PRACTICA 2 DEMOSTRACIÓN DEL ALTO PODER CATALITICO DE LA AMILASA SALIVAL INTRODUCCIÓN.

PRACTICA 2
DEMOSTRACIÓN DEL ALTO PODER CATALITICO
DE LA AMILASA SALIVAL
INTRODUCCIÓN.
La hidrólisis del glucógeno (ó almidón) puede ser catalizada por ácidos ó por
enzimas. En la hidrólisis catalizada por ácidos hay un rompimiento
desordenado de enlaces, con la formación intermedia de todos los posibles
oligosacáridos y con la conversión final de estos oligosacáridos a glucosa. Las
enzimas son más específicas con respecto a los enlaces rotos, por ejemplo la
alfa-amilasa cataliza la hidrólisis rápida y ordenada de enlaces internos alfa(14) y no hidroliza los enlaces alfa(1-6), ni maltosa; La alfa-amilasa actúa
rompiendo el glucógeno inicialmente en dextrinas ramificadas de peso
molecular mediano, formando solamente pequeñas cantidades de maltosa;
posteriormente disminuye el peso molecular de las dextrinas, a través de
rompimientos relativamente lentos dando glucosa y un oligosacárido con un
residuo de glucosa menos. Los productos finales de la degradación son:
glucosa, maltosa e isomaltosa.
Debido a que durante la hidrólisis, ya sea catalizada por ácidos ó por alfaamilasa, hay un incremento de grupo reductores, el progreso de la reacción
puede ser observado midiendo la cantidad de azúcares reductores por
reducción del 3,5-dinitro salicilato. El grado ó porcentaje de hidrólisis se
determina comparando la cantidad del azúcar reductor formado en un tiempo
dado con la cantidad del azúcar presente después de la hidrólisis acídica total
PRODUCTO BIOLÓGICO
Saliva humana obtenida al momento de realizar la práctica.
MATERIAL Y EQUIPO
 8 tubos de ensaye de 18x150
 1 gradilla






6 pipetas serológicas de 1 ml, 5 ml y 10 ml
1 vaso de precipitado de 50 ml
1 vaso de precipitado de 500 ml
Plancha de calentamiento
Espectrofotómetro
Cuba para espectrofotómetro
REACTIVOS






Glucógeno de hígado de rata
HCl 2 N
NaOH 1.2 N
Reactivo de 3,5-dinitro salicilato
Amortiguador de fosfatos 0.02 M pH=6.9
NaCl 0.005 M
TÉCNICA
A-. HIDRÓLISIS ÁCIDA
1. Preparación de la solución de glucógeno:
Disolver 40 mg de glucógeno de hígado de rata en 5 ml de agua
destilada (esta solución es de 8 mg/ml). (Nota 1)
2. Hidrólisis del glucógeno:
Numerar 8 tubos de 18x150(del 1al 8), y agregar lo siguiente:
TUBO NÚMERO
REACTIVO (ML)
Agua destilada
Soln de glucógeno
HCl 2 N
NaOH 1.2 N
1
2
3
4
5
6
7
8
0.1 - 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
1
1
-
3. Introducir los tubos del 3 al 8 en baño de agua hirviendo.
4. retirar los tubos del 3 al 8 del baño de agua hirviente a intervalos de 3
minutos cada uno y neutralizar inmediatamente añadiendo a cada tubo
0.1 ml de NaOH 1.2 N
5. después de 25 minutos retirar el tubo 8 del baño de agua hirviente y
añadir inmediatamente 1 ml de NaOH 1.2 N.
6. Añadir a todos los tubos (del 1 al 8), 1 ml del reactivo de 3,5
dinitrosalicilato e introducirlos en baño de agua hirviente por 5 minutos.
7. Sacar los tubos del baño de agua e introducirlos inmediatamente baño
de agua con hielo. Una vez fríos, añadir a cada tubo 15 ml de agua,
mezclar por inversión y medir la absorbancia de cada tubo a 540 nm
utilizando el tubo 1 como blanco.
B-. HIDRÓLISIS ENZIMATICA.
1. recolección de la saliva.
El voluntario debe enjuagarse perfectamente la boca con agua y
masticar un pequeño fragmento de parafina limpia para estimular la
producción de la saliva. Recoger 2 ml de saliva en un vaso de 50 ml.
Cuando todo este listo para la hidrólisis enzimática preparar una
dilución de 1:80, 1:10 ó 1:15 de ésta saliva. Utilizar la saliva para la
hidrólisis inmediatamente después de diluida. (Nota 2)
2. Preparación de la solución de glucógeno.
Disolver 32 mg de glucógeno de hígado de rata en 4 ml de NaCl 0.005
M (el ión cloruro activa la alfa-amilasa). (Nota 3)
3. Hidrólisis del glucógeno.
Numerar 8 tubos de 18x150 (del 1 al 8), y añadirles lo siguiente:
TUBO NÚMERO
REACTIVO
(ml)
Agua destilada
Solución
de
glucógeno
Saliva diluida
Reactivo de 3,5
dinitrosalicilico
1
2
3
4
5
6
7
8
0.1
-
--
-
-
-
-
-
-
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1
1
-
-
-
-
-
-
4. Incubar a temperatura ambiente.
5. Añadir a los tubos 3 al 8 a intervalos de 2 minutos cada uno, 1 ml de
reactivo de 3,5 dinitrosalicilato. Introducir todos los tubos (del 1 al 8)
en un baño de agua hirviente durante 5 minutos.
6. Enfriar los tubos en baño de agua fría. Una vez fríos añadir a cada uno
de los tubos 18 ml de agua, mezclar por inversión y medir la
absorbancia a cada uno de los tubos a 540 nm utilizando el tubo uno
como blanco. ( Nota 4).
NOTAS.
1. Puede utilizarse en lugar de la solución de glucógeno una solución de
almidón preparada de la siguiente manera:
Moler 2 gr. de almidón en un mortero que contenga 15 ml de agua
destilada fría. Verter esta suspensión lentamente en 185 ml de agua
hirviendo, agitando constantemente. Enfriar a temperatura ambiente
antes de usar.
2. La concentración de alfa-amilasa es diferente en diversas muestras de
saliva; depende del estado fisiológico y de la constitución genética del
donante. Se necesitan, pues, probar distintas diluciones de saliva par a
que la concentración de la enzima catalice la hidrólisis de modo que
marche a una velocidad adecuada para ser medida.
3. Puede utilizarse en lugar de la solución de glucógeno una solución de
almidón preparada en la forma indicada en la nota 1 sustituyendo el
agua destilada por amortiguador de fosfato 0.02 M (pH=6.9.
4. Si la velocidad de hidrólisis es demasiado rápida para dar una velocidad
lineal durante los primero 4 minutos, o demasiado lenta para ser
apreciada, repetir el análisis con otra dilución de saliva.
CALCULOS
Los cálculos para obtener él % de hidrólisis son iguales para la hidrólisis
acídica y la enzimática.
Tubo 2
Tubo 8
Tubo x
0 % de hidrólisis
100 % de hidrólisis
Tubos del 3 al 7
% de hidrólisis = Absorbancia del tubo x
(Tubos 3-7) Absorbancia del tubo 8
X 100
REFERENCIAS
1. Plummer, David T. An introduction to practical biochemistry 2a –
Mc graw-hill company (UK) limited, 1979 pp197, 188, 272-274.
2. Rendina, George Dr. Técnicas de bioquímica aplicada 1a Nueva
Editorial interamenricana, S.A., Méx. 1974. pp82 y 83
REPORTE
1. Mencionar 3 fuentes naturales de alfa-amilasa.
2. Describir que tipo de enzima es la alfa-amilasa
3. Escribir con formulas de reacción que ocurre entre un azúcar reductor y
el 3,5 dinitrosalicilato.
4. Escribir los datos y resultados obtenidos, en la siguiente tabla.
HIDRÓLISIS ACIDICA
Tubo % A
#
T
% DE
HIDROLISIS
TIEMPO
HIDRÓLISIS ENZIMATICA
%
T
A
% DE
HIDROLISIS
5. Graficar los resultados obtenidos (% de hidrólisis Vs tiempo).
6. ¿Que se concluye a partir de los datos obtenidos?
TIEMPO