750
1
96
33,5
3282
55,5
5398,5
0,5
49,5
8
780
1,50
144
des. estándar
1,41
1,41
2,45
2,05
282843
0,21
0,07
366,84
212,13
1,41
135,76
14,85
1518,87
12,02
1054,3
0,71
70
0
16,97
2,12
203,65
82
Mediana
46
15,4
19,29
33,45
8000000
5,55
5,05
4139,05
9750
1
96
33,5
3282
55,5
5398,5
0,5
49,5
8
780
1,50
144
EE
1
1
1,73
1,45
200000
0,15
0,05
259,39
150
1
96
10,5
1074
8,5
745,5
0,5
49,5
0
12
LCI 95%
44,04
13,44
15,9
30,61
7608000
5,26
4,95
3630,63
9456
-0,96
-92,16
12,92
1176,96
38,84
3937,32
-0,48
-47,52
8
756,48
LCS 95%
47,96
17,36
22,69
36,28
8392000
5,84
5,15
4647,46
10044
2,96
284,16
54,08
5387,04
72,16
6859,68
1,48
146,52
8
803,52
144
-138,24
426,24
Anexo 4. Resultados de Hematología, grupo D (12 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Promedio des. estándar
50,5
4,95
17,55
0,78
35,89
3,27
34,84
1,88
4920000
664680
5
0,28
4,4
0,14
4003,9
1767,15
3875
742
1
0
38,75
7,42
54,5
4,95
2130,25
596,44
42
4,24
1611,75
147,43
0,5
0,71
22
31,11
0,5
0,71
22
31,11
1,50
2,12
50,25
71,06
83
Mediana
50,5
17,55
35,89
34,84
4920000
5
4,4
4003,9
3875
1
38,75
54,5
2130,25
42
1611,75
0,5
22
0,5
22
1,50
50,25
EE
3,5
0,55
2,31
1,33
470000
0,2
0,1
1249,57
525
0
5,25
3,5
421,75
3
104,25
0,5
22
0,5
22
1,5
50,25
LCI 95%
43,64
16,47
31,36
32,25
3998800
4,61
4,2
1554,75
2846
1
28,46
47,64
1303,62
36,12
1407,42
-0,48
-21,12
-0,48
-21,12
-1,44
-48,24
LCS 95%
57,36
18,63
40,42
37,44
5841200
5,39
4,6
6453,04
4904
1
49,04
61,36
2956,88
47,88
1816,08
1,48
65,12
1,48
65,12
4,44
148,74
Anexo 5. Resultados de Hematología, grupo E (15 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Promedio des. estándar
42,25
1,06
12,90
4,67
39,67
27,21
30,68
11,82
3725000
1378858
4,70
0,42
4,75
0,21
4473,55
1293,67
7850
3677
8,50
7,78
524,25
298,05
62,00
8,49
5023,00
2945,81
25,00
1,41
1988,50
1030,25
1,00
1,41
52,50
74,25
3,50
0,71
261,75
73,19
0
0
0
0
84
Mediana
42,25
12,9
39,67
30,68
3725000
4,7
4,75
4473,55
7850
8,5
524,25
62
5023
25
1988,5
1
52,5
3,5
261,75
0
0
EE
0,75
3,30
19,24
8,36
975000
0,30
0,15
914,76
2600
5,50
210,75
6,00
2083
1,00
728,50
1,00
52,50
0,5
51,75
0
0
LCI 95%
40,78
6,43
1,95
14,30
1814000
4,11
4,46
2680,62
2754
-2,28
111,18
50,24
940,32
23,04
560,64
-0,96
-50,40
2,52
160,32
0
0
LCS 95%
43,72
19,37
77,38
47,06
5636000
5,29
5,04
6266,48
15057
19,28
937,32
73,76
9105,68
26,96
3416,36
2,96
155,40
4,48
363,18
0
0
Anexo 6. Resultados de Hematología, grupo F (18 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia
porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos x mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Promedio des. estándar
46
0
12,10
1,84
16,84
4,98
26,30
4,00
7345000
1081873
5,45
1,34
4,85
0,49
1821,28
87,43
5075
742
10,50
2,12
540,75
185,62
54,00
19,80
2814,00
1405,73
34,50
21,92
1669,50
856,31
1
0
50,75
7,42
0
0
0
0
0
0
0
0
85
Mediana
46
12,1
16,84
26,30
7345000
5,45
4,85
1821,28
5075
10,5
540,75
54
2814
34,5
1669,5
1
50,75
0
0
0
0
EE
0
1,30
3,52
2,83
765000
0,95
0,35
61,82
525
1,50
131,25
14,00
994
15,50
605,50
0
5,25
0
0
0
0
LCI 95%
46
9,55
9,93
20,77
5845600
3,59
4,16
1700,10
4046
7,56
283,5
26,56
865,76
4,12
482,72
1
40,46
0
0
0
0
LCS 95%
46
14,65
23,75
31,84
8844400
7,31
5,54
1942,45
6104
13,44
798
81,44
4762,24
64,88
2856,28
1
61,04
0
0
0
0
Anexo 7. Resultados de Hematología, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus).
n
Hto %
Hb g/dL
HCM Picogramos
CCMH %
Eritrocitos μL
Proteína Plasmática
Proteína Sérica g/dL
CK (UI/L)
Leucocitos mm3
Neutrófilos B. Relativo
Neutrófilos B. Absoluto
Neutrófilos S. Relativo
Neutrófilos S. Absoluto
Linfocitos Relativo
Linfocitos Absoluto
Eosinófilos Relativo
Eosinófilos Absoluto
Monocitos Relativo
Monocitos Absoluto
KC cells Relativo
KC cells Absoluto
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Promedio des. estándar
40,75
5,21
12,87
1,89
25,80
8,75
31,82
4,50
5362500
1492427
5,40
0,55
5,28
0,48
4222,97
853,35
5813
3695
1,33
1,86
59,42
80,04
45,17
14,30
2939,45
3006,67
48,67
13,98
2599,47
1062,86
1,50
1,38
70,10
79,59
3,00
3,10
130,57
92,13
0
0
0
0
86
Mediana
42,75
13,05
22,11
32,80
5710000
5,35
5,3
4469,86
4750
1
42,5
42
1816,25
51
2601,65
1
47,5
2
115,45
0
0
EE
2,13
0,77
3,57
1,84
609281
0,23
0,20
348,38
1509
0,76
32,67
5,84
1227,47
5,71
433,91
0,56
32,49
1,26
37,61
0
0
LCI 95%
36,58
11,36
18,80
28,22
4168310
4,96
4,90
3540,15
2857
-0,16
-4,62
33,72
533,61
37,48
1749,00
0,40
6,42
0,52
56,85
0
0
LCS 95%
44,92
14,38
32,81
35,43
6556690
5,84
5,67
4905,79
8770
2,82
123,46
56,61
5345,29
59,85
3449,93
2,60
133,78
5,48
204,29
0
0
Anexo 8. Resultados estadísticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa
patógena de Clostridium chauvoei.
Temperatura
ºC
n
G
A
B
C
D
E
Control
F
18
2
2
2
2
2
2
6
35,54
38
38,85
38,45
39,85
28,8
21
38,3
Des. estándar
6,75
0
0,35
0,78
0,21
11,03
1,41
0,58
Mediana
38,2
38
38,85
38,45
39,85
28,8
21
38,3
EE
1,59
0
0,25
0,55
0,15
7,8
1
0,24
LCI 95%
32,42
38
38,36
37,37
39,56
13,51
19,04
37,84
LCS 95%
38,66
38
39,34
39,53
40,14
44,09
22,96
38,76
Promedio
p
0,0008
87
Anexo 9. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
DENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
MÚSCULO
GRUPO
BAZO
DUODENO
HÍGADO
PÁNCREAS
PULMÓN
ESTRIADO
CARDIACO
Congestión, área de
01/01/2004
3
A
Deplesión
Infiltrado
linfoide
mononuclear
consolidación con
SCPA
SCPA
engrosamiento de septos
alveolares. Neumonía
Infiltrado mononuclear
perivascular
intersticial
Infiltrado
01/02/2004
3
A
Deplesión
Infiltrado
linfoide
mononuclear
Engrosamiento septos
mononuclear
periportal,
SCPA
degeneración
Congestión,
3
G
deplesión
linfoidea
Infiltrado
mononuclear
88
Infiltrado mononuclear
mononuclear, congestión,
perivascular
neumonía intersticial.
centrolobulillar
01/03/2004 ©
alveolares, infiltrado
Congestión,
SCPA
SCPA
engrosamiento septos
alveolares
SCPA
Anexo 10. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
GRUPO
MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO
A
polimorfonuclear, separación fibras,
Necrosis, congestión, infiltrado
01/01/2004
3
edema
RIÑÓN
CEREBRO
ADRENAL
Congestión cortical y
Congestión, edema
medular
perivascular
SCPA
SCPA
SCPA
SCPA
SCPA
SCPA
SCPA
Necrosis de coagulación, infiltrado
01/02/2004
3
A
polimorfonuclear, separación fibras,
edema, hemorragia
01/03/2004 ©
3
G
Separación de fibras por edema
89
Anexo 11. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
MÚSCULO
GRUPO
BAZO
6
B
linfoide,
congestión
02/02/2004
6
6
PÁNCREAS
PULMÓN
B
SCPA
G
deplesión
Engrosamiento
Congestión,
Infiltrado
infiltrado
mononuclear
mononuclear
septos
SCPA
alveolares,
congestión,
periportal
hemorragia
Congestión,
Focos,
Infiltrado
infiltrado
Engrosamiento
eosinófilos
mononuclear
ESTRIADO
SCPA
de septos
Congestión,
infiltrado
mononuclear
perivascular
Infiltrado
mononuclear
perivascular
periportal
alveolares
Congestión
Engrosamiento
Congestión
de septos
moderada
Focos,
Congestión,
02/03/2004 ©
HÍGADO
CARDIACO
Deplesión
02/01/2004
DUODENO
SCPA
linfoidea ligera
moderada
SCPA
alveolares, ligera
90
Anexo 12. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
02/01/2004
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
6
GRUPO
B
MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO
RIÑÓN
Hemorragia, separación de fibras por
Congestión,
edema, necrosis de coagulación,
degeneración vacuolar
infiltrado polimorfonuclear
tubular
CEREBRO
ADRENAL
Edema perivascular,
infiltrado de
mononucleares en
SCPA
meninges, congestión
Congestión, separación de fibras por
02/02/2004
6
B
edema, necrosis de coagulación,
Congestión
Congestión, edema
hemorragia, infiltrado polimorfonuclear,
corticomedular
perivascular
SCPA
precipitación de calcio
Separación de fibras por edema,
02/03/2004 ©
6
G
infiltrado polimorfonuclear ligero,
precipitación de calcio
91
Congestión
corticomedular ligera
Congestión ligera
SCPA
Anexo 13. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
03/01/2004
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
9
GRUPO
C
BAZO
Congestión
leve
DUODENO
Infiltrado
mononucleares,
leve
HÍGADO
PÁNCREAS
PULMÓN
9
C
Congestión
moderada
SCPA
alveolares con infiltración
Infiltrado mononuclear
mononucleares,
perivascular leve
congestión
Deplesión
Infiltrado
linfoidea leve
mononuclear
Congestión leve
SCPA
alveolares moderado con
infiltrado mononuclear y
congestión moderada
03/03/2004 ©
9
G
CARDIACO
Engrosamiento septos
Engrosamiento septos
03/02/2004
MÚSCULO ESTRIADO
Congestión,
Infiltrado
deplesión
mononuclear
linfoidea ligera
ligero
infiltrado
mononuclear
periportal ligero
92
Engrosamiento
Congestión ligera,
SCPA
generalizado de septos
alveolares con focos de
infiltrado mononuclear
Congestión, infiltrado
mononuclear
perivascular, leve
Congestión moderada e
infiltrado perivascular
mononuclear ligero
Anexo 14. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
GRUPO
MÚSCULO ESTRIADO
RIÑÓN
CEREBRO
necrosis coagulativa moderada,
Congestión cortical y
Edema perivascular,
hemorragia leve, infiltrado
medular leve
congestión
ESQUELÉTICO
ADRENAL
Separación de fibras por edema,
03/01/2004
9
C
SCPA
polimorfonuclear moderado
Hemorragia, separación de fibras por
03/02/2004
9
C
edema, necrosis de coagulación,
infiltrado polimorfonuclear, presencia
de bacterias bacilares basófilas
Necrosis, congestión, infiltrado
03/03/2004 ©
9
G
polimorfonuclear, separación fibras,
edema, ligero
93
Congestión corticomedular,
foco de infiltrado
mononuclear en médula
Congestión cortical y
medular moderada
Congestión, edema
perivascular ligero
SCPA
SCPA
SCPA
Anexo 15. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
04/01/2004
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
12
GRUPO
D
BAZO
Deplesión
linfoidea ligera
DUODENO
Infiltrado
mononucleares,
leve
12
D
SCPA
PÁNCREAS
infiltrado
mononuclear
mononuclear
ligero
Congestión
moderada
PULMÓN
MÚSCULO ESTRIADO
CARDIACO
Congestión, área de
Congestión ligera,
consolidación con
SCPA
engrosamiento de septos
Congestión leve
alveolares. Neumonía
periportal ligero
Infiltrado
04/02/2004
HÍGADO
intersticial
Focos de consolidación ,
SCPA
engrosamiento de septos
Congestión ligera
alveolares
Engrosamiento
04/03/2004 ©
12
G
Deplesión
Infiltrado
linfoidea,
mononuclear
congestión
ligero
generalizado de septos
Congestión leve
SCPA
alveolares con focos de
infiltrado mononuclear,
congestión moderada
94
Congestión leve
Anexo 16. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
GRUPO
MÚSCULO ESTRIADO
ESQUELÉTICO
RIÑÓN
CEREBRO
ADRENAL
Congestión ligera
SCPA
Separación de fibras por edema,
04/01/2004
12
D
necrosis coagulativa moderada,
Congestión cortical y
congestión moderada, infiltrado
medular leve, infiltrado
polimorfonuclear severo con
mononuclear subepitelial en
presencia de abundantes bacterias y
pelvis
áreas de precipitados de calcio
Congestión moderad y hemorragia
ligera. Infiltrado polimorfonucleares
04/02/2004
12
D
con presencia de bacterias,
separación de fibras y necrosis
Congestión corticomedular,
severa
Congestión moderada
con edema
SCPA
perivascular ligero
coagulativa
Necrosis, congestión, infiltrado
04/03/2004 ©
12
G
polimorfonuclear, separación fibras,
edema, ligero
95
SCPA
Congestión ligera
SCPA
Anexo 17. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
MÚSCULO
GRUPO
BAZO
DUODENO
HÍGADO
PÁNCREAS
PULMÓN
ESTRIADO
CARDIACO
Congestión, área de
Congestión ligera
05/01/2004
15
E
y presencia de
hemosiderófagos
consolidación con
Infiltrado
Congestión
mononuclear
moderada
SCPA
Congestión moderada
engrosamiento de
e infiltrado
septos alveolares.
perivascular
Neumonía intersticial,
mononuclear ligero
moderado
Infiltrado
05/02/2004
15
E
Congestión ligera
Infiltrado
y presencia de
mononuclear
hemosiderófagos
ligero
periportal
mononuclear
ligero y
Congestión ligera
SCPA
engrosamiento de
infiltrados
septos alveolares
mononucleares
Congestión
perivasculares ligeros
ligera
Engrosamiento
Infiltrado
05/03/2004 ©
15
G
Deplesión
mononuclear
linfoidea
en submucosa
ligero
generalizado de
Infiltrado
mononuclear
periportal, ligero
SCPA
septos alveolares con
focos de infiltrado
mononuclear,
congestión moderada
96
SCPA
Anexo 18. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
GRUPO
MÚSCULO ESTRIADO
ESQUELÉTICO
Separación de fibras por edema,
05/01/2004
15
E
necrosis de coagulación, infiltrado
polimorfonuclear, mononucleares
RIÑÓN
15
E
medular moderada,
Edema perivascular
infiltrado mononuclear
ligero, área gliosis
15
G
polimorfonucleares con presencia
Congestión corticomedular,
de bacterias, separación de fibras y
ligera
Necrosis coagulación
97
SCPA
perivascular
necrosis coagulativa
05/03/2004 ©
ADRENAL
Congestión cortical y
Congestión modera, Infiltrado
05/02/2004
CEREBRO
Congestión ligera
Congestión ligera,
edema perivascular
ligero
Congestión ligera
Hemorragia
severa
SCPA
Anexo 19. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
MÚSCULO
GRUPO
BAZO
DUODENO
18
F
F
18
G
infiltrado
perivascular
congestión ligera
alveolares. Edema ligero
mononuclear ligero
Congestión,
Congestión, área de
mononuclear
mononuclear
periportal ligero y
moderada,
Infiltrado
deplesión
mononuclear y
linfoide
polimorfonuclear
infiltrado
mononuclear
SCPA
SCPA
Infiltrado
Infiltrado
linfoidea ligera,
mononuclear en
mononuclear
congestión
submucosa
periportal,
ligera
ligero
congestión ligera
consolidación con
engrosamiento de septos
alveolares. Edema ligero
periportal
Deplesión
98
Congestión ligera e
consolidación con
Infiltrado
deplesión
moderada
06/03/2004 ©
ESTRIADO
engrosamiento de septos
moderada,
Congestión
18
PULMÓN
Congestión, área de
Infiltrado
linfoide severa
06/02/2004
PÁNCREAS
CARDIACO
Congestión
06/01/2004
HÍGADO
Congestión
moderada e
infiltrado
perivascular
mononuclear ligero
Engrosamiento
generalizado de septos
SCPA
alveolares con focos de
infiltrado mononuclear,
congestión moderada
SCPA
Anexo 20. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).
Marzo 11 de 2004
IDENTIFICACIÓN
Hora inóculo:
Clostridium
8:00 a.m.
chauvoei
HORA DE
SACRIFICIO
GRUPO
MÚSCULO ESTRIADO
ESQUELÉTICO
Separación de fibras por edema,
06/01/2004
18
F
RIÑÓN
18
F
necrosis de coagulación, infiltrado
medular moderada,
polimorfonuclear, mononucleares,
degeneración vacuolar de
bacterias bacilares basófilas, severo
túbulos ligera
necrosis de coagulación, infiltrado
Congestión cortical y
polimorfonuclear, mononucleares,
medular ligera
bacterias bacilares basófilas, severo
06/03/2004 ©
18
G
Ligero infiltrado polimorfonuclear
99
ADRENAL
Congestión
SCPA
Congestión cortical y
Separación de fibras por edema,
06/02/2004
CEREBRO
Congestión corticomedular
ligera
Congestión ligera,
infiltrado mononuclear
SCPA
en meninges
Congestión ligera
SCPA
Anexo 21. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejido de Cavia porcellus inoculados
con la cepa patógena de Clostridium chauvoei
Tejido
Mean
Std. dev.
Min
Max
p
Bazo
1,11
0,68
0
3
0,06
Duodeno
0,89
0,76
0
2
0,08
Hígado
1,06
0,64
0
2
0,19
Páncreas
0,00
0,00
Pulmón
2,00
0,69
1
3
0,81
MEC
0,94
0,73
0
2
0,09
MEE
1,61
0,85
0
3
0,00
Riñón
1,17
0,79
0
3
0,48
Cerebro
0,89
0,47
0
2
0,40
Adrenal
0,11
0,47
0
2
0,23
P = Nivel de significancía; MEC: Músculo estriado cardiaco; MEE: Músculo estriado esquelético; © = Grupos testigo
inoculados con Cloruro de Calcio.
100
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