BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICAS AREA: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR “EFECTOS DE LA FRACCIÓN Hc DE LA TOXINA TETANICA SOBRE LAS CONDUCTAS MOTORAS Y NFκB EN RATA LESIONADA CON 6-OHDA” TESIS PARA OBTENER EL GRADO EN MAESTRIA EN CIENCIAS QUÍMICAS AREA: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PRESENTA: Q. F. LILIANA MARTINEZ MENDIETA DIRECTORES DE TESIS: cDr. ILHUICAMINA DANIEL LIMÓN PÉREZ DE LEON FCQ-BUAP Dr. ARTURO ORTEGA SOTO Depto. Genética y Biología Molecular Centro de investigación y Estudios Avanzados Campus Zacatenco Octubre, 2006 INDICE I. INTRODUCCION Pág. 4 1.1 Enfermedad de Parkinson………………………………………………. 4 1.2 Neurodegeneración en la Enfermedad de Parkinson y el estrés 6 oxidativo……………………………………………………………………… 1.3 La apoptosis en la degeneración de las neuronas dopaminérgicas…… 7 1.4 El uso de la 6-hidroxidopamina en el estudio de la EP…………….. 7 1.5 Estrés oxidativo causado por 6-OHDA ….………………………..... 8 1.6 Apoptosis inducida por 6-OHDA……………………………………… 9 1.7 El factor nuclear k B (NFκB)…………………………………………… 10 1.8 El uso de la L-Dopa en el tratamiento de la EP……………………… 12 1.9 La toxina tetánica como una estrategia terapéutica en la EP…………. 13 1.10 El fragmento C-terminal de toxina tetánica..................................... 14 1.11 Actividad del fragmento Hc-TeTx sobre SNC……………………….. 16 II. JUSTIFICACION…………………………………………………………….. 21 III. HIPÓTESIS……………………………………………………………………. 22 IV. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………… 22 V. OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………………….. 22 VI. METODOLOGIA…………………………………………………………… 23 VII. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ………………………………….. 24 VIII. METODOS…………………………………………………………………. 24 IX. PROCEDIMIENTO…………………………………………………………… 25 X. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS……………………. 27 XI. RESULTADOS……………………………………………………………… 29 12.1 Administración Local ………………………………………………… 29 12.2 Asimetría motora………………………………………………………. 29 12.3 Actividad motora en campo cerrado………………………………….. 33 12.4 Determinación de NFkB………………………………………………. 35 2 XIII. DISCUSIÓN………………………………………………………………… 38 XIV. CONCLUSIONES………………………………………………………….. 41 XV. TECNICAS PARA LA DETERMINACION DE NFκB………………… 42 15.1 Protocolo para la extracción de extractos nucleares……………….. 42 15.2 Protocolo para la cuantificación de proteínas por el método de 44 Bradford……………………………………………………………………… 15.3 Inmunodetección en fase sólida, western blot………………………... XVI. APENDICE I……………………………………………………………….. 45 47 16.1 Sustancias………………………………………………………………. 47 16.2 Reactivos……………………………………………………………….. 47 16.3 Fármacos……………………………………………………………….. 48 16.4 Material…………………………………………………………………. 48 XVII. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………… 50 3 I. INTRODUCCION 1.1 Enfermedad de Parkinson En 1817, James Parkinson describió por primera vez la Enfermedad de Parkinson (EP) con el nombre de Parálisis agitante (Parkinson 1817). Fue hasta 1960 que Oleh Hornykiewicz, encontró una pérdida severa de dopamina (DA) en núcleo caudado y putamen en los cerebros de pacientes con EP (Ehringer and Hornykiewicz, 1960). Actualmente, se considera que es una enfermedad neurodegenerativa asociada a lesiones neuropatológicas específicas, siendo la principal de éstas la pérdida de neuronas DAérgicas en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) y del estriado (Jellinger 1987). En esta patología aparecen inclusiones intracelulares llamadas cuerpos de Lewy (Gibb y Lees 1989). Los síntomas característicos de la EP son: el temblor, la rigidez muscular, la dificultad para iniciar la marcha, la pérdida de los reflejos posturales y la bradicinesia, entre otros (Fig 1). a b c Figura 1. Paciente con enfermedad de Parkinson. a) Parkinsonismo severo con alteraciones en la marcha y discapacidad postural, en estado no ambulatorio. b) Característica de mascara facial (sin expresión) con disminución parpadeo. c) Apraxia del parpado (Tomado de Gálvez-Jiménez, 2005). El diagnóstico se confirma cuando se realiza un análisis histopatológico post-mortem. De acuerdo a los síntomas presentados en los enfermos con EP, se han definido cinco estadios evolutivos, Tabla 1 (Hoehn y Yahr, 1967). 4 Tabla 1. Clasificación de los cinco estadios evolutivos de la EP ESTADIO SINTOMAS Estadio I Síntomas unilaterales Estadio II Síntomas bilaterales, generalmente asimétricos, sin alteraciones del equilibrio postural Alteraciones del equilibrio postural, aunque el paciente sigue siendo independiente. Estadio III Estadio IV Estadio V El paciente requiere ayuda para las tareas diarias, aunque aun puede mantenerse en pie con ayuda de otros. El paciente es totalmente dependiente y se puede encontrar en silla de ruedas o en cama. La ocurrencia de esta enfermedad incrementa con la edad y se considera que afecta a más del 2 % de la población mayor de 65 años. Algunos reportes indican que la media es de 60 años, con una duración promedio de 13 años (Hughes et al., 1992, Lang y Lozano 1998). Aunque menos frecuente, se ha encontrado que puede aparecer a los 40 años (Golbe, 1991). La etiología de la EP es principalmente de tipo idiopática, sin embargo se ha asociado a factores ambientales y genéticos que podrían contribuir al desarrollo de la enfermedad. El descubrimiento en decada de los 80’s de la toxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) un compuesto que produce una muerte selectiva de neuronas de la SNpc en humanos originaba los síntomas de la EP y también en modelos experimentales. Esto apoyó la hipótesis ambiental (Gerlach and Riederer, 1996) además, se ha encontrado en cerebros de pacientes parkinsonianos postmortem, altas concentraciones de compuestos como organoclorinas, dieldrin y difenil policlorinatos contenidos en pesticidas que apoyan la misma hipótesis (Song et al., 2000). Otra hipótesis del origen de la enfermedad es la presencia del estrés oxidativo que lleva al incremento de la producción de radicales libres (RL) provenientes de diversas vías metabólicas y al exceder la producción de estos contribuyen al proceso neurodegenerativo (Olanow y Cohen, 1992; Zhang et al., 2000). También se ha propuesto que el origen menos frecuente es el genético, sólo aproximadamente el 10% de los casos se presentan por esta causa (Calne, 1999); algunos estudios post-mortem dado evidencias de que mutaciones en proteínas α-sinucleina, un 5 componente de los cuerpos de Lewy y la mutación del gen parkina ubicado en el 6q25.2-q27 pueden generar esta enfermedad. 1.2 Neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson y el estrés oxidativo Existe un gran interés por comprender el proceso neurodegenerativo de la EP, por lo que hasta el momento se le ha abribuído al estrés oxidativo, debido a que las neuronas de la SNpc por su contenido de neuromelanina son altamente vulnerables a las especies reactivas de oxígeno (ROS) (Hirsch et al., 1988; Hirsch et al., 1997; Uhl, 1998). También el metabolismo enzimático de la DA induce la formación de peróxido de hidrógeno por la actividad de la monoamino oxidasa (MAO) y la auto-oxidación que potencía la formación de radicales hidroxilo (Fahn y Cohen, 1992). También se ha encontrado que las neuronas se hacen más vulnerables debido a la disminución en la síntesis de glutatión peroxidasa (Damier et al., 1993). Los dos principales fenómenos bioquímicos que permiten el incremento de ROS y que participan en el proceso neurodegenerativo en la SNpc son: el incremento en los niveles de hierro y la disminución en los mecanismos de defensa antioxidantes, como la catalasa, glutatión reducido entre otras (Tabla 2). Tabla 2. El estrés oxidativo en la enfermedad de Parkinson Factores de La generación de H2O2 por la MAO REFERENCIAS vulnerabilidad al estrés en SNpc de cerebros normal La auto-oxidación de DA induce la formación de ROS La formación de neuromelanina Incremento de los niveles de hierro Factores de Disminución de los niveles de glutatión GSH Disminución de los niveles de GSH-peroxidasa (Blum et al., 2001a) (Dexter et al., 1989; Hirsch et al., 1991; Good et al., 1992) (Sofic et al., 1992) (Damier et al., 1993) vulnerabilidad al Disminución de los niveles de catalasa (Ambani et al., 1975) estrés en SNpc de Incremento de los ácidos grasos poli-insaturados e Incremento del ácido tiobarbitúrico Incremento de ROS en las células gliales de la SNpc Incremento de la expresión de la síntasa inducible del NO (iNOS), Incremento de los niveles de óxido nítrico y la generación de peroxinitrito. (Fahn 1992) pacientes parkinsonianos y Cohen, (McGeer et al., 1988) (Hunot et al., 1996). 6 El daño en las mitocondrias contribuye a la pérdida de neuronas de la SNpc, una de las principales alteraciones mitocondriales es la del complejo I mitocondrial (nicotinamida adenina dinucleótido coenzima Q reductasa) de la cadena respiratoria mitocondrial produciendo la muerte celular. En pacientes con EP hay una disminución en la actividad e inmunoreactividad a la forma reducida del complejo I en SNpc (Mizuno et al., 1989; Hattori et al., 1991, Beal et al., 1996). 1.3 Apoptosis en las neuronas dopaminérgicas En la EP el efecto del estrés oxidativo, así como el decremento en los antioxidantes y las alteraciones mitocondriales dan como resultado la inducción de la apoptosis de las células afectadas. Recientemente, se ha propuesto que una disminución en el potencial de membrana mitocondrial podría llevar a la muerte celular por apoptosis (Jacotot et al., 1999). Estudios realizados por Mochizuki et al., 1996 dieron evidencias de la fragmentación del DNA, característica de la apoptosis en la sustancia nigra de pacientes con EP. Los estudios sobre apoptosis han mostrado que alrededor del 6% de las neuronas ricas en mielina muestran los signos característicos de apoptosis, como son condensación de cromatina, disminución del tamaño celular, enrollamiento de la envoltura nuclear y la presencia de cuerpos apoptóticos (Tompkins et al., 1997; Kingsbury et al., 1998; Tatton et al., 1998). 1.4 El uso de la 6-hidroxidopamina en el estudio de la enfermedad de Parkinson Entre los modelos para estudiar la fisiopatología de la EP está la administración de 6hidroxidopamina (6-OHDA). La selectividad de esta neurotoxina hacia las neuronas catecolaminérgicas es atribuida a que la toxina puede ser capturada por el transportador catecolaminérgico (DAT) presente en las terminales dopaminérgicas. Esta toxina incluso puede formarse a partir de DA por una hidroxilación no enzimática en presencia de Fe2+ y H2O2 (Wang et al., 2004). En la rata la 6-OHDA es inyectada en el núcleo estriado, la substancia nigra o fibras ascendentes del cerebro medio produce denervación de las neuronas nigrales DAnérgicas con lo que disminuye los niveles de DA en este núcleo. Estos cambios reproducen las características fisiopatológicas similares a los daños en el sistema motor de la EP. In vivo ha sido muy utilizada por dar el estado acinético y los efectos discinéticos por el 7 tratamiento farmacológico, y ha sido una herramienta valiosa para evaluar la fisiopatología de la denervación DAnérgica y también en la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad (Kostrzewa & Jocobowitz, 1974; Kumar et al., 1995). La administración unilateral de 6-OHDA en la SNc de rata permite evaluar la asimetría motora o conducta de giro (una conducta motora cuantificable) por la administración sistémica de un agonista dopaminérgico, L-Dopa o fármacos que produzcan la liberación de DA (Hefti et al., 1980). Esta prueba refleja la lesión doparminérgica en SNpc y estriado asociado con una pérdida neuronal de aprox. 90% y e incluso es útil en la evaluación de diversos tratamientos (Ungerstedt, 1968). En los últimos años han surgido otros modelos conductuales donde se emplean ratas y que permiten evaluar diversas conductas que reflejan los estados discinéticos, como la evaluación del giro contralateral, el movimiento orolingual, el giro axial y de los miembros superiores después de la administración de L-Dopa (Lunblad et al., 2002). 1.5 El estrés oxidativo causado por 6-hidroxidopamina La inyección de 6-OHDA en las vías nigroestriatales produce una degeneración de estas neuronas vía producción de peróxido de hidrógeno e hidroxiradicales (Heikkila y Cohen, 1971). Varios estudios han propuesto que induce estrés oxidativo in vivo (Lotharius et al., 1999) como la generación ROS y la disiminución de estos por acción de la enzima superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa, sin embargo cuando el estrés oxidativo lleva hacia el daño celular, en esas circunstancias no es suficiente la actividad de las enzimas antioxidantes e incluso la presencia de hierro contribuye a la generación de ROS. Cuando el estrés oxidativo se incrementa se presentan diferentes alteraciones celulares como peroxidación de los lípidos de membrana, alteraciones en el potencial de membrana mitocondrial, así como alteraciones en funciones mitocondriales entre estas se altera la cadena respiratoria mitocondrial, desorganización del citoesqueleto, daños en la recaptura de glucosa y del ácido α-aminoisobutírico, también se pueden generar alteraciones en el DNA como la fragmentación y mutaciones. 8 Tabla 3. La 6-OHDA incrementa el estrés oxidativo en el sistema catecolaminérgico Estrés oxidativo por 6-OHDA Disminución de la muerte celular cuando aumenta la actividad de la (Asanuma enzima SOD y glutatión peroxidasa. Bensadoun et al., 1998) Incrementa el peróxido de hidrógeno vía MAO (Karoum et al., 1993) Genera ROS: radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno por un (Seitz et al., 2000; Soto-Otero proceso no enzimático de auto-oxidación, radical superóxido et al., 2000) Genera quinonas (Graham et al., 1978; Hastings et al., 1998; y Zigmond 1994) Incrementa los niveles de hierro en ganglios basales (Wang et al., 2004) Causa peroxidación de lípidos, decremento de los niveles de (Kumar et al., 1995) fosfolípidos, aumento de malonildialdehido. Alteraciones del potencial de membrana mitocondrial por ROS (Lotharius et al., 1999) Daña las funciones mitocondriales por diversos mecanismos, altera (Glinka et al., 1996 y 1998) la cadena respiratoria mitocondrial: principalmente inhibe el complejo mitocondrial I Por incremento Mutaciones, de ROS Desorganización genera: Fragmentación del DNA, del citoesqueleto, daños en la (Gee et al., 1992; Davison et al., 1986) recaptura de glucosa y recaptura del ácido-α-aminoisobutírico. 1.6 Apoptosis inducida por 6-OHDA En 1994 Walkinshaw y Waters propusieron que la 6-OHDA tiene efectos proapoptóticos. En cultivo de células PC12 produce los signos apoptóticos: condensación de cromatina, disminución del tamaño celular, enrollamiento de la envoltura nuclear y aumento del volumen de la membrana. (Lotharius et al., 1999; Woodgate et al., 1999; Mayo et al., 1998). La 6-OHDA es capaz de inducir apoptosis en neuronas DAminérgicas y necrosis (Marti et al., 1997; Burke y Kholodilov, 1998). La administración de 6-OHDA produce un incremento de la inmunoreactividad a p53 en la sustancia nigra de ratas (Qin et al., 1997). Otros estudios in vitro han mostrado que la caspasa 3, un factor decisivo en la muerte neuronal, que se activa con esta neurotoxina (Ochu et al., 1998). La DA en condiciones patológicas, como isquemia o hipoxia puede incrementar sus niveles intra- y extra-celulares para producir muerte neuronal. La auto-oxidación permite la 9 formación de 6-OHDA y neuromelanina (Slivka and Cohen, 1985; Jellinger et al., 1995). Experimentos in vitro han mostrado que la DA puede ser neurotóxica (Graham et al., 1978; Michel y Hefti, 1990), así como in vivo (Filoux y Townsend, 1993), y por la auto-oxidación de y produce radicales, compuestos como quinonas y melanina que son tóxicos para las células (Offen et al., 1996). El incremento de la producción de DA induce también un incremento en la liberación de ácido glutámico (Glu), un neurotransmisor que a altas concentraciones es excitotóxico (Choi, 1990). Algunos estudios han mostrado que la DA incrementa los niveles intracelulares de oxido nítrico (NO) induciendo la muerte neuronal (Jones et al., 2000). Esto sugiere que en determinadas condiciones los incrementos en los niveles de DA pueden aumentar el proceso neurodegenerativo. Incluso se sabe que existe una activación del factor de transcripción k B (NFkB) involucrado en la regulación de la muerte célular después de la administración de 6-OHDA (Blum et al., 2001b; Lee et al., 2001). 1.7 Factor nuclear k B( NFκB) Debido a la gran actividad de las vías metabólicas que generan radicales libres y ROS que participan como señal de las vías de transducción que medían la apoptosis, recientemente se ha investigado al factor de trascripción NFκB. El factor NFκB se ha implicado en diferentes procesos como inflamación, crecimiento y el desarrollo incluso juega un papel importante en la regulación de la apoptosis tanto en neuronas como en células no neuronales (Mattson et al., 2000; Ben-Nerian 2000). Este factor de transcripción existe en citoplasma en su forma inactiva y es translocado al núcleo cuando es activado. El NFκB es un heterodímero formado por dos péptidos; p50 (50 KDa) y p65 (65 KDa) y se encuentra unido a por la proteína Iκ-B, la cual lo mantiene inactivo en el citoplasma. La activación de NFκB implica su disociación de la Iκ-B y su posterior traslocación como heterodímero (p50-p65) hacia el núcleo, donde se enlaza a una secuencia de DNA e incrementa la expresión de genes (Fig. 1). En el SNC, el NFκB se encontró tanto en células gliales como en neuronas. Este factor de transcripción se activa como respuesta a estímulos neurotóxicos como es la liberación de glutamato (O’Neil y Kaltschmidt et al., 1997). La liberación de glutamato implica la activación tanto del receptor N-metil D-aspartato (NMDA) como α-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propionato 10 (AMPA), pudiendo tener un efecto de neuroprotección, sin embargo esto todavía no es claro. En diversos modelos experimentales se ha sugerido que el incremento en los niveles de NFkB, es consecuencia de un daño neuronal y que la acción de este factor pudiese ser antiapoptótica. NFκB forma parte de una vía de transducción dependiente de PKC, se sabe que puede actuar como inhibidor de la apoptosis, siendo capaz de bloquear la activación de la caspasa 8 a través de la regulación de ciertos genes que codifican para IAP’s (factores inhibidores de la apoptosis y para TRAFF1/2 (factor asociado al receptor TNF conocido como factor de necrosis tumoral, es una proteína adaptadora con dominios de muerte DD), por lo que inhibe la liberación del citocromo c mitocondrial, induciendo la expresión de genes antiapoptoticos de la familia Bcl-2 (proto-oncogen Bcl-2), (Park y Levit 1993; Wang 1999). También puede inducir la transcripción de genes de la cadena respiratoria inflamatoria como citoquinas y receptores de citoquinas (Philpott et al., 2000) y recientemente se propuso que induce la activación pro-apoptotica a tra es de genes inductores de la apoptosis (Lin et al., 1999, Israel et al., 2000). En pacientes parkinsonianos se ha encontrado un alto número de neuronas DA pigmentadas en núcleo, con NFκB activo y se propone que tiene un papel importante el la degeneración de la EP (SNpc y VTA). Durante el proceso de apoptosis existe un incremento de ROS y NFκB. El uso del antioxidante N-acetil-cisteína inhibe la producción de ROS y protege a las neuronas de la muerte vía NFκB por lo que se sugiere que el papel de este factor de transcripción en la EP es prevenir la muerte celular (Hunot et al., 1997). Otros estudios proponen que la activación de NFκB durante la apoptosis por la auto-oxidación de DA, contrarresta el proceso apoptótico (Lee et al., 2001). 11 NFkB p50 p50 p65 p50 p65 p65 Proteasoma kinasa IkB p50 p65 Sitio-κB Especies reactivas de oxigeno? Ceramida? p50 Otros? RelA IκB ESTIMULO INDUCCION DE GENES EFECTO ANTIAPOPTOTICO 1 Neurotrofinas (NGF) 1 Neurotransmisores (glutamato) 1 Stress oxidativo Tomado de: (O’Neil y Kaltschmidt 1997;Hu et al., 1999) Fig. 1. Activación de NFkB por estrés oxidativo, neurotrofinas, entre otros. La activación de este factor de transcripción se induce después de la fosforilación de IkB y su posterior degradación, permitiendo al heterodimero p50-p65 traslocarse hacia el núcleo e para inducir la expresión de varios genes. 1.8 El uso de L-Dopa en el tratamiento de la EP El principal fármaco en el tratamiento de la EP es L-3,4-dihidroxifenilalanina (LDopa) un precursor de la DA que logra sustituir la DA en el estriado de pacientes parkinsonianos (Cotizas 1969, Hornykiewicz 2002). La L-Dopa mejora las funciones motoras, lo que lo hace altamente eficaz. A pesar de que este fármaco logra restablecer las funciones motoras, sin embargo la aparición del fenómeno de “desgaste” se presenta posteriormente, y se requiere incrementar la dosis y la frecuencia de administración para obtener los mismos beneficios del fármaco, dicho evento se le conoce como “wearing off”. El estado del paciente se complica por el desarrollo de discinesias o movimientos involuntarios excesivos y anormales. Las discinesias ocurren en un 80% de los pacientes que reciben largas terapias de L-dopa. Así el 50% de los pacientes presentan fluctuaciones motoras como discinesias después de 5 años de tratamiento con L-Dopa (Chase, 1990; Marsden, 1994). En las etapas tardías de la enfermedad, los pacientes pueden fluctuar con rapidez entre estar “apagados”, y estar “encendidos” pero con discinesias incapacitantes, situación que se 12 ha denominado fenómeno “on-off” (Marsden y Parkes 1977; Luquin et al., 1992; Marconi et al., 1994). La prevalencia de las fluctuaciones motoras y de las discinesias incrementa con la duración y la severidad de la enfermedad así como con la duración del tratamiento con LDopa (Obeso 2000). La forma mas común de discinecias consiste en una combinación de distonía (espasmo muscular breve o sostenido, a menudo con movimientos anormales lentos) y movimientos coreicos (movimientos involuntarios, irregulares, sin objetivo, arrítmicos, bruscos, rápidos, no sostenidos, que fluyen de una parte del cuerpo a otra). Las discinecias aparecen cuando las concentraciones de L-Dopa son altas en plasma, incluso pueden aparecer cuando los niveles del fármaco son bajos. Hasta el momento la L-Dopa es la herramienta farmacológica más poderosa y más empleada, sin embargo los problemas motores aparecen por el uso crónico. Esto conduce a la búsqueda de otras alternativas farmacológicas con el fin de disminuir las dosis de L-Dopa, y disminuir las alteraciones motoras lo que mejoraría la calidad de vida de los pacientes. 1.9 La toxina tetánica como una estrategia terapéutica en la EP La toxina tetánica (TeTx) es producida por el bacilo Clostridium tetani, en condiciones anaeróbicas. Pertenece a la familia de las neurotoxinas clostridiales (NTC), son consideradas como holoproteínas, ejemplos de ellas son la toxina botulínica y la tetánica. Aunque todas las NTC comparten el mismo origen y tienen estructuras moleculares muy similares e incluso mecanismos de acción a nivel molecular semejantes, las enfermedades que inducen tienen diferencias importantes. La toxina tetánica induce tétanos, caracterizada por una contractura muscular y espasmos recurrentes, e induce la muerte por colapso respiratorio y asfixia. Los síntomas son contrarios en el botulismo debido a que se presenta una parálisis flácida generalizada. Actualmente se conoce que las NTC son metaloproteasas que actúan en las terminaciones nerviosas. Las proteínas sobre las que actúan se conocen como el complejo SNARE (complejo soluble de unión al receptor proteíco), está conformado por SNAP-25 (proteína asociada al sinpatosoma de 25 kDa), sinaptobrevina o VAMP (proteína asociada a vesículas de membrana) y sintaxina. Estas proteínas participan de manera importante con otras proteínas en las diferentes etapas de la fusión de la vesícula sináptica con la membrana. La 13 toxina tetánica, ejerce su acción sobre el sistema nervioso periférico y central, inhibiendo la liberación de neurotransmisores por su unión selectiva a la proteína de la vesícula sináptica sinaptobrevina II, e inhibe el anclaje de la vesícula sináptica (Schiavo et al., 1992). También se ha propuesto que la TeTx puede activar GTP-transglutaminasa dependiente de Ca2+ produciendo un sinergismo en el bloqueo de liberación del NT. Vesícula Sináptica BoNT/D Sinaptotagmina Lys -Leu 59 TeTx-BoNT/B Gln -Phe 7 7 60 Sinaptobrevina BoNT/G Ala81-Ala 82 BoNT/F Gln -Lys 58 Sintaxina Espacio Sináptico 59 TM 116 -C Nsinaptobrevina-2/VAMP-2 Fig. 6. Mecanismo de acción de la Toxina Tetánica sobre la vesícula sináptica y su sitio de reconocimiento en la sinaptobrevina-2/VAMP-2, una proteína del complejo SNARE, que sufre proteólisis por las NTC. 1. 10 El fragmento C-terminal de la toxina tetánica El precursor de la TeTx (single-chain TeTx) se sintetiza como una sola cadena polipeptídica (150 KDa) y es activada por una endopeptidasa clostridial. Los productos obtenidos de la hidrólisis son dos cadenas polipeptídicas unidas por un puente disulfuro; la cadena ligera L-TeTx induce el efecto toxico por inhibir la liberación de NT y la cadena pesada Hc-TeTx (100 kDa) permite el reconocimiento en la membrana celular y la internalización en la neurona (Fig. 2). 14 Neurotoxina un solo dominio COOH S Zn H2N S Cadena pesada 100 kDa Neurotoxina S Proteasas Zn H2N S COOH NH2 Reduccion H2N COOH SH Zn COOH NH SH COOH Cadena ligera 50 kDa SH COOH NH2 COOH NH2 Papaina Hc-Tetx 50kDa Fig. 2. Esquema de la obtención del fragmento Hc-TeTx a partir de la toxina tetánica. Por proteólisis se obtienen los fragmentos Hc-TeTx y es producto del corte la cadena pesada (100 kDa) y el fragmento L-TeTx o cadena ligera (50 kDa). Posteriormente la cadena pesada es cortada por una proteasa (papaína) en Ser864 y Lys865 obteniéndose dos fragmentos: el fragmento HCN-TeTx (865-1110 de 50 kDa) y una parte C-terminal o β-trefoil, Hcc-TeTx (1110-1315 residuos; 50 kDa). La forma tridimensional de los dos fragmentos unidos por una sola cadena α-hélice se muestra en la Fig. 3 (Emsley et al., 2000). HCC-TeTx β-trefoil HCN-TeTx Fig. 8. Conformación tridimensional del fragmento Hc-TeTx (tomado de Chaib-Oukadour 2004) Los dos fragmentos conservan su actividad sobre la neurosecreción para L-TeTx y de unión a la membrana para Hc-TeTx (Mochida et al., 1995; Meckler et al., 1990). En algunos estudios se ha mostrado que el dominio β-trefoil del fragmento Hc-TeTx se une a los poligangliósidos y a las células neuronales de manera más eficaz que el fragmento Hc-TeTx (Halpern y Loftus et al., 1993). Mientras que Figereido et al., 1995, mostró que el fragmento HCN-TeTx no presenta tal afinidad hacia los complejos lipídicos. Posteriormente, estudios de foto-afinidad muestran que la alta afinidad del fragmento Hc-TeTx en la región próxima al 15 residuo His1293 (Shapiro et al., 1997). Otras investigaciones usando la estructura cristalina del fragmento unida a un gangliosido sintético Gb1, proporcionó las evidencias de que no solo el fragmento Hc-TeTx tiene alta afinidad a gangliosidos incluso las toxinas clostridiales se unen de forma especial a gangliósidos con dos o más restos de ácido siálico unidos a un resto de galactosa, ejemplos: GD1b, GT1b,GQ1b (Van Heyningen 1963; Lalli et al., 1999). Estudios de unión y de toxicidad indican que el reconocimiento del fragmento Hc-TeTx tanto a lactosa como a ácido siálico, son esenciales para llevar a cabo la toxicidad de la TeTx (Rummel et al., 2003). 1.10 El fragmento Hc-TeTx en SNC El dominio C-terminal es el responsable de que la TeTx pueda unirse a la membrana celular, ya que se une de manera altamente específica a zonas no mielinizadas de los axones neuronales (Yavín et al., 1981; Monteccuco et al., 1986). Experimentos realizados en membranas neuronales de rata, en donde se empleo el fragmento Hc-TeTx mostraron su capacidad de unión (por Goldberg et al., 1981. Tal efecto también fue mostrado en cultivos primarios de neuronas ( Lalli et al., 1999). Las investigaciones realizadas sobre la acción del fragmento Hc-TeTx indican que a dosis muy bajas inhibe la captura de 5-HT (5-Hidroxitriptamina) en preparaciones enriquecidas en sinaptosomas de tejido nervioso de rata (Inserte et al., 1999; Najib et al., 1999; Pelliccioni et al., 2001). El mecanismo de acción de la TeTx es la inducción de la fosforilación en un residuo del transportador SERT (transportador de la serotonina). Así el fragmento HcTeTx ha mostrado reproducir los efectos de la TeTx, de tal manera que se le atribuye una actividad similar a los inhibidores selectivos del transporte de 5-HT, ejemplos de este tipo de fármacos son la fluoxetina (Proxac) ampliamente utilizado en patologías del comportamiento (Najib, 2000). En el SNC la administración intraventricular de la TeTx en ratas adultas induce fosforilación y la activación de la fosfolipasa C Cγ−1 (PLCγ−1), acompañada de una regulación negativa de la proteina kinasa C (PKC) (Aguilera y Yavín, 1990). Así también, el fragmento Hc-TeTx en cultivos primarios de neuronas corticales de rata aumentaba la 16 actividad de la PKC y la hidrólisis de fosfoinosítidos (Gil et al., 1998). Debido a la activación de receptores tirosina quinasa A (Trk A), por la fosforilación/autofosforilación de este receptor se propuso que este fragmento activaba los mismos blancos neuronalaes que inducen las cascadas de señalización de los factores de crecimiento quienes están implicados en los procesos de sobrevivencia célular (Najib et al., 1999, 2000, Pelliccioni et al., 2001). El fragmento Hc-TeTx en sinaptosomas de encéfalo de rata, activa al receptor receptor Trk A, fosforilandose en Tyr490, y se induce la fosforilación/activación de la PLCγ-1 y la consecuente activación/translocación, y finalmente una regulación negativa de las formas clásicas y nuevas de PKC, la fosforilación de la quinasa ERK1/2 (quinasas reguladas de forma extracelular de 44 y 42 kDA, respectivamente) (Gil et al., 2000). En cultivo primario de neuronas corticales de rata se encontró el fragmento Hc-TeTx activa al receptor Trk por la fosforilación de residuo de Tyr674/Tyr675 con lo que se activan las vías p21Ras/MAPK (proteína G de 21 kDa/proteínas cinasas activadas por mitógenos) y PI3K/Akt (fosfatidilinositol 3 cinasa/proteína cinasa B ó PKB), conocidas como las vías activadas por neurotrofinas (Chaib Oukadour, 2004). Estos efectos son dependientes de la interacción de la neurotoxina TeTx, con la membrana celular y se sabe que también son producto de la acción del fragmento Hc-TeTx. El avance en las investigaciones sobre las vías por las cuales actuaba este fragmento inocuo, pero con actividad similar a los factores de crecimiento hizo pensar que éste poseía un efecto neuroprotector ante diversos ambientes de apoptosis ó en patologías donde existen procesos neurodegenerativos como la EP. Cuando se evaluó el efecto del fragmento en la muerte por apoptosis en de neuronas granulares en cultivo (NGC), se encontró que había sobrevivencia celular ante un estrés inducido por el cambio de K25 a K5, el cual resulta excitotoxico en este tipo celular y que lleva a la muerte por apoptosis, por las vías p21Ras, fosforilandose en Ser259 de Raf (una cinasa Ser/Thr de 70-75 kDa ), con la activación de la vía MAPK’s (MEK1/2 en Ser217; ERK1/2 en Thr202 y Tyr204) y posteriormente la PI3K y Akt (fosforilado en Ser473 y Thr308). El fragmento también es capaz de inhibir la des-fosforilación de Akt y las ERK1/2, e inactivar a la glicógeno sintasa cinasa (GSK-3β) por su fosforilación en Ser9 y por estas vías inducir sus efectos de neuroprotección. La vía p21Ras/MAPK es esencial en la inhibición de la apoptosis, y lleva a cabo la activación del factor 90Rsk por su fosforilación en Ser380. Este es un sustrato relevante de MAPK, ya que es una señal de inhibición de la proteína proapoptotica Bad (Bcl-X/Bcl-2 17 promotor de muerte asociado) y por otra parte la expresión de genes de sobrevivencia celular por activación del factor CREB (elemento de respuesta a la proteína de unión a AMP cíclico) fosforilado en Ser133. Una similitud entre la actividad del fragmento Hc-TeTx y el factor de crecimiento derivado del cerebro (BDNF) es que ambos activan estas vías (Chaib Oukadour et a., 2004). Otra forma en que el Hc-TeTx induce neuroprotección es por la inhibir la procaspasa 3, tal efecto se mostró al depositar a 10 nM Hc-TeTx en las NGC. Las implicaciones en este proceso de muerte, es que el fragmento Hc-TeTx puede proteger contra la apoptosis, dicho proceso se puede evaluar sobre la fragmentación del DNA, la condensación de la cromatina o en la formación de cuerpos apoptóticos, indicadores de apoptosis (Thronberry y Lazebnik, 1998). NT: Hc-TeTx NGF BDNF NT-3 ANG II TPA TrkA,TrkB,TrkC p110 PI-3K sos ras nPKC Shc PIP3 Ras-GDP GAP Akt Bad P14-3-3 Raf-1 MEK ERK Bad Dianas citosòllicas Rs Caspasa9 PLA2,TyrH,raf-1 p90 Dianas nucleares Caspasa3 PKC Ras-GTP c-fos,c-jun,Elk1 MAPKAP2 MATs,tau,… APOPTOSIS Fig. 9. Vías de señalización de las MAPK’s y las PI3K (Tomado de Aguilera J. 2004) El N-metil-4-fenilpiridina (MPP+) es el metabolito activo del MPTP, un agente químico que al atravesar la barrera hematoencefálica es capaz de inducir el síndrome 18 parkinsoniano. La administración sistémica de MPTP es convertido a MPP+, es recapturado por el DAT y se acumula en las neuronas DA de la SNpc. El MPP+ inhibe la cadena respiratoria mitocondrial por inhibir el complejo I e induce un déficit de ATP (Mizuno et al., 1987), también incrementa los niveles de superóxido y puede difundir y reaccionar con el NO para formar peroxinitrito (ONOO-), un agente altamente reactivo que puede dañar la membrana lipídica, proteínas y el DNA (Przedborski et al., 1996; Beal et al., 1995). El MPP+ P es capaz de inducir muerte celular por apoptosis in vitro en varios tipos celulares como NGC, PC12, entre otros (Leist et al., 1998; Shimoke Kudo 2001). In vivo uno de los marcadores de apoptosis encontrados son los núcleos apoptóticos después de la exposición a MPP+ y MPTP (Tatton y Kirsh 1997). El MPP+ ha mostrado inducir muerte por apoptosis en NGC (Du et al., 1997). Este tipo celular ha mostrado ser vulnerable a los efectos neurotoxicos del MPP+ (Langston et al., 1983) Factores neurotróficos como el BDNF o el EGF protegen a las DA contra el MPP+ (Spina 1992; Yoghinaga 1998). El fragmento Hc-TeTx también ha mostrado ser eficiente en la neuroprotección en las NGC, cuando se induce la apoptosis en este tipo celular al inducir una disminución de K+. Los mecanismos por los cuales el fragmento Hc-TeTx induce la sobrevivencia célular parecen llevarse a cabo a través de las vías MAPK y PI3K (Segal and Greehgerl 1996; Nuñez del Peso 1998; Chaib-Oukadour et al., 2004). Además, el fragmento Hc-TeTx ha mostrado proteger de la apoptosis por MPP+, debido a que disminuye la condensación de la cromatina, inhibe la translocación de Bax (proteína X asociada a Bcl-2) para la liberación de citocromo c (Cit c) y la proteína caspasa 3, ambos promotores de la apoptosis. La liberación del Cit c induce apoptosis debido a que se puede asociar con Apaf -1 (factor activador de proteasas) provocando la agregación y activación de la pro-caspasa 9, también se produce un colapso de la membrana mitocondrial y una disminución del potencial de membrana. En cuanto a las caspasas al estar inactivas protegen de la apoptosis inducida por los receptores de muerte. La mitocondria tiene un papel clave en la iniciación de las vías de muerte (Wei et al., 2001). Otro promotor de la apoptosis es Bad, quién puede activar a Bax, en condiciones normales se encuentra inactiva cuando esta unida a la chaperona 14-3-3 y al activarse se une a Bcl-XL. El fragmento Hc-TeTx también induce su efecto neuroprotector por la vía Bad, al inhibir su disociación con la chaperona 14-3-3. Se 19 sabe que la fosforilación de Bad en Ser136 y Ser112 por Akt y Erk, se promueve la unión de Bad a 14-3-3 (Del peso et al., 1997, Blume-Jensen et al., 1998). Es por estas diferentes vías que el fragmento Hc-TeTx promueve la sobrevivencia célular al inhibir la apoptosis por MPP+ (Chaib-Ouckadour, en proceso). 20 II. JUSTIFICACIÓN La EP afecta al 2 % de la población mayor de 65 años y su duración promedio es de 13 años. Aunque, se ha encontrado que la EP puede aparecer a los 40 años (Hughes et al., 1992, Lang y Lozano 1998; Golbe, 1991). El tratamiento es de tipo sintomático, uno de los más eficaces es L-Dopa el cual incrementa los niveles de DA y reestablece las funcines motoras. En los primeros años de tratamiento la L-Dopa genera grandes beneficios ya que revierte la acinesia, temblor entre otros, sin embargo después de varios años de tratamiento comienza a ser ineficaz y a generar otros problemas motores como las discinecias (Obeso et al., 2000). Algunos estudios sugieren que el tratamiento crónico con L-Dopa es un factor que contribuye en el proceso neurodegenerativo por su capacidad de generar radicales libres (Maeda et al., 1997; Soliman et al., 2002). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio (Mendieta, 2004) han mostrado que la lesión dopaminérgica y el tratamiento crónico de LDopa inducen un deterioro motor y cognitivo, incluso acentuando el estrés oxidativo debido a un incremento de NO en estriado. Debido a las alteraciones motoras que produce la LDopa y su posible efecto neurotóxico, actualmente se están buscando nuevos fármacos que ayuden tanto a retardar el proceso neurodegenerativo como a mejorar las funciones motoras de los pacientes parkinsonianos. Estudios realizados in vitro e in vivo han mostrado que la toxicidad de la DA está vinculada con el estrés oxidativo y su consecuente apoptosis. En el proceso degenerativo de la EP, la apoptosis juega un papel importante (Mochizuki et al., 1996). El modelo con 6OHDA ha mostrado ser importante en el estudio de la neurodegeneración dopaminérgica (Lotharius et al., 1999). NFκB tiene un papel importante en el proceso apoptotico debido a que participa en la activación de genes anti-apoptoticos en modelos de EP (Hunot et al., 1997; Lee et al., 2001; Levites et al., 2002) El fragmento Hc-TeTx de la TeTx activa varias antiapoptóticas en NGC, debido a que tiene como blanco los receptores de neurotrofinas Trk (Aguilera y Chaib-Oukadour., 2004). Incluso el fragmento Hc-TeTx es capaz de rescatar a las neuronas de la muerte celular después de ser expuestas a MPP+, sin embargo todavía no es claro si in vivo puede ejercer su efecto neuroprotector. Este trabajo propone evaluar el fragmento Hc-TeTx sobre la asimetría motora y la actividad motora en campo cerrado en el modelo de lesión unilateral con 621 OHDA en rata, un modelo ampliamente utilizado para la evaluación de nuevas terapéuticas en la EP (Marín et al., 2006) Posteriormente evaluaremos la activación de NFκB como un factor que muestra los cambios a nivel de transcripción de genes que pueden estar relacionados con la disminución del proceso apoptótico. III. HIPOTESIS H1 La fracción Hc de la toxina tetánica produce cambios en las conductas motoras y cambios en la activación de NFκB en rata lesionada con 6-OHDA. H0 La fracción Hc de la toxina tetánica no produce cambios en las conductas motoras y cambios en la activación de NFκB en rata lesionada con 6-OHDA. IV. OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre las conductas motoras y sus cambios en la activación de NFκB en rata lesionada con 6-OHDA. V. OBJETIVOS PARTICULARES 1) Estudiar si la fracción Hc de la toxina tetánica revierte la asimetría motora inducida por la administración de anfetamina, en rata con 6-OHDA. 2) Estudiar el efecto de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre la actividad motora en rata con lesión unilateral de 6-OHDA. 3) Estudiar el efecto de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre los niveles de NFκB en rata con lesión unilateral de 6-OHDA en corteza frontal y estriado. 22 VI. METODOLOGIA Ratas macho cepa Wistar 300-350 gr Cirugía estereotáxica AP= -1.8, L= +2.0, P= -6.5 Vehículo (Ác. ascórbico) 2μL en vías nigroetriatales (n=10) 6-OHDA 2μL (8μg/μL) en VTA en vías nigroestriatales (n=10) Conducta de giro (Metanfetamina 5mg/kig s.c.) por 1 hora 14 días post-lesión (10 giros/min para grupo 6-OHDA) Control (Ác. ascórbico) 2 μL+ Hc-Tetx 2 μL (20μM) en vías nigroestriatales (n=10) Hc tetx 2 μL (20μM)/6-OHDA 2μL (8μg/μL) en vías nigroestritales (n=10) Actividad Motora durante 120 min. en cajas de campo cerrado a 20 días post-lesión Extracción de cerebros y disección de estriado y corteza frontal Determinación de los niveles de NFκB 23 TENCNICA PARA DETERMINAR NFĸB EN ESTRIADO Y CORTEZA FRONTAL Obtención de extractos nucleares y citoplásmicos de estriado y corteza frontal Cuantificación de proteínas por el método de Bradford Determinación de p65 con Western Blot (anti- p65) VII. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Se usaron ratas macho de la cepa Wistar de un peso entre 300 y 350 gramos. Los animales a usar provienen del Bioterio “Claude Bernard” de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. IX. METODOS A. Cirugía estereotáxica. 1) Las ratas se anestesian con hidrato de cloral (350mg/Kg, i.p.). El Hidrato de Cloral es preparado a una concentración de [60 mg/ml]. 2) Cirugía estereotáxica, para lesionar las vías nigroestriatales se inyectaron 2 μl de 6- OHDA (8μg/μl), con coordenadas (AP= -1.8, L=+2.0, P=-6.5) (Paxinos & Watson 1998). Se utilizan 4 mg de 6-OHDA, los cuales son disueltos en 500 μL de ácido ascórbico 0.01%. El fragmento Hc-TeTx fue administrada en el mismo sitio a la concentración correspondiente. [2, 10, 20 y 50 μM]. 3) Cirugía estereotáxica para el grupo control se inyectó el vehículo ácido ascórbico 0.001% en las vías nigroestriatales con las mismas coordenadas del grupo experimental. 24 4) A todos los animales se les da un tratamiento post-operatorio administrando 20 unidades de antibiótico (Penicilina G/lidocaína) por vía intramuscular durante tres días. 5) Las ratas se recuperaron de la cirugía durante 8 días. B. Conducta de giro Después de 14 días de haber realizado la cirugía estereotáxica se evalúo la lesión causada con la 6-OHDA mediante la evaluación conducta de giro, se administra metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantifica el número de giros ipsilaterales durante 60 minutos (Ungerstedt 1968). Únicamente se consideran las ratas que presentan al menos 10 giros/minuto o más para el grupo de ratas con 6-OHDA. C. Evaluación de la actividad motora en campo cerrado. En todos los grupos experimentales se les cuantificó la actividad motora con las cajas de actividad motora de campo cerrado. Los animales son introducidos en las cajas y se cuantificó su actividad durante 120 min. Finalizado el tiempo, se obtuvo el número de cuentas acumuladas (promedio de movimientos en 10 minutos) por periodos de 10 min y la cuenta total durante el tiempo de evaluación. X. PROCEDIMIENTO En este experimento utilizamos dos lotes (n=40) (ver diagrama de trabajo). Grupos Experimentales: 1. Al primer grupo un grupo de animales (n=10) son anestesiados para realizarles la cirugía estereotáxica y producir una lesión dopaminérgica con (2μL) 6-OHDA [8μg/μL] en vías nigroestriatales según el procedimiento convencional y coordenadas AP=-1.8; L=+2.0; P=-6.5 (Paxinos & Watson 1998). A una concentración de 6OHDA. Al Segundo grupo se le inyecto 2 μl del fragmento Hc-TeTx a la concentración 2 μM, 10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA, al tercer grupo se le inyecto el fragmento 2 μl de Hc-TeTx a la concentración 10 μM; 10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA; al cuarto grupo se le inyecto 2μl del fragmento Hc-TeTx a la concentración 20 μM, 10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA y por último un quinto grupo se le inyecto 2 μl del fragmento Hc-TeTx a la concentración 50 μM, 10 minutos previo a la inyección de 6-OHDA, en vías nigroestriatales. 25 2. A todos los animales se les administró antibiótico 2 U durante 3 días postoperatorio por vía intramuscular. 3. Después de 14 días de recuperación, se valoró la lesión dopaminérgica mediante la conducta de giro, inducida con metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantificó el número de giros ipsilaterales durante 60 minutos. 4. Al día 20 posterior a la cirugía se cuantificó la actividad motora en las cajas de actividad motora de campo cerrado. 5. Finalizada la evaluación de actividad motora los grupos 6-OHDA y Hc-TeTx/6OHDA (20 μM) son sacrificados para extraer cerebro y hacer la disección se núcleos: estriado y de la corteza frontal. 6. Posteriormente del estriado y de la corteza frontal se obtuvo el extracto nuclear y citoplásmico con el protocolo correspondiente (ver apéndice). 7. Se realizó la determinación de proteínas por el método de Bradford (ver apéndice). 8. Por cada 3 muestras del mismo núcleo o área cerebral se realizó una mezcla, a la cual se le realizó la inmunodetección en fase sólida ó Western blot para p65 (se utilizó el anticuerpo primario anti-p65). 9. Posteriormente se realizan Western Blot con anti-p65 para determinación de NFκB, (Ver apéndice, técnicas). Grupos Controles Usamos dos grupos controles: 10. A un grupo de animales (n=10) son anestesiados para realizarles la cirugía estereotáxica e inyectar 2μL del vehículo (ácido ascórbico) ácido ascórbico (0.001%) en vías nigroestriatales según el procedimiento convencional y coordenadas AP=-1.8; L=+2.0; P=-6.5 (Paxinos & Watson 1998). En el grupo Hc-TeTx se le inyecto 2 μl a 20μM en las vías nigroestriatales. 11. A todos los animales se les administró antibiótico 2 U durante 3 días postoperatorio por vía intramuscular. 12. Después de 14 días de recuperación, se valoró la lesión dopaminérgica mediante la conducta de giro, inducida con metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantificó el número de giros ipsilaterales durante 60 minutos. 26 13. Al día 20 posterior a la cirugía se cuantificó la actividad motora en las cajas de actividad motora de campo cerrado. 14. Finalizada la evaluación de actividad motora los animales son sacrificados para extraer cerebro y hacer la disección se núcleos: estriado y de la corteza frontal. 15. Posteriormente del estriado y de la corteza frontal se obtuvo el extracto nuclear y citoplásmico con el protocolo correspondiente (ver apéndice). 16. Se realizó la determinación de proteínas por el método de Bradford (ver apéndice). 17. Por cada 3 muestras del mismo núcleo o área cerebral se realizó una mezcla, a la cual se le realizó la inmunodetección en fase sólida ó Western blot para p65 (se utilizó el anticuerpo primario anti-p65). 18. Posteriormente se realizan Western Blot con anti-p65 para determinación de NFκB, (Ver apéndice, técnicas). XI. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS 1) En el lote de ratas lesionadas se cuantificó el promedio del número de giros ipsilaterales (SEM, los cuales fueron graficados en periodos de 10 minutos durante una hora. Los grupos Hc-TeTx fueron analizados con su grupo control con una prueba t-student, (*p<0.05). Finalmente los grupos serán evaluados con una prueba ANOVA de una vía y una prueba Dunnett p<0.05 2) Las pruebas de actividad motora se graficó de acuerdo al número de cuentas acumuladas en periodos de 10 minutos. El análisis estadístico se evaluó con una tstudent, por cada periodo (*p<0.05). Finalmente los grupos fueron evaluados con una prueba ANOVA de una vía y una prueba post-Bonfferroni. 3) La determinación de proteínas citoplasmáticas y nucleares se realizaron en una curva de calibración lineal, r2=0.99 4) La densitometría del western blot fue analizada con el programa: Kodak 1D, versión 3.5.4. Los valores obtenidos de la densitometría del grupo control se ajustaron al 100% y los siguientes grupos experimentales fueron evaluados 27 respecto al grupo control. Se realizó una prueba ANOVA de una vía para evaluar los grupos experimentales respecto al control tanto en los extractos citoplasmicos como en los nucleares, y se evaluó finalmente con una prueba post-Dunnett *p<0.05 28 XII. RESULTADOS 12.1 ADMINISTRACIÓN LOCAL DE AZUL DE METILENO Se realizó la administración unilateral de azul de metileno en las proyecciones de la nigra y área ventral tegmental hacia el estriado, para evaluar el sitio exacto para realizar la administración local. La inyección se realizó con las siguientes coordenadas: (AP= -1.8, L= +2.0, P=-6.5) A) B) H E SNpc VTA A) Esquema de la localización coronal del sitio de lesión (Paxinos & Watson, 1998), B) Foto de corte de cerebro que muestra la inyección con azul de metileno en las vías nigroestriatales. (E: estriado, H:hipocampo, VTA: área ventral tegmental; SNc: sustancia nigra compacta). 12.2 EVALUACIÓN DE LA ASIMETRÍA MOTORA Antes de realizar la administración del fragmento Hc-TeTx en las vías nigroestriatales, nos propusimos realizar una curva dosis respuesta, para que mostrara las dosis a las cuales el fragmento mostraba efectos sobre la conducta motora. Para llevar a cabo este objetivo realizamos un grupo para cada dosis de Hc-TeTx a 2, 10, 20 y 50 μM/y la inyección de 6OHDA (Gráfica 1). Posterior a la cirugía estereotáxica de cada grupo, se realizó evaluó el efecto de la administración de 6-OHDA unilateral, en este grupo esperábamos un respuesta de alto daño dopaminérgico reflejado tanto en la conducta motora como en la asimetría motora. Un parámetro de inclusión para las ratas con administración de 6-OHDA, fueron aquellos animales que presentaron 10 o mas giros ipsilaterales por minuto en un periodo de 10 min 29 durante la prueba de asimetría motora. El día 14 postoperatorio, los animales recibieron metanfetamina (5 mg/kg s.c.) y se cuantificó en número de giros ipsilaterales por minuto durante una hora. Los resultados muestran una disminución significativa en el número de giros ipsilaterales en los animales que reciben previa administración del fragmento Hc-TeTx a de 6-OHDA de los diferentes grupos 2, 10, 20 y 50 μM de 81.2%, 82.7%, 64.4%, 63.8%, respectivamente (Tabla 3). Los datos de todos los grupos fueron analizados con una prueba ANOVA de una vía, y una prueba Dunnett (*p<0.01). Los grupos Hc-TeTx y control ácido ascórbico no mostraron el giro ipsilateral cuando se les administró anfetamina (5 mg/kg), por lo que los datos no son mostrados. Giros ipsilaterales/m i n 30 A) 25 20 15 10 5 * * 30 40 * * 50 60 6-OHDA Hc-TeTx 2μM/6-OHDA 0 0 10 20 70 Giros ipsilaterales/min Tiempo (min) 30 B) 25 20 15 10 5 * 0 0 10 20 * * 30 40 * * 50 60 6-OHDA Hc-TeTx 10μM/6-OHDA 70 Tiempo (min) Gráficas de Asimetría Motora de los grupos Hc-TeTx/6-OHDA y 6-OHDA en vías nigroestriatales. En A) Se muestra la respuesta del grupo Hc-TeTx 2 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA y en B) el grupo Hc-TeTx 10 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA. Todos los grupos fueron evaluados durante la prueba de asimetría motora inducida con la administración de metanfetamina (5mg/kg s.c.) evaluada durante una hora. Los grupos Hc-TeTx/6-OHDA presentaron un decremento significativo en 30 el número de giros ipsilaterales respecto a su control, t-student *p<0.05 Giros ipsilaterales/min 30 C) 25 20 15 10 5 * * * * 6-OHDA * Hc-TeTx 20μM/6-OHDA 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Giros ipsilaterales/min Tiempo (min) 30 D) 25 20 15 10 5 * 0 0 10 20 * * 30 40 * * 6-OHDA Hc-TeTx 50μM/6-OHDA 50 60 70 Tiempo (min) Gráficas de Asimetría Motora de los grupos Hc-TeTx/6-OHDA y 6-OHDA en vías nigroestriatales. En C) Se muestra la respuesta del grupo Hc-TeTx 20 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA y en D) el grupo Hc-TeTx 50 μM/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA. Todos los grupos fueron evaluados durante la prueba de asimetría motora inducida con la administración de metanfetamina (5mg/kg s.c.) evaluada durante una hora. Los grupos Hc-TeTx/6-OHDA presentaron un decremento significativo en el número de giros ipsilaterales respecto a su control, t-student *p<0.05 31 Giros ipsilaterales/minuto 25 E) 20 15 10 0 * * 5 *** 10 * * * * 20 ** * * 30 * * * 40 * * ** ** 50 60 * Tiempo (min) 6-OHDA Hc-TeTx 10μM/6-OHDA Hc-TeTx 2 μM/6-OHDA Hc-TeTx 50μM/6-OHDA Hc-TeTx 20μM/6-OHDA Gráfica dosis-respuesta del efecto del fragmento Hc-TeTx sobre la asimetría motora cuando se deposita en vías nigroestriatales. E) Se evaluaron los giros ipsilaterales de los cuatro grupos Hc-TeTx/6-OHDA a (2, 10, 20 y 50 μM, respectivamente para el fragmento) respecto al grupo 6-OHDA 2 ul (8μg/μl). La conducta de giro se indujo con la administración de metanfetamina 5 mg/kg s.c. y fue evaluada por una hora. Los giros ipsilaterales disminuyeron significativamente en los grupos Hc-TeTx/6-OHDA respecto al grupo 6-OHDA. ANOVA de una vía y una post-Dunnett *p<0.01 Tabla 3. Resultados la Conducta de Giro (Número de giros ipsilaterales/min) VALOR 6-OHDA Hc-TeTx Hc-TeTx Hc-TeTx Hc-TeTx 2μM/6-OHDA 10μM/6-OHDA 20μM/6- 50μM/6-OHDA OHDA MAX 18,31 3,467 3,175 6,525 6,633 PROMEDIO 12,53 2,35 1,82 3,95 2,66 +/-SEM 2,8 +/-SEM 0,32 +/-SEM 0,60 +/-SEM 1,07 +/-SEM 1,12 32 12.3 ACTIVIDAD MOTORA EN CAMPO CERRADO Número de cuentas acumuladas 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) Hc-TeTx Hc-TeTx 10 μM/6-OHDA CONTROL Hc-TeTx 2 μΜ/6-OHDA 60 70 Hc-TeTx 50μ/6-OHDA 6-OHDA Hc-TeTx 20 μM/6-OHDA Gráfica 6. Efecto del fragmento Hc-TeTx sobre la actividad motora en campo cerrado. Se cuantificó la actividad motora durante una hora de seis grupos de los cuales uno fue un grupo intacto, el segundo grupo recibió 6-OHDA (8 μg/μl), los siguientes grupos recibieron previamente a la 6-OHDA, HcTeTx ( 2, 10, 20 y 50 8 μM), fueron administrados en VTA. La actividad motora del grupo 6-OHDA disminuyo respecto al grupo control intacto. El grupo que mostró una mejoría significativa (**p<0.001)en la actividad motora fue el grupo que recibió Hc-TeTx 10 μM previa a la 6-OHDA. ANOVA de una vía y una post-Bonferroni, con *p<0.05 Tabla 4. Resultados de la evaluación en la actividad motora en campo cerrado durante una hora. Número de cuentas acumuladas GRUPO CONTROL (Ac. Ascórbico) Hc-TeTx 20 μM 6-OHDA (2 μL, 8μg/μl) Hc-TeTx 2 μM/6-OHDA Hc-TeTx 10 μM/6-OHDA Hc-TeTx 20 μM/6-OHDA Hc-TeTx 50 μM/6-OHDA MIN 1385 1185 627 648.8 1124 701.1 591.0 MAX 3213 2260 999.8 1364 1872 1168 1299 PROMEDIO 2555 1929 883.9 1060 1571 996.9 983.4 ±SEM 291.8 168.0 56.4 112.1 111.6 68.3 106.2 % 100 75.5 34.6 41.5 61.5 39.0 38.5 33 Los resultados de actividad motora indican que existe un decremento significativo de la actividad motora del grupo 6-OHDA del 65.4%, respecto al grupo control ácido ascórbico. El grupo Hc-TeTx no muestra cambio respecto al grupo control (ác. Ascórbico) lo que indica que la administración del fragmento Hc-TeTx no genera cambios significativos sobre la actividad motora, debido a que presenta un comportamiento del 75.5%. Por otra parte, la administración del fragmento Hc-TeTx a 2, 10, 20 y 50 μM, previo a la administración de 6OHDA (disminuyen 58.5%, 38.5%, 61.0% y 61.5%, respectivamente) por lo que no existen diferencias significativas de la actividad motora respecto al grupo 6-OHDA. Los resultados, anteriormente mostrados fueron analizados con una prueba ANOVA de una vía y una prueba Bonferroni *p<0.05 Para el estudio del efecto del fragmento Hc-TeTx a 20 μM (gráfica 7), se evaluaron los siguientes grupos: un grupo control (Ac. Ascórbico), un grupo Hc-TeTx (20 μM), un grupo 6OHDA y finalmente un grupo Hc-TeTx/6-OHDA. Los resultados indicaron que el fragmento Hc-TeTx no induce alteraciones en la conducta motora cuando es administrado en las vías nigroestriatales, respecto al grupo control. El grupo 6-OHDA induce un decremento significativo en la conducta motora del 65.4% respecto al control y finalmente se encontró que la administración previa de Hc-TeTx (20 μM)/6-OHDA presenta una disminución del 61%, ligeramente menor que en el grupo 6-OHDA. Los resultados fueron analizados con una prueba ANOVA de una vía y una post-Bonferroni p<0.05. 34 No. de cuentas acumuladas 3500 3000 CONTROL 2500 HC-TETX 2000 6-OHDA HC-TETX 20μM + 6-OHDA 1500 * 1000 500 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo (min) Gráfica 7. Efecto del fragmento Hc-TeTx (20 μM) sobre la actividad motora en campo cerrado. Se cuantificó la actividad motora durante una hora un grupo control (ác. Ascórbico), un grupo 6-OHDA (8 μg/μl), y un grupo Hc-TeTx/6-OHDA en las vías nigroestriatales. La actividad motora del grupo 6OHDA disminuyo 61% respecto al grupo control, sin lesión. El grupo Hc-TeTx/6-OHDA no presenta cambios significativos de la conducta motora respecto al grupo 6-ODHA. ANOVA de una vía y una post-Bonferroni, con *p<0.05 12.4 DETERMINACIÓN DE NFκB Después de realizar la extracción de cerebro, se hizo la disección del núcleo estriado y la corteza frontal. Los tejidos fueron almacenados a -70º C hasta su uso. Posteriormente, se realizaron los extractos citoplásmicos y nucleares del tejido. Los extractos obtenidos de cada animal fueron utilizados para la determinación de proteínas por el método de Bradford (ver técnicas) y para cada western blot se utilizó un pool de 3 animales. Inmunodetección en fase sólida (Western Blot) La cantidad de muestra fue ajustada a 100 μg de proteína y posteriormente se le agrego Sample Buffer, y posteriormente se realizó el corrimiento electroforético al 10% de archilamida en fase sólida. La determinación de NFκB se realizó con anti-p65 (1:250). Las muestras fueron distribuidas de la siguiente manera, en el primer carril el marcador de peso molecular, donde nuestra referencia fue el de 66 kDa. Obtenidas las placas, se realizó el análisis densitométrico. Los datos del grupo control fueron ajustados al 100% 35 Los resultados de la determinación de p65 en extractos citoplásmicos de la corteza frontal no mostraron cambios significativos respecto a su control (100%, unidades arbitrarias). La respuesta en citoplasma fue 204.8% ±103.5 del grupo Hc-TeTx, 81.20% ±59.47 para el grupo 6-OHDA y 343.1 ±150.9 para el grupo Hc-TeTx/6-OHDA, respecto a su control. La determinación de p65 en extractos nucleares, donde NFκB se encuentra activo, mostró que existe una tendencia a incrementar los niveles de p65 en el grupo 6-OHDA. La respuesta fue 118.1% ±21.21 en el grupo Hc-TeTx, 241.9% ±148.8 para el grupo 6-OHDA, y el grupo Hc-TeTx/6-OHDA 146.6% ±99.99, respecto a su control. Sin embargo la variabilidad entre los datos alta, sin cambio significativo respecto al control. En el caso del grupo Hc-TeTx/6-OHDA se encontró que existe la tendencia a disminuir la presencia de p65, pero los datos no arrojan un cambio significativo cuando se aplica el análisis estadístico, realizado con una prueba ANOVA de una vía y una prueba post-Dunnett p<0.05 Los datos de la presencia de p65 en el extracto citoplásmico de estriado del grupo HcTeTx 66.33% ±103.5 , para el grupo 6-OHDA 50.77% ±25.18 y finalmente del grupo HcTeTx/6-OHDA 118.3% ±42.23, respecto a su control (100%, unidades arbitrarias). La determinación de p65 en extractos nucleares, donde NFκB se encuentra activo, mostró que existe un incremento en los niveles de p65 en el grupo 6-OHDA de 618.6% ±46.53, respecto a su control, lo que indica una gran activación de este factor de transcripción debido al estrés. Por otra parte la respuesta del fragmento Hc-TeTx también indujo un incremento de p65 de 685.9% ±271.1. Finalmente el grupo Hc-TeTx/6-OHDA 168.1% ±30.82, este último grupo muestra que se revierte el efecto de la 6-OHDA de incrementar los niveles de p65. Los datos fueron analizados con una prueba ANOVA de una vía y una post-Dunnett *p<0.05 36 A) CORTEZA FRONTAL p65 65 kDa Actina 45kDa % DEL CONTROL 600 500 400 300 200 100 A H D A H C +6 -O H D 6O L H C ext. citoplásmicos B) -T ET X TR O N H D C O H C +6 -O H D A A X ET -T 6O C O H C N TR O L 0 ext. nucleares ESTRIADO 65 kDa p65 45kDa Actina 1200 % DEL CONTROL 1000 800 600 400 200 extracto citoplásmico D A C +6 -O H D A 6O H -T ET X C L O N TR O D A C H H H C +6 -O H D A 6O H -T ET X C H C O N TR O L 0 extracto nuclear Gráfica 8. Determinación de p65 en el grupos control, fragmento Hc-TeTx (20μM), 6-OHDA (2 μl, 8μg/μl y grupo Hc-TeTx/6-OHDA en corteza frontal y estriado. A) En corteza frontal la presencia de p65 no mostró diferencias de los grupos experimentales respecto a su control, en los extractos citoplásmicos y nucleares. B) En el estriado el grupo experimental Hc-TeTx/6-OHDA presenta un decremento de p65 significativo respecto a al grupo 6-OHDA y el grupo Hc-TeTx presentó un aumento de p65 respecto al control, ambos cambios en el extracto nuclear. ANOVA de una vía *p<0.05 37 XVII. DISCUSIÓN En el estudio de la EP se han usado diferentes modelos tanto in vitro, in situ como in vivo. El modelo donde se emplea la neurotoxina 6-OHDA ha sido de gran utilidad en el estudio de la fisiopatología de la enfermedad, así como para poder evaluar nuevas terapéuticas. La evaluación del grupo 6-OHDA mostró que el giro ipsilateral se presenta persistente (aprox. 10 giros/min) con la administración de metanfetamina (Hefti et al., 1980). y que el máximo número de giros fue de 18.31 giros/min y en promedio 12.5 giros/min. Estos resultados indican que hemos producido una lesión en las vías de VTA, con lo que inducimos una denervación dopaminérgica y disminución consecuente de los niveles DA. Aunque no cuantificamos los niveles de dopamina se asocia, el número de giros con el nivel de perdida dopaminérgica en los ganglios basales ipsilateral, los cuales son cercanos al 90% al día 14 post-lesión. Incluso con la lesión de 6-OHDA se observan cambios a largo plazo, así como cambios neuroanatómicos y bioquímicos después de la administración de 6-OHDA, como son una disminución del 97% en la inmunohistoquímica para la TH y un incremento en la tinción Fe2+ al día 14 post lesión (Wang et al., 2004). Dichos datos nos indican que hemos reproducido satisfactoriamente el modelo de lesión unilateral con 6-OHDA. Por otra parte, se estudio el fragmento Hc-TeTx en un modelo in vivo, en primer lugar sobre la asimetría motora; el cual se ha usado extensamente como modelo pre-clínico (Marín et al., 2006). Se inyectó el fragmento a varios grupos, los cuales recibieron el fragmento HcTeTx (2, 10, 20 y 50 μM) previamente a la inyección de 6-OHDA y a los 14 días posteriores a la lesión evaluamos la asimetría motora. Así obtuvimos una respuesta favorable en los grupos que recibieron el fragmento Hc-TeTx respecto al grupo de 6-OHDA (Gráficas 1, 2, 3 y 4). Estos resultados indican, que el Hc-TeTx indujo decremento en el número de giros ipsilaterales por efecto de la lesión dopaminérgica, cuando se administraba metanfetamina. Esto indica que pudiese haber un menor daño sobre el sistema de los ganglios basales, ya que se ha propuesto que el grado de lesión dopaminérgica (disminución en los niveles de DA y de la enzima tirosina hidroxilasa) se relaciona con la ocurrencia y el grado del déficit conductual (Schwarting and Huston 1996). Este modelo in-vivo, se basa en el daño que se 38 induce con la 6-OHDA sobre las neuronas dopaminérgicas y las alteraciones causadas sobre el sistema de los ganglios basales, que se manifiesta cuando el animal presentan giros al ser estimulado con anfetamina o un agonista dopaminérgico. De tal manera que los animales con lesión unilateral de 6-OHDA, desencadenan una conducta conocida como conducta de giro o asimetría motora, la cual sigue un curso tipo gaussiano. Por lo que sugerimos que el decremento en el giro ipsilateral puede ser una muestra de una menor alteración sobre el sistema dopaminérgico. Además estudios de Chaturvedi et al., 2006 se puede aumentar la liberación de DA en la rata lesionada con 6-OHDA, vía receptores p75NTR, quienes son blanco del fragmento Hc-TeTx y por esta vía regular la neurotransmisión dopaminérgica, con lo que puede mejorar las conductas motoras. Al obtener la curva dosis respuesta, Hc-TeTx/6-OHDA de las dosis 2 a 50 μM, no se mostraron cambios significativos sobre la conducta motora (Gráfica 6), solo encontramos mejoría a en el grupo Hc-TeTx/6-OHDA (10 μM). Los resultados del grupo Hc-TeTx/6OHDA (20 μM) inducen un comportamiento similar a su grupo control 6-OHDA (Gráfica 7). A pesar que durante esta prueba no exista incremento en la actividad motora, no quiere decir que el Hc-TeTx no se este induciendo cambios en la neurotransmisión dopaminérgica o sobre los mecanismos de protección. Incluso se propone que el grado de daño dopaminérgico puede variar de animal a animal y la evaluación de este tipo de actividad motora solo es una de las medidas a evaluar. Experimentos previos han asociado que el fragmento Hc-TeTx presenta cualidades similares a los factores de crecimiento al producir sobrevivencia neuronal en condiciones de estrés (Chaïb-Oukadour et al., 2004). Si bien por un lado la neurotoxina 6-OHDA, produce estrés oxidativo y apoptosis (Bonnet y Houeto 1999; Olanow y Tatton 1999), lo que induce a la muerte de neuronas dopaminérgicas. Estos procesos serian muy semejantes a los procesos que estarían llevándose a cabo durante la neurodegeneración en la EP. Otra pregunta que plantea el presente trabajo es ¿El fragmento Hc-TeTx es capaz de mejorar las conductas motoras en rata con lesión unilateral de 6-OHDA? y si así fuese, ¿El mecanismo por el cual ejerce su efecto es por la activación de NFκB? un factor que puede tener un papel importante en el proceso de apoptosis que sucede en la neurodegeneración de la EP (Hunot et al., 1997). 39 Los efectos protectores y sobre la señalización del fragmento Hc-TeTx han sido analizados por el Dr. Aguilera, por activar PI3K proteínas MAPK, además de que el fragmento induce la fosforilación de los receptores Trk. Incluso se ha sugerido que el empleo de factores de crecimiento como el BDNF (factor de crecimiento derivado del cerebro) son alternativas farmacológicas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como EP, por lo que este fragmento tendría un efecto muy similar (Mufson et al., 1999). Así también el Hc-TeTx induce la inhibición de la caspasa 3, como un efecto antiapoptótico que inducen la sobrevivencia cuando las células son sometidas a condiciones de estrés. Por lo que creemos que es por estas vías que ejerce su acción en las células dopaminérgicas. Para obtener evidencias sobre el papel de este fragmento Hc-TeTx sobre los procesos de daño por 6OHDA, evaluamos el factor de transcripción NFκB. La aplicación de 6-OHDA ha mostrado inducir la traslocación de NFκB y la activación de sus vías de señalización (Luo et al., 1999; Park et al., 2004); siendo esta activación mediada por la presencia de ROS. Debido a ello se ha sugerido que este incremento en la actividad de NFκB tiene un efecto sobre los procesos de apoptosis de prevenir la muerte por 6-OHDA en células PC12 (Lee et al., 2001). Cuando se evaluó la presencia de p65 en corteza frontal de los grupos control, Hc-TeTx, 6-OHDA y Hc-TeTx, encontramos que en el extracto citoplásmico y nucleares no había cambios significativos, sin embargo el comportamiento en los animales era variable pero con la misma tendencia de incrementar la actividad de NFkB en el extracto nuclear del grupo 6-OHDA, como respuesta a las alteraciones celulares que induce esta toxina y en el grupo Hc-TeTx/6OHDA podemos observar la tendencia a bajar la presencia del factor NFkB. En el núcleo estriado, de nuestros grupos experimentales permitía ver con mayor claridad el efecto tanto de 6-OHDA como del fragmento Hc sobre la activación de p65. Así el fragmento Hc-TeTx produjo una alta activación de NFκB. En el grupo 6-OHDA se incremento en gran medida la presencia de 6-OHDA y finalmente los niveles de p65 en el grupo Hc-TeTx/6-OHDA disminuyen nuevamente. Si bien, no es posible dar un mecanismo certero del porque se revierten los niveles de p65, al administrar el fragmento Hc previo a la 6-OHDA, sabemos que 6-OHDA es capaz de inducir la activación de NFκB, para rescatar a las células del deterioro que induce la neurotoxina, ya que se ha encontrado que la inhibición de la activación de NFkB, genera mayor muerte celular (Park et al., 2004). Por lo que se sugiere que este factor de transcripción pueda tener un papel antiapoptótico, lo que indicaría que los 40 grupos con Hc-TeTx/6-OHDA presenten un cambio sobre los niveles de p65, hacia el decremento. Por otra parte el fragmento Hc-TeTx, por sí solo induce incremento de p65 esto probablemente se debe a su actividad sobre receptores Trk o por las vías Akt, una proteína cinasa B, vías que activan los factores de crecimiento que llevan a la activación de este factor de transcripción, sin embargo se sugiere que este efecto se encuentra en otro contexto como lo haría por ejemplo el NGF, quien también activan las vías MAPK’s. Sugerimos que puedan ser algunas vías por las cuales se activa este factor de transcripción, sin embargo es amplia la variedad de proteínas implicadas en la sobrevivencia celular, después de la administración de 6-OHDA. Por lo que continuaremos nuestro estudio sobre el efecto del fragmento Hc-TeTx tanto a nivel bioquímico como conductual. XIV. CONCLUSIONES 1. El fragmento Hc-TeTx decremento el giro ipsilateral a diferentes dosis (2, 10, 20 y 50 μM) en el modelo de lesión unilateral con 6-OHDA. 2. El fragmento Hc-TeTx no altero la actividad motora en campo en el modelo de lesión unilateral con 6-OHDA, ligeramente incrementa a la dosis de 10 μM. 3. El grupo Hc-TeTx/6-OHDA presentó un decremento de NFkB en estriado, sin cambio de este factor de trascripción en la corteza frontal. 41 XV. TÉCNICAS PARA LA DETERMINACION DE NFκB 15. 1 PROTOCOLO DE OBTENCIÓN DE EXTRACTOS NUCLEARES 1) Empastillar las células por centrifugación a 4°C por 3 min a 13,000 rpm, o bien por 5 min. si las muestras fueron previamente congeladas. 2) Retirar el sobrenadante. 3) Agregar 400 μL de solución amortiguadora, a cada muestra. 4) Homogenizar, subiendo y bajando con punta, por lo menos 10 veces o hasta que la mezcla este completamente homogénea. 5) Incubar 20 min tomando de referencia el momento en que se le agregue el solución A a la primera muestra. 6) Agregar 25 de NP-40 al 10% y agitar en vortex 12 seg. si es tejido, o bien 10 seg. si son células en cultivo. Este paso es importante para romper completamente la membrana citoplasmática. 7) Centrifugar 1 min a 10,000 rpm a 4°C. Tomar el tiempo hasta que e alcancen las 10,000 rpm. 8) Retirar el sobrenadante con la trampa de vacío. 9) Agregar de 50 a 100 μL de solución C, dependiendo del tamaño de la pastilla de núcleos. 10) Vortexear 11) Homogenizar en el vortex de 20 a 30 min en el cuarto frío. 12) Centrifugar 5 min a 9,000 rpm a 4°C. 13) Recuperar el sobrenadante 14) Hacer alícuotas de los extractos 15) Almacenar a -70°C. 42 ANEXO 1 Solución A 1mL (µL) 2mL (µL) 3mL (µL) 4mL (µL) 5 mL (µL) HEPES 1M pH 7.9 10 20 30 40 50 KCl 1M 10 20 30 40 50 EDTA 50 mM 2 4 6 8 10 EGTA 10 mM 10 20 30 40 50 DTT 100 mM 10 20 30 40 50 PMSF 100 mM 10 20 30 40 50 Apro 1 2 3 4 5 Leup 1 2 3 4 5 H2O 946 1892 2838 3784 4730 100µL (µL) 200µL 300µL 400µL 500µL (µL) (µL) (µL) (µL) Solución C HEPES 1M pH 7.9 2 4 6 8 10 NaCl 4M 10 20 30 40 50 EDTA 50 mM 0.2 0.4 0.6 0.8 1 EGTA 10 mM 1 2 3 4 5 DTT 100 mM 1 2 3 4 5 PMSF 100 mM 1 2 3 4 5 Apro 0.5 0.5 0.5 0.5 1 Leup 0.5 0.5 0.5 0.5 1 H2O 83.8 168.6 253.4 338.2 422 43 15.2 PROTOCOLO PARA LA CUANTIFICACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD Metodo de Bradford (Bradford 1976) 1) Realizar una curva estándar de calibración preparando soluciones de γ-globulina a concentraciones conocidas de 0,1, 3, 6 y 12 μg/μL en un volumen final de 80 μL complementando con agua. [Proteína] Agua γ-globulina Vol. final 0 µg/µL 80 µL 0 µL 80 µL 1 µg/µL 76 µL 4 µL 80 µL 2 µg/µL 72 µL 8 µL 80 µL 3 µg/µL 68 µL 12 µL 80 µL 6 µg/µL 56 µL 24 µL 80 µL 12 µg/µL 32 µL 48 µL 80 µL 2) Tomar 20 μL de cada solución y colocarlos en los pozos de la placa de ELISA, por duplicado. Agregar a cada una 180 μL de reactivo de Bradford 1X (Del stock hacer una dilución 1:5). 3) Incubar 5 min (La estabilidad de la reacción es de 30 a 120 min.). 4) Encender el lector de placas de ELISA. 5) Programar el lector con un filtro de 630 nm y 30 seg. de agitación 6) Con los datos obtenidos se grafican las concentraciones (eje X) contra el promedio de las absorbancias (eje Y) obtenidas para la misma muestra. El coeficiente de correlación obtenido de la regresión lineal de la grafica deberá ser mayor o igual a 0.95 7) Obtener la ecuación de la recta. 8) Al trabajar con muestras de las que se desconoce su concentración de proteínas, se hace una dilución de esta equivalente a 1μg/μL de γ-globulina (76 μL de agua + 4 μL de la muestra). Estas se deben correr al mismo tiempo que se corre la curva estándar y con los mismos parámetros. 9) Para saber la concentración de proteína de las muestras, solo basta con interpolar los valores de la gráfica de la curva de calibración. Esto es posible despejando a ”X” de la ecuación de la recta y tomando a “Y” como los valores promedio de las absorbancias 44 obtenidas. El volumen a tomar de muestra es el mismo que el que se toma para 1 μg/ μL de γ-globulina. 15.3 INMUNODETECCIÓN EN FASE SÓLIDA, WESTERN BLOT 1) Preparar Gel de Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 10%. 2) Dejar melificar 3) Preparar gel concentrador Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 5%. 4) Preparar muestras a 100 μg/en 45 μL (las muestras deben ser preparadas previamente) Las muestras son puestas en baño María y se pasan a la centrifuga unos segundos) 5) Agregar marcador al gel. 6) Teniendo las muestras cargadas en el gel correr dos horas a 100 voltz. 7) Finalizada la corrida del gel, se preparan las muestras para la transferencia. Para transferir se utilizan casetes de transferencia, esponjas, filtros, membrana de nitrocelulosa, buffer de transferencia 1X. Nota: evitar burbujas entre las esponjas, filtros y la membrana. 8) Se transfiere en una cámara, con buffer de transferencia 1X a 100 mA por 3 hrs, a 4 °C. 9) Al terminar la transferencia, se saca la membrana y se verifica la transferencia con rojo de Ponceau. 10) El gel se pone con azul de coomassie, y se agita durante 2 a 3 hrs. 11) La membrana se enjuaga 2 min con PBS para desteñir, hasta que quede sin coloración. 12) Se bloquea la membrana con TBS/tween leche libre de grasa 5%, por 1 hr con agitación. 13) Enjuaga el exceso de leche. 14) Pone el Anticuerpo primario p65 1:500 (NFκB) y se deja por 12 hrs. 15) La membrana nuevamente es enjuagada con TBS/Tween 16) Realizar 6 ciclos de agitado de 10 min con TBS/Tween leche al 1%. 17) Al terminar se enjuaga la membrana con TBS/Tween. 18) Ponerle el anticuerpo secundario anti-rabbit 1:4000. por 1 hora. 19) Realizar 6 ciclos de agitado de 10 min con TBS/Tween leche 1%, frío. 20) Preparar para revelar la membrana. Agregar solución luminol 300 μL 45 21) Revelar con una exposición de 5 min en placa fotográfica. Usando revelador y fijador. 22) Cuantificar la densitometría de las bandas en placa. Gel de Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 10% Soluciones 10% 5 ml 10ml 15ml 20ml H2O 1.9 4.0 5.9 7.9 Acrilamida al 30% 1.7 3.3 5.0 6.7 Tris 1.5 M (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 SDS 10% 0.05 0.1 0.15 0.2 Persulfato de amonio 10% 0.05 0.1 0.15 0.2 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 Gel concentrador Tris-glicina SDS-Poliacrilamida al 5% Soluciones 5% 1 ml (ml) 2ml (ml) 3ml (ml) 4ml (ml) H2O 0.68 1.4 2.1 2.7 Acrilamida al 30% 1.7 0.33 0.5 0.67 Tris 1.5 M (pH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 SDS 10% 0.01 0.02 0.03 0.04 Persulfato de amonio 10% 0.01 0.02 0.03 0.04 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 46 XVI. APENDICE 16.1 SUSTANCIAS 6-Hidroxidopamina (4mg en 500μl de ácido ascórbico 0.1%, SIGMA) Fracción Hc de la toxina tetánica fracción sintetizada y donada por el Dr. José Aguilera, del Instituto de Neurociencias, Universidad de Autónoma de Barcelona, España). Anti-NFκB, p65 rabbit sc.372 , el cual fue obtenido de la casa comercial Santa Cruz, Biotechnology MR Anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante, el cual fue obtenido de la casa comercial Amershan Pharmacia BiotechMR 16.2 REACTIVOS HEPES 1M pH 7.9 (N-[2-Hidroxietil]piperazin-N´-2-etanosulfato) KCl 1M (MERK) EDTA 50 mM (Ac. Etilendiamintetraacetato, SIGMA) EGTA 10 mM (Etilenglicol-bis( -aminoetileter)N, N`tetra acetato, SIGMA) DTT 100 mM (Dithiotreitol, SIGMA) PMSF 100 mM (Fenilmetilsulfonil fluoruro, SIGMA) Aprotinina (ROCHE) Leupeptina (BOEHRINER MANHEIM) Tris Base (RESEARCH ORGANIC) NP-40 al 10% (Nonidet, SIGMA) Reactivo de Bradford (Protein Assay, BIO RAD) Albumina serica bovina (INVITROGEN) Archilamida (SIGMA) Bisacrilamida (SIGMA) Glicina (JB BAKER) SDS (BIO RAD) HCl (JT BAKER) Metanol (JT BAKER) KCl (MERK) KH2PO4 (BAKER ANALYTIC) 47 Na2HPO4 (BAKER ANALYTIC) NaCl (JT BAKER) Acido acético (JT BAKER) Luminol (Sensitive Western Blot detection system) APS 10% (Persulfato de amonio, FERMONT) TEMED (BAKER) Leche light (SVELTY) Azul de coomassie (Azul brillante, SIGMA) Revelador (KODAK) Fijador (KODAK) Ácido clorhídrico (FERMONT) Solución de Ponceau (SIGMA) Tween 20 (RESEARCH ORGANICS) 16.3 FÁRMACOS Hidrato de Cloral como anestésico. Antibiótico (penicilina G benzatínica, 1´20000 UI). Metanfetamina (SIGMA) 15.4 MATERIAL Papel parafilm (FISHER) Aparato estereotáxico para roedores (STOELTING), Moto-tool Compuradora Acer Pentium IV Material quirúrgico para disección Rasuradora Placa para Elisa Membranas para transferencia (Western Blot) Placas fotográficas (KODAK) Pipetas semiautomáticas 5-50, 200, 100-1000 μl (BRAND) Ependorfs 1500 y 500 μl (CORNING) 48 Tubos de 50 y 15 ml (CORNING) Centrífuga refrigerada (para muestras de suero o plasma, HERAEUS) Vortex (Thermolyne) Cajas de actividad motora de campo cerrado. Videograbadora (Sharp). Cámara fotográfica KODAK Programa (placas) Voltímetro o fuente (BIO RAD) Vidrios para gel (1.5mm) Peines (Bio Rad) Cámaras (BIO RAD) Membranas (BIO RAD) Casete (X-omatic KODAK) 49 XX. BIBLIOGRAFIA Aguilera, J., Yavin, E., 1990. In vivo translocation a down-regulation of kinase C following intraventricular administration of tetanus toxin. J. Neurochem. 54: 339-342. Aguilera J., 2004. Fisiología Celular y Molecular Principios y Conceptos. 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