PDF (Parte1) - Universidad Nacional de Colombia

AVANCES INVESTIGATEOS
EN LA PRODUCCIÓN DE
BIOCOMBUSTIBLES
Carlos Ariel Cardona Alzate
Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis Orgánica,
Ph.D en Ingeniería Química
Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia,
Sede Manizales
Carlos Eduardo Orrego Alzate
Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas,
Especialista en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ph.D en Química
Profesor. Titular, Universidad Nacional de Colombia,
Sede Manizales
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Cardona C. A. y Orrego C.E. (Editores)
Avances investigativos en la producción de biocombustibles
Manizales, Caldas, Colombia,junio de 2009
ISBN: 978-958-44-5261-0
Número de páginas: 248
Palabras clave: Biocombustibles, Bioetanol, Biodiesel
Revisión:
Ph.D. Johnny Alexander Tamayo Arias,
Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia,
Sede Manizales
200 copias
Primera Edición, 2009
Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales
Gobernación de Caldas
Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo, PNUD
Impresión: Gráficas Tizan, Manizales
Impreso en Colombia.
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PREFACIO
La inestabilidad de los precios de los combustibles fósiles, la incertidumbre del agotamiento
de los pozos petroleros y la liberación que estos combustibles realizan a la atmósfera de
grandes cantidades de gases contaminantes, han generado un interés mundial en la investigación de nuevas fuentes de energía de carácter renovable que solucionen estos problemas.
Una de las alternativas más abundantes y accesibles es la energía obtenida a partir de biomasa, con un énfasis mayor en los biocombustibles líquidos debido a su facilidad de utilización
en el sector del transporte. Dos de los más importantes biocombustibles líquidos son el
alcohol etílico y el biodiesel. Este libro se enfoca al estudio de estos dos biocombustibles
desde la óptica de los principales avances tecnológicos relacionados con su producción. En
cuanto al concepto de materias primas, se analiza desde la posibilidad de usar aceites de
microalgas para producir biodiesel hasta el uso del bioetanol para producir otro biocombustibie como es el hidrógeno, que se vislumbra como uno de los más promisorios gracias
a su combustión limpia.
Para lograr estos propósitos se convocaron autores de universidade de España, Brasil y Colombia, quienes amablemente aportaron con sus capítulos los últimos avances desarrollados
por sus grupos de investigación. En ese sentido, vale la pena destacar que las contribuciones
de estos países al desarrollo de los biocombustibles no son solamente de tipo científico o
tecnológico. España lidera en Europa la comercialización e instalación de nuevas tecnologías para producción de biocombustibles, mientras que Brasil lo hace en Latinoamérica.
Colombia ocupa un lugar privilegiado en la producción de biocombustibles en América Latina, gracias a sus condiciones geográficas, climáticas, de suelo y a un marco regulatorio que
ha intentado estar a la vanguardia. Además, por el interés generado en instituciones públicas
y privadas para el desarrollo de los aspectos agronómicos de la producción de la biomasa,
así como de su transformación agroindustrial.
La Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales, en las Plantas Piloto de Biotecnología y Agroindustria, con sus grupos de investigación en Procesos Químicos, Catalíticos y
Biotecnológicos y Alimentos - Frutales, ha venido desarrollando diversos trabajos en el área
de los biocombustibles con la realización de diversas investigaciones, tesis de doctorado y
maestría, convenios e intercambios académicos con grupos de investigación en Biocombustibles de Colombia y el mundo. Muchos de estos grupos participan en la escritura de este
libro.
La recopilación de algunas de estas investigaciones se presenta en el libro, donde la primera
parte está dedicada a la producción de biodiesel, analizando su producción con el uso de
Car!' s Ariel Cardona Alza e
enzimas, su obtención a partir de microalgas y el uso de tecnologías no convencionales
como son los fluidos supercríticos, la destilación y la extracción reactiva, y su efecto en la
emisión de contaminantes atmosféricos. Además, un capítulo describe algunos usos del más
importante subproducto: el glicerol como materia prima para otros procesos.
La segunda parte del libro está dedicada a la producción del bioetanol, realizando un análisis
de los microorganismos que pueden ser usados para su elaboración, algunas tecnologías
para transformar el material lignocelulósico y la estabilidad de los biorreactores utilizados.
Se presenta además en esta sección el análisis de la producción de hidrógeno utilizando
como materia prima bioetanol. El último capítulo presenta el uso de campos electromagnéticos en la producción, tanto de bioetanol como de biodiesel.
Los editores y autores reconocen el esfuerzo de la Gobernación del Departamento de Caldas - Colombia, por haber financiado íntegramente la impresión de esta obra a través del
proyecto ARCANO fase III (Apropiación Rural de Competencias Agroindustriales para
nuevas oportunidades en Caldas). Se destaca también el apoyo del Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo, PNUD por su apoyo incondicional al presente trabajo.
También se gratifica con mucho aprecio el apoyo de la Ingeniera Diana Catalina Cubides en
la compilación y organización final del presente libro. Un especial agradecimiento se brinda
también en este libro al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación de Colombia, COLCIENCIAS, a la Dirección de Investigaciones de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Manizales, DIMA, a la Fundación de Amparo e Investigación
del Estado de Río de Janeiro, FAPERJ, la Agencia Española de Cooperación Internacional, AECI, entre otras entidades, por haber financiado diferentes proyectos y misiones que
permitieron establecer relaciones directas de investigación entre los editores y autores del
presente libro.
Los editores y autores de esta obra consideran que los avances investigativos en la producción de biocombustibles pueden ser muy diversos, pero tal vez los más importantes
siempre serán aquellos que consideren nuestro contexto geográfico, económico, ambiental
y social. Cada capítulo al ser analizado demuestra como los autores tratan de acondicionar
sus investigaciones y resultados a la realidad de nuestros países. No obstante la dinámica
investigativa en el tema de los biocombustibles exigirá que los temas planteados aquí sean
objeto de renovación constante, para lo cual se espera que los lectores de otros grupos de
investigación sean los futuros gestores de iniciativas de este tipo.
Xvanccs In vestitati vos en la Producción de: Biocombustibles
AUTORES
CAPÍTULO 1. PRODUCCIÓN ENZIMÀTICA DE BIODIESEL
Carlos Eduardo Orrego Alzate, Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas, Especialista en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ph.D en Química. Profesor Titular, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Diana Marcela Cetina Medina, Ing. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Oscar Darío Hernández Parra, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 2. LAS MICROALGAS, FUENTE DE ACEITE PARA LA PRODUCCIÓN
DE BIODIESEL
Luz Marina Flórez Pardo, Ing. Química, Ph. D en Tecnología de Alimentos. Docente,
Universidad Autónoma de Occidente. Grupo de Investigación en Biocombustibles.
José Luis López Yelasco, Biólogo, Docente, Universidad Autónoma de Occidente. Grupo de Investigación en Biocombustibles.
Jorge Enrique López Galán, Ing. Químico, especialista en Informática y Computación.
Ph. D en Materias Primas Minerales y Energéticas. Docente, Universidad del Valle, Grupo
de Investigación en Biocombustibles.
CAPÍTULO 3. BIOCATÁLISIS MEDIANTE CÉLULAS. APLICACIÓN A LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
Carlos Eduardo Orrego Alzate, Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas, Especialista en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ph.D en Química. Profesor Titular, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Óscar Darío Hernández Parra, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Car!' s Ariel Cardona Alza e
Diana Marcela Cetina Medina, lng. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 4. PRODUCCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO TECNOLOGÍA DE
FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
Diana Catalina Cubides Román, lng. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Carlos Ariel Cardona Alzate. Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis
Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 5. POSIBILIDADES DE PROCESOS REACCIÓN-SEPARACIÓN
PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES
Carlos Ariel Cardona Alzate. Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis
Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Annie Alexandra Cerón Sánchez, Ing. Química, Estudiante de Maestría en IngenieríaIngeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 6. BIOGLICEROL COMO MATERIA PRIMA PARA LA OBTENCIÓN
DE PRODUCTOS DE VALOR AGREGADO
Jhon Alexánder Posada, Ing. Químico, M. Se. en Ingeniería-Ingeniería Química, Estudiante Ph. D. en Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Carlos Ariel Cardona Alzate. Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis
Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Diana Marcela Cetina Medina, Ing. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
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Avances ín\es¡¡e;aipvos en la Producción de Biocombusabíes
Carlos Eduardo Orrego Alzate, Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas, Especialista en Ciencia de los Alimentos, Ph.D en Química. Profesor Titular, Universidad Nacional
de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 7. EFECTO DEL USO DE BIODIESEL EN LA EMISIÓN DE
CONTAMINAN-TES ATMOSFÉRICOS
Franz Edwin López, Ingeniero Químico, Candidato a Ph. D Universidad de Alicante.
España.
Agustín Bueno, Químico, Ph.D en Química. Profesor Titular, Departamento Química
Inorgánica, Universidad de Alicante. España.
María José Illán, Química, Ph.D en Química. Profesora Titular, Departamento Química
Inorgánica, Universidad de Alicante. España.
Oscar Hernán Giraldo, Químico, Ph.D en Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 8. ESTANDARIZACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
DE INTERÉS PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL
Juan Carlos Higuita Vásquez, Microbiólogo, Ph. D en Microbiología y Biología Tumoral. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Carlos Ariel Cardona Alzate, Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis
Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Juan Pablo Mariscal Moreno, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Javier Mauricio Naranjo Vasco, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Christian Fernando Triana Carantón, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
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Carlos A riel Ca rei o na AI2 ate
CAPÍTULO 9. NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL
A PARTIR DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA
Julián Quintero, Ing. Químico, M. Se. en Ingeniería-Ingeniería Química, Estudiante Ph. D.
en Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Carlos Ariel Cardona Alzate, Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis
Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 10. ESTABILIDAD DE BIORREACTORES PARA PRODUCCIÓN DE
ETANOL
Isabel Cristina Paz Astudillo, Ing. Química, M. Se. en Ingeniería Química, Candidato a
Ph. D. en Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
Carlos Ariel Cardona Alzate, Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis
Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.
CAPÍTULO 11. PRODUCCIÓN DE HIDRÓGENO A PARTIR DE BIOETANOL
Viatcheslav Kafarov, Ing. Químico, M.Sc. en Matemática Aplicada, Ph. D. en Ciencias
Técnicas. Profesor Titular, Universidad Industrial de Santander.
CAPÍTULO 12. BIORREACTORES ASISTIDOS POR CAMPOS ELECTROMAGNÉTICOS
Víctor Haber Pérez, Ing. Químico, M. Se. en Ingeniería Agrícola. Ph. D en Procesos Biotecnológicos, Profesor Universidade Estadual do Norte Fluminense. Brasil.
Oselys Rodríguez Justo, Ing. Química, M. Se en Ingeniería Química, Ph. D en Ingeniería
Química. Investigador Universidad Estadual de Campiñas.- UNICAMP.
Nadia Rosa Pereira, Ing. Química, M. Se en Ingeniería Química, Ph. D en Ingeniería Química. Universidade Estadual de Campiñas - UNICAMP
Avances Investigamos en la P'oducción de Hiocombus tibies»
CONTENIDO
'REFACIO
VUTORES
FIGURAS
TABLAS
:APÍTULO 1
PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA DE BIODIESEL
1.1. Lipasas
1.1.1 Aspectos estructurales de las lipasas
...
1.1.2. El sitio activo y la activación Ínter facial
1.1.3. Pre-tratamientos de lipasas para catálisis en medios no acuosos
1.2. Inmovilización de lipasas
1.2.1. Métodos de retención física
1.2.2. Inmovilización por enlace químico
1.3. Aspectos cinéticos en la producción de biodiesel
1.3.1. La importancia de la actividad de agua
1.3.2. Cinéticas monosustrato. La ecuación de Michaelis - Menten
1.3.3. Cinéticas bisustrato
1.3.4. Mecanismos y cinéticas en la producción de biodiesel
1.3.5. Efectos del medio de reacción en las expresiones de velocidad
Conclusiones
Referencias
CAPÍTULO 2
LAS MICROALGAS, FUENTE DE ACEITE PARA LA PRODUCCIÓN
DE BIODIESEL
2.1 Contexto general sobre los biocombustibles
2.2. Las microalgas
2.3. Composición de ácidos grasos en microalgas
2.4. Avances en el cultivo de microalgas
2.4.1. Medios de cultivo (sustratos para su elaboración)
2.4.2. Co-culdvos
2.4.3. Modificaciones debidas a estrés alimenticio y a otros factores
2.4.4. Modificaciones de la forma de cultivo
2.4.5. Diseño de fotobiorreactores
Referencias
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XIV
XVI
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19
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Carlos Ariel Cardona A L ate
CAPITULO 3
57
BIOCATÁLISIS MEDIANTE CÉLULAS. APLICACIÓN A LA
PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
57
Introducción
57
3.1. Ventajas y desventajas del uso de biocatalizadores de células completas (BCC)... 58
3.2. BCCs en medios orgánicos
59
3.3. Estabilidad de los biocatalizadores de células completas-BCC60
3.4. Biocatalizadores inmovilizados
61
3.5. Células inmovilizadas sobre partículas de biomasa (CPB).
62
3.6. Usos de CPBs con lipasas
62
3.7. Condiciones de inmovilización de CPBs con lipasas.
62
3.8. CPBs con lipasas para producción de biodiesel
64
Conclusiones
65
Referencias
66
CAPÍTULO 4
PRODUCCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO TECNOLOGÍA DE
FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
Introducción
4.1. Fluidos supercrítico
4.2. Transesterificación de triglicéridos en FSC
4.3. Consideraciones de condiciones de proceso al usar FSC para producir biodiesel
4.3.1. Alcoholes usados
4.3.2. Impurezas en la materia prima
4.3.3. Relación molar alcohol aceite
4.4. Modelamiento del estado supercrítico
4.4.1. Cinética para la transesterificación en condiciones supercríticas
4.5. Análisis económico
4.6. Condiciones subcríticas
4.7. Proceso supercrítico catalizado con bases
4.8. Proceso supercrítico catalizado con enzimas
Conclusiones
Referencias
71
CAPÍTULO 5
POSIBILIDADES DE PROCESOS REACCIÓN-SEPARACIÓN PARA
LA PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES
5.1. Procesos simultáneos
5.2. Destilación reactiva
5.2.1. Producción de biodiesel a partir de aceite de palma por destilación reactiva
89
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Avances invcstitiativos en ia Producción de Biocombustibles
5.3. Extracción reactiva
Referencias
98
100
CAPITULO 6
103
BIOGLICEROL COMO MATERIA PRIMA PARA LA OBTENCIÓN
DE PRODUCTOS DE VALOR AGREGADO.
... 103
Introducción
103
6.1. Propiedades
fisicoquímicas
104
6.2. Mercado y aplicaciones comerciales
105
6.3. Grados comerciales del glicerol
106
6.4. Oxidación con catalizadores metálicos
107
6.5. Reducción a glicoles
110
6.6. Eterificación a poligliceroles
112
6.7. Pirólisis y gasificación
113
6.8. Esterificación e interesterificación
115
6.8.1. Esterificación de ácidos carboxílicos e interesterificación de triglicéridos. 115
6.8.2. Carboxilación de glicerol a carbonato de glicerol
117
6.8.3 Nitración de glicerol a nitrato de glicerol
119
6.9. Eterificación
120
6.9.1 Butilación de glicerol
120
6.9.2. Glicosilación de glicerol
120
6.10. Halogenación
121
Referencias
122
CAPÍTULO 7
EFECTO DEL USO DE BIODIESEL EN LA EMISIÓN DE
CONTAMINANTES ATMOSFÉRICOS
Introducción
7.1. Composición de los gases de escape de los motores diesel y gasolina
7.2. Sistemas de eliminación de contaminantes en motores diesel
7.3. Estudio experimental del efecto del uso de biodiesel comercial en la
generación de contaminantes y en su eliminación en sistemas de
post-combustión
7.3.1. Efecto del uso de biodiesel en la emisión de contaminantes
7.3.2. Efecto del uso de biodiesel en las propiedades físico-químicas de la
carbonilla generada
7.3.3. Efecto del uso de biodiesel en la reactividad de la carbonilla generada
Conclusiones
Referencias
I 11 I
129
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130
130
131
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143
Garios Ariel Cardona Alzate
CAPÍTULO 8
ESTANDARIZACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
DE INTERÉS PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL
Introducción
8.1. Estandarización de microorganismos empleados a nivel industrial
8.1.1. Aislamiento de microorganismos
8.1.2. Identificación de microorganismos
8.1.3. Almacenamiento
8.2. Principales microorganismos empleados para la producción de bioetanol
8.2.1. Bioquímica de los microorganismos fermentadores
8.2.2. Factores que afectan el desempeño de los microorganismos en la
producción de bioetanol
8.3. Mejoramiento de microorganismos para la producción de etanol
8.3.1. Técnicas de modificación genética no inducida
8.3.2. Técnicas de modificación genética inducida
8.4. Principales parámetros a considerar en la selección de microorganismos
para la producción de etanol
8.4.1. Materias primas ricas en azúcares
8.4.2. Materias primas lignocelulósicas:
Referencias
147
CAPITULO 9
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL
A PARTIR DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA
Introducción
9.1. Biomasa lignocelulósica
9.1.1. Celulosa
9.1.2. Hemicelulosa
9.1.3. Lignina
9.1.4. Etanol a partir de biomasa lignocelulósica
9.2. Tecnologías de pretratamiento
9.2.1. Pretratamiento mecánico
9.2.2. Pretratamiento térmico
9.2.3. Pretratamiento químico
9.2.4. Combinaciones
9.3. Hidrólisis de celulosa
9.3.1. Hidrólisis enzimàtica
9.3.2. Hidrólisis àcida concentrada
9.3.3. Hidrólisis àcida diluida
9.4. Microorganismos fermentativos
171
I
12
I
147
147
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148
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172
172
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181
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18.
Avances Investij»ativos en la Producción ik- ñiwfMtibuslibles
9.4.1 Bacterias
9.4.2. Levaduras y hongos
9.5. Configuraciones tecnológicas de la fermentación
9.5.1. Sacarificación y fermentación simultáneas
9.5.2. Células inmovilizadas
9.6. Tecnologías de deshidratación
9.6.1. Destilación con variación de presión
9.6.2. Destilación azeotrópica
9.6.3. Destilación extractiva
9.6.4. Destilación extractiva salina
9.6.5. Adsorción
9.6.6. Pervaporación
9.7. Discusión
Referencias
183
183
184
185
186
186
186
187
187
188
188
189
190
192
CAPÍTULO 10
ESTABILIDAD DE BIO RRE ACTO RE S PARA PRODUCCIÓN DE
ETANOL
Introducción
10.1. Conceptos básicos
10.2. Análisis de estabilidad
10.3. Fenómenos de estabilidad presentes en sistemas continuos para la
producción de etanol
10.3.1. Análisis del comportamiento oscilatorio
10.4. Efecto de las variables de operación sobre la estabilidad de los biorreactores
en la producción de etanol
10.5. Control de los fenómenos de estabilidad
Conclusiones
Referencias
199
199
199
200
202
203
204
205
207
209
211
CAPÍTULO 11
215
PRODUCCIÓN DE HIDRÓGENO A PARTIR DE BIOETANOL
215
Introducción
215
11.1. Combustibles limpios
216
11.2. Reformado de bioetanol
216
11.3. Influencia de la presencia de inerte en la reacción de reformado de bioetanol. 220
11.3.1. Consideraciones termodinámicas
220
11.3.2. Evaluación numérica
222
11.4. Producción de hidrógeno
223
11.5. Distribución de productos de reacción
224
Csirlos Ariel Cíttdon;i, Al/¡nc
Referencias
226
CAPÍTULO 12
OBTENCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES EN BIO RRE ACTO RE S
ASISTIDOS POR CAMPOS ELECTROMAGNÉTICOS
12.1. Producción de etanol: Campos electromagnéticos de baja frecuencia
12.2. Fundamentos teóricos aplicados a biorreactores tipo tanque agitado
asistido por campos electromagnéticos
12.3. Fundamentos teóricos aplicados a biorreactores estabilizados
magnéticamente
12.4. Producción de etanol en biorreactores asistidos por campos
electromagnéticos
12.5. Produción de biodiesel en biorreactores asistidos por microondas
12.6. Fundamentos teóricos de las microondas
12.7. Mecanismos de calentamiento por microondas
12.8. Propiedades dieléctricas
Referencias
229
229
229
231
234
236
239
239
241
241
243
FIGURAS
Figura
Figura
Figura
Figura
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
Figura 1.5.
Figura 1.6.
Figura 1.7.
Figura 4.1.
Figura 4.2.
Figura 5.1.
Figura 5.2.
Figura 5.3.
Figura 6.1.
Ejemplo del mecanismo de reacción de una lipasa
20
Métodos de inmovilización de enzimas
24
Entrecruzamiento enzima-soporte y soporte-soporte con glutaraldehído ...25
Mecanismos de reacciones bisustrato: a) Mecanismo ping-pong bi-bi, b)
Mecanismo secuencial ordenado, c) Mecanismo secuencial aleatorio
29
Esquema de la transesterificación o alcohólisis de triglicéridos:
a) Reacción general, b) Pasos de la reacción
30
Mecanismo de reacción propuesto por Camacho et al
31
Esquema de reacción de interesterificación: a) Reacción general,
b) Pasos de reacción
32
Esquema de proceso para la producción de etil esteres a partir de
aceite de palma y etanol en condiciones supercríticas y sin el uso de
catalizador
75
Fracción molar dióxido de carbono supercrítico en etil palmitato a
313.15, 323.15 y 333.15
85
Configuración básica de una columna de destilación reactiva
93
Esquema para la producción de biodiesel por destilación reactiva a)
con alimentación estequiométrica y b) usando metanol en exceso
97
Esquema de extracción reactiva simulado
99
Posibles productos para la oxidación de glicerol
108
I H |
Avances InvestigatiTOS en la Producción de Biocombustibles
Figura
Figura
Figura
Figura
6.2.
6.3.
6.4.
7.1.
Estructura Monoglicéridos
115
Mecanismo de Reacción por Esterificación Directa
116
Mecanismo de Reacción por Interesterificación
117
Contaminantes emitidos por un motor diesel (Nisan 2.0), utilizando
diesel y biodiesel como combustible
138
Figura 7.2. Difractogramas de rayos X de las carbonillas
139
Figura 7.3. Espectros Raman de las carbonillas
140
Figura 7.4. Espectros DRIFTS de las carbonillas
140
Figura 7.5. Micro fotografías TEM de las carbonillas, (a) Biodiesel (b) Diesel,
(c) Printex-U y (de) Vulcan
141
Figura 7.6. Perfiles de combustión de carbonilla en NOx + 0 2
142
Figura 7.7. Perfiles de combustión de carbonilla en NOx + 0 2 catalizada
por Cu/A1203
142
Figura 7.8. Velocidad de oxidación de la carbonilla en condiciones isotermas
143
Figura 8.1: Ruta metabòlica de la producción de metanol en S. cerevisiae
154
Figura 8.2. Ruta metabòlica de Carbohidratos en Z. mobilis
155
Figura 8. 3: Técnicas de mejoramiento de microorganismos
159
Figura 10.1. Concentración versus tiempo para fermentaciones convencional y
extractiva
208
Figura 10.2. Diagrama de bifurcación para la velocidad de producción de etanol con
el área de permeación como parámetro de bifurcación
209
Figura 11.1. Almacenamiento de hidrógeno en densidad másica y volumétrica para
diferentes métodos químicos
216
Figura 11.2. Rendimiento a hidrógeno para diferentes relaciones molares agua/
etanol: a. 3, b. 6 y c. 9. Relaciones molares inerte (argón)/(agua/etanol):.... 223
Figura 11.3. Efecto de la adición de inerte en la distribución de productos de
reacción del reformado de etanol
225
Figura 12.1. Variables de importancia en el estudio de sistemas expuestos a campos
magnéticos
232
Figura 12.2. Movimiento de una particular con carga en el seno de una suspensión
expuesta al efecto de un campo electromagnético
232
Figura 12.3. Radio de curvatura de una partícula con carga en el seno de una
suspensión bajo influencia del efecto de un campo electromagnético
234
Figura 12.4. Producción de etanol asistida por campo electromagnético para el tratamiento
magnético de suspensiones microbianas de Saccharomyces cerevisiae
236
Figura 12.5. Reacción genérica de obtención de biodiesel
239
Figura 12.6. Representación esquemática de una microonda
240
LA5J
Car!' s Ariel Cardona A l z a e
TABLAS
Tabla 1.1.
Parámetros cinéticos del modelo ping pong para esterificaciones en
medio no acuoso catalizadas por lipasas
34
Tabla 3.1. Ventajas y desventajas del uso de BCCs
58
Tabla 3.2. Productos comerciales obtenidos mediante BCCs
59
Tabla 3.3. Condiciones de cultivo y tipo de soporte utilizados en la producción
de algunos CPPS con microorganismos productores de lipasas
63
Tabla 3.3
(Continuación). Condiciones de cultivo y tipo de soporte utilizados
en la producción de algunos CPPS con microorganismos productores
de lipasas
63
Tabla 3.4. Algunas condiciones de reacción y sustratos utilizados en la producción d
ésteres metílicos de ácidos grasos (EM) mediante catálisis con células inmovi
lizadas en partículas de biomasa (CPB) o biocatalizadores de células completa
(BCC)
64
Tabla 4.1. Algunas aplicaciones de los Fluidos Supercríticos
73
Tabla 5.2. Composición del aceite de palma usado en la simulación (% peso)
95
Tabla 5.3. Propiedades calculadas
95
Tabla 5.4. Constantes para el cálculo de Cp
96
Tabla 5.5. Constantes para el cálculo de la presión de vapor por Antoine
96
Tabla 5.6. Paramétras de interacción de grupos para sistemas que contienen
triglicéridos
91
Tabla 5.7. Principales datos obtenidos en la simulación del proceso
10C
Tabla 6.1. Principales propiedades físicas del glicerol
105
Tabla 6.2. Hidrogenólisis de Glicerol
112
Tabla 7.1. Análisis elemental de las carbonillas
135
Tabla 7.2. Análisis inmediato de las carbonillas
13Ç
Tabla 8.1: Principales microorganismos empleados en la producción de etanol y
vía fermentativa
152
Tabla 8.2: Levaduras empleadas en la producción de etanol utilizando diferentes
materias primas
15:
Tabla 8.3: Bacterias empleadas en la producción de etanol utilizando diferentes
materias primas
156
Tabla 8.4: Ejemplos de mejora de microorganismos, técnicas usadas y
característica mejorada
162
Tabla 8.5: Composición química de algunas materiales lignocelulósicos (% en
base seca)
16í
Tabla 10.1. Clasificación de estados estacionarios para un sistema bidimensional
201
Tabla 10.2. Efecto de variables en la estabilidad de sistemas productores de etanol 20(
I 16 |
— —
Avance-- InvcsHi'aiivi n en la Producción de Biocombustibles
Tabla 10.3. Datos de rendimiento y productividad para fermentación convencional
y extractiva
208
Tabla 11.1.a. Resumen de catalizadores para reformado de bioetanol
217
Tabla 11.1 .b. Resumen de catalizadores para reformado de bioetanol
218
Tabla 11.1.c. Resumen de catalizadores para reformado de bioetanol
219
Tabla 11.2. Condiciones de operación utilizadas para los cálculos termodinámicos
223
Tabla 12.1. Estudios de los efectos biológicos de campos electromagnéticos sobre
Saccharomyces cerevisiae
236
Tabla 12.2. Parámetros cinéticos de la fermentación en lote de mieles de caña de azúcar
por Saccharomyces cerevisiae a 30°C y 300 rpm en el biorreactor tipo tanque
agitado asistido por campo electromagnético, usando una combinación de dos
diferentes tipos de sistemas de generación de campo electromagnético 238
Tabla 12.3. Datos comparativos de la fermentación de etanol usando S. cerevisiae inmovilizada en diferentes biorreactores.
238
Tabla 12.4. Particularidades de sistemas de microondas empleados en varios
procesos
243
.
Q7J
«
•Vanees Investiga ih o» en la Producción de Biocombustibles
CAPÍTULO 1
PRODUCCIÓN ENZIMÀTICA DE BIODIESEL
Carlos Eduardo Orrego Alzate*,
Diana Marcela Cetina Medina,
Óscar Darío Hernández Parra
En este capítulo se presentan los aspectos básicos de la producción de biodiesel catalizada por lipasas. Inicialmente se analizan las previsiones necesarias que se deben tener
para que estas enzimas ejerzan su función catalítica en sistemas no acuosos para lo cual
se han publicado diferentes tipos de tratamientos, incluida la inmovilización. En una segunda parte se estudian los fundamentos de la cinética de reacciones mono y bi-sustrato
para la mejor comprensión de los modelos que se han propuesto por parte de diversos
autores para las reacciones de transesterificación e interesterifícación que usualmente se
utilizan en la producción de biodiesel vía catálisis con lipasas.
1.1. LIPASAS
Las lipasas (triacilglicerol hidrolasas, E.C. 3.1.1.3) son enzimas capaces de hidrolizar o sintetizar glicéridos de ácidos grasos de cadena larga [1], cuya función natural más conocida es la
contribución que hacen a la digestión de los triglicéridos aprovechando la energía de sus enlaces ésteres. Aparte de sus sustratos naturales, tales como triglicéridos y ésteres insolubles
en agua, las lipasas pueden catalizar hidrólisis enantio y regioselectivas y síntesis de un gran
espectro de ésteres naturales y sintéticos [2-4], Las aplicaciones industriales de lipasas han
sido revisadas a fondo por Vulfson [5], Actualmente, las lipasas encuentran aplicaciones en
el procesamiento químico orgánico, formulaciones de detergentes, síntesis de biosurfactantes, la industria oleoquímica, la industria lechera, la industria agroquímica, la manufactura de
papel, nutrición, cosmética, en la síntesis de químicos finos y el procesamiento farmacéutico
[6]. Las lipasas son las enzimas que más frecuentemente se utilizan en medios orgánicos
ya que tienen una afinidad inherente por los ambientes hidrofóbicos [7]. Además tienen la
habilidad de catalizar no sólo reacciones hidrolíticas sino también reacciones de síntesis en
medios orgánicos, cuando el contenido de agua está muy limitado. Más aún, estas enzimas
pueden presentar una amplia especificidad en relación con el sustrato y también ser muy
selectivas con respecto a la reacción catalizada, incluyendo una alta enantio selectividad [8],
' Universidad Nacional de Colombia-Sede Maníjales, Plantas Piloto de biotecnologia y Agroindustria, Campus Ltì Nubla,
AA 127, Colombia. Telefax: +57-68879400 Ext. 55880.E-mail: ceotregoa@unal.edu.co
Manióles,
Producción Enzimática de Biodicsel
Hay publicados numerosos trabajos que resaltan el gran potencial de lipasas en química
orgánica [9-12],
1.1.1 ASPECTOS ESTRUCTURALES DE LAS LIPASAS
Las lipasas usadas con mayor frecuencia provienen de microorganismos (bacterias y hongos), pero están también presentes en animales y plantas. Sus moléculas han sido reconocidas y estudiadas y muestran que el número de aminoácidos en sus cadenas normalmente
se encuentra entre 270 y 641 [13]. Las lipasas están contenidas, estructuralmente hablando,
en la familia de las <x/[3 hidrolasas, proteínas cuya estructura consiste en un arreglo central
hidrofóbico de ocho [3-hojas empacadas entre dos capas de a-hélices amfifílicas. Las lipasas se denominan serina hidrolasas, ya que su sitio activo contiene una tríada catalítica
formada por los aminoácidos Ser - His - Asp/Glu que permite el ambiente adecuado para
catalizar tanto la hidrólisis como la síntesis. El mecanismo, que es esencialmente el mismo
para la creación o ruptura de enlaces tipo éster de los acilglicéridos se puede dividir en varios
pasos:
1. Unión del sustrato a la serina de la tríada catalítica, dando como resultado un intermedio
tetraedral estabilizado por enlaces de hidrógeno entre los residuos His y Asp del sitio
activo.
2. El alcohol es liberado creando un complejo acil-enzima.
3. Luego se realiza un ataque de un nucleófilo (agua en la hidrólisis, alcoholes en las transesterificaciones u otros ésteres en las interesterificaciones) formando de nuevo un intermediario tetraedral.
4. Luego, la resolución del ataque hace que se liberen los dos productos (un ácido o éster)
y libera la enzima en su forma original.
Este mecanismo se ilustra en la figura 1.1. mediante un ejemplo para una hidrólisis [14]:
o- N
R
- .. V
Hfc
\
\/7
Figura 1.1. Ejemplo del mecanismo
de reacción de una lipasa
Kvances Investiga tivus en la Producción de Biocumbustibles
1.1.2. EL SITIO ACTIVO Y LA ACTIVACIÓN INTERFACI AL
La evidencia de un cambio súbito en la actividad de lipasas después de una concentración
determinada de sustratos en medios acuosos llevó a un estudio más a fondo de la estructura de estas proteínas que explicara este fenómeno. Mediante la cristalografía de rayos X
y otras técnicas aplicadas en las lipasas nativas y en complejos con inhibidores (p. ej. lipasa
de Candida rugosa [15, 16], Pseudomonas cepacia [17]) se revelaron cambios conformacionales con respecto a la enzima nativa que llevaron a proponer que existe una "tapa"
cubriendo el sitio activo de las lipasas. De esta manera, estas enzimas tienen dos estructuras
estables, una cerrada (inactiva) en agua en la cual esta tapa cubre el espacio donde se enlazan
los sustratos y, por tanto, también al sitio activo, y una abierta (activa) que se forma en una
interface agua - lípido/ solventes orgánicos que efectúa un cambio en la conformación,
desplaza esta tapa y expone el sitio activo.
Las lipasas tienen un amplio espectro de aplicaciones industriales, y una de las más actuales
es su aplicación como un catalizador en la producción de biodiesel. Existe ya una gran cantidad de estudios alrededor de su desempeño [18-26],
1.1.3. PRE-TRATAMIENTOS DE LIPASAS PARA CATÁLISIS EN MEDIOS NO
ACUOSOS
Hasta hace muy poco tiempo, el uso de enzimas en medios no acuosos parecía no ser viable,
pues al comparar con las reacciones llevadas a cabo en solución acuosa, las velocidades de
reacción en solventes orgánicos anhidros son típicamente de dos a cuatro órdenes de magnitud más lentas [27]. Como posibles causas de este comportamiento está el hecho de que
las enzimas son insolubles en tales medios formando aglomerados. Sufren además la deshidratación de regiones críticas de la enzima y en tales disolventes no se despliega fácilmente
como sí sucede en un medio acuoso- la estructura alterada de la enzima por su liofilización
(proceso usual para su conservación). Para soslayar estos problemas, se ha descrito una serie
de estrategias con el objetivo de acelerar la tasa de reacción en reacciones enzimáticas en
medios no acuosos que incluyen, entre otros, la modificación química, el tratamiento con
tensoactivos, el uso de sales para su co-liofilización, la activación mediante éteres corona y la
inmovilización en soportes poliméricos [28-30], técnicas que se describen en forma sucinta
a continuación.
Tensoactivos: para ilustrar esta alternativa de activación se resalta el trabajo que realizaron
Yasuda et al [31] para mejorar la actividad de transesterificación de una lipasa liofilizada.
Las enzimas que fueron liofilizadas en compañía de metil ésteres de ácidos grasos (los de
los ácidos esteárico, mirístico y láurico mostraron los mejores resultados) o de ciertos tipos
de surfactantes (Tritón: X-45, X-57, X-100 y X-165) exhibieron mayores actividades de
transesterificación que las que se prepararon sin estos aditivos. Otros resultados que usaron
metodología similar fueron los reportados por Persson et al [32] que utilizaron lipasas de
| 21 |
•
l'roduccton !
_ Biodlc^c]
Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Rhizomucor miehei y Pseudomonas cepacia adsorbidas en el surfactante monoestearato de sorbitan. Las lipasas adsorbidas en e]
surfactante fueron "activadas" entre 1.9 a 150 veces comparada con la lipasa cruda. En otre
reporte la lipasa de Candida rugosa, recubierta con un surfactante (di-dodecil éster ribitol
amida del ácido glutámico) exhibió una considerable actividad en la esterificación de lauri]
alcohol y ácido láurico en isooctano. En contraste, el polvo de lipasa nativa no mostró casi
actividad cuando se dispersó en el solvente [33].
Co-liofiü^ación con sales: se ha demostrado que al co-liofilizar la enzima con algunas sales le
permite un mejor desempeño catalítico en disolventes orgánicos. Como explicaciones se
ha sugerido el incremento de la polaridad del sitio activo detectado por medio de espectroscopia de resonancia de giro de electrones (ESR por sus siglas en inglés), por el efectc
estabilizador de las sales cosmotrópicas y al fenómeno de hidratación preferencial [34], LÍ
activación por sales es un fenómeno general [28], Respecto a las lipasas, la adición de cloruro de potasio antes de la liohlización de la lipasa de Humicola lanuginosa incrementó si
actividad hasta 46 veces comparada con la lipasa cruda [4],
Eteres corona: los éteres corona son poliéteres cíclicos compuestos de unidades de oxi-eti
leño, que se han usado para la activación enzimàtica también con un procedimiento de
co-liofilización de una disolución acuosa lipasa-éter. Los estudios hechos por van Unen 5
colaboradores [35, 36] han señalado que esta técnica puede resultar en una alta actividac
biocatalítica en medios orgánicos. En particular reportaron que la adición de éter corona antes de la liofiüzación de oc-quimotripsina mejora la actividad en tolueno. De manera similai
Koops et al\bl\ y Persson efa¿[32] elevaron la actividad de algunas lipasas. Los éteres coroni
incrementan la frecuencia de conversión de la enzima (TOF por sus siglas en idioma inglés
y/o el porcentaje de enzima catalíticamente activa. Ambos efectos pueden ser explicado;
por la estabilización conformacional inducida por los éteres corona en medios orgánicos
Parte de esta estabilización se atribuye a los complejos no covalentes de los éteres coron;
con los grupos amino en los residuos de lisina en las proteínas [36], Una segunda hipótesi;
ha sido desarrollada por Santos et al\ò*S\ quienes propusieron que los éteres corona actúar
como impresores moleculares, los cuales preservan la estructura local del sitio activo enzi
mático durante la catálisis en ambientes deshidratados.
Ciclodextrinas: las ciclodextrinas comprenden una serie de oligosacáridos cíclicos de D-glu
copiranosa enlazados con un enlace oc(l-4), producidos a partir de almidón [39]. Las ciclo
dextrinas son capaces de estabilizar proteínas en solución acuosa y en solventes hidrofílicos
Griebenow et al [40] observaron que si la subtilisina Carlsberg se liofiüza en presencia d<
metil-¡3-ciclodextrina, la tasa de transesterificación de m-fenetil alcohol con vinil butirato er
tetrahidro furano se incrementa en 164 veces. Un efecto similar se observó para las lipasa;
de Pseudomonas cepacia (PCL) cuando fueron co-liofilizadas con nueve ciclodextrina;
[41], Como con los éteres corona, el incremento de la actividad se explica por la retenciór
de la estructura secundaria de la enzima nativa en un solvente polar orgánico [28].
'¡i;in< Lnresií'M,L\us cri] l.i Produccir-n ve .rtmcumbiisnlíks
Impresores moleculares: la impresión molecular bloquea la enzima en una conformación favorable para la catálisis durante la liofilización a través de la adición de una molécula-plantilla
a la solución de la enzima antes de su congelamiento, seguida por su remoción después de
la liofilización. Se ha mostrado que las lipasas co-liofilizadas con materiales anfifílicos tipogéminis, solubles en agua, tienen una alta actividad enzimàtica en medios no acuosos [42],
Modificación química: otra estrategia para incrementar la solubilidad, actividad y estabilidad
de lipasas en solventes orgánicos es la modificación química de su superficie. Koops et al.
[43] reportaron el uso de dos derivados activados de polietilenglicol y «-octanol como modificadores; el éter monometílico triesilactivado de polietilenglicol 2000 fue el modificador
más efectivo, al activar lipasas que mostraron un incremento de su actividad en disolventes
orgánicos en 27 veces.
1.2. INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS
La inmovilización de enzimas consiste en la restricción deliberada de la movilidad de la
enzima [44], Después de su inmovilización las enzimas quedan localizadas en una región definida del espacio, limitada por barreras materiales o electrostáticas, que separan físicamente
la enzima del seno del medio de reacción, pero que son permeables a las moléculas de reactivos v de productos. La inmovilización puede servir para dos objetivos: mejorar la estabilidad de la enzima y reducir su consumo ya que la enzima puede ser retirada y reutilizada en
varios ciclos de reacciones. El grado de mejora de esta estabilidad operacional depende de
la estructura de la enzima, el método de inmovilización y el tipo de soporte [45],
Los procesos de inmovilización pueden ser llevados a cabo mediante manipulación del
microambiente de la enzima variando el tipo de enlace con el soporte (p.ej. enlace covalente,
adsorción hidrofóbica e intercambio iónico y entrecruzamiento), por atrapamiento en una
barrera material (p.ej. microencapsulación en vesículas lipídicas, atrapamiento en micelas
invertidas o en matrices poliméricas, y confinamiento membranas de ultrafiltración). También se puede lograr la inmovilización de la enzima alterando su macroambiente (mediante
modificación del medio de reacción, lo que puede ocasionar por, ejemplo, su precipitación
en el disolvente orgánico) [46].
La inmovilización de lipasas tiene dos aspectos importantes: en primera medida, y dado que
la mayoría de lipasas parecen requerir alguna forma de activación interfacial, la inmovilización debería promover este proceso al máximo posible y prevenir que la enzima activada
se revierta a su forma cerrada. Existen estudios que muestran que matrices que provean
simultáneamente características no-polares/hidrofóbicas y polares/hidrofílicas son adecuadas para alcanzar una activación y estabilización óptima de la lipasa. Como segundo aspecto,
y dado que las lipasas comerciales son frecuentemente mezclas crudas con contenidos tan
l J r.-diKXi-n I: il zi malica ele Biodiese!
bajos como 0.1 - 5% p/p, el protocolo de inmovilización debería permitir el enlace selectivo de una enzima de interés a partir de una mezcla compleja de enzimas [47]. Las estructuras 3D de lipasas indican que son proteínas simultáneamente hidrofílicas e hidrofóbicas,
siendo su principal área hidrofóbica la región alrededor del sitio catalítico. De acuerdo con
esta hipótesis, la afinidad entre soportes y enzima es muy importante para la inmovilización
eficiente de la enzima [48],
Los métodos de inmovilización de lipasas-enzimas pueden ser diferenciados en dos categorías generales: retención física y enlazamiento químico [49], Un esquema que ilustra algunos
de los tipos de inmovilización, según esta categorización, se muestra en la figura 1.2.
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Figura 1.2. Métodos de inmovilización
de
encimas
1.2.1. MÉTODOS DE RETENCIÓN FÍSICA
1.2.1.1. Adsorción
Es el método más simple e involucra interacciones superficiales reversibles entre la enzima
y el material de soporte. Se ha observado que la inmovilización por adsorción no-covalente
es muy útil en sistemas no acuosos, en los cuales la desorción puede ser despreciada debido
a la baja solubilidad de enzimas en estos solventes, por lo que son ampliamente usadas en
estos medios de reacción [44, 50-56].
1.2.1.2. Atrapamiento o inclusión
En el atrapamiento en matrices, la solución de enzima se mezcla con un fluido polimèrico
que luego se solidifica. Ejemplos característicos de este tipo de inmovilización son el atrapamiento en geles de polisacáridos como alginatos, x-carragenanos, agar, quitosano y ácido
poligalcturónico u otras matrices poliméricas como gelatina, colágeno y polivinilalcohol
[57-60]. Esta técnica tiene diferentes opciones como la del atrapamiento de lipasas en mem-
| 24 |
«
Avances jnvesriííauvos en ja Producción de Biocombustibíes
branas delgadas semipermeables [61-64] o la encapsulación en microcápsulas que varían
entre 1 0 - 1 0 0 pim de diámetro usando vesículas lipídicas [65], materiales inorgánicos [66] y
microcápsulas de hidrogel [67-69].
1.2.2. INMOVILIZACIÓN POR ENLACE QUÍMICO
1.2.2.1. Enlazamiento iónico
Está basado en las interacciones electrostáticas de grupos iónicos con diferentes cargas entre la matriz del soporte de las enzimas. Los soportes de intercambio iónico (p. ej. Duolite
A358, celulosa DEAE, Sephadex DEAE y carboximetil celulosa) se han usado con frecuencia y buen desempeño [70-73].
1.2.2.2. Enlace covalente
La inmovilización de lipasas por enlace covalente con matrices insolubles es una técnica
ampliamente investigada. Se pueden formar enlaces covalentes entre los materiales de soporte y algunos grupos funcionales de los residuos de aminoácido presentes en la superficie
de la enzima (usualmente - N H , de la lisina o la arginina, -COOH de los ácido aspártico o
glutámico, -OH de la serina o la treonina y - S H de la cisteína). En un caso típico del uso
de esta técnica el soporte se activa inicialmente por un reactivo específico para hacer que
sus grupos funcionales se tornen fuertemente electrofíücos, para que luego reaccionen con
algunos grupos nucleofílicos fuertes en la enzima. La reacción involucrada puede involucrar
la formación de isoúrea, enlaces diazo, enlaces peptídicos o una reacción de alquilación. El
procedimiento debe ser llevado a cabo bajo condiciones de reacción suaves para evitar la
desactivación de la enzima [74-80]. En la figura 1.3. se ilustra el tipo de enlace imina que se
forma cuando se usa glutaraldehído como agente entrecruzante para soportes con grupos
amino superficiales disponibles o como brazo espaciador en la inmovilización covalente
con residuos de lisina.
'}— NH2
CH0
CHJ
CH2 CH2 C H O
NH?_L
1
N=CH—CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH=N~L
- Entrecruzamiento
i
NCH—CMCH2 * CH¡2 CHfíH
Figura 1.3. Entrecruzamiento encima-soporte y soporte-soporte con glutaraldehído
Producción Enzimàtica de Biodiesel
1.3. ASPECTOS CINÉTICOS EN LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
Luego de conocer los procedimientos mediante los cuales las lipasas son protegidas, activadas o inmovilizadas para su uso en medios orgánicos, deben comprenderse otros aspectos
que afectan su comportamiento en estos ambientes. El primero de ellos es el que debe
garantizarse una disponibilidad de agua mínima para que estas enzimas logren hacer su
función catalítica. El parámetro fundamental que se utiliza para la medida de esta condición
es la actividad de agua del medio de reacción o del microambiente en el que la lipasa se
encuentra inmovilizada.
1.3.1. LA IMPORTANCIA DE LA ACTIVIDAD DE AGUA
El agua es crítica para las enzimas y afecta su desempeño en diferentes formas: influenciando la estructura de la enzima mediante enlaces no-covalentes como los puentes de
hidrógeno, facilitando la difusión de reactivos y alterando el equilibrio de la reacción. Un
contenido muy bajo de agua generalmente reduce la actividad enzimàtica. Varios estudios
han demostrado que la cantidad de agua adsorbida en una enzima en disolventes orgánicos
es un parámetro más determinante de la actividad enzimàtica que el contenido de agua del
solvente mismo. Pencreac'h y Baratti [81] encontraron que la actividad hidrolítica de lipasas
en medios orgánicos no puede ser estimada de la actividad en medios acuosos. Entonces,
para cuantificar la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción, la actividad termodinámica de agua ( a j es una medida muy usada [34, 82] y es considerada el parámetro clave
que gobierna la actividad de lipasas y enzimas en general en medios orgánicos [83],
Usualmente, las lipasas adsorbidas no son muy útiles en trabajo en sistemas con alta actividad de agua por su posible desorción, sin embargo, las enzimas pueden permanecer
adsorbidas en las superficies de membranas en medios orgánicos debido a la insolubilidad
práctica en disolventes orgánicos. A su vez, la inmovilización puede permitir altas actividades de esterificación sin una hidrólisis asociada [84], Los biocatalizadores de lipasas inmovilizadas usan frecuentemente matrices que, por sí mismas, pueden actuar como adsorbentes
de agua [85],
La actividad de agua ( a j de un medio es un factor importante en reacciones catalizadas
por lipasas porque las reacciones lipolíticas ocurren en interfases aceite-agua. Una alta aw
favorece la lipólisis mientras las reacciones de esterificación se conducen de mejor manera
con bajos valores de a . En una esterificación de ácido láurico con octan-l-ol en isooctano
catalizado por lipasas inmovilizada en un sol-gel, los datos indicaron que el a^ del medio
correlacionó con la cantidad de éster (octil laurato) producido con un rendimiento máximo
de éster a un a de 0.6. La alcohólisis catalizada por lipasas y la acilación [86] se conducen
mejor a a < 0 . 5 mientras que la lipasa de Candida rugosa expresó su más alta relación
de transesterificación a hidrólisis a aW = 0.11 yJ la más alta actividad total a aw = 0.53 L[87],
J
'
U6J
"
Avances mvesuiranvos en la Producción de Biocombusübíes
Finalmente, la actividad de agua inicial de un disolvente orgánico es modificada por el agua
liberada en la reacción y su exceso puede llevar a la generación de sistemas bifásicos, lo que
puede ser beneficioso para ésteres de síntesis [88].
I.3.2. CINÉTICAS MONOSUSTRATO. LA ECUACIÓN DE MICHAELIS - MIENTEN
La ecuación más fundamental para el estudio de cinéticas de reacción enzimáticas es la que
se basa en la suposición simple de que una enzima (E) se enlaza reversiblemente con un
sustrato ( i ) para formar un complejo enzima-sustrato (ES) que posteriormente reacciona
irreversiblemente para arrojar un producto (P) y devolver la enzima en su forma original
(E). Este mecanismo se puede desglosar como sigue:
enzima E y un único sustrato, en donde ES simboliza el complejo enzima sustrato y P el
producto:
E + S+zz
ES - + E + P
(l.l)
La velocidad de esta reacción es proporcional a la concentración que existe del complejo
enzima-sustrato, de tal manera que:
v=kca,[ES]
(1.2)
Suponiendo que la velocidad a la que se forma el complejo enzima - sustrato es contrarrestada por la velocidad en la que se libera producto y en la que se liberan enzima y sustrato, se
puede obtener un parámetro denominado la constante de Michaelis K :
[E][S]
[£S]
k_l+k2
A,
(1.3)
Es preferible que la expresión de la velocidad de reacción se normalice sobre la concentración total de enzima en el sistema, ya que ésta se encuentra repartida entre el complejo
enzima - sustrato y la enzima libre, de tal manera que:
II...
I' M ' M
l ' l
1
tu
^
(1.4)
Producción Enzimàtica de BiodieseJ
Con lo que la velocidad de reacción se puede obtener como:
y =
Ir
[/
Eli
(1.5)
E introduciendo al parámetro y
reacción posible:
=
— k.
¡
q u e representa la máxima velocidad de
vmax [S]
K
+[S]
(1.6)
Este resultado se ha denominado la ecuación de Michaelis — Menten.
1.3.3. CINÉTICAS BISUSTRATO
Históricamente, las cinéticas de reacción enzimàtica están ligadas a los parámetros desarrollados para reacciones con un único sustrato (monosustrato). Sin embargo, en el caso de la
producción de biodiesel, las posibles rutas (transesterificación directa e hidrólisis — esterificación) incluyen reacciones con dos sustratos (bisustrato). Las materias primas concernientes al proceso (aceites y grasas refinadas, crudas o usadas, etc.) contienen un gran número
de sustancias, aunque desde el punto de vista químico, los triglicéridos son las principales
materias primas del proceso y generalmente a éstos van dirigidos muchos estudios cinéti-
Los modelos desarrollados para reacciones bisustrato se pueden dividir de acuerdo a la
forma en que los sustratos son enlazados por la enzima en dos tipos: secuenciales y ping
- pong [89, 90].
En los mecanismos secuenciales, la enzima debe enlazar los dos sustratos para formar un
complejo ternario de enzima — sustratos antes de liberar los productos. En este caso se utiliza una sub clasificación de acuerdo al orden en que los sustratos deben enlazarse. Si existe
un orden preciso para enlazarse se habla de mecanismos secuenciales ordenados, si, por
el contrario, el orden no interesa, el mecanismo se denomina secuencial aleatorio.
En los mecanismos ping — pong el enlace de la enzima con cualquier sustrato produce
un complejo que libera un producto y luego el siguiente sustrato se enlaza para liberar un
siguiente producto y regresar a la enzima a su estado original.
Avances IrH'gsURativos en la Ptniluccii!»» <.ie Biocombuscibies
La expresión de velocidad resultante para estos casos se puede expresar respectivamente
:omo:
v
—
!
M ^ J
(Secuencia! ordenado, primero se enlaza A) (1.7)
[A]+[A][B]
ksKab+Kah[Á\+Kha[B]+[A\B}
(Secuencial aleatorio)
v=
(1.8)
Pon Bi Bi
KUt [A] + Ky¡ [5]+ [A ][5]
S
)
5n la figura 1.4. se muestran los esquemas de las cinéticas mencionadas suponiendo que la
reacción general entre los dos sustratos es irreversible.
A
1-
i'
EA^E'P
EA
A
B
B
Á
R
Q
1)
EAB — El'Q
1»
FQ
P
e)
Q
Q P
I'igtra 1.4. Mecanismos de reacciones btsustrato: a) Mecanismo ping-pong bi-hi,
b) Mecanismo secuencial ordenado, c) Mecanismo secuencial aleatorio
Los mecanismos relacionados representan las situaciones más simples para la comprensión
de las reacciones bisustrato. Sin embargo, de acuerdo a las características de reactantes utilizados, lo más riguroso es postular mecanismos paso a paso que describen el funcionamien-
c -9)
I 'roduccion i^nzimatica ele Diodiesu
to de las lipasas, la formación de complejos intermedios enzima - sustrato y enzima - producto, para obtener las expresiones correspondientes a las que se ajustan estadísticamente
los datos experimentales que se puedan tomar. Un caso de esta aproximación lo presentan
Paiva et al ¡91] que derivan para hidrólisis reversibles simultáneas de ésteres, la tasa de un
éster particular con una mitad acilo m y una mitad alcohólica n, a partir de un número I de
mitades acilo y J mitades alcohólicas presentes en la solución.
1.3.4. MECANISMOS Y CINÉTICAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
Como ya se ha mencionado, el proceso de producción de biodiesel tiene básicamente dos
rutas, la transesterificación y un proceso en dos pasos, hidrólisis - esterificación. Debido
a la complejidad de los tri-acil-glicéridos usados como materias primas, para los estudios
cinéticos usualmente se deben realizar simplificaciones como restringir el seguimiento de la
reacción a grasas idealizadas compuestas de un solo tipo de ácidos grasos y la transformación global del triglicérido a los metil o etil ésteres sin considerar los pasos intermedios de
formación de mono y di acil glicéridos.
1.3.4.1. Cinéticas de transesterificación
La figura 1.5. (a) muestra la reacción global de transesterificación. En la figura 1.5. (b) se
ilustra un mecanismo más real en el que se producen los alquil ésteres a partir de mono, di
y triglicéridos.
í
R,—C—O
.
t
9I
y—O—C—R
Et—C~I»"«
• 3 r—oa «F
R( C O
»a—c--o R •
y —o— C " * J
/-—O --C—Rj
^
©M
Ra—C O—»
?
T
> OH
•••
Rj C O R
Figura 1.5. Esquema de la transesterificación o alcohólisis de triglicéridos: a) Reacción general, b) Pasos de la reacción
nces Invesrigaovos en la Producciun de Biocombusiibles
Al-Zuhair et al [92] estudiaron la cinética de la metanólisis de aceite de palma mediante lipasa
libre de Mucor miehei en n-hexano como solvente mediante la reacción de la Figura 1.4.a
y propusieron un mecanismo Ping Pong Bi Bi con inhibición por ambos sustratos. Dossat
etal [93], usando esta misma reacción, estudiaron la cinética de alcohólisis con butanol de
aceite de girasol con un alto contenido oleico usando lipasa inmovilizada á&¥Jji%pmncor miehei en n-hexano y medio libre de solvente proponiendo un mecanismo Ping Pong Bi Bi. Los
datos se ajustaron al modelo con inhibición competitiva por parte del alcohol.
Una propuesta más completa del mecanismo de la alcohólisis fue propuesta por Camacho et al [94]. Ésta consiste en tomar los pasos según la reacción de la figura 1.5.b, aunque
aumentando el número de triglicéridos tomados en cuenta de acuerdo a la posición de la
cadena de ácido graso e incluyendo como paso del mecanismo la migración de las cadenas
de ácido graso en diferentes posiciones (migración (l,2)/(2,3)- a (l,3)-diacilglicéridos y (2)a (l)/(3)-monoacilglicéridos) (ver figura 1.5.). La reacción fue estudiada usando tnoleína
y etanol como sustratos, así como un aceite con alto contenido de ácido oleico y etanol,
mediante lipasas inmovilizadas de Mucor miehei y Rhizopus oryzae en metil /er-butil éter
como solvente. Se realizó la derivación de las ecuaciones para describir la variación de la
concentración de los tri-, di- y monoglicéridos (sumando todas las combinaciones para cada
acilglicérido) respecto al tiempo, usando la suposición de estado estable para los complejos
enzima - sustrato.
E*0S5Í=^=ÍEA-OOS
'
gol==iQSS
<_
E-OSi=¿=±EA+SSS
*
* *
b)
c)
i)
EA-OTÍ===E + o s o
d)
+BA
e)
Figura 1.6. Mecanismo de reacción propuesto por Camacbo et al [94 j:
a) Desacilación del triglicérido a través del complejo acil - enverna para producir los diglicéridos,
b) Lomen-ración del 2-monoglicérido a 1 (3)-monoglicérido, c) Formación de glicerol del 1(3)monoglicéndo por parte de la lipasa, d) Formación del 1,2-diglicérido del 1 (3)-monoglicérido
por esterificación del grupo acilo liberado del triglicérido, e) Esterificaríón del grupo aalo liberado
del triglicérido a través del complejo acil- encima con el alcohol
Otra propuesta interesante es la hecha por Cheirslip et al [95], En ésta se involucra al agua
como un sustrato adicional además de aceite de palma y etanol, de tal manera que se tom
| 31
Producción hnznrninoi de fíiodiesel
marón en cuenta tanto reacciones de transesterificación como hidrólisis de los glicéridos y
esterificación de los ácidos grasos libres. En este trabajo se utilizó lipasa de Pseudomonas
sp inmovilizada en polvo de polipropileno micro poroso. Se propusieron tres mecanismos
para el proceso en donde de nuevo se hace la suposición de estado estable para los complejos enzima — sustrato en los cuales se incluyó la inhibición por alcohol. Los datos experimentales se ajustaron mejor al tercer mecanismo.
1.3.4.2. Cinéticas de interesterifícación
La interesterificación se refiere al uso de sustrato un éster, generalmente más pequeño, que
modifica el sustrato de triglicérido. El esquema de la reacción se muestra en la figura 1.6.
En este caso no se desintegra el triglicérido sino que se reemplazan las cadenas de ácido
graso con los radicales acilo del segundo éster. La interesterificación presenta como ventaja
frente a la alcohólisis la capacidad de reutilización de la lipasa, ya que no tiene una inhibición
apreciable [96], aunque Xu é>/<?/[97] demostraron mediante un estudio cinético de la interesterificación de aceite de soya y acetato de metilo mediante lipasa inmovilizada de Candida
antarctica libre de solvente que los datos cinéticos se ajustan a un modelo Ping Pong Bi Bi
con inhibición por parte del acetato.
1.3.5. EFECTOS DEL MEDIO DE REACCIÓN EN LAS EXPRESIONES DE
VELOCIDAD
Hasta la fecha no hay un modelo general para predecir los efectos del medio en la cinética,
en la estabilidad de la enzima, en la enantioselectividad y en la estabilidad del reactor [28, 83.
98-100]. Se han hecho intentos para establecer correlaciones entre la actividad de la enzima
y las diferentes propiedades fisicoquímicas de los disolventes, tal como la acomodación de
carga (constante dieléctrica) [83] y la hidrofobicidad (coeficiente de partición octanol/agua
logP) [101, 102],
>4-
b)
Figura 1.6. Esquema de reacríón de interesterificación: a) Reacción general, b) Pasos de reacríón
Avances ínvesti^ativos en ¡a Producción de
fíiocombusríbles
tín una teoría que ha sido desarrollada por van Tol et al. [103] de acuerdo a la teoría del estado de transición, el complejo del estado de transición se asume en equilibrio con el estado
base del sustrato y la enzima. La correspondiente constante de equilibrio termodinàmico se
puede así expresar en parámetros cinéticos basados en la actividad, que son los mismos en
todos los solventes, como también la constante de especificidad (igual a
/ [Encima],
K . en la ecuación de Michaelis) basada en la actividad termodinámica resulta independiente
del solvente. Por ello, en este modelo, las constantes cinéticas basadas en la actividad son
llamados "parámetros intrínsecos" debido a que el solvente no las afecta. Sandoval et al. [99]
mejoró y verificó este modelo usando la esterificación de ácido oleico con etanol catalizado
por una lipasa inmovilizada para predecir la cinética en varios solventes orgánicos y en sistemas libres de solvente.
Hazarika et al. [102] estudiaron el efecto del solvente en la esterificación de ácido oleico
con etanol en un sistema disperso de lipasa pancreática de porcino. Los solventes fueron
seleccionados con base en sus valores de hidrofobicidad (log P). El valor de log P ha sido
propuesto como una medida cuantitativa de la polaridad del solvente y de la actividad de
la enzima para reacciones catalizadas por lipasas, y en general, las velocidades de reacción
se incrementan con la hidrofobicidad del solvente. La relación de la velocidad de reacción
inicial con los valores de log P de disolvente muestra que la actividad de la enzima se incrementa casi linealmente con el incremento de log P. Resultados similares fueron reportados
con lipasa de Candida rugosa recubierta con un tensoactivo como catalizador en disolventes orgánicos.
Sin importar el tipo de reacción catalizada (bien sea hidrólisis, esterificación o interesterificación), la descripción más general y aceptada de la acción catalítica de lipasas es un
mecanismo Ping Pong Bi Bi [4], Muchos investigadores han propuesto también modelos
cinéticos para reacciones en medios orgánicos basados en este mecanismo [68, 73]. Algunos
valores para síntesis de ásteres en medios no acuosos catalizada por lipasas obtenidos de
diferentes referencias bibliográficas se muestran en la 0.
Existen dos tipos generales de mecanismos cinéticos reconocidos para una reacción Bi Bi,
Ping Pong (no secuencial) o mecanismos de complejo ternario (secuencial). Al Zuhair et al
[92] propusieron un mecanismo de alcohólisis de aceites basados en el mecanismo de hidrólisis enzimàtica. Los grupos funcionales ácidos o básicos encontrados en lugares específicos
en los sitios activos de la enzima catalizan la reacción donando o aceptando protones durante el curso de la reacción. Tal mecanismo de transferencia de protones empieza el paso
catalítico en muchas reacciones catalizadas por enzimas [104],
* t r ; | 33 |
Producción Enzimàtica de Biodiesci
CONCLUSIONES
Las lipasas pueden catalizarla producción de biodiesel mediante reacciones de esterificación
transesterificación e interesterificación. Para hacerlo eficientemente requieren de acondicio
namientos que garanticen la apertura del centro activo a los sustratos, la estabilidad de esta:
enzimas en medios tan agresivos como disolventes orgánicos y la disponibilidad de agu:
suficiente para que desempeñen la función catalítica. La inmovilización, realizada correcta
mente, puede ofrecer el microambiente necesario para que se cumplan estos requisitos.
Sin importar el tipo de reacción catalizada (bien sea hidrólisis, esterificación o interesterifi
cación), la descripción más general y aceptada de la acción catalítica de lipasas es un meca
nismo Ping Pong Bi Bi.
Tabla 1.1. Parámetros cinéticos del modelo ping pong para esterificaciones
en medio no acuoso catalizadas por lipasas.
Sustratos/
Solvente/ Linasa
wo-butírico.
Alcohol amílico/isooctano/LCR libre
Acido laúrico.
sulcatol/tolueno/LCR
Acido palmítico.
mentol/;¿ooctano/LCR
Acido oleico.
Metanol/hexano/LCA
Acido oleico.
etanol/hexano/LPP libre
Ácido oleico.
Etanol/hexano/LMM
Acido oleico.
Etanol/COj S C / M M L
Ácido oleico, nbutanol/hexano/LCR
Ácido oleico, nbutanol/wo-octano/LC'R
V
' max
Ka
Kb
(mmol m i r f ' g 1 )
(mol L ')
(mol L" l l
(mol L ')
K,k
(mol L"1)
Ref.
0,167
0,60
0,750
-
0,020
[105]
0,400
0,439
2,522
-
0,795
[106]
0,640
1,00
0,011
-
0,013
[107]
4,9
0,013
0,016
0,003
[108]
4,0
0,066
0,103
0,020
[109]
23,0
0,45
0,6
-
0,06
[110]
14,0
0,16
1,60
-
0,065
[110]
3,2
0,380
0,190
0,23
0,780
[111]
18,2
19.0
0.599
0,640
0,149
0,128
-
1,933
-
[112]
ri i 2 i
K,A
-
Upasa de Mucor miehetlMM; lipasa de päncreas de porcino: LPP; lipasa de KMiehei: LRM;
lipasa de Candida antarctia. LC4; lipasa de Candida rugosa: LCR
| 34 |
»»
Av anees Investiga ti vos en la Producción de ßiocomb ustible
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