Guía 2010

INMUNOLOGÍA MOLECULAR
2010
DOCENTES AUXILIARES: Juan Sebastián Mucci
Virginia Tribulatti
Romina P Muiá
Valentina Cattaneo
María Ana Meira
Condiciones de la cursada:
Trabajos Prácticos y Seminarios:
Asistencia 80%
Aprobación del 80 % de los parcialitos de seminarios
Los parciales prácticos se aprueban con 6/10
(Se puede recuperar sólo uno de los dos parciales prácticos al final de la
cursada)
Promoción de la materia:
Los parciales téoricos deben ser aprobados con 7/10.
Parciales Prácticos aprobados (sin recuperar ninguno)
Cronograma Trabajos Prácticos Inmunología Molecular (Segundo
Cuatrimestre 2010)
13/08 TP1 Inmunización
20/08 TP 2 Proliferación Celular I
27/08 TP 3 Proliferación Celular II
03/09 Seminario I
10/09 TP 4 Citometría de Flujo
17/09 Seminario II
24/09 Primer Parcial
01/10 TP 5 Purificación de Inmunoglobulinas
08/10 Seminario III
22/10 TP 6 Interacción Ag-Ac I
29/10 Seminario IV
05/11 TP 7 Grupo Sanguíneo / TP 8 RIA (teórico)
12/11 TP 9 ELISA
19/11 Segundo Parcial
26/11 Recuperatorio
27/11 Fin cursada
02/12 Entrega de Actas
Trabajo práctico Nº 1: Inmunización de animales
INTRODUCCION:
La producción de anticuerpos depende de la respuesta humoral de los
animales. El uso de los anticuerpos tiene importancia a varios niveles:
investigación, diagnóstico, purificación de compuestos, etc.
La habilidad de una molécula para inducir respuesta inmune, llamada
inmunogenicidad, esta determinada
por su
estructura
química
intrínseca y por la capacidad del animal de reconocerla como no propia.
Estos dos factores están íntimamente relacionados y son la base para
diseñar un buen protocolo de inmunización.
Una clave para mejorar la respuesta hacia un inmunógeno soluble es el
uso de adyuvantes que se comportan como estimulantes no específicos
del sistema inmune.
PROTOCOLO:
Se inmunizarán ratones con un antígeno en diferentes adyuvantes o sin el
mismo.
PRIMERA DOSIS
SEGUNDA DOSIS
TERCERA DOSIS
Dia 0
Dia 15-20
Dia 30-45
10µg/ratón + adyuv.
2µg/ratón + adyuv. Freund 2µg/ratón + adyuv. Freund
Freund completo.
incompleto.
10µg/ratón + adyuv.
2µg/ratón + adyuv. alúmina 2µg/ratón + adyuv. alúmina
incompleto.
alúmina
Paralelamente se inmunizarán animales con antígenos repetitivos con
los cuales se trabaja en el laboratorio y con una enzima que requiere
mantener su conformación para producir una respuesta neutralizante de
su actividad enzimática. Se discutirá en el practico el tipo de adyuvante a
utilizar y el esquema de inmunización.
Preparación de la Alúmina:
Pesar 1gr de sulfato de aluminio y disolver en 10ml de agua destilada en
un tubo de 50ml (Dejar por lo menos 30 min.). Agregar gota a gota 22,8ml
de NaOH 0,25N con agitación constante para evitar la formación de
precipitado
Dejar a temp amb unos 30min.
Centrifugar a 3200 rpm por 10min y descartar el sobrenadante. Resuspender
en 50ml de agua destilada y volver a pelletear. Descartar nuevamente el
sobrenadante, agregar Tris 150mM como conservante. Guardar a 4°C.
Acomplejamiento de proteínas a Alúmina:
Mezclar alúmina con la proteína en un buffer que no contenga fosfatos ni
otros aniones (Por ejemplo TBS).
Incubar a temp amb durante 30min agitando el tubo
cada tanto. Teóricamente, 1mg de alúmina pega 50200µg de proteína.
Adyuvante de Freund:
Es el más utilizado en los laboratorios. Es una emulsión preparada con
aceites no metabolizables y M.tuberculosis (En el caso del Completo).
Para la primera dosis se utiliza el completo, ya que produce una fuerte y
prolongada respuesta local, para el resto de las dosis se utilizará el
adyuvante incompleto.
Si se usa el adyuvante completo se deberá vortexear muy bien el vial que lo
contiene para resuspender las partículas bacterianas.
El antígeno disuelto en PBS se mezclará en partes iguales con el adyuvante
y se emulsionará utilizando un microemulsificador.
Se tomarán muestras de sangre preinmune antes de la primer dosis.
A los 14-30 dias se sangrará nuevamente a los animales y finalmente se los
sangrarán al finalizar con el esquema de inmunización.
Los sueros serán valorados por ELISA y por dot blot al final de la cursada. Se
compararán
los
diferentes
esquemas
considerando
inmunoglobulinas especificas obtenidas (Título del suero).
cantidad
de
Trabajo Práctico 2: Ensayo de proliferación celular.
INTRODUCCIÓN
La incorporación de [3H] timidina se basa en la incorporación de este
nucleótido a las cadenas de DNA que se están sintetizando. Este método
posee una elevada sensibilidad y rapidez. Dependiendo el sistema celular a
utilizar, se deben incubar las células con el núcleotido marcado desde 4
hasta 24 Hs.
En el práctico vamos a utilizar esta técnica para medir activación de
células T provenientes de un ratón transgénico, cuyos TCRs
interaccionan con un péptido específico de la Ovoalbúmina (OVA). En
el día de hoy se utilizara este péptido compuesto por los aa´s 323-339 y
la proteína OVA para activar a las células T.
Dentro de los métodos más utilizados para medir la proliferación
celular se encuentran:
1. La incorporación de Timidina tritiada.
2. La medición de actividad metabólica por MTT o similares.
3. Dilución del colorante CFSE y medición por citometría de flujo
Materiales:
•
Tijeras y pinzas de cirugía estériles
•
Caja de petri con malla de acero estéril
•
Buffer de lisis de glóbulos rojos
•
Medio de cultivo RPMI 1640, 10% Suero Fetal Bovino
•
Placas de 96 wells
•
Solución de péptido OVA (1mg/ml)
•
Solución OVA (100 mg/ml)
•
Timidina tritiada (1mCi/ml)
•
Viales y Líquido de centelleo
Procedimiento
1. Colocar 2ml de RMPI sin suero en la caja de petri que contiene el
rayador, y dejar en hielo.
2. Sacrificar al ratón por asfixia en anhídrido carbónico.
3. Extraer el bazo y colocar en la placa de petri.
4. Rallar el órgano con la malla de acero en 1-2 ml de medio RPMI.
Transferir las células a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a
400xg durante 5 minutos a 4°C.
5. Tirar el sobrenadante por volcado y agregar 2-3 ml de buffer de lisis
de glóbulos rojos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Llevar
a 15 ml con PBS frío. Centrifugar a 400xg por 5 minutos a 4°C.
6. Tirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de RPMI
10% SFB, hacer una dilución 1/100 en PBS, y contar en cámara
de Neubauer (10 µl).
Proliferación
1. Se utilizará una placa de 96 wells, y se sembraran 12 wells con 100
µl de una suspensión celular 3x105 esplenocitos/ml.
2. Agregar el péptido OVA (concentración final 0.5 µg /ml grupo 1 y
1µg/ml
2) o la proteína OVA (concentración final 1 mg/ml grupo 3 y 2.5
mg/ml 4). Sembrar 4 wells sin nada como controles del fondo del
experimento y 4 wells que serán estimulados con Concavalina A (0,5
µg/ml recién preparada), un mitógeno de células T utilizado como
control de la proliferación.
Todas los estímulos deben ser agregados en 100 µl de RPMI 10%
SFB.
3. Cultivar las células por 48Hs y luego agregar 0.5 µCi/well de timidita
tritiada en 50 µl de RPMI 10% SFB.
4. Dejar incubando las células por 24 Hs. más.
Trabajo práctico Nº 3: Cosecha y medición de radiactividad incorporada
En el trabajo práctico se cosecharan las células con un cosechador de
células automático.
1. Colocar cada filtro de fibra de vidrio correspondiente a cada well en un
tubo polistor.
2. Agregar a cada tubo 1ml de líquido de centelleo (Hisafe) y tapar.
Rotular bien los tubos.
3. Contar la radiactividad incorporada en un contador de emisiones beta.
Trabajo Práctico N 4: Análisis de proliferación celular por citometría de
flujo
INTRODUCCIÓN
El reactivo CFDA SE (carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl
ester), comúnmente llamado CFSE difunde pasivamente dentro de las
células. Es incoloro y no fluorescente hasta que sus grupos acetatos son
clivados por esterasas intracelulares dando lugar al compuesto
carboxyfluorescein succinimidyl ester
altamente fluorescente. Este
compuesto reacciona con los grupos amino intracelulares, formando
conjugados fluorescentes que son bien retenidos por las células y que
pueden ser fijados con aldehídos. El exceso de reactivo no conjugado
difunde pasivamente hacia el medio extracelular, donde puede ser lavado.
Los conjugados que se forman son retenidos por las células a lo largo
de su desarrollo. Esta marca es heredada por las células hijas después de la
división o fusión celular, y no es transferida a las células adyacentes. Esta
particularidad hace que el compuesto pueda ser utilizado como un trazador in
vivo. Los picos de excitación y emisión luego de su hidrólisis son 492nm y
517nm, respectivamente. Las células marcadas con CFSE pueden ser
analizadas por citometría de flujo usando el canal FL1.
OBJETIVOS
•
Cuantificar la proliferación celular de esplenocitos provenientes del
ratón DO11.10 TCROVA en presencia de la proteína ovoalbúmina
(OVA) y del péptido específico OVA323-339 mediante la dilución del
compuesto CFSE y posterior análisis por citometría de flujo.
MATERIALES
-Ratones DO11.10 TCROVA
-Tijeras y pinzas de cirugía estériles
-Caja de Petri con malla de acero estéril
-Solución de lisis de glóbulos rojos
-Medio de cultivo RPMI 1640, 10% Suero Fetal Bovino (SFB)
-Placas de 96 pocillos
-Solución de péptido OVA323-339 (1mg/ml)
-Solución de ovoalbúmina (100 mg/ml)
-Solución stock CFSE (10 mM)
-PBS/0.5% SFB.
PROCEDIMIENTO
Purificación de esplenocitos totales
4. Sacrificar un ratón y extraer el bazo.
5. Colocar el órgano en una caja de Petri con 2ml de RMPI + SFB y
mantener en hielo.
6. Disgregar el bazo con la malla de acero. Transferir las células a un
tubo de 15 ml, agregando RPMI sin suero y centrifugar a 400xg
durante 5 minutos a 4 °C.
7. Descartar el sobrenadante por volcado y agregar 2-3 ml de solución
de lisis de glóbulos rojos. Incubar a temperatura ambiente durante 5
minutos. Llevar a 15 ml con PBS frío. Centrifugar a 400xg por 5
minutos a 4 °C.
Marcación con CFSE
IMPORTANTE: guardar 1-2x106 células sin marcar y fijar para usar de
control.
8. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml PBS +
0,5% SFB (precalentado a 37°C) conteniendo 3µM de CFSE.
Incubar 10 minutos a 37°C.
9. Agregar 10 ml de RPMI y centrifugar a 400xg durante 5 min.
Resuspender el pellet en 2 ml de RPMI completo. Diluir una
alícuota 1/100 en PBS y contar las células en cámara de
Neubauer.
Ensayo de proliferación
10. Sembrar en una placa de 96 wells, 200 µl de una suspensión
celular (1,5.106 esplenocitos/ml).
11. Los tratamientos se harán por duplicado: agregar el péptido
OVA323-339 (concentración final 1 g/ml) o la proteína OVA
(concentración final 2,5 mg/ml). Como control
positivo de
proliferación se usará Concavalina A (0,5 µg/ml final), y se dejarán
células sin estimular como control negativo.
12. Luego de cultivar las células durante 72 – 96 horas en estufa de
CO2, se colectan las células y se lavan con 1 ml de PBS frío. A
continuación se fijan con paraformaldehído 2% en PBS y se
guardan a 4°C, a resguardo de la luz.
13. La muestras se analizarán por citometría de flujo y los datos se
procesarán usando el programa WinMDI2.9.
Trabajo práctico N°5: Purificación de inmunoglobulinas a partir de
suero.
A) METODOS INESPECÍFICOS
Existen varios métodos inespecíficos para separar las globulinas del resto de
las proteínas séricas. Si se parte de sueros de animales inmunizados o de
pacientes infectados, donde una alta proporción de las proteínas son
inmunoglobulinas, utilizando estos métodos pueden obtenerse soluciones de
globulinas donde un 40-80 % corresponde a inmunoglobulinas.
Los métodos inespecíficos más utilizados son:
Precipitación salina
Precipitación alcohólica
Cromatografía de
intercambio
iónico Columna de hidroxiapatita
Tamiz molecular
1) PURIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS POR PRECIPITACIÓN
SALINA
Para realizar esta técnica los compuestos más utilizados son:
Sulfato de amonio: utilizando una solución al 30-50% de saturación
precipitan las inmunoglobulinas.
Sulfato de sodio.
Ácido caprílico: es un método barato por el cual se logra separar la
IgG pero también precipitan otras proteínas séricas. La pureza de la
preparación así obtenida puede aumentarse realizando una segunda
precipitación con sulfato de amonio.
En el trabajo práctico se realizará una purificación de IgG de suero humano
normal por precipitación salina con sulfato de amonio.
Materiales:
Suero humano normal
Solución saturada de sulfato de amonio: 760g de (NH4)2SO4 disueltos en 1
litro de H2O destilada
Solución Fisiológica: NaCl 0,15M
PROCEDIMIENTO:
1) Añadir lentamente gota a gota con agitación 1 volumen (4 ml) de una
solución saturada de sulfato de amonio a 1 volumen (4 ml) de suero
(concentración final: 50%). Dejar agitando 15 minutos a temperatura
ambiente. Para concentración final: 33%, mezclar 1/2 volumen de la
sol.de sulfato de amonio (2 ml ) con un volumen de suero (4 ml).
2) Centrifugar a 4000 rpm durante 15´ a temperatura ambiente o en frío.
3) Guardar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en el mismo
volumen original con solución fisiológica.
4) Repetir los pasos 1 y 2.
Resuspender el precipitado en H2O destilada: 0,2 y 0,6 ml para 33 y 50 %
respectivamente.
B) METODOS ESPECIFÍCOS
Para purificar anticuerpos específicos hacia un determinado antígeno a partir
de un inmunosuero es necesario utilizar métodos específicos como una
cromatografía de afinidad. En este método el antígeno puro es unido
irreversiblemente a un soporte sólido, permitiéndose luego el contacto del
inmunosuero con dicho soporte. Los anticuerpos inespecíficos y las demás
proteínas séricas son removidas por lavado, quedando retenidos únicamente
los anticuerpos que interactúan con el antígeno pegado al soporte (Ac
específicos). Dichos anticuerpos son luego eluídos mediante agentes
caotrópicos o por medio de antígeno libre. Esta técnica permite aislar
anticuerpos específicos de una mezcla de anticuerpos con distintas
especificidades.
Algunas subclases de IgG tienen afinidad por proteína A, esta propiedad es
muy utilizada para purificar IgG con un alto grado de pureza. Para ello se
utilizan resinas de proteína A-Sepharosa.
1) PURIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS POR CROMATOGRAFIA
DE AFINIDAD.
En el trabajo práctico se purificará IgG de suero humano normal utilizando
una columna de proteína A-Sepharosa.
MATERIALES:
2 ml suero humano normal diluído 1/5 en TBS.
Columna Hi-trap acoplada con proteína A
Buffer Tris-Glicina 0,1 M pH: 2,5
TBS: Buffer Tris-HCl 20 mM, ClNa 0,15 M
Trizma Base 1M
Solución fisiológica
PROCEDIMIENTO:
1) Equilibrar la columna con 10 volúmenes de TBS.
2) Sembrar lentamente en la columna el suero diluído al medio con TBS.
3) Lavar la columna con 10 ml de solución fisiológica.
4) Eluir con 5 ml de buffer Tris-Glicina pH: 2,5 tomando fracciones de 1
ml y neutralizando rápidamente las mismas con 50 µl de buffer
Trizma-Base 1M.
Para analizar la pureza de las preparaciones realizadas en este trabajo
práctico las muestras serán corridas en un gel desnaturalizante de
poliacrilamida 10% (SDS-PAGE).
Preparar la siguientes mezclas:
Gel separador (10%):
Acri/Bis (29:1)
3,35 ml
Tris-HCl 1M pH 8.8
3,75 ml
SDS 10%
100 µl
H2O bidestilada
2,90 ml
TEMED
10 µl
Persultato de amonio (APS) 10%
50 µl
Stacking gel:
Acri/Bis (29:1)
840 µl
Tris-HCl 1M pH 6.8
560 µl
SDS 10%
H2O bidestilada
50 µl
3,5 ml
TEMED
10 µl
Persultato de amonio (APS) 10%
40 µl
PREPARAR TODO CON GUANTES!!
Colocar la mezcla del gel separador entre dos vidrios. Dejar espacio
suficiente para luego agregar el stacking gel. Inmediatamente agregar H2O
bidestilada para que la superficie de polimerización sea pareja y no esté en
contacto con el O2 atmosférico que inhibe el proceso de polimerización.
Esperar que polimerice. Volcar por inversión el líquido de la fase superior.
Lavar con H2O destilada y secar con papel de filtro. Agregar la mezcla
correspondiente al stacking gel y colocar el peine. Esperar que polimerice y
retirar el peine.
Preparación de las muestras para correr en SDS-PAGE:
Tomar alícuotas adecuadas de las muestras obtenidas en cada paso de
purificación (las cantidades serán discutidas con los docentes) y agregar 4 µl
de buffer de siembra 5X para llegar a una concentración 1X en un volumen
final de 20 µl (completar el volumen con H2O destilada si es necesario).
Hervir todas las muestras así preparadas durante 2 min.
Como control s incluirá una muestra de suero normal humano (4 µl de una
solución 1/20).y también una marcador de peso molecular.
Sembrar el gel de poliacrilamida y correr a 140 Volts hasta que el frente
coloreado llegue hasta el borde inferior del mismo.
El gel será teñido con 15 ml de solución colorante durante 30 min con
agitación y luego desteñido por sucesivos lavados con solución decolorante.
− Solución colorante: Coomasie blue:
1,25 g coomasie brilliant blue R-250
45 ml ácido acético
225 ml metanol
230 ml H2O
- Solución decolorante:
150 ml metanol
50 ml ácido acético
300 ml H2O
Trabajo práctico Nº 6: Interacción antígeno anticuerpo.
INTRODUCCIÓN
La interacción de un anticuerpo (Ac) con un antígeno (Ag) forma la
base de todas las técnicas inmunoquímicas. Entre las técnicas más utilizadas
tanto en diagnóstico como en investigación se encuentran: la inmunodifusión
y la inmunoelectroforesis. Cuando un antígeno soluble se enfrenta con su
anticuerpo específico, en una relación adecuada, se produce un precipitado.
Esta reacción se denomina precipitación específica y es la reacción básica
sobre la cual se ha desarrollado la inmunoquímica. La gran especificidad de
dicha precipitación le da un importante valor como técnica para la
identificación y caracterización de diferentes proteínas y polisacáridos.
Cuando la reacción de precipitación se realiza a anticuerpo constante y
antígeno variable, la cantidad de precipitado aumenta con el agregado de
antígeno hasta un punto en donde el aumento de la cantidad de antígeno
produce una disminución del precipitado. Al graficar la cantidad de
precipitado en función de la cantidad de antígeno, se pueden distinguir 3
zonas:
a- La zona de exceso de Anticuerpo, donde no se logra formar gran cantidad
de precipitado por la alta concentración de Anticuerpo.
b- La zona de equivalencia, es la zona de máximo precipitado y donde no se
observa la presencia de Antígeno o Anticuerpo en solución.
c- La zona de exceso de Antígeno, donde no se logra formar gran cantidad
de precipitado por la alta concentración de Antígeno.
I) INMUNODIFUSION
La inmunodifusión es usada para el análisis cuali y cuantitativo de los
antígenos y anticuerpos presentes en una solución, en clínica se utiliza para
analizar el suero y otros fluídos corporales. La técnica consiste en una
inmunoprecipitación en gel, es decir, se coloca una solución de Ag y Ac en
distintas secciones de un gel y se deja difundir libremente; en la región donde
los gradientes de difusión se encuentran en proporciones de equivalencia se
forma un precipitado que se evidencia como una banda opaca en el gel.
A pesar de que la formación del complejo Ac-Ag en un medio
semisólido como el agar, depende de los electrolitos presentes en el buffer,
del pH y la temperatura a la cual se realiza el experimento, el principal
determinante de la reacción es la concentración relativa del antígeno y el
anticuerpo. Debido a que diferentes pares de Ag y Ac alcanzan la
equivalencia en distintas posiciones dentro del gel, una preparación que
contiene múltiples antígenos frente a un antisuero multiespecífico dará
numerosas bandas de precipitación. De esta manera, mediante esta técnica
se puede analizar la complejidad de distintas mezclas antigénicas y/o la
especificidad de distintos antisueros.
Las reacciones de inmunodifusión pueden ser clasificadas como
simples o dobles. En la inmunodifusión simple se mantiene fijo el Ag o el Ac
permitiendo el movimiento del otro reactante para formar complejo con éste.
En la inmunodifusión doble ambos reactantes están libres para difundir hacia
el otro y formar un precipitado, dicho movimiento puede ser radial o lineal.
Inmunodifusión doble radial: Técnica de Ouchterlony en placa.
Este método fue desarrollado por Ouchterlony y consiste en poner
soluciones de antígeno y anticuerpo en reservorios separados cavados en
una placa de agar. Este método se encuentra en uso hoy en día y tiene
muchas aplicaciones en la detección y análisis de sistemas de precipitación
Ag-Ac.
En el trabajo práctico se analizarán los resultados obtenidos por la técnica de
Ouchterlony al enfrentar suero de conejo anti-IgG humana o suero de conejo
anti suero total humano con suero humano o inmunoglobulinas humanas
purificadas por distintos métodos.
Materiales:
• Agarosa
• Inmunosueros: suero de conejo anti IgG-humana, suero de conejo anti
suero-humano.
• Antígenos: suero humano total, purificaciones de Inmunoglobulinas
humanas.
• Buffer Tris-glicina pH 8.5
• Solución colorante: 1.25 gr Coomasie blue, 45 ml ácido acético, 225 ml
metanol, 230 ml agua.
• Solución decolorante: 150 ml metanol, 50 ml ácido acético, 300 ml agua.
Procedimiento:
a) Preparar una solución 1.5 % de agarosa en Buffer Tris-glicina.
b) Fundir la solución calentando en microondas durante 1 minuto
aproximadamente.
c) Verter la agarosa fundida en una placa de manera de formar una capa
delgada.
d) Dejar solidificar y con una pipeta Pasteur hacer los reservorios para el Ag
y el Ac según el diagrama que indique el docente.
e) Sembrar el antígeno y el antisuero en los reservorios formados en la placa
según el esquema que indiquen los docentes.
f) Colocar las placas en cámara húmeda y dejar difundir a temperatura.
ambiente durante toda la noche.
g) Observar a las 24 horas para ver las bandas de precipitación.
Para mejor visualización de las bandas, el agar puede teñirse de la siguiente
manera:
1) Al término del período de difusión sumergir la placa de en solución
fisiológica durante 72 horas, renovando la solución cada 24 horas.
2) Lavar la placa durante 48 horas con agua destilada, realizando cambios
cada 24 horas.
3) Luego de estos lavados retirar la placa de la solución y colocar sobre ésta
un papel de filtro embebido en agua destilada.
4) Colocar la placa así cubierta en estufa a 37ºC hasta sequedad.
5) Una vez que el agar este seco retirar el papel de filtro y verter sobre el
agar el colorante (coomasie blue).
6) Incubar 15 minutos a temperatura. ambiente.
7) Retirar el colorante y realizar lavados de 10 minutos cada uno con la
solución decolorante.
II) ANALISIS INMUNOELECTROFORETICO (AIE)
La inmunoelectroforesis combina tres técnicas independientes:
separación electroforética, difusión y precipitación de proteínas. Esta
combinación de técnicas en una le confiere a la inmunoelectroforesis un
gran poder resolutivo, permitiendo realizar una cuantificación aproximada e
identificación de proteínas individuales presentes en mezclas complejas
como suero, orina u otros fluidos biológicos.
En esta técnica se llevan a cabo consecutivamente en la misma placa
de agar o agarosa, una electroforesis y una inmunodifusión doble. En el
primer caso las proteínas son separadas principalmente por su carga neta
superficial en un soporte inerte que no impide ni promueve el movimiento de
las moléculas en el campo eléctrico. En este paso la muestra a analizar se
coloca en un reservorio realizado en la placa y se somete a un campo
eléctrico de, aproximadamente, 3.3 V/cm durante 30-60 minutos. En el
segundo paso se deposita, en un canal paralelo a la dirección de migración
electroforética, un inmunosuero específico para los constituyentes de la
mezcla y se dejan difundir ambos, antígeno y antisuero hasta visualizar las
bandas de precipitación (aprox. 18-24 horas). El resultado de la precipitación
puede ser fotografiado o bien el gel puede ser lavado, secado y teñido como
se explicó en la parte II de esta guía.
La especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipitación
permiten distinguir sustancias de movilidades electroforéticas idénticas dado
que cada antígeno reacciona separadamente con su anticuerpo homólogo
dando un arco independiente.
Numerosas deficiencias inmunológicas pueden ser analizadas con
esta técnica. Puede determinarse, por ejemplo, si los niveles de
inmunoglobulinas en suero están aumentados o disminuidos respecto de los
valores normales o si se detectan altos niveles de fragmentos de cadena
pesada de inmunoglobulinas (lo cual está relacionado con enfermedades de
cadena pesada). También es una técnica de gran utilidad para detectar
cantidades aumentadas de proteínas en el fluido cerebroespinal en pacientes
con enfermedades neurológicas.
Ventajas del AIE:
• Se puede utilizar cuando la mezcla a analizar es muy pequeña,
permitiendo el estudio de sustancias naturales como fluidos corporales y
extractos celulares.
• Tiene alta sensibilidad ya que permite detectar impurezas presentes en
concentraciones menores al 0.1%, pudiendo resolver los componentes de
mezclas muy complejas.
• El soporte utilizado (agarosa) ofrece poca posibilidad de efectos de
interfase sólido-líquido, como ocurre con otros soportes (papel, almidón,
etc).
Limitaciones del AIE:
• Los productos a analizar deben ser solubles en medio acuoso y poseer
propiedades antigénicas.
• El inmunosuero es un producto biológico difícil de estandarizar. Por lo
cual, a veces es necesario cambiar de especie para poder revelar el
máximo de componentes biológicos de una mezcla.
• El método es fundamentalmente cualitativo y solamente permite una
apreciación semicuantitativa.
En el trabajo práctico se analizará un suero humano y las distintas
purificaciones de inmunoglobulinas humanas con un suero anti-suero
humano.
Materiales:
• Cuba electroforética
• Fuente de poder
• Buffer Tris-glicina, pH: 8,5
• Portaobjetos
• Agarosa 3% en agua destilada
• Colorante indicador de frente: bromofenol
• Solución colorante y decolorate
• Muestra antigénica e inmunosuero
PROTOCOLO:
1) Colocar unas gotas de agarosa 3% fundida sobre un portaobjetos en el
que se han colocado trozos de papel de filtro a modo de prolongación
del portaobjetos.
2) Colocar dicho portaobjetos en una superficie perfectamente horizontal
y verter con pipeta 3-4 ml de agarosa fundido diluído al medio con
Buffer Tris-glicina y dejar solidificar.
3) Realizar en la parte media del gel una doble incisión perfectamente
centrada de 2 mm de ancho y 65 mm de largo. Luego realizar en forma
equidistante a ésta dos orificios de 1,8 mm de diámetro
aproximadamente. (ver el esquema diseñado por los docentes).
4) Colocar 5µl de la muestra en uno de los orificios y en el otro 5 µl del
muestra diluída con colorante indicador.
5) Colorar el portaobjetos así preparado en una cuba electroforética y
cargar los compartimientos electródicos con cantidad apropiada de
Buffer Tris-glicina.
6) Conectar la cuba a la fuente de poder. Aumentar gradualmente la
intensidad de la corriente hasta obtener 8 mA por portaobjetos.
7) Detener la corrida cuando el colorante (bromofenol) se haya
desplazado aproximadamente 3-4 cm.
8) Retirar con una aguja el agar limitado por la doble incisión longitudinal
y colocar en el surco 70-100 µl del antisuero correspondiente.
9) Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda y observar las bandas
de precipitación a las 24 y 48 horas. Teñir el agar como se explicó en
la guía.
Trabajo práctico Nº 7: Determinación de Grupo Sanguíneo
INTRODUCCIÓN
El sistema AB0 es el primer sistema de aloantígenos identificado en
mamíferos por Landsteiner en el año 1900 y consiste en una familia de
antígenos de superficie presente en los glóbulos rojos humanos. Todos los
individuos normales sintetizan un glicano inicial, llamado antígeno 0, el cual
se encuentra unido a un esfingolípido. Un único locus codifica tres alelos para
una glicosiltransferasa. El producto del alelo 0 carece de actividad
enzimática, mientras que el producto del alelo A transfiere un residuo terminal
de N-acetilgalactosamina y el producto del alelo B transfiere un residuo
terminal de galactosa. Los individuos que son homocigotas 0 no pueden
adicionar azúcares terminales al antígeno 0 y expresan solamente el
antígeno 0. En cambio, los individuos que poseen un alelo A (AA, A0 o AB)
forman el antígeno A. De la misma manera, los individuos que poseen un
alelo B (BB, B0 o AB) forman el antígeno B. Los individuos heterocigotas AB
poseen tanto antígeno A como B.
Alelos
Grupo sanguíneo
00
0
AA y A0
A
BB y B0
B
AB
AB
Todos los individuos son tolerantes al antígeno 0 debido a que todos lo
expresan. Aquellos que tienen grupo A o B también son tolerantes a los
antígenos A ó B, respectivamente. Sin embargo, los individuos con grupo 0 y
A poseen anticuerpos IgM anti-B, y los individuos con grupo 0 y B poseen
anticuerpos IgM anti-A. Estos anticuerpos anti-A y anti-B son naturales y
están presentes en individuos normales que no han recibido transfusiones de
sangre previas. Se cree que estos anticuerpos se originarían en respuesta a
antígenos microbianos cross-reactivos. Si un paciente recibe una transfusión
de GR de un donante que expresa un antígeno distinto al propio, puede
provocar hemólisis intravascular grave. Es por esto que el sistema de grupo
sanguíneo ABO sigue siendo el más significativo en medicina transfusional y
constituye la base de los estudios pretransfusionales entre receptores y
donantes.
Las células del endotelio vascular también expresan los antígenos AB0. De
esta manera, durante los primeros transplantes la presencia de anticuerpos
anti-AB0 eran causa de rechazo hiperagudo. Hoy en día, esto no representa
un problema en la clínica debido a que todos los donantes y receptores son
seleccionados para que tengan el mismo tipo AB0.
Rh positivo y Rh negativo
Las denominaciones descriptivas “Rh positivo” y “Rh negativo” se refieren a
la presencia o ausencia de antígenos D en la superficie de los glóbulos rojos.
El primer ejemplo de anticuerpos humanos contra los antígenos D fue
identificado por Levine y Stetson en 1939, en el suero de la madre de un niño
con enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN). En medicina
transfusional, los D son los antígenos eritrocitarios más importantes después
de los A y B. No obstante, las personas que carecen de antígenos D no
siempre producen los anticuerpos correspondientes. La formación de anti-D
suele resultar de la exposición a glóbulos rojos con antígenos D durante una
transfusión o gestación. Los D son más inmunogénicos que casi todos los
demás antígenos eritrocitarios; más del 80% de las personas D negativas que
reciben una transfusión D positiva, desarrolla anti-D. Para evitarlo, se evalúan
los antígenos D en la sangre de todos los receptores y donantes.
Test de Coombs
La enfermedad hemolítica del recién nacido o eritroblastosis fetal ocurre
cuando la madre genera anticuerpos IgG contra el antígeno Rh presente en
los GR del feto. Las madres Rh(-) generan estos Ac cuando estan expuestas
a los GR del feto Rh(+), heredado por el gen Rh paterno. Estas IgG anti-Rh
atraviesan placenta y cubren los GR fetales, los cuales son destruídos por
fagocitosis en el hígado, causando una anemia hemolítica en el feto y en el
recién nacido.
Test de Coombs Directo: se hacen reaccionar GR fetales, previamente
lavados, con anti-Igs humanas. Se observa aglutinación cuando existen
anticuerpos maternos unidos a los GR fetales.
Test de Coombs Indirecto: detecta anticuerpos anti-Rh en el suero materno.
Primero se incuba el suero con GR Rh(+), se lava para remover los
anticuerpos que no se unieron y luego se aglutinan con anti-Igs humanas.
Este test sirve para evaluar la incompatibilidad por Rh y eventualmente
detectar y/o prevenir la enfermedad hemolítica del recién nacido.
OBJETIVOS
- Determinar el grupo sanguíneo y factor Rh en muestras de sangre
entera y analizar los principios de la interacción antígenoanticuerpo.
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO:
Los GR se ponen en contacto con el reactivo Anti-A, Anti-B y Anti-D. Si
existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes, se
producirá una aglutinación visible macroscópicamente.
MATERIALES
- Anti-A, Anti-B y Anti-D (Wiener Lab): reactivos preparados a partir de
anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares dehibridomas de
ratón
- Sangre entera fresca
- Anticoagulante (EDTA, Heparina o citrato)
- Portaobjetos de vidrio
- Pipetas pasteur o capilares cerrados
- Agujas descartables
- Algodón
- Etanol 96°
- Guantes descartables de látex
PROCEDIMIENTO (Usar guantes descartables durante todo momento)
1) Colocar una gota del reactivo (Anti-A, B o D) sobre un
portaobjetos limpio.
2) Agregar una gota de sangre a probar.
3) Mezclar el reactivo y la sangre con un capilar cerrado limpio en un
área de 2cm de diámetro y balancear constantemente durante 2
minutos. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de
aglutinación.
Interpretación de resultados
Cuando se utiliza el Anti-D la observación de aglutinación indica una
reacción positiva.
TRABAJO PRÁCTICO N° 8: RADIOINMUNOENSAYO (Teórico)
INTRODUCCIÓN:
La base del radioinmunoensayo (RIA) consiste en la inhibición
competitiva de la unión de un antígeno radioactivo (trazador) a su anticuerpo
específico por parte del antígeno no marcado.
El sistema puede esquematizarse como una interacción reversible
combinada:
Ac
Ag
+ A
Ac-Ag
Ac-Ag
Donde Ac: anticuerpo específico
Ag :antígeno marcado (trazador) libre
Ag: antígeno libre no marcado
Ac- Ag : complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado
Ac-Ag: complejo soluble con el antígeno no marcado
Este sistema permite la detección de sustancias presentes en mezclas
complejas, como los sistemas biológicos, aún estando en concentraciones
muy bajas.
Se basa en dos principios fundamentales:
1) la facilidad de detectar un compuesto radioactivo
2) La especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo.
Requerimientos Fundamentales:
Del compuesto a valorar:
a) La sustancia debe ser antigénica e inducir la formación de anticuerpos.
b) Se debe disponer de la sustancia químicamente pura y en una
concentración conocida para ser utilizada como estándar.
c) El estándar y el compuesto a valorar deben comportarse igual frente al
anticuerpo.
Del compuesto marcado:
Se debe disponer del compuesto marcado y con alta actividad específica.
Del anticuerpo:
a) Debe tener alto título.
b) Debe poseer especificidad y afinidad adecuada.
De la reacción:
a) Debe seguir una cinética de segundo orden (excluye efectos alostéricos
y/o cooperativos).
b) Debe alcanzarse el equilibrio de la reacción.
Gráficos y Cálculos:
La ecuación:
B/F= Kq-KB
(Ecuación de Scatchard)
Donde:
B: antígeno pegado (bound).
F: libre ( free).
La ecuación indica que existe una relación lineal entre la relación B/F y la
concentración del antígeno unido B.
Si se grafica B/F en función de B, la recta obtenida tiene una pendiente -K e
intercepta las absisas en un valor de B igual a la concentración de sitios
totales de anticuerpo.
Se puede hallar una expresión de B en función de la concentración del
antígeno total:
B+F=Atotal
Despejando F y dividiendo por B se obtiene:
F/B=( Atotal -B)/ B
Finalmente se llega a :
B= Atotal / (F/B+1)
Y de forma análoga se deduce para F.
Trabajo práctico N° 9: Elisa indirecto.
INTRODUCCION:
Los enzimoinmunoanálisis se basan en dos fenómenos básicos:
1. La elevada especificidad de los anticuerpos (Ac).
2. La alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayos, lo
que permite la amplificacion de la señal generada por la muestra.
Independientemente de los esquemas experimentales empleados, el ensayo
se basa en las siguientes etapas:
a) Adsorción del antigeno (Ag) a la placa. En el caso de tratarse de un ELISA
de captura, lo que se pega es un anticuerpo.
b) Reacción de un inmunorreactante con un antígeno o un anticuerpo.
c) Detección de ese inmunorreactante mediante la utilización de un
conjugado enzimático.
d) Reacción de la enzima conjugada con el sustrato incoloro para
transformarlo en un producto coloreado.
Inmovilización de inmunorreactantes a la fase sólida:
Las superficies utilizadas para inmovilizar antígenos deben reunir ciertas
características como la: alta capacidad de unión, deben ser capaces de
inmovilizar diversos inmunorreactantes, debe producirse una desorción
mínima y la desnaturalización de la moléculas adsorbidas debe ser mínima.
Las placas de ELISA son de poliestireno o polivinilo (PVC) y las uniones
entre el soporte y inmunorreactante son de tipo hidrofóbicas.
La cantidad de inmunorreactante que se puede adsorber a la fase sólida se
denomina "capacidad de saturación". En general se pega en el orden de 1 a
10 µg/ml de una solución de Ag o Ac.
La temperatura, el pH, el tiempo y la concentración son factores importantes
en el proceso de la adsorción. En general se el proceso de unión se lleva a
cabo a 4°C toda la noche o 1-2 horas a 37°C.
Se utilizan como diluyente para los inmunorreactantes: PBS o carbonato de
sodio pH=9 entre otros.
Cálculo del título de un suero:
Los resultados de los ELISA pueden expresarse de dos formas:
Se puede informar la concentración de un Ag por comparación e interpolación
de una zona de calibración hecha con una solución de concentración
conocida de Ag. Por otro lado se puede expresar en unidades arbitrarias,
utilizando métodos como: titulación a punto final, medida de absorbancia de
un suero a dilución simple o unidades arbitrarias por comparación con un
suero patrón.
Titulación a punto final:
El método de titulación a punto final consiste en analizar el suero problema
en diluciones seriadas. Luego se grafica la absorbancia en función del
logaritmo de la inversa de la dilución del suero y se obtiene una curva
sigmoidea. Luego se calcula el título en función a la línea de corte.
Medida de la absorbancia a dilución simple:
Se toma como título la absorbancia del suero a una dilución fija.
La desventaja de este método es que no sirve para discriminar entre sueros
de bajo título.
Titulo por comparación con un suero patrón:
Consiste en titular el suero problema y un suero patrón, al que
arbitrariamente se le asigna una determinada cantidad de unidades por ml.
Cálculo de la línea o valor de corte:
Se denomina valor de corte (o “cutt- off”) al valor de discriminación entre una
muestra positiva y una negativa. Este valor es independiente del método
usado para calcular el título del suero.
Este valor debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sea positivos o
negativos.
Si se analiza un gran número de muestras, se puede establecer el valor de
corte como la reactividad media de los sueros negativos + dos o tres desvíos
estándar (DS).
Se formarán cuatro grupos, cada uno de las cuales realizará un trabajo
diferente. Se titularán los sueros obtenidos durante el protocolo realizado
durante la cursada.
Protocolo básico:
1) Se cubren los pocillos de la placa con 100µl de la solución de Ag a pegar.
Se incuban las placas de 1 a 3 horas a 37°C.
2) Se descarta la solución del paso anterior; Se bloquean los pocillos con
300µl de TBS-leche 3% durante 30min a temperatura ambiente.
3) Se lava 3 veces con abundante TBS.
4) Se preparan las diluciones del suero a titular en solución de bloqueo.
5) Se siembran 100µl de dilución en cada pocillo (por duplicado) y se incuba
1 hora a temp amb.
6) Se lava 3 veces con abundante TBS.
7) Se prepara la dilución del segundo anticuerpo acoplado (en este caso a
Peroxidasa). Se siembran 100µl y se incuba 1 hora a temp amb.
8) Se lava tres veces con abundante TBS.
9) Se agrega, luego del último lavado, 100µl del reactivo colorimétrico a cada
pocillo (TMB) y se deja reaccionar entre 15-30 min.
10) Se detiene la reacción con 100µl de H2SO4 0.2M
11) Se leen las placas de ELISA a 450 nm.
Controles:
Un pocillo sin Ag pegado a la placa, uno sin el suero a titular y uno con un Ag
no relacionado.