BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA

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BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICAS
AREA: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
“EFECTOS DE LA FRACCIÓN Hc DE LA TOXINA TETANICA SOBRE LAS
CONDUCTAS MOTORAS Y NFκB EN RATA LESIONADA CON 6-OHDA”
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO EN
MAESTRIA EN CIENCIAS QUÍMICAS
AREA: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
PRESENTA:
Q. F. LILIANA MARTINEZ MENDIETA
DIRECTORES DE TESIS:
cDr. ILHUICAMINA DANIEL LIMÓN PÉREZ DE LEON
FCQ-BUAP
Dr. ARTURO ORTEGA SOTO
Depto. Genética y Biología Molecular
Centro de investigación y Estudios Avanzados Campus Zacatenco
Octubre, 2006
INDICE
I. INTRODUCCION
Pág.
4
1.1 Enfermedad de Parkinson……………………………………………….
4
1.2 Neurodegeneración en la Enfermedad de Parkinson y el estrés
6
oxidativo………………………………………………………………………
1.3 La apoptosis en la degeneración de las neuronas dopaminérgicas……
7
1.4 El uso de la 6-hidroxidopamina en el estudio de la EP……………..
7
1.5 Estrés oxidativo causado por 6-OHDA ….……………………….....
8
1.6 Apoptosis inducida por 6-OHDA………………………………………
9
1.7 El factor nuclear k B (NFκB)……………………………………………
10
1.8 El uso de la L-Dopa en el tratamiento de la EP………………………
12
1.9 La toxina tetánica como una estrategia terapéutica en la EP…………. 13
1.10 El fragmento C-terminal de toxina tetánica.....................................
14
1.11 Actividad del fragmento Hc-TeTx sobre SNC………………………..
16
II. JUSTIFICACION……………………………………………………………..
21
III. HIPÓTESIS…………………………………………………………………….
22
IV. OBJETIVO GENERAL………………………………………………………
22
V. OBJETIVOS PARTICULARES……………………………………………..
22
VI. METODOLOGIA……………………………………………………………
23
VII. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN …………………………………..
24
VIII. METODOS………………………………………………………………….
24
IX. PROCEDIMIENTO……………………………………………………………
25
X. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS…………………….
27
XI. RESULTADOS………………………………………………………………
29
12.1 Administración Local …………………………………………………
29
12.2 Asimetría motora……………………………………………………….
29
12.3 Actividad motora en campo cerrado………………………………….. 33
12.4 Determinación de NFkB……………………………………………….
35
2
XIII. DISCUSIÓN…………………………………………………………………
38
XIV. CONCLUSIONES…………………………………………………………..
41
XV. TECNICAS PARA LA DETERMINACION DE NFκB…………………
42
15.1 Protocolo para la extracción de extractos nucleares………………..
42
15.2 Protocolo para la cuantificación de proteínas por el método de
44
Bradford………………………………………………………………………
15.3 Inmunodetección en fase sólida, western blot………………………...
XVI. APENDICE I………………………………………………………………..
45
47
16.1 Sustancias……………………………………………………………….
47
16.2 Reactivos………………………………………………………………..
47
16.3 Fármacos………………………………………………………………..
48
16.4 Material…………………………………………………………………. 48
XVII. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………
50
3
I. INTRODUCCION
1.1 Enfermedad de Parkinson
En 1817, James Parkinson describió por primera vez la Enfermedad de Parkinson (EP)
con el nombre de Parálisis agitante (Parkinson 1817). Fue hasta 1960 que Oleh
Hornykiewicz, encontró una pérdida severa de dopamina (DA) en núcleo caudado y
putamen en los cerebros de pacientes con EP (Ehringer and Hornykiewicz, 1960).
Actualmente, se considera que es una enfermedad neurodegenerativa asociada a lesiones
neuropatológicas específicas, siendo la principal de éstas la pérdida de neuronas DAérgicas
en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) y del estriado (Jellinger 1987). En esta patología
aparecen inclusiones intracelulares llamadas cuerpos de Lewy (Gibb y Lees 1989).
Los síntomas característicos de la EP son: el temblor, la rigidez muscular, la dificultad
para iniciar la marcha, la pérdida de los reflejos posturales y la bradicinesia, entre otros
(Fig 1).
a
b
c
Figura 1. Paciente con enfermedad de Parkinson. a) Parkinsonismo severo con alteraciones en la marcha
y discapacidad postural, en estado no ambulatorio. b) Característica de mascara facial (sin expresión) con
disminución parpadeo. c) Apraxia del parpado (Tomado de Gálvez-Jiménez, 2005).
El diagnóstico se confirma cuando se realiza un análisis histopatológico post-mortem. De
acuerdo a los síntomas presentados en los enfermos con EP, se han definido cinco estadios
evolutivos, Tabla 1 (Hoehn y Yahr, 1967).
4
Tabla 1. Clasificación de los cinco estadios evolutivos de la EP
ESTADIO
SINTOMAS
Estadio I
Síntomas unilaterales
Estadio II
Síntomas bilaterales, generalmente asimétricos, sin alteraciones del equilibrio
postural
Alteraciones del equilibrio postural, aunque el paciente sigue siendo independiente.
Estadio III
Estadio IV
Estadio V
El paciente requiere ayuda para las tareas diarias, aunque aun puede mantenerse en
pie con ayuda de otros.
El paciente es totalmente dependiente y se puede encontrar en silla de ruedas o en
cama.
La ocurrencia de esta enfermedad incrementa con la edad y se considera que afecta a
más del 2 % de la población mayor de 65 años. Algunos reportes indican que la media es de
60 años, con una duración promedio de 13 años (Hughes et al., 1992, Lang y Lozano 1998).
Aunque menos frecuente, se ha encontrado que puede aparecer a los 40 años (Golbe, 1991).
La etiología de la EP es principalmente de tipo idiopática, sin embargo se ha asociado
a factores ambientales y genéticos que podrían contribuir al desarrollo de la enfermedad. El
descubrimiento en decada de los 80’s de la toxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
(MPTP) un compuesto que produce una muerte selectiva de neuronas de la
SNpc en
humanos originaba los síntomas de la EP y también en modelos experimentales. Esto apoyó
la hipótesis ambiental (Gerlach and Riederer, 1996) además, se ha encontrado en cerebros de
pacientes
parkinsonianos
postmortem,
altas
concentraciones
de
compuestos
como
organoclorinas, dieldrin y difenil policlorinatos contenidos en pesticidas que apoyan la
misma hipótesis (Song et al., 2000). Otra hipótesis del origen de la enfermedad es la
presencia del estrés oxidativo que lleva al incremento de la producción de radicales libres
(RL) provenientes de diversas vías metabólicas y al exceder la producción de estos
contribuyen al proceso neurodegenerativo (Olanow y Cohen, 1992; Zhang et al., 2000).
También se ha propuesto que el origen menos frecuente es el genético, sólo
aproximadamente el 10% de los casos se presentan por esta causa (Calne, 1999); algunos
estudios post-mortem
dado evidencias de que mutaciones en proteínas α-sinucleina, un
5
componente de los cuerpos de Lewy y la mutación del gen parkina ubicado en el 6q25.2-q27
pueden generar esta enfermedad.
1.2 Neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson y el estrés oxidativo
Existe un gran interés por comprender el proceso neurodegenerativo de la EP, por lo
que hasta el momento se le ha abribuído al estrés oxidativo, debido a que las neuronas de la
SNpc por su contenido de neuromelanina son altamente vulnerables a las especies reactivas
de oxígeno (ROS) (Hirsch et al., 1988; Hirsch et al., 1997; Uhl, 1998). También el
metabolismo enzimático de la DA induce la formación de peróxido de hidrógeno por la
actividad de la monoamino oxidasa (MAO) y la auto-oxidación que potencía la formación
de radicales hidroxilo (Fahn y Cohen, 1992). También se ha encontrado que las neuronas se
hacen más vulnerables debido a la disminución en la síntesis de glutatión peroxidasa (Damier
et al., 1993).
Los dos principales fenómenos bioquímicos que permiten el incremento de
ROS y que participan en el proceso neurodegenerativo en la SNpc son: el incremento en los
niveles de hierro y la disminución en los mecanismos de defensa antioxidantes, como la
catalasa, glutatión reducido entre otras (Tabla 2).
Tabla 2. El estrés oxidativo en la enfermedad de Parkinson
Factores de
La generación de H2O2 por la MAO
REFERENCIAS
vulnerabilidad al
estrés en SNpc de
cerebros normal
La auto-oxidación de DA induce la formación de
ROS
La formación de neuromelanina
Incremento de los niveles de hierro
Factores de
Disminución de los niveles de glutatión GSH
Disminución de los niveles de GSH-peroxidasa
(Blum et al., 2001a)
(Dexter et al., 1989;
Hirsch et al., 1991;
Good et al., 1992)
(Sofic et al., 1992)
(Damier et al., 1993)
vulnerabilidad al
Disminución de los niveles de catalasa
(Ambani et al., 1975)
estrés en SNpc de
Incremento de los ácidos grasos poli-insaturados
e Incremento del ácido tiobarbitúrico
Incremento de ROS en las células gliales de la
SNpc
Incremento de la expresión de la síntasa
inducible del NO (iNOS), Incremento de los
niveles de óxido nítrico y la generación de
peroxinitrito.
(Fahn
1992)
pacientes
parkinsonianos
y
Cohen,
(McGeer et al., 1988)
(Hunot et al., 1996).
6
El daño en las mitocondrias contribuye a la pérdida de neuronas de la SNpc, una de
las principales alteraciones mitocondriales es la del complejo I mitocondrial (nicotinamida
adenina dinucleótido coenzima Q reductasa)
de la cadena respiratoria mitocondrial
produciendo la muerte celular. En pacientes con EP hay una disminución en la actividad e
inmunoreactividad a la forma reducida del complejo I en SNpc (Mizuno et al., 1989; Hattori
et al., 1991, Beal et al., 1996).
1.3 Apoptosis en las neuronas dopaminérgicas
En la EP el efecto del estrés oxidativo, así como el decremento en los antioxidantes y
las alteraciones mitocondriales dan como resultado la inducción de la apoptosis de las células
afectadas. Recientemente, se ha propuesto que una disminución en el potencial de membrana
mitocondrial podría llevar a la muerte celular por apoptosis (Jacotot et al., 1999). Estudios
realizados por Mochizuki et al., 1996 dieron evidencias de la fragmentación del DNA,
característica de la apoptosis en la sustancia nigra de pacientes con EP. Los estudios sobre
apoptosis han mostrado que alrededor del 6% de las neuronas ricas en mielina muestran los
signos característicos de apoptosis, como son condensación de cromatina, disminución del
tamaño celular, enrollamiento de la envoltura nuclear y la presencia de cuerpos apoptóticos
(Tompkins et al., 1997; Kingsbury et al., 1998; Tatton et al., 1998).
1.4 El uso de la 6-hidroxidopamina en el estudio de la enfermedad de Parkinson
Entre los modelos para estudiar la fisiopatología de la EP está la administración de 6hidroxidopamina (6-OHDA). La selectividad de esta neurotoxina hacia las neuronas
catecolaminérgicas es atribuida a que la toxina puede ser capturada por el transportador
catecolaminérgico (DAT) presente en las terminales dopaminérgicas. Esta toxina incluso
puede formarse a partir de DA por una hidroxilación no enzimática en presencia de Fe2+ y
H2O2 (Wang et al., 2004). En la rata la 6-OHDA es inyectada en el núcleo estriado, la
substancia nigra o fibras ascendentes del cerebro medio produce denervación de las neuronas
nigrales DAnérgicas con lo que disminuye los niveles de DA en este núcleo. Estos cambios
reproducen las características fisiopatológicas similares a los daños en el sistema motor de la
EP. In vivo ha sido muy utilizada por dar el estado acinético y los efectos discinéticos por el
7
tratamiento farmacológico, y ha sido una herramienta valiosa para evaluar la fisiopatología
de la denervación DAnérgica y también en la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas
para esta enfermedad (Kostrzewa & Jocobowitz, 1974; Kumar et al., 1995). La
administración unilateral de 6-OHDA en la SNc de rata permite evaluar la asimetría motora
o conducta de giro (una conducta motora cuantificable) por la administración sistémica de un
agonista dopaminérgico, L-Dopa o fármacos que produzcan la liberación de DA (Hefti et al.,
1980). Esta prueba refleja la lesión doparminérgica en SNpc y estriado asociado con una
pérdida neuronal de aprox. 90% y e incluso es útil en la evaluación de diversos tratamientos
(Ungerstedt, 1968). En los últimos años han surgido otros modelos conductuales donde se
emplean ratas
y que permiten evaluar diversas conductas que reflejan los estados
discinéticos, como la evaluación del giro contralateral, el movimiento orolingual, el giro axial
y de los miembros superiores después de la administración de L-Dopa (Lunblad et al., 2002).
1.5 El estrés oxidativo causado por 6-hidroxidopamina
La inyección de 6-OHDA en las vías nigroestriatales produce una degeneración de estas
neuronas vía producción de peróxido de hidrógeno e hidroxiradicales (Heikkila y Cohen,
1971). Varios estudios han propuesto que induce estrés oxidativo in vivo (Lotharius et al.,
1999) como la generación ROS y la disiminución de estos por acción de la enzima
superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa, sin embargo cuando el estrés oxidativo
lleva hacia el daño celular, en esas circunstancias no es suficiente la actividad de las enzimas
antioxidantes e incluso la presencia de hierro contribuye a la generación de ROS. Cuando el
estrés oxidativo se incrementa se presentan diferentes alteraciones celulares como
peroxidación de los lípidos de membrana, alteraciones en el potencial de membrana
mitocondrial, así como alteraciones en funciones mitocondriales entre estas se altera la
cadena respiratoria mitocondrial, desorganización del citoesqueleto, daños en la recaptura de
glucosa y del ácido α-aminoisobutírico, también se pueden generar alteraciones en el DNA
como la fragmentación y mutaciones.
8
Tabla 3. La 6-OHDA incrementa el estrés oxidativo en el sistema catecolaminérgico
Estrés oxidativo por 6-OHDA
Disminución de la muerte celular cuando aumenta la actividad de la
(Asanuma
enzima SOD y glutatión peroxidasa.
Bensadoun et al., 1998)
Incrementa el peróxido de hidrógeno vía MAO
(Karoum et al., 1993)
Genera ROS: radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno por un
(Seitz et al., 2000; Soto-Otero
proceso no enzimático de auto-oxidación, radical superóxido
et al., 2000)
Genera quinonas
(Graham et al., 1978; Hastings
et
al.,
1998;
y Zigmond 1994)
Incrementa los niveles de hierro en ganglios basales
(Wang et al., 2004)
Causa peroxidación de lípidos, decremento de los niveles de
(Kumar et al., 1995)
fosfolípidos, aumento de malonildialdehido.
Alteraciones del potencial de membrana mitocondrial por ROS
(Lotharius et al., 1999)
Daña las funciones mitocondriales por diversos mecanismos, altera
(Glinka et al., 1996 y 1998)
la cadena respiratoria mitocondrial: principalmente inhibe el complejo
mitocondrial I
Por
incremento
Mutaciones,
de
ROS
Desorganización
genera:
Fragmentación
del
DNA,
del citoesqueleto, daños en la
(Gee et al., 1992;
Davison et al., 1986)
recaptura de glucosa y recaptura del ácido-α-aminoisobutírico.
1.6 Apoptosis inducida por 6-OHDA
En 1994 Walkinshaw y Waters propusieron que la 6-OHDA tiene efectos
proapoptóticos. En cultivo de células PC12 produce los signos apoptóticos: condensación de
cromatina, disminución del tamaño celular, enrollamiento de la envoltura nuclear y aumento
del volumen de la membrana. (Lotharius et al., 1999; Woodgate et al., 1999; Mayo et al.,
1998). La 6-OHDA es capaz de inducir apoptosis en neuronas DAminérgicas y necrosis
(Marti et al., 1997; Burke y Kholodilov, 1998). La administración de 6-OHDA produce un
incremento de la inmunoreactividad a p53 en la sustancia nigra de ratas (Qin et al., 1997).
Otros estudios in vitro han mostrado que la caspasa 3, un factor decisivo en la muerte
neuronal, que se activa con esta neurotoxina (Ochu et al., 1998).
La DA en condiciones patológicas, como isquemia o hipoxia puede incrementar sus
niveles intra- y extra-celulares para producir muerte neuronal. La auto-oxidación permite la
9
formación de 6-OHDA y neuromelanina (Slivka and Cohen, 1985; Jellinger et al., 1995).
Experimentos in vitro han mostrado que la DA puede ser neurotóxica (Graham et al., 1978;
Michel y Hefti, 1990), así como in vivo (Filoux y Townsend, 1993), y por la auto-oxidación de
y produce radicales, compuestos como quinonas y melanina que son tóxicos para las células
(Offen et al., 1996). El incremento de la producción de DA induce también un incremento en
la liberación de ácido glutámico (Glu), un neurotransmisor que a altas concentraciones es
excitotóxico (Choi, 1990). Algunos estudios han mostrado que la DA incrementa los niveles
intracelulares de oxido nítrico (NO) induciendo la muerte neuronal (Jones et al., 2000). Esto
sugiere que en determinadas condiciones los incrementos en los niveles de DA pueden
aumentar el proceso neurodegenerativo. Incluso se sabe que existe una activación del factor
de transcripción k B (NFkB) involucrado en la regulación de la muerte célular después de la
administración de 6-OHDA (Blum et al., 2001b; Lee et al., 2001).
1.7 Factor nuclear k B( NFκB)
Debido a la gran actividad de las vías metabólicas que generan radicales libres y ROS
que participan como señal de las vías de transducción que medían la apoptosis,
recientemente se ha investigado al factor de trascripción NFκB.
El factor NFκB se ha implicado en diferentes procesos como inflamación, crecimiento y el
desarrollo incluso juega un papel importante en la regulación de la apoptosis tanto en
neuronas como en células no neuronales (Mattson et al., 2000; Ben-Nerian 2000).
Este factor de transcripción existe en citoplasma en su forma inactiva y es translocado al
núcleo cuando es activado. El NFκB es un heterodímero formado por dos péptidos; p50 (50
KDa) y p65 (65 KDa) y se encuentra unido a por la proteína Iκ-B, la cual lo mantiene
inactivo en el citoplasma. La activación de NFκB implica su disociación de la Iκ-B y su
posterior traslocación como heterodímero (p50-p65) hacia el núcleo, donde se enlaza a una
secuencia de DNA e incrementa la expresión de genes (Fig. 1). En el SNC, el NFκB se
encontró tanto en células gliales como en neuronas. Este factor de transcripción se activa
como respuesta a estímulos neurotóxicos como es la liberación de glutamato (O’Neil y
Kaltschmidt et al., 1997). La liberación de glutamato implica la activación tanto del receptor
N-metil
D-aspartato
(NMDA)
como
α-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propionato
10
(AMPA), pudiendo tener un efecto de neuroprotección, sin embargo esto todavía no es claro.
En diversos modelos experimentales se ha sugerido que el incremento en los niveles de
NFkB, es consecuencia de un daño neuronal y que la acción de este factor pudiese ser
antiapoptótica. NFκB forma parte de una vía de transducción dependiente de PKC, se sabe
que puede actuar como inhibidor de la apoptosis, siendo capaz de bloquear la activación de
la caspasa 8 a través de la regulación de ciertos genes que codifican para IAP’s (factores
inhibidores de la apoptosis y para TRAFF1/2 (factor asociado al receptor TNF conocido
como factor de necrosis tumoral, es una proteína adaptadora con dominios de muerte DD),
por lo que inhibe la liberación del citocromo c mitocondrial, induciendo la expresión de
genes antiapoptoticos de la familia Bcl-2 (proto-oncogen Bcl-2), (Park y Levit 1993; Wang
1999). También puede inducir la transcripción de genes de la cadena respiratoria inflamatoria
como citoquinas y receptores de citoquinas (Philpott et al., 2000) y recientemente se propuso
que induce la activación pro-apoptotica a tra es de genes inductores de la apoptosis (Lin et al.,
1999, Israel et al., 2000).
En pacientes parkinsonianos se ha encontrado un alto número de neuronas DA
pigmentadas en núcleo, con NFκB activo y se propone que tiene un papel importante el la
degeneración de la EP (SNpc y VTA). Durante el proceso de apoptosis existe un incremento
de ROS y NFκB. El uso del antioxidante N-acetil-cisteína inhibe la producción de ROS y
protege a las neuronas de la muerte vía NFκB por lo que se sugiere que el papel de este factor
de transcripción en la EP es prevenir la muerte celular (Hunot et al., 1997). Otros estudios
proponen que la activación de NFκB durante la apoptosis por la auto-oxidación de DA,
contrarresta el proceso apoptótico (Lee et al., 2001).
11
NFkB
p50
p50 p65
p50 p65
p65
Proteasoma
kinasa IkB
p50
p65
Sitio-κB
Especies reactivas
de oxigeno?
Ceramida?
p50
Otros?
RelA
IκB
ESTIMULO
INDUCCION DE GENES
EFECTO ANTIAPOPTOTICO
1 Neurotrofinas (NGF)
1 Neurotransmisores (glutamato)
1 Stress oxidativo
Tomado de:
(O’Neil y Kaltschmidt 1997;Hu et al., 1999)
Fig. 1. Activación de NFkB por estrés oxidativo, neurotrofinas, entre otros. La activación de este factor de
transcripción se induce después de la fosforilación de IkB y su posterior degradación, permitiendo al
heterodimero p50-p65 traslocarse hacia el núcleo e para inducir la expresión de varios genes.
1.8 El uso de L-Dopa en el tratamiento de la EP
El principal fármaco en el tratamiento de la EP es L-3,4-dihidroxifenilalanina (LDopa) un precursor de la DA que logra sustituir la DA en el estriado de pacientes
parkinsonianos (Cotizas 1969, Hornykiewicz 2002). La L-Dopa mejora las funciones
motoras, lo que lo hace altamente eficaz. A pesar de que este fármaco logra restablecer las
funciones motoras, sin embargo la aparición del fenómeno de “desgaste” se presenta
posteriormente, y se requiere incrementar la dosis y la frecuencia de administración para
obtener los mismos beneficios del fármaco, dicho evento se le conoce como “wearing off”. El
estado del paciente se complica por el desarrollo de discinesias o movimientos involuntarios
excesivos y anormales. Las discinesias ocurren en un 80% de los pacientes que reciben largas
terapias de L-dopa. Así el 50% de los pacientes presentan fluctuaciones motoras como
discinesias después de 5 años de tratamiento con L-Dopa (Chase, 1990; Marsden, 1994).
En las etapas tardías de la enfermedad, los pacientes pueden fluctuar con rapidez entre
estar “apagados”, y estar “encendidos” pero con discinesias incapacitantes, situación que se
12
ha denominado fenómeno “on-off” (Marsden y Parkes 1977; Luquin et al., 1992; Marconi
et al., 1994). La prevalencia de las fluctuaciones motoras y de las discinesias incrementa con
la duración y la severidad de la enfermedad así como con la duración del tratamiento con LDopa (Obeso 2000).
La forma mas común
de discinecias consiste en
una combinación de distonía
(espasmo muscular breve o sostenido, a menudo con movimientos anormales lentos) y
movimientos coreicos (movimientos involuntarios, irregulares, sin objetivo, arrítmicos,
bruscos, rápidos, no sostenidos, que fluyen de una parte del cuerpo a otra). Las discinecias
aparecen cuando las concentraciones de L-Dopa son altas en plasma, incluso pueden
aparecer cuando los niveles del fármaco son bajos.
Hasta el momento la L-Dopa es la herramienta farmacológica más poderosa y más
empleada, sin embargo los problemas motores aparecen por el uso crónico. Esto conduce a la
búsqueda de otras alternativas farmacológicas con el fin de disminuir las dosis de L-Dopa, y
disminuir las alteraciones motoras lo que mejoraría la calidad de vida de los pacientes.
1.9 La toxina tetánica como una estrategia terapéutica en la EP
La toxina tetánica (TeTx) es producida por el bacilo Clostridium tetani, en condiciones
anaeróbicas. Pertenece a la familia de las neurotoxinas clostridiales (NTC), son consideradas
como holoproteínas, ejemplos de ellas son la toxina botulínica y la tetánica. Aunque todas
las NTC comparten el mismo origen y tienen estructuras moleculares muy similares e incluso
mecanismos de acción a nivel molecular semejantes, las enfermedades que inducen tienen
diferencias importantes. La toxina tetánica induce tétanos, caracterizada por una contractura
muscular y espasmos recurrentes, e induce la muerte por colapso respiratorio y asfixia. Los
síntomas son contrarios en el botulismo debido a que se presenta una parálisis flácida
generalizada. Actualmente se conoce que las NTC son metaloproteasas que actúan en las
terminaciones nerviosas. Las proteínas sobre las que actúan se conocen como el complejo
SNARE (complejo soluble de unión al receptor proteíco), está conformado por SNAP-25
(proteína asociada al sinpatosoma de 25 kDa), sinaptobrevina o VAMP (proteína asociada a
vesículas de membrana) y sintaxina. Estas proteínas participan de manera importante con otras
proteínas en las diferentes etapas de la fusión de la vesícula sináptica con la membrana. La
13
toxina tetánica, ejerce su acción sobre el sistema nervioso periférico y central, inhibiendo la
liberación de neurotransmisores por su unión selectiva a la proteína de la vesícula sináptica
sinaptobrevina II, e inhibe el anclaje de la vesícula sináptica (Schiavo et al., 1992). También
se ha propuesto que la TeTx puede activar GTP-transglutaminasa dependiente de Ca2+
produciendo un sinergismo en el bloqueo de liberación del NT.
Vesícula
Sináptica
BoNT/D
Sinaptotagmina
Lys -Leu
59
TeTx-BoNT/B
Gln -Phe
7
7
60
Sinaptobrevina
BoNT/G
Ala81-Ala 82
BoNT/F
Gln -Lys
58
Sintaxina
Espacio Sináptico
59
TM
116
-C
Nsinaptobrevina-2/VAMP-2
Fig. 6. Mecanismo de acción de la Toxina Tetánica sobre la vesícula sináptica y su sitio de
reconocimiento en la sinaptobrevina-2/VAMP-2, una proteína del complejo SNARE, que sufre proteólisis por
las NTC.
1. 10 El fragmento C-terminal de la toxina tetánica
El precursor de la TeTx (single-chain TeTx) se sintetiza como una sola cadena
polipeptídica (150 KDa) y es activada por una endopeptidasa clostridial. Los productos
obtenidos de la hidrólisis son dos cadenas polipeptídicas unidas por un puente disulfuro; la
cadena ligera L-TeTx induce el efecto toxico por inhibir la liberación de NT y la cadena
pesada Hc-TeTx (100 kDa) permite el reconocimiento en la membrana celular y la
internalización en la neurona (Fig. 2).
14
Neurotoxina un solo
dominio
COOH
S
Zn
H2N
S
Cadena pesada 100 kDa
Neurotoxina
S
Proteasas
Zn
H2N
S
COOH
NH2
Reduccion
H2N
COOH
SH
Zn
COOH
NH
SH
COOH
Cadena ligera 50 kDa
SH
COOH
NH2
COOH
NH2
Papaina
Hc-Tetx 50kDa
Fig. 2. Esquema de la obtención del fragmento Hc-TeTx a partir de la toxina tetánica. Por
proteólisis se obtienen los fragmentos Hc-TeTx y es producto del corte la cadena pesada (100 kDa) y
el fragmento L-TeTx o cadena ligera (50 kDa).
Posteriormente la cadena pesada es cortada por una proteasa (papaína) en Ser864 y
Lys865 obteniéndose dos fragmentos: el fragmento HCN-TeTx (865-1110 de 50 kDa) y una
parte C-terminal o β-trefoil, Hcc-TeTx (1110-1315 residuos; 50 kDa). La forma tridimensional
de los dos fragmentos unidos por una sola cadena α-hélice se muestra en la Fig. 3 (Emsley et
al., 2000).
HCC-TeTx
β-trefoil
HCN-TeTx
Fig. 8. Conformación tridimensional del fragmento Hc-TeTx (tomado de Chaib-Oukadour 2004)
Los dos fragmentos conservan su actividad sobre la neurosecreción para L-TeTx y de
unión a la membrana para Hc-TeTx (Mochida et al., 1995; Meckler et al., 1990). En algunos
estudios se ha mostrado que el dominio β-trefoil del fragmento Hc-TeTx se une a los
poligangliósidos y a las células neuronales de manera más eficaz que el fragmento Hc-TeTx
(Halpern y Loftus et al., 1993). Mientras que Figereido et al., 1995, mostró que el fragmento
HCN-TeTx no presenta tal afinidad hacia los complejos lipídicos. Posteriormente, estudios
de foto-afinidad muestran que la alta afinidad del fragmento Hc-TeTx en la región próxima al
15
residuo His1293 (Shapiro et al., 1997). Otras investigaciones usando la estructura cristalina del
fragmento unida a un gangliosido sintético Gb1, proporcionó las evidencias de que no solo el
fragmento Hc-TeTx tiene alta afinidad a gangliosidos incluso las toxinas clostridiales se unen
de forma especial a gangliósidos con dos o más restos de ácido siálico unidos a un resto de
galactosa, ejemplos: GD1b, GT1b,GQ1b (Van Heyningen 1963; Lalli et al., 1999). Estudios
de unión y de toxicidad indican que el reconocimiento del fragmento Hc-TeTx tanto a
lactosa como a ácido siálico, son esenciales para llevar a cabo la toxicidad de la TeTx
(Rummel et al., 2003).
1.10 El fragmento Hc-TeTx en SNC
El dominio C-terminal es el responsable de que la TeTx pueda unirse a la membrana
celular, ya que se une de manera altamente específica a zonas no mielinizadas de los axones
neuronales (Yavín et al., 1981; Monteccuco et al., 1986).
Experimentos realizados en
membranas neuronales de rata, en donde se empleo el fragmento Hc-TeTx mostraron su
capacidad de unión (por Goldberg et al., 1981. Tal efecto también fue mostrado en cultivos
primarios de neuronas ( Lalli et al., 1999).
Las investigaciones realizadas sobre la acción del fragmento Hc-TeTx indican que a
dosis muy bajas inhibe la captura de 5-HT (5-Hidroxitriptamina) en preparaciones
enriquecidas en sinaptosomas de tejido nervioso de rata (Inserte et al., 1999; Najib et al., 1999;
Pelliccioni et al., 2001). El mecanismo de acción de la TeTx es la inducción de la fosforilación
en un residuo del transportador SERT (transportador de la serotonina). Así el fragmento HcTeTx ha mostrado reproducir los efectos de la TeTx, de tal manera que se le atribuye una
actividad similar a los inhibidores selectivos del transporte de 5-HT, ejemplos de este tipo de
fármacos son la fluoxetina (Proxac) ampliamente utilizado en patologías del comportamiento
(Najib, 2000).
En el SNC la administración intraventricular de la TeTx en ratas adultas induce
fosforilación y la activación de la fosfolipasa C Cγ−1 (PLCγ−1), acompañada de una
regulación negativa de la proteina kinasa C (PKC) (Aguilera y Yavín, 1990). Así también, el
fragmento Hc-TeTx
en cultivos primarios de neuronas corticales de rata aumentaba la
16
actividad de la PKC y la hidrólisis de fosfoinosítidos (Gil et al., 1998). Debido a la activación
de receptores tirosina quinasa
A (Trk A), por la fosforilación/autofosforilación de este
receptor se propuso que este fragmento activaba los mismos blancos neuronalaes que inducen
las cascadas de señalización de los factores de crecimiento quienes están implicados en los
procesos de sobrevivencia célular (Najib et al., 1999, 2000, Pelliccioni et al., 2001). El
fragmento Hc-TeTx en sinaptosomas de encéfalo de rata, activa al receptor receptor Trk A,
fosforilandose en Tyr490,
y se induce la fosforilación/activación de la PLCγ-1 y la
consecuente activación/translocación, y finalmente una regulación negativa de las formas
clásicas y nuevas de PKC, la fosforilación de la quinasa ERK1/2 (quinasas reguladas de
forma extracelular de 44 y 42 kDA, respectivamente) (Gil et al., 2000). En cultivo primario
de neuronas corticales de rata se encontró el fragmento Hc-TeTx activa al receptor Trk por la
fosforilación de residuo de Tyr674/Tyr675 con lo que se activan las vías p21Ras/MAPK
(proteína G de 21 kDa/proteínas cinasas activadas por mitógenos) y PI3K/Akt
(fosfatidilinositol 3 cinasa/proteína cinasa B ó PKB), conocidas como las vías activadas por
neurotrofinas (Chaib Oukadour, 2004). Estos efectos son dependientes de la interacción de
la neurotoxina TeTx, con la membrana celular y se sabe que también son producto de la
acción del fragmento Hc-TeTx. El avance en las investigaciones sobre las vías por las cuales
actuaba este fragmento inocuo, pero con actividad similar a los factores de crecimiento hizo
pensar que éste poseía un efecto neuroprotector ante diversos ambientes de apoptosis ó en
patologías donde existen procesos neurodegenerativos como la EP. Cuando se evaluó el
efecto del fragmento en la muerte por apoptosis en de neuronas granulares en cultivo (NGC),
se encontró que había sobrevivencia celular ante un estrés inducido por el cambio de K25 a
K5, el cual resulta excitotoxico en este tipo celular y que lleva a la muerte por apoptosis, por
las vías p21Ras, fosforilandose en Ser259 de Raf (una cinasa Ser/Thr de 70-75 kDa ), con la
activación de la vía MAPK’s (MEK1/2 en Ser217; ERK1/2 en Thr202 y Tyr204) y
posteriormente la PI3K y Akt (fosforilado en Ser473 y Thr308). El fragmento también es capaz
de inhibir la des-fosforilación de Akt y las ERK1/2, e inactivar a la glicógeno sintasa cinasa
(GSK-3β) por su fosforilación en Ser9 y por estas vías inducir sus efectos de neuroprotección.
La vía p21Ras/MAPK es esencial en la inhibición de la apoptosis, y lleva a cabo la
activación del factor 90Rsk por su fosforilación en Ser380. Este es un sustrato relevante de
MAPK, ya que es una señal de inhibición de la proteína proapoptotica Bad (Bcl-X/Bcl-2
17
promotor de muerte asociado) y por otra parte la expresión de genes de sobrevivencia celular
por activación del factor CREB (elemento de respuesta a la proteína de unión a AMP cíclico)
fosforilado en Ser133. Una similitud entre la actividad del fragmento Hc-TeTx y el factor de
crecimiento derivado del cerebro (BDNF) es que ambos activan estas vías (Chaib Oukadour
et a., 2004). Otra forma en que el Hc-TeTx induce neuroprotección es por la inhibir la procaspasa 3, tal efecto se mostró al depositar a 10 nM Hc-TeTx en las NGC. Las implicaciones
en este proceso de muerte, es que el fragmento Hc-TeTx puede proteger contra la apoptosis,
dicho proceso se puede evaluar sobre la fragmentación del DNA, la condensación de la
cromatina o en la formación de cuerpos apoptóticos, indicadores de apoptosis (Thronberry y
Lazebnik, 1998).
NT:
Hc-TeTx
NGF
BDNF
NT-3
ANG II
TPA
TrkA,TrkB,TrkC
p110
PI-3K
sos ras
nPKC
Shc
PIP3
Ras-GDP
GAP
Akt
Bad
P14-3-3
Raf-1
MEK
ERK
Bad
Dianas citosòllicas
Rs
Caspasa9
PLA2,TyrH,raf-1
p90
Dianas nucleares
Caspasa3
PKC
Ras-GTP
c-fos,c-jun,Elk1
MAPKAP2
MATs,tau,…
APOPTOSIS
Fig. 9. Vías de señalización de las MAPK’s y las PI3K (Tomado de Aguilera J. 2004)
El N-metil-4-fenilpiridina (MPP+) es el metabolito activo del MPTP, un agente
químico que al atravesar la barrera hematoencefálica es capaz de inducir el síndrome
18
parkinsoniano. La administración sistémica de MPTP es convertido a MPP+, es recapturado
por el DAT y se acumula en las neuronas DA de la SNpc. El MPP+ inhibe la cadena
respiratoria mitocondrial por inhibir el complejo I e induce un déficit de ATP (Mizuno et al.,
1987), también incrementa los niveles de superóxido y puede difundir y reaccionar con el NO
para formar peroxinitrito (ONOO-), un agente altamente reactivo que puede dañar la
membrana lipídica, proteínas y el DNA (Przedborski et al., 1996; Beal et al., 1995). El MPP+
P
es capaz de inducir muerte celular por apoptosis in vitro en varios tipos celulares como NGC,
PC12, entre otros (Leist et al., 1998; Shimoke Kudo 2001). In vivo uno de los marcadores de
apoptosis encontrados son los núcleos apoptóticos después de la exposición a MPP+ y MPTP
(Tatton y Kirsh 1997).
El MPP+ ha mostrado inducir muerte por apoptosis en NGC (Du et al., 1997). Este
tipo celular ha mostrado ser vulnerable a los efectos neurotoxicos del MPP+ (Langston et al.,
1983) Factores neurotróficos como el BDNF o el EGF protegen a las DA contra el MPP+
(Spina 1992; Yoghinaga 1998). El fragmento Hc-TeTx también ha mostrado ser eficiente en
la neuroprotección en las NGC, cuando se induce la apoptosis en este tipo celular al inducir
una disminución de K+. Los mecanismos por los cuales el fragmento Hc-TeTx induce la
sobrevivencia célular parecen llevarse a cabo a través de las vías MAPK y PI3K (Segal and
Greehgerl 1996; Nuñez del Peso 1998; Chaib-Oukadour et al., 2004). Además, el fragmento
Hc-TeTx ha mostrado proteger de la apoptosis por MPP+, debido a que disminuye la
condensación de la cromatina, inhibe la translocación de Bax (proteína X asociada a Bcl-2)
para la liberación de citocromo c (Cit c) y la proteína caspasa 3, ambos promotores de la
apoptosis. La liberación del Cit c induce apoptosis debido a que se puede asociar con Apaf -1
(factor activador de proteasas) provocando la agregación y activación de la pro-caspasa 9,
también se produce un colapso de la membrana mitocondrial y una disminución del
potencial de membrana. En cuanto a las caspasas al estar inactivas protegen de la apoptosis
inducida por los receptores de muerte. La mitocondria tiene un papel clave en la iniciación
de las vías de muerte (Wei et al., 2001). Otro promotor de la apoptosis es Bad, quién puede
activar a Bax, en condiciones normales se encuentra inactiva cuando esta unida a la
chaperona 14-3-3 y al activarse se une a Bcl-XL. El fragmento Hc-TeTx también induce su
efecto neuroprotector por la vía Bad, al inhibir su disociación con la chaperona 14-3-3. Se
19
sabe que la fosforilación de Bad en Ser136 y Ser112 por Akt y Erk, se promueve la unión de Bad
a 14-3-3 (Del peso et al., 1997, Blume-Jensen et al., 1998). Es por estas diferentes vías que el
fragmento Hc-TeTx promueve la sobrevivencia célular al inhibir la apoptosis por MPP+
(Chaib-Ouckadour, en proceso).
20
II. JUSTIFICACIÓN
La EP afecta al 2 % de la población mayor de 65 años y su duración promedio es de
13 años. Aunque, se ha encontrado que la EP puede aparecer a los 40 años (Hughes et al.,
1992, Lang y Lozano 1998; Golbe, 1991). El tratamiento es de tipo sintomático, uno de los
más eficaces es L-Dopa el cual incrementa los niveles de DA y reestablece las funcines
motoras. En los primeros años de tratamiento la L-Dopa genera grandes beneficios ya que
revierte la acinesia, temblor entre otros, sin embargo después de varios años de tratamiento
comienza a ser ineficaz y a generar otros problemas motores como las discinecias (Obeso et
al., 2000). Algunos estudios sugieren que el tratamiento crónico con L-Dopa es un factor que
contribuye en el proceso neurodegenerativo por su capacidad de generar radicales libres
(Maeda et al., 1997; Soliman et al., 2002). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio
(Mendieta, 2004) han mostrado que la lesión dopaminérgica y el tratamiento crónico de LDopa inducen un deterioro motor y cognitivo, incluso acentuando el estrés oxidativo debido
a un incremento de NO en estriado. Debido a las alteraciones motoras que produce la LDopa y su posible efecto neurotóxico, actualmente se están buscando nuevos fármacos que
ayuden tanto a retardar el proceso neurodegenerativo como a mejorar las funciones motoras
de los pacientes parkinsonianos.
Estudios realizados in vitro e in vivo han mostrado que la toxicidad de la DA está
vinculada con el estrés oxidativo y su consecuente apoptosis. En el proceso degenerativo de
la EP, la apoptosis juega un papel importante (Mochizuki et al., 1996). El modelo con 6OHDA ha mostrado ser importante en el estudio de la neurodegeneración dopaminérgica
(Lotharius et al., 1999). NFκB tiene un papel importante en el proceso apoptotico debido a
que participa en la activación de genes anti-apoptoticos en modelos de EP (Hunot et al., 1997;
Lee et al., 2001; Levites et al., 2002)
El fragmento Hc-TeTx de la TeTx activa varias antiapoptóticas en NGC, debido a que
tiene como blanco los receptores de neurotrofinas Trk (Aguilera y Chaib-Oukadour., 2004).
Incluso el fragmento Hc-TeTx es capaz de rescatar a las neuronas de la muerte celular
después de ser expuestas a MPP+, sin embargo todavía no es claro si in vivo puede ejercer su
efecto neuroprotector. Este trabajo propone evaluar el fragmento Hc-TeTx sobre la asimetría
motora y la actividad motora en campo cerrado en el modelo de lesión unilateral con 621
OHDA en rata, un modelo ampliamente utilizado para la evaluación de nuevas terapéuticas
en la EP (Marín et al., 2006) Posteriormente evaluaremos la activación de NFκB como un
factor que muestra los cambios a nivel de transcripción de genes que pueden estar
relacionados con la disminución del proceso apoptótico.
III. HIPOTESIS
H1
La fracción Hc de la toxina tetánica produce cambios en las conductas motoras y cambios en
la activación de NFκB en rata lesionada con 6-OHDA.
H0
La fracción Hc de la toxina tetánica no produce cambios en las conductas motoras y cambios
en la activación de NFκB en rata lesionada con 6-OHDA.
IV. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre las conductas motoras y sus
cambios en la activación de NFκB en rata lesionada con 6-OHDA.
V. OBJETIVOS PARTICULARES
1) Estudiar si la fracción Hc de la toxina tetánica revierte la asimetría motora inducida
por la administración de anfetamina, en rata con 6-OHDA.
2) Estudiar el efecto de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre la actividad motora en
rata con lesión unilateral de 6-OHDA.
3) Estudiar el efecto de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre los niveles de NFκB en
rata con lesión unilateral de 6-OHDA en corteza frontal y estriado.
22
VI. METODOLOGIA
Ratas macho cepa Wistar
300-350 gr
Cirugía estereotáxica
AP= -1.8, L= +2.0, P= -6.5
Vehículo
(Ác. ascórbico)
2μL en vías
nigroetriatales
(n=10)
6-OHDA 2μL
(8μg/μL) en VTA
en vías
nigroestriatales
(n=10)
Conducta de giro
(Metanfetamina 5mg/kig s.c.)
por 1 hora 14 días post-lesión
(10 giros/min para grupo 6-OHDA)
Control (Ác. ascórbico)
2 μL+ Hc-Tetx 2 μL
(20μM) en vías
nigroestriatales
(n=10)
Hc tetx 2 μL
(20μM)/6-OHDA
2μL (8μg/μL) en vías
nigroestritales
(n=10)
Actividad Motora
durante
120 min. en cajas de
campo cerrado a 20
días post-lesión
Extracción de cerebros y disección de estriado
y corteza frontal
Determinación de los
niveles de NFκB
23
TENCNICA PARA DETERMINAR NFĸB EN ESTRIADO Y CORTEZA FRONTAL
Obtención de extractos nucleares y citoplásmicos
de estriado y corteza frontal
Cuantificación de proteínas por
el método de Bradford
Determinación de p65 con
Western Blot (anti- p65)
VII. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Se usaron ratas macho de la cepa Wistar de un peso entre 300 y 350 gramos. Los
animales a usar provienen del Bioterio “Claude Bernard” de la Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla.
IX. METODOS
A. Cirugía estereotáxica.
1) Las ratas se anestesian con hidrato de cloral (350mg/Kg, i.p.). El Hidrato de Cloral es
preparado a una concentración de [60 mg/ml].
2) Cirugía estereotáxica, para lesionar las vías nigroestriatales se inyectaron 2 μl de
6-
OHDA (8μg/μl), con coordenadas (AP= -1.8, L=+2.0, P=-6.5) (Paxinos & Watson
1998). Se utilizan 4 mg de 6-OHDA, los cuales son disueltos en 500 μL de ácido
ascórbico 0.01%. El fragmento Hc-TeTx fue administrada en el mismo sitio a la
concentración correspondiente. [2, 10, 20 y 50 μM].
3) Cirugía estereotáxica para el grupo control se inyectó el vehículo ácido ascórbico
0.001% en las vías nigroestriatales con las mismas coordenadas del grupo
experimental.
24
4) A todos los animales se les da un tratamiento post-operatorio administrando 20
unidades de antibiótico (Penicilina G/lidocaína) por vía intramuscular durante tres
días.
5) Las ratas se recuperaron de la cirugía durante 8 días.
B. Conducta de giro
Después de 14 días de haber realizado la cirugía estereotáxica se evalúo la lesión
causada con la 6-OHDA mediante la evaluación conducta de giro, se administra
metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantifica el número de giros ipsilaterales durante 60
minutos (Ungerstedt 1968). Únicamente se consideran las ratas que presentan al menos 10
giros/minuto o más para el grupo de ratas con 6-OHDA.
C. Evaluación de la actividad motora en campo cerrado.
En todos los grupos experimentales se les cuantificó la actividad motora con las cajas de
actividad motora de campo cerrado.
Los animales son introducidos en las cajas y se
cuantificó su actividad durante 120 min. Finalizado el tiempo, se obtuvo el número de
cuentas acumuladas (promedio de movimientos en 10 minutos) por periodos de 10 min y la
cuenta total durante el tiempo de evaluación.
X. PROCEDIMIENTO
En este experimento utilizamos dos lotes (n=40) (ver diagrama de trabajo).
Grupos Experimentales:
1. Al primer grupo un grupo de animales (n=10) son anestesiados para realizarles la
cirugía estereotáxica y producir una lesión dopaminérgica con (2μL) 6-OHDA
[8μg/μL] en vías nigroestriatales según el procedimiento convencional y coordenadas
AP=-1.8; L=+2.0; P=-6.5 (Paxinos & Watson 1998). A una concentración de 6OHDA. Al Segundo grupo se le inyecto 2 μl del fragmento Hc-TeTx a la
concentración 2 μM, 10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA, al tercer grupo se
le inyecto el fragmento 2 μl de Hc-TeTx a la concentración 10 μM; 10 minutos previo
a la inyección de 6-OHDA; al cuarto grupo se le inyecto 2μl del fragmento Hc-TeTx a
la concentración 20 μM, 10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA y por último
un quinto grupo se le inyecto 2 μl del fragmento Hc-TeTx a la concentración 50 μM,
10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA, en vías nigroestriatales.
25
2. A todos los animales se les administró antibiótico 2 U durante 3 días postoperatorio
por vía intramuscular.
3. Después de 14 días de recuperación, se valoró la lesión dopaminérgica mediante la
conducta de giro, inducida con metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantificó el
número de giros ipsilaterales durante 60 minutos.
4. Al día 20 posterior a la cirugía se cuantificó la actividad motora en las cajas de
actividad motora de campo cerrado.
5. Finalizada la evaluación de actividad motora los grupos 6-OHDA y Hc-TeTx/6OHDA (20 μM) son sacrificados para extraer cerebro y hacer la disección se núcleos:
estriado y de la corteza frontal.
6. Posteriormente del estriado y de la corteza frontal se obtuvo el extracto nuclear y
citoplásmico con el protocolo correspondiente (ver apéndice).
7. Se realizó la determinación de proteínas por el método de Bradford (ver apéndice).
8. Por cada 3 muestras del mismo núcleo o área cerebral se realizó una mezcla, a la cual
se le realizó la inmunodetección en fase sólida ó Western blot para p65 (se utilizó el
anticuerpo primario anti-p65).
9. Posteriormente se realizan Western Blot con anti-p65 para determinación de NFκB,
(Ver apéndice, técnicas).
Grupos Controles
Usamos dos grupos controles:
10. A un grupo de animales (n=10) son anestesiados para realizarles la cirugía
estereotáxica e inyectar 2μL del vehículo (ácido ascórbico) ácido ascórbico (0.001%)
en vías nigroestriatales según el procedimiento convencional y coordenadas AP=-1.8;
L=+2.0; P=-6.5 (Paxinos & Watson 1998). En el grupo Hc-TeTx se le inyecto 2 μl a
20μM en las vías nigroestriatales.
11. A todos los animales se les administró antibiótico 2 U durante 3 días postoperatorio
por vía intramuscular.
12. Después de 14 días de recuperación, se valoró la lesión dopaminérgica mediante la
conducta de giro, inducida con metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantificó el
número de giros ipsilaterales durante 60 minutos.
26
13. Al día 20 posterior a la cirugía se cuantificó la actividad motora en las cajas de
actividad motora de campo cerrado.
14. Finalizada la evaluación de actividad motora los animales son sacrificados para
extraer cerebro y hacer la disección se núcleos: estriado y de la corteza frontal.
15. Posteriormente del estriado y de la corteza frontal se obtuvo el extracto nuclear y
citoplásmico con el protocolo correspondiente (ver apéndice).
16. Se realizó la determinación de proteínas por el método de Bradford (ver apéndice).
17. Por cada 3 muestras del mismo núcleo o área cerebral se realizó una mezcla, a la cual
se le realizó la inmunodetección en fase sólida ó Western blot para p65 (se utilizó el
anticuerpo primario anti-p65).
18. Posteriormente se realizan Western Blot con anti-p65 para determinación de NFκB,
(Ver apéndice, técnicas).
XI. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS
1) En el lote de ratas lesionadas se cuantificó el promedio del número de giros
ipsilaterales (SEM, los cuales fueron
graficados en periodos de 10 minutos
durante una hora. Los grupos Hc-TeTx fueron analizados con su grupo control
con una prueba t-student, (*p<0.05). Finalmente los grupos serán evaluados con
una prueba ANOVA de una vía y una prueba Dunnett p<0.05
2) Las pruebas de actividad motora se graficó de acuerdo al número de cuentas
acumuladas en periodos de 10 minutos. El análisis estadístico se evaluó con una tstudent, por cada periodo (*p<0.05). Finalmente los grupos fueron evaluados con
una prueba ANOVA de una vía y una prueba post-Bonfferroni.
3) La determinación de proteínas citoplasmáticas y nucleares se realizaron en una
curva de calibración lineal, r2=0.99
4) La densitometría del western blot fue analizada con el programa: Kodak 1D,
versión 3.5.4. Los valores obtenidos de la densitometría del grupo control se
ajustaron al 100% y los siguientes grupos experimentales fueron evaluados
27
respecto al grupo control. Se realizó una prueba ANOVA de una vía para evaluar
los grupos experimentales respecto al control tanto en los extractos citoplasmicos
como en los nucleares, y se evaluó finalmente con una prueba post-Dunnett
*p<0.05
28
XII. RESULTADOS
12.1 ADMINISTRACIÓN LOCAL DE AZUL DE METILENO
Se realizó la administración unilateral de azul de metileno en las proyecciones de la
nigra y área ventral tegmental hacia el estriado, para evaluar el sitio exacto para realizar la
administración local. La inyección se realizó con las siguientes coordenadas:
(AP= -1.8, L= +2.0, P=-6.5)
A)
B)
H
E
SNpc
VTA
A) Esquema de la localización coronal del sitio de lesión (Paxinos & Watson, 1998), B) Foto de corte
de cerebro que muestra la inyección con azul de metileno en las vías nigroestriatales. (E: estriado,
H:hipocampo, VTA: área ventral tegmental; SNc: sustancia nigra compacta).
12.2 EVALUACIÓN DE LA ASIMETRÍA MOTORA
Antes de realizar la administración del fragmento Hc-TeTx en las vías nigroestriatales,
nos propusimos realizar una curva dosis respuesta, para que mostrara las dosis a las cuales el
fragmento mostraba efectos sobre la conducta motora. Para llevar a cabo este objetivo
realizamos un grupo para cada dosis de Hc-TeTx a 2, 10, 20 y 50 μM/y la inyección de 6OHDA (Gráfica 1).
Posterior a la cirugía estereotáxica de cada grupo, se realizó evaluó el efecto de la
administración de 6-OHDA unilateral, en este grupo esperábamos un respuesta de alto daño
dopaminérgico reflejado tanto en la conducta motora como en la asimetría motora. Un
parámetro de inclusión para las ratas con administración de 6-OHDA, fueron aquellos
animales que presentaron 10 o mas giros ipsilaterales por minuto en un periodo de 10 min
29
durante la prueba de asimetría motora. El día 14 postoperatorio, los animales recibieron
metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantificó en número de giros ipsilaterales por minuto
durante una hora. Los resultados muestran una disminución significativa en el número de
giros ipsilaterales en los animales que reciben previa administración del fragmento Hc-TeTx a
de 6-OHDA de los diferentes grupos 2, 10, 20 y 50 μM de 81.2%, 82.7%, 64.4%, 63.8%,
respectivamente (Tabla 3). Los datos de todos los grupos fueron analizados con una prueba
ANOVA de una vía, y una prueba Dunnett (*p<0.01). Los grupos Hc-TeTx y control ácido
ascórbico no mostraron el giro ipsilateral cuando se les administró anfetamina (5 mg/kg), por
lo que los datos no son mostrados.
Giros ipsilaterales/m i n
30
A)
25
20
15
10
5
*
*
30
40
*
*
50
60
6-OHDA
Hc-TeTx 2μM/6-OHDA
0
0
10
20
70
Giros ipsilaterales/min
Tiempo (min)
30
B)
25
20
15
10
5
*
0
0
10
20
*
*
30
40
*
*
50
60
6-OHDA
Hc-TeTx 10μM/6-OHDA
70
Tiempo (min)
Gráficas de Asimetría Motora de los grupos Hc-TeTx/6-OHDA y 6-OHDA en vías nigroestriatales.
En A) Se muestra la respuesta del grupo Hc-TeTx 2 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA y en B) el
grupo Hc-TeTx 10 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA. Todos los grupos fueron evaluados
durante la prueba de asimetría motora inducida con la administración de metanfetamina (5mg/kg s.c.)
evaluada durante una hora. Los grupos Hc-TeTx/6-OHDA presentaron un decremento significativo en 30
el número de giros ipsilaterales respecto a su control,
t-student *p<0.05
Giros ipsilaterales/min
30
C)
25
20
15
10
5
*
*
*
*
6-OHDA
*
Hc-TeTx 20μM/6-OHDA
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Giros ipsilaterales/min
Tiempo (min)
30
D)
25
20
15
10
5
*
0
0
10
20
*
*
30
40
*
*
6-OHDA
Hc-TeTx 50μM/6-OHDA
50
60
70
Tiempo (min)
Gráficas de Asimetría Motora de los grupos Hc-TeTx/6-OHDA y 6-OHDA en vías nigroestriatales. En
C) Se muestra la respuesta del grupo Hc-TeTx 20 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA y en D) el
grupo Hc-TeTx 50 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA. Todos los grupos fueron evaluados durante
la prueba de asimetría motora inducida con la administración de metanfetamina (5mg/kg s.c.) evaluada
durante una hora. Los grupos Hc-TeTx/6-OHDA presentaron un decremento significativo en el número
de giros ipsilaterales respecto a su control,
t-student *p<0.05
31
Giros ipsilaterales/minuto
25
E)
20
15
10
0
*
*
5
***
10
*
*
*
*
20
**
*
*
30
*
*
*
40
*
*
**
**
50
60
*
Tiempo (min)
6-OHDA
Hc-TeTx 10μM/6-OHDA
Hc-TeTx 2 μM/6-OHDA
Hc-TeTx 50μM/6-OHDA
Hc-TeTx 20μM/6-OHDA
Gráfica dosis-respuesta del efecto del fragmento Hc-TeTx sobre la asimetría motora cuando se deposita
en vías nigroestriatales. E) Se evaluaron los giros ipsilaterales de los cuatro grupos Hc-TeTx/6-OHDA a
(2, 10, 20 y 50 μM, respectivamente para el fragmento) respecto al grupo 6-OHDA 2 ul (8μg/μl). La
conducta de giro se indujo con la administración de metanfetamina 5 mg/kg s.c. y fue evaluada por una
hora. Los giros ipsilaterales disminuyeron significativamente en los grupos Hc-TeTx/6-OHDA respecto al
grupo 6-OHDA. ANOVA de una vía y una post-Dunnett *p<0.01
Tabla 3. Resultados la Conducta de Giro
(Número de giros ipsilaterales/min)
VALOR
6-OHDA
Hc-TeTx
Hc-TeTx
Hc-TeTx
Hc-TeTx
2μM/6-OHDA
10μM/6-OHDA
20μM/6-
50μM/6-OHDA
OHDA
MAX
18,31
3,467
3,175
6,525
6,633
PROMEDIO
12,53
2,35
1,82
3,95
2,66
+/-SEM 2,8
+/-SEM 0,32
+/-SEM 0,60
+/-SEM 1,07
+/-SEM 1,12
32
12.3 ACTIVIDAD MOTORA EN CAMPO CERRADO
Número de cuentas acumuladas
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (min)
Hc-TeTx
Hc-TeTx 10 μM/6-OHDA
CONTROL
Hc-TeTx 2 μΜ/6-OHDA
60
70
Hc-TeTx 50μ/6-OHDA
6-OHDA
Hc-TeTx 20 μM/6-OHDA
Gráfica 6. Efecto del fragmento Hc-TeTx sobre la actividad motora en campo cerrado. Se cuantificó
la actividad motora durante una hora de seis grupos de los cuales uno fue un grupo intacto, el segundo
grupo recibió 6-OHDA (8 μg/μl), los siguientes grupos recibieron previamente a la 6-OHDA, HcTeTx ( 2, 10, 20 y 50 8 μM), fueron administrados en VTA. La actividad motora del grupo 6-OHDA
disminuyo respecto al grupo control intacto. El grupo que mostró una mejoría significativa
(**p<0.001)en la actividad motora fue el grupo que recibió Hc-TeTx 10 μM previa a la 6-OHDA.
ANOVA de una vía y una post-Bonferroni, con *p<0.05
Tabla 4. Resultados de la evaluación en la actividad motora en campo
cerrado durante una hora.
Número de cuentas acumuladas
GRUPO
CONTROL (Ac. Ascórbico)
Hc-TeTx 20 μM
6-OHDA (2 μL, 8μg/μl)
Hc-TeTx 2 μM/6-OHDA
Hc-TeTx 10 μM/6-OHDA
Hc-TeTx 20 μM/6-OHDA
Hc-TeTx 50 μM/6-OHDA
MIN
1385
1185
627
648.8
1124
701.1
591.0
MAX
3213
2260
999.8
1364
1872
1168
1299
PROMEDIO
2555
1929
883.9
1060
1571
996.9
983.4
±SEM
291.8
168.0
56.4
112.1
111.6
68.3
106.2
%
100
75.5
34.6
41.5
61.5
39.0
38.5
33
Los resultados de actividad motora indican que existe un decremento significativo de
la actividad motora del grupo 6-OHDA del 65.4%, respecto al grupo control ácido ascórbico.
El grupo Hc-TeTx no muestra cambio respecto al grupo control (ác. Ascórbico) lo que indica
que la administración del fragmento Hc-TeTx no genera cambios significativos sobre la
actividad motora, debido a que presenta un comportamiento del 75.5%. Por otra parte, la
administración del fragmento Hc-TeTx a 2, 10, 20 y 50 μM, previo a la administración de 6OHDA (disminuyen 58.5%, 38.5%, 61.0% y 61.5%, respectivamente) por lo que no existen
diferencias significativas de la actividad motora respecto al grupo 6-OHDA. Los resultados,
anteriormente mostrados fueron analizados con una prueba ANOVA de una vía y una
prueba Bonferroni *p<0.05
Para el estudio del efecto del fragmento Hc-TeTx a 20 μM (gráfica 7), se evaluaron los
siguientes grupos: un grupo control (Ac. Ascórbico), un grupo Hc-TeTx (20 μM), un grupo 6OHDA y finalmente un grupo Hc-TeTx/6-OHDA. Los resultados indicaron que el
fragmento Hc-TeTx no induce alteraciones en la conducta motora cuando es administrado en
las vías nigroestriatales, respecto al grupo control. El grupo 6-OHDA induce un decremento
significativo en la conducta motora del 65.4% respecto al control y finalmente se encontró
que la administración previa de Hc-TeTx (20 μM)/6-OHDA presenta una disminución del
61%, ligeramente menor que en el grupo 6-OHDA. Los resultados fueron analizados con una
prueba ANOVA de una vía y una post-Bonferroni p<0.05.
34
No. de cuentas acumuladas
3500
3000
CONTROL
2500
HC-TETX
2000
6-OHDA
HC-TETX 20μM + 6-OHDA
1500
*
1000
500
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
Gráfica 7. Efecto del fragmento Hc-TeTx (20 μM) sobre la actividad motora en campo cerrado. Se
cuantificó la actividad motora durante una hora un grupo control (ác. Ascórbico), un grupo 6-OHDA
(8 μg/μl), y un grupo Hc-TeTx/6-OHDA en las vías nigroestriatales. La actividad motora del grupo 6OHDA disminuyo 61% respecto al grupo control, sin lesión. El grupo Hc-TeTx/6-OHDA no presenta
cambios significativos de la conducta motora respecto al grupo 6-ODHA. ANOVA de una vía y una
post-Bonferroni, con *p<0.05
12.4 DETERMINACIÓN DE NFκB
Después de realizar la extracción de cerebro, se hizo la disección del núcleo estriado y
la corteza frontal. Los tejidos fueron almacenados a -70º C hasta su uso. Posteriormente, se
realizaron los extractos citoplásmicos y nucleares del tejido. Los extractos obtenidos de cada
animal fueron utilizados para la determinación de proteínas por el método de Bradford (ver
técnicas) y para cada western blot se utilizó un pool de 3 animales.
Inmunodetección en fase sólida (Western Blot)
La cantidad de muestra fue ajustada a 100 μg de proteína y posteriormente se le
agrego Sample Buffer, y posteriormente se realizó el corrimiento electroforético al 10% de
archilamida en fase sólida. La determinación de NFκB se realizó con anti-p65 (1:250). Las
muestras fueron distribuidas de la siguiente manera, en el primer carril el marcador de peso
molecular, donde nuestra referencia fue el de 66 kDa. Obtenidas las placas, se realizó el
análisis densitométrico. Los datos del grupo control fueron ajustados al 100%
35
Los resultados de la determinación de p65 en extractos citoplásmicos de la corteza
frontal no mostraron cambios significativos respecto a su control (100%, unidades
arbitrarias). La respuesta en citoplasma fue 204.8% ±103.5 del grupo Hc-TeTx, 81.20%
±59.47 para el grupo 6-OHDA y 343.1 ±150.9 para el grupo Hc-TeTx/6-OHDA, respecto a
su control. La determinación de p65 en extractos nucleares, donde NFκB se encuentra activo,
mostró que existe una tendencia a incrementar los niveles de p65 en el grupo 6-OHDA. La
respuesta fue 118.1% ±21.21 en el grupo Hc-TeTx, 241.9% ±148.8 para el grupo 6-OHDA, y
el grupo Hc-TeTx/6-OHDA 146.6% ±99.99, respecto a su control. Sin embargo la
variabilidad entre los datos alta, sin cambio significativo respecto al control. En el caso del
grupo Hc-TeTx/6-OHDA se encontró que existe la tendencia a disminuir la presencia de
p65, pero los datos no arrojan un cambio significativo cuando se aplica el análisis estadístico,
realizado con una prueba ANOVA de una vía y una prueba post-Dunnett p<0.05
Los datos de la presencia de p65 en el extracto citoplásmico de estriado del grupo HcTeTx 66.33% ±103.5 , para el grupo 6-OHDA 50.77% ±25.18 y finalmente del grupo HcTeTx/6-OHDA 118.3% ±42.23, respecto a su control (100%, unidades arbitrarias). La
determinación de p65 en extractos nucleares, donde NFκB se encuentra activo, mostró que
existe un incremento en los niveles de p65 en el grupo 6-OHDA de 618.6% ±46.53, respecto
a su control, lo que indica una gran activación de este factor de transcripción debido al estrés.
Por otra parte la respuesta del fragmento Hc-TeTx también indujo un incremento de p65 de
685.9% ±271.1. Finalmente el grupo Hc-TeTx/6-OHDA 168.1% ±30.82, este último grupo
muestra que se revierte el efecto de la 6-OHDA de incrementar los niveles de p65. Los datos
fueron analizados con una prueba ANOVA de una vía y una post-Dunnett *p<0.05
36
A)
CORTEZA FRONTAL
p65
65 kDa
Actina
45kDa
% DEL CONTROL
600
500
400
300
200
100
A
H
D
A
H
C
+6
-O
H
D
6O
L
H
C
ext. citoplásmicos
B)
-T
ET
X
TR
O
N
H
D
C
O
H
C
+6
-O
H
D
A
A
X
ET
-T
6O
C
O
H
C
N
TR
O
L
0
ext. nucleares
ESTRIADO
65 kDa
p65
45kDa
Actina
1200
% DEL CONTROL
1000
800
600
400
200
extracto citoplásmico
D
A
C
+6
-O
H
D
A
6O
H
-T
ET
X
C
L
O
N
TR
O
D
A
C
H
H
H
C
+6
-O
H
D
A
6O
H
-T
ET
X
C
H
C
O
N
TR
O
L
0
extracto nuclear
Gráfica 8. Determinación de p65 en el grupos control, fragmento Hc-TeTx (20μM), 6-OHDA
(2 μl, 8μg/μl y grupo Hc-TeTx/6-OHDA en corteza frontal y estriado. A) En corteza frontal la
presencia de p65 no mostró diferencias de los grupos experimentales respecto a su control, en los
extractos citoplásmicos y nucleares. B) En el estriado el grupo experimental Hc-TeTx/6-OHDA
presenta un decremento de p65 significativo respecto a al grupo 6-OHDA y el grupo Hc-TeTx
presentó un aumento de p65 respecto al control, ambos cambios en el extracto nuclear. ANOVA de
una vía *p<0.05
37
XVII. DISCUSIÓN
En el estudio de la EP se han usado diferentes modelos tanto in vitro, in situ como in
vivo. El modelo donde se emplea la neurotoxina 6-OHDA ha sido de gran utilidad en el
estudio de la fisiopatología de la enfermedad, así como para poder evaluar nuevas
terapéuticas. La evaluación del grupo 6-OHDA mostró que el giro ipsilateral se presenta
persistente (aprox. 10 giros/min) con la administración de metanfetamina (Hefti et al., 1980).
y que el máximo número de giros fue de 18.31 giros/min y en promedio 12.5 giros/min.
Estos resultados indican que hemos producido una lesión en las vías de VTA, con lo que
inducimos una denervación dopaminérgica y disminución consecuente de los niveles DA.
Aunque no cuantificamos los niveles de dopamina se asocia, el número de giros con el nivel
de perdida dopaminérgica en los ganglios basales ipsilateral, los cuales son cercanos al 90% al
día 14 post-lesión. Incluso con la lesión de 6-OHDA se observan cambios a largo plazo, así
como cambios neuroanatómicos y bioquímicos después de la administración de 6-OHDA,
como son una disminución del 97% en la inmunohistoquímica para la TH y un incremento
en la tinción Fe2+ al día 14 post lesión (Wang et al., 2004). Dichos datos nos indican que
hemos reproducido satisfactoriamente el modelo de lesión unilateral con 6-OHDA.
Por otra parte, se estudio el fragmento Hc-TeTx en un modelo in vivo, en primer lugar
sobre la asimetría motora; el cual se ha usado extensamente como modelo pre-clínico (Marín
et al., 2006). Se inyectó el fragmento a varios grupos, los cuales recibieron el fragmento HcTeTx (2, 10, 20 y 50 μM) previamente a la inyección de 6-OHDA y a los 14 días posteriores a
la lesión evaluamos la asimetría motora. Así obtuvimos una respuesta favorable en los grupos
que recibieron el fragmento Hc-TeTx respecto al grupo de 6-OHDA (Gráficas 1, 2, 3 y 4).
Estos resultados indican, que el Hc-TeTx indujo decremento en el número de giros
ipsilaterales por efecto de la lesión dopaminérgica, cuando se administraba metanfetamina.
Esto indica que pudiese haber un menor daño sobre el sistema de los ganglios basales, ya que
se ha propuesto que el grado de lesión dopaminérgica (disminución en los niveles de DA y de
la enzima
tirosina hidroxilasa) se relaciona con la ocurrencia y el grado del déficit
conductual (Schwarting and Huston 1996). Este modelo in-vivo, se basa en el daño que se
38
induce con la 6-OHDA sobre las neuronas dopaminérgicas y las alteraciones causadas sobre
el sistema de los ganglios basales, que se manifiesta cuando el animal presentan giros al ser
estimulado con anfetamina o un agonista dopaminérgico. De tal manera que los animales
con lesión unilateral de 6-OHDA, desencadenan una conducta conocida como conducta de
giro o asimetría motora, la cual sigue un curso tipo gaussiano. Por lo que sugerimos que el
decremento en el giro ipsilateral puede ser una muestra de una menor alteración sobre el
sistema dopaminérgico. Además estudios de Chaturvedi et al., 2006 se puede aumentar la
liberación de DA en la rata lesionada con 6-OHDA, vía receptores p75NTR, quienes son
blanco del fragmento Hc-TeTx y por esta vía regular la neurotransmisión dopaminérgica, con
lo que puede mejorar las conductas motoras.
Al obtener la curva dosis respuesta, Hc-TeTx/6-OHDA de las dosis 2 a 50 μM, no se
mostraron cambios significativos sobre la conducta motora (Gráfica 6), solo encontramos
mejoría a en el grupo Hc-TeTx/6-OHDA (10 μM). Los resultados del grupo Hc-TeTx/6OHDA (20 μM) inducen un comportamiento similar a su grupo control 6-OHDA (Gráfica
7). A pesar que durante esta prueba no exista incremento en la actividad motora, no quiere
decir que el Hc-TeTx no se este induciendo cambios en la neurotransmisión dopaminérgica o
sobre los mecanismos de protección. Incluso se propone que el grado de daño dopaminérgico
puede variar de animal a animal y la evaluación de este tipo de actividad motora solo es una
de las medidas a evaluar.
Experimentos previos han asociado que el fragmento Hc-TeTx presenta cualidades
similares a los factores de crecimiento al producir sobrevivencia neuronal en condiciones de
estrés (Chaïb-Oukadour et al., 2004). Si bien por un lado la neurotoxina 6-OHDA, produce
estrés oxidativo y apoptosis (Bonnet y Houeto 1999; Olanow y Tatton 1999), lo que induce a
la muerte de neuronas dopaminérgicas. Estos procesos serian muy semejantes a los procesos
que estarían llevándose a cabo durante la neurodegeneración en la EP.
Otra pregunta que plantea el presente trabajo es ¿El fragmento Hc-TeTx es capaz de
mejorar las conductas motoras en rata con lesión unilateral de 6-OHDA? y si así fuese, ¿El
mecanismo por el cual ejerce su efecto es por la activación de NFκB? un factor que puede
tener un papel importante en el proceso de apoptosis que sucede en la neurodegeneración de
la EP (Hunot et al., 1997).
39
Los efectos protectores y sobre la señalización del fragmento Hc-TeTx han sido
analizados por el Dr. Aguilera, por activar PI3K
proteínas MAPK, además de que el
fragmento induce la fosforilación de los receptores Trk. Incluso se ha sugerido que el empleo
de factores de crecimiento como el BDNF (factor de crecimiento derivado del cerebro) son
alternativas farmacológicas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como EP,
por lo que este fragmento tendría un efecto muy similar (Mufson et al., 1999). Así también el
Hc-TeTx induce la inhibición de la caspasa 3, como un efecto antiapoptótico que inducen la
sobrevivencia cuando las células son sometidas a condiciones de estrés. Por lo que creemos
que es por estas vías que ejerce su acción en las células dopaminérgicas. Para obtener
evidencias sobre el papel de este fragmento Hc-TeTx sobre los procesos de daño por 6OHDA, evaluamos el factor de transcripción NFκB. La aplicación de 6-OHDA ha mostrado
inducir la traslocación de NFκB y la activación de sus vías de señalización (Luo et al., 1999;
Park et al., 2004); siendo esta activación mediada por la presencia de ROS. Debido a ello se
ha sugerido que este incremento en la actividad de NFκB tiene un efecto sobre los procesos
de apoptosis de prevenir la muerte por 6-OHDA en células PC12 (Lee et al., 2001). Cuando
se evaluó la presencia de p65 en corteza frontal de los grupos control, Hc-TeTx, 6-OHDA y
Hc-TeTx,
encontramos que en el extracto citoplásmico y nucleares no había cambios
significativos, sin embargo el comportamiento en los animales era variable pero con la misma
tendencia de incrementar la actividad de NFkB en el extracto nuclear del grupo 6-OHDA,
como respuesta a las alteraciones celulares que induce esta toxina y en el grupo Hc-TeTx/6OHDA podemos observar la tendencia a bajar la presencia del factor NFkB. En el núcleo
estriado, de nuestros grupos experimentales permitía ver con mayor claridad el efecto tanto
de 6-OHDA como del fragmento Hc sobre la activación de p65. Así el fragmento Hc-TeTx
produjo una alta activación de NFκB. En el grupo 6-OHDA se incremento en gran medida la
presencia de 6-OHDA y finalmente los niveles de p65 en el grupo Hc-TeTx/6-OHDA
disminuyen nuevamente. Si bien, no es posible dar un mecanismo certero del porque se
revierten los niveles de p65, al administrar el fragmento Hc previo a la 6-OHDA, sabemos
que 6-OHDA es capaz de inducir la activación de NFκB, para rescatar a las células del
deterioro que induce la neurotoxina, ya que se ha encontrado que la inhibición de la
activación de NFkB, genera mayor muerte celular (Park et al., 2004). Por lo que se sugiere
que este factor de transcripción pueda tener un papel antiapoptótico, lo que indicaría que los
40
grupos con Hc-TeTx/6-OHDA presenten un cambio sobre los niveles de p65, hacia el
decremento.
Por otra parte el fragmento Hc-TeTx, por sí solo induce incremento de p65 esto
probablemente se debe a su actividad sobre receptores Trk o por las vías Akt, una proteína
cinasa B, vías que activan los factores de crecimiento que llevan a la activación de este factor
de transcripción, sin embargo se sugiere que este efecto se encuentra en otro contexto como
lo haría por ejemplo el NGF, quien también activan las vías MAPK’s.
Sugerimos que puedan ser algunas vías por las cuales se activa este factor de
transcripción, sin embargo es amplia la variedad de proteínas implicadas en la sobrevivencia
celular, después de la administración de 6-OHDA. Por lo que continuaremos nuestro estudio
sobre el efecto del fragmento Hc-TeTx tanto a nivel bioquímico como conductual.
XIV. CONCLUSIONES
1. El fragmento Hc-TeTx decremento el giro ipsilateral a diferentes dosis (2, 10, 20 y 50
μM) en el modelo de lesión unilateral con 6-OHDA.
2. El fragmento Hc-TeTx no altero la actividad motora en campo en el modelo de lesión
unilateral con 6-OHDA, ligeramente incrementa a la dosis de 10 μM.
3.
El grupo Hc-TeTx/6-OHDA presentó un decremento de NFkB en estriado, sin
cambio de este factor de trascripción en la corteza frontal.
41
XV. TÉCNICAS PARA LA DETERMINACION DE NFκB
15. 1 PROTOCOLO DE OBTENCIÓN DE EXTRACTOS NUCLEARES
1) Empastillar las células por centrifugación a 4°C por 3 min a 13,000 rpm, o bien por 5
min. si las muestras fueron previamente congeladas.
2) Retirar el sobrenadante.
3) Agregar 400 μL de solución amortiguadora, a cada muestra.
4) Homogenizar, subiendo y bajando con punta, por lo menos 10 veces o hasta que la
mezcla este completamente homogénea.
5) Incubar 20 min tomando de referencia el momento en que se le agregue el solución A
a la primera muestra.
6) Agregar 25 de NP-40 al 10% y agitar en vortex 12 seg. si es tejido, o bien 10 seg. si son
células en cultivo. Este paso es importante para romper completamente la membrana
citoplasmática.
7) Centrifugar 1 min a 10,000 rpm a 4°C. Tomar el tiempo hasta que e alcancen las
10,000 rpm.
8) Retirar el sobrenadante con la trampa de vacío.
9) Agregar de 50 a 100 μL de solución C, dependiendo del tamaño de la pastilla de
núcleos.
10) Vortexear
11) Homogenizar en el vortex de 20 a 30 min en el cuarto frío.
12) Centrifugar 5 min a 9,000 rpm a 4°C.
13) Recuperar el sobrenadante
14) Hacer alícuotas de los extractos
15) Almacenar a -70°C.
42
ANEXO 1
Solución A
1mL (µL)
2mL (µL)
3mL (µL)
4mL (µL)
5 mL (µL)
HEPES 1M pH 7.9
10
20
30
40
50
KCl 1M
10
20
30
40
50
EDTA 50 mM
2
4
6
8
10
EGTA 10 mM
10
20
30
40
50
DTT 100 mM
10
20
30
40
50
PMSF 100 mM
10
20
30
40
50
Apro
1
2
3
4
5
Leup
1
2
3
4
5
H2O
946
1892
2838
3784
4730
100µL (µL)
200µL
300µL
400µL
500µL
(µL)
(µL)
(µL)
(µL)
Solución C
HEPES 1M pH 7.9
2
4
6
8
10
NaCl 4M
10
20
30
40
50
EDTA 50 mM
0.2
0.4
0.6
0.8
1
EGTA 10 mM
1
2
3
4
5
DTT 100 mM
1
2
3
4
5
PMSF 100 mM
1
2
3
4
5
Apro
0.5
0.5
0.5
0.5
1
Leup
0.5
0.5
0.5
0.5
1
H2O
83.8
168.6
253.4
338.2
422
43
15.2 PROTOCOLO PARA LA CUANTIFICACION DE PROTEINAS
POR EL METODO DE BRADFORD
Metodo de Bradford (Bradford 1976)
1) Realizar una curva estándar de calibración preparando soluciones de
γ-globulina a concentraciones conocidas de 0,1, 3, 6 y 12 μg/μL en un volumen final de 80
μL complementando con agua.
[Proteína]
Agua
γ-globulina
Vol. final
0 µg/µL
80 µL
0 µL
80 µL
1 µg/µL
76 µL
4 µL
80 µL
2 µg/µL
72 µL
8 µL
80 µL
3 µg/µL
68 µL
12 µL
80 µL
6 µg/µL
56 µL
24 µL
80 µL
12 µg/µL
32 µL
48 µL
80 µL
2) Tomar 20 μL de cada solución y colocarlos en los pozos de la placa de ELISA, por
duplicado. Agregar a cada una 180 μL de reactivo de Bradford 1X (Del stock hacer una
dilución 1:5).
3) Incubar 5 min (La estabilidad de la reacción es de 30 a 120 min.).
4) Encender el lector de placas de ELISA.
5) Programar el lector con un filtro de 630 nm y 30 seg. de agitación
6) Con los datos obtenidos se grafican las concentraciones (eje X) contra el promedio de las
absorbancias (eje Y) obtenidas para la misma muestra. El coeficiente de correlación
obtenido de la regresión lineal de la grafica deberá ser mayor o igual a 0.95
7) Obtener la ecuación de la recta.
8) Al trabajar con muestras de las que se desconoce su concentración de proteínas, se hace
una dilución de esta equivalente a 1μg/μL de γ-globulina (76 μL de agua + 4 μL de la
muestra). Estas se deben correr al mismo tiempo que se corre la curva estándar y con los
mismos parámetros.
9) Para saber la concentración de proteína de las muestras, solo basta con interpolar los
valores de la gráfica de la curva de calibración. Esto es posible despejando a ”X” de la
ecuación de la recta y tomando a “Y” como los valores promedio de las absorbancias
44
obtenidas. El volumen a tomar de muestra es el mismo que el que se toma para 1 μg/ μL
de γ-globulina.
15.3 INMUNODETECCIÓN EN FASE SÓLIDA, WESTERN BLOT
1) Preparar Gel de Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 10%.
2) Dejar melificar
3) Preparar gel concentrador Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 5%.
4) Preparar muestras a 100 μg/en 45 μL (las muestras deben ser preparadas previamente)
Las muestras son puestas en baño María y se pasan a la centrifuga unos segundos)
5) Agregar marcador al gel.
6) Teniendo las muestras cargadas en el gel correr dos horas a 100 voltz.
7) Finalizada la corrida del gel, se preparan las muestras para la transferencia.
Para transferir se utilizan casetes de transferencia, esponjas, filtros, membrana de
nitrocelulosa, buffer de transferencia 1X.
Nota: evitar burbujas entre las esponjas, filtros y la membrana.
8) Se transfiere en una cámara, con buffer de transferencia 1X a 100 mA por 3 hrs, a 4 °C.
9) Al terminar la transferencia, se saca la membrana y se verifica la transferencia con rojo de
Ponceau.
10) El gel se pone con azul de coomassie, y se agita durante 2 a 3 hrs.
11) La membrana se enjuaga 2 min con PBS para desteñir, hasta que quede sin coloración.
12) Se bloquea la membrana con TBS/tween leche libre de grasa 5%, por 1 hr con agitación.
13) Enjuaga el exceso de leche.
14) Pone el Anticuerpo primario p65 1:500 (NFκB) y se deja por 12 hrs.
15) La membrana nuevamente es enjuagada con TBS/Tween
16) Realizar 6 ciclos de agitado de 10 min con TBS/Tween leche al 1%.
17) Al terminar se enjuaga la membrana con TBS/Tween.
18) Ponerle el anticuerpo secundario anti-rabbit 1:4000. por 1 hora.
19) Realizar 6 ciclos de agitado de 10 min con TBS/Tween leche 1%, frío.
20) Preparar para revelar la membrana.
Agregar solución luminol 300 μL
45
21) Revelar con una exposición de 5 min en placa fotográfica. Usando revelador y fijador.
22) Cuantificar la densitometría de las bandas en placa.
Gel de Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 10%
Soluciones 10%
5 ml
10ml
15ml
20ml
H2O
1.9
4.0
5.9
7.9
Acrilamida al 30%
1.7
3.3
5.0
6.7
Tris 1.5 M (pH 8.8)
1.3
2.5
3.8
5.0
SDS 10%
0.05
0.1
0.15
0.2
Persulfato de amonio 10%
0.05
0.1
0.15
0.2
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
Gel concentrador Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 5%
Soluciones 5%
1 ml (ml)
2ml (ml)
3ml (ml)
4ml (ml)
H2O
0.68
1.4
2.1
2.7
Acrilamida al 30%
1.7
0.33
0.5
0.67
Tris 1.5 M (pH 6.8)
0.13
0.25
0.38
0.5
SDS 10%
0.01
0.02
0.03
0.04
Persulfato de amonio 10%
0.01
0.02
0.03
0.04
TEMED
0.001
0.002
0.003
0.004
46
XVI. APENDICE
16.1 SUSTANCIAS
6-Hidroxidopamina (4mg en 500μl de ácido ascórbico 0.1%, SIGMA)
Fracción Hc de la toxina tetánica fracción sintetizada y donada por el Dr. José Aguilera,
del Instituto de Neurociencias, Universidad de Autónoma de Barcelona, España).
Anti-NFκB, p65 rabbit sc.372 , el cual fue obtenido de la casa comercial Santa Cruz,
Biotechnology MR
Anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante, el cual fue obtenido de la casa
comercial Amershan Pharmacia BiotechMR
16.2 REACTIVOS
HEPES 1M pH 7.9 (N-[2-Hidroxietil]piperazin-N´-2-etanosulfato)
KCl 1M (MERK)
EDTA 50 mM (Ac. Etilendiamintetraacetato, SIGMA)
EGTA 10 mM (Etilenglicol-bis( -aminoetileter)N, N`tetra acetato, SIGMA)
DTT 100 mM (Dithiotreitol, SIGMA)
PMSF 100 mM (Fenilmetilsulfonil fluoruro, SIGMA)
Aprotinina (ROCHE)
Leupeptina (BOEHRINER MANHEIM)
Tris Base (RESEARCH ORGANIC)
NP-40 al 10% (Nonidet, SIGMA)
Reactivo de Bradford (Protein Assay, BIO RAD)
Albumina serica bovina (INVITROGEN)
Archilamida (SIGMA)
Bisacrilamida (SIGMA)
Glicina (JB BAKER)
SDS (BIO RAD)
HCl (JT BAKER)
Metanol (JT BAKER)
KCl (MERK)
KH2PO4 (BAKER ANALYTIC)
47
Na2HPO4 (BAKER ANALYTIC)
NaCl (JT BAKER)
Acido acético (JT BAKER)
Luminol (Sensitive Western Blot detection system)
APS 10% (Persulfato de amonio, FERMONT)
TEMED (BAKER)
Leche light (SVELTY)
Azul de coomassie (Azul brillante, SIGMA)
Revelador (KODAK)
Fijador (KODAK)
Ácido clorhídrico (FERMONT)
Solución de Ponceau (SIGMA)
Tween 20 (RESEARCH ORGANICS)
16.3 FÁRMACOS
Hidrato de Cloral como anestésico.
Antibiótico (penicilina G benzatínica, 1´20000 UI).
Metanfetamina (SIGMA)
15.4 MATERIAL
Papel parafilm (FISHER)
Aparato estereotáxico para roedores (STOELTING),
Moto-tool
Compuradora Acer Pentium IV
Material quirúrgico para disección
Rasuradora
Placa para Elisa
Membranas para transferencia (Western Blot)
Placas fotográficas (KODAK)
Pipetas semiautomáticas 5-50, 200, 100-1000 μl (BRAND)
Ependorfs 1500 y 500 μl (CORNING)
48
Tubos de 50 y 15 ml (CORNING)
Centrífuga refrigerada (para muestras de suero o plasma, HERAEUS)
Vortex (Thermolyne)
Cajas de actividad motora de campo cerrado.
Videograbadora (Sharp).
Cámara fotográfica KODAK
Programa (placas)
Voltímetro o fuente (BIO RAD)
Vidrios para gel (1.5mm)
Peines (Bio Rad)
Cámaras (BIO RAD)
Membranas (BIO RAD)
Casete (X-omatic KODAK)
49
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