Caracterización y respuesta biológica de nanoceramicas de óxido

Superficies y Vacío 23(S) 27-30, agosto de 2010
©Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales
Caracterización y respuesta biológica de nanoceramicas de óxido de circonio sintetizado
por el método de rocío pirolítico ultrasónico
Janeth Serrano Bello, Javier de la Fuente Hernández, Marco Antonio Álvarez-Pérez*
Laboratorio de Bioingeniería Celular, Facultad de Odontología, UNAM
Coyoacán 04510, México, D.F.
Manuel García-Hipólito, Carlos Hernández-Pérez, Alejandro Arellano-Riasgo,
Julio Alberto Juárez-Islas, Octavio Álvarez-Fregoso
Instituto de Investigaciones en Materiales, UNAM
Coyoacán 04510, México, D.F.
José Luis Suárez-Franco
Facultad de Odontología Río Blanco, Universidad Veracruzana
C.P. 94730, Río Blanco Veracruz.
(Recibido: 18 de febrero de 2010; Aceptado: 04 de mayo de 2010)
Películas delgadas de ZrO2 fueron sintetizadas en función de la temperatura de substrato, por la técnica de rocío
ultrasónico para determinar su biocompatibilidad celular in Vitro. La estructura cristalina del ZrO2 depende de la
temperatura de substrato y los patrones de difracción de rayos X indican que a bajas temperaturas < 400°C, su estructura
es de carácter amorfo mientras que a mayores temperaturas, su estructura es tetragonal con una dirección preferencial de
crecimiento (101). Para determinar la biocompatibilidad celular de estas cerámicas se hicieron pruebas de adhesión celular
sobre la superficie del ZrO2 , así como, pruebas de citotóxicidad celular. Los resultados indican que las células presentan
una adhesividad mayor al 100% respecto a la adhesividad celular de la superficie de vidrio corning 7059 utilizado como
referencia patrón. Por otro lado, no se detecto ningún efecto citotóxico de las cerámicas de ZrO2 sobre las células
osteoblásticas, en consecuencia se determinó que el ZrO2 es un buen candidato para usarse como biomaterial en diversos
aspectos dentales.
Palabras clave: Rocío pirolítico ultrasónico; ZrO2; Biocompatibilidad celular
ZrO2 thin films were synthesized by ultrasonic spray pyrolysis process as a function of deposition temperature for study
their cellular biocompatibility in vitro. The crystal structure of ZrO2 films are dependent of temperature of deposition
process and X-ray diffraction studies showed that a low temperature < 400°C the films have poor cristallinity, but for
higher temperatures of deposition, the patterns indicate a tetragonal crystalline structure with a preferential orientation of
growth (1 0 1). For biocompatibility studies of these films we evaluated the cellular adhesion process and cytotoxicity
assays over the surface of ZrO2 thin films. The results indicate that cells showed a good adhesion respond enhanced over
100 % with respect to control corning glass 7059. The cytotoxicity assay showed no effects of the surface ZrO2 ceramics
over the cellular behavior of the osteoblastic cells; in addition ZrO2 thin films can be used as good candidate as
biomaterial coating on diverse dental and orthopedic applications.
Key words: Ultrasonic spray pirolysis; ZrO2; Biocompatibility
en rangos nanométricos con buenas propiedades físicas con
una alta velocidad de depósito, con mayor control y calidad
sobre grandes áreas superficiales en un corto periodo de
tiempo [6]. Esta técnica ha sido empleada en el depósito de
diversas películas delgadas tales como Al2O3, ZnAl2O4,
ZrO2 y HfO2 [7-10]. De entre las anteriores películas
delgadas la que mayor aplicación presenta en el área de
ingeniería de tejidos óseos es la referente a la del oxido de
circonio (ZrO2). Esto es debido a que el oxido de circonio
es ampliamente utilizado para el diseño y recubrimientos
de materiales de implante por sus excelentes propiedades
fisicoquímicas, tales como una alta estabilidad química,
baja conductividad iónica y térmica, su alta resistencia
mecánica, su alta resistencia a la fractura y por
considerarse bioinerte y biocompatible [11]. Por otro lado,
el ZrO2 exhibe excelentes propiedades ópticas,
1. Introducción
El incremento en la demanda de prótesis ortopédicas y
dentales en los últimos años ha estimulado la investigación
de nuevas técnicas de recubrimiento y depósito para
modificar la superficie del implante y así otorgarle nuevas
propiedades fisicoquímicas,
de protección a la
degradación, a la corrosión y al control de la fricción en las
interfaces de interacción celular, incrementando la
respuesta biológica y de integración del tejido con la
superficie del implante [1-3]. Esto ha dado lugar a la
aparición de múltiples técnicas de depósito desarrolladas en
función de las propiedades específicas que se espera de los
recubrimientos a base de materiales cerámicos [4, 5]. La
técnica de rocío pirolítico ultrasónico es una técnica de
bajo costo que permite la obtención de películas delgadas
*
27
marcoalv@servidor.unam.mx
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fotoluminiscentes, eléctricas, químicas y posee un amplio
rango de aplicaciones catalíticas y como biomaterial. Por
esta última razón, el interés de este trabajo radica en
caracterizar la morfología superficial y la composición
química de la película delgada de oxido de circonio
depositada por el método de rocío pirolítico ultrasónico y
evaluar el efecto en la biocompatibilidad celular de la
nanotopografía de las cerámicas de ZrO2 en cultivos
celulares in vitro.
300
ZrO2
(101)
Fase tetragonal
500 °C
(202)
150
(103)
(112)
200
(002)
XRD intensidad (u. a.)
250
100
50
2. Procedimiento Experimental
450 °C
400 °C
350 °C
2.1. Depósito y Caracterización de las Cerámicas
Nanoestructuradas
0
10
20
30
40
50
60
70
El proceso de elaboración de las cerámicas en película
delgada, se llevó a cabo por la técnica de rocío pirolítico
ultrasónico, utilizando como precursor Oxicloruro de
Circonio Octa-hidratado a una concentración de 0.05 M
disuelto en agua de-ionizada (ZrOCl2 · 8H2O, Aldrich
Chemical Co.). Para el depósito de las películas de ZrO2 se
utilizaron sustratos de vidrio de 1.5 cm2 (Corning glass
7059), y se controló su temperatura (Ts) de 350ºC hasta
500°C. Esta técnica consiste en la generación de un fino
vapor desde la solución precursora por medio de un
generador ultrasónico que trabaja a 800 kHz,. El vapor es
dirigido a través de un tubo que contiene aire filtrado como
portador a una velocidad de flujo de 10L min-1; a la
superficie del sustrato caliente localizado sobre una base de
estaño fundido que es en donde se lleva a cabo la reacción
química depositando la película.
La estructura cristalina de las cerámicas fue analizada
por medio de difracción de Rayos X (XRD), utilizando el
equipo Siemens D-5000 con una longitud de onda de
radiación de 1.5406 Å (Cu kα). Para caracterizar la
morfología superficial de las cerámicas se utilizó la técnica
de microscopia electrónica de barrido por medio del
microscopio SEM: Leica-Cambridge 440. Por último, para
caracterizar la composición química de las cerámicas se
usó la técnica de dispersión de energía (EDS) por medio
del microscopio SEM acoplado con el detector Pentafet
con microsonda marca Oxford.
Los sustratos cerámicos de ZrO2 y los sustratos control
(vidrio) utilizados en los estudios de la respuesta biológica,
fueron sometidos a luz ultravioleta durante 24 horas, para
garantizar su esterilidad y evitar contaminaciones con
microorganismos como bacterias y hongos.
2θ (grados)
Figura 1. Difractograma de Rayos X de la cerámica de óxido de
circonio depositada a diferentes Ts: 350, 400, 450 y 500°C.
Figura 2. Imagen de microscopia electrónica de barrido de la
morfología superficial de la cerámica de óxido de circonio depositada
en función de la Ts: 350 (a), 400 (b), 450 (c) y 500 (d). En la imagen se
aprecia la distribución de la morfología de aglomerados superficiales y
de las nanofibras porosas interconectadas. Barra = 10 µm.
2.2. Ensayo de Biocompatibilidad celular
Para establecer el efecto de la topografía de las cerámicas
depositadas a una Ts = 500°C sobre la biocompatibilidad
celular, se utilizaron células osteoblásticas, las cuales se
mantuvieron en un medio de cultivo Mínimo Esencial de
Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM) suplementado
con 10% de suero fetal bovino (SFB) y una solución de
antibióticos (penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100
Figura 3. Adhesión celular de las células osteoblásticas en las
superficies de oxido de circonio a una Ts = 500°C después de un
periodo de incubación de 6 y 12 h.
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cultivo se le adiciona una solución con 0.04 M de ácido
clorhídrico (HCl) en isopropanol y la placa se lleva a un
lector de ELISA, para obtenerse la densidad óptica a una
longitud de onda de 570 nm.
3. Resultados y Discusión
Los patrones de difracción de rayos X (XRD) de las
muestras depositadas a Ts de 350 hasta 500°C; indican que
a temperaturas por debajo de <400°C las cerámicas de
ZrO2 presentan una baja cristalinidad (material amorfo);
pero a altas Ts; estas cerámicas muestran picos que
corresponden con la fase tetragonal del ZrO2 (JCPDS 17923) con un incremento en el tamaño de grano cristalino.
Los picos representativos en los difractogramas de XRD a
30.2°, 34.8°, 35.2°, 50.2°, 50.6°, 59.5°, 60.1° y 62.9°
pueden asignarse a la estructura tetragonal con índices: (1 0
1), (0 0 2), (1 1 0), (1 1 2), (2 0 0), (1 0 3), (2 1 1) y (2 0 2)
como se observa en la Figura 1.
La composición química de las cerámicas se determinó
por medio de la técnica de espectroscopia de dispersión de
energía (EDS). Los estándares de energía asociados a cada
átomo para obtener la composición química se adquirieron
del programa: Multi-elementos químicos estándares de
referencia Microspec serial 0034, parte N° 8160-53
ubicados en la PC del SEM. Los resultados experimentales
promedio son representados en la Tabla-1 que indican la
composición química en porcentajes atómicos de oxigeno,
circonio y cloro que se encuentran presentes en las
cerámicas de ZrO2 depositadas en función de la
temperatura de sustrato. De acuerdo a estos resultados, las
cerámicas son de óxido de circonio envenenadas con cloro,
el cual disminuye con el aumento de la temperatura de
substrato.
El análisis de la morfología superficial de la cerámica de
ZrO2 por medio de SEM muestra que la cerámica presenta
una diferencia en morfología dependiente de la Ts (Figura
2). Como se puede observar en la figura 2(a); a una
temperatura de 350°C la superficie de la cerámica muestra
una morfología de agregados cumulares que indica que el
material no ha sido procesado completamente debido a que
la energía térmica no es suficiente para realizar
eficientemente la reacción pirolítica en la superficie del
substrato evitando así una formación compacta de ZrO2.
Con el incremento en la Ts ≥ 400°C (Figura 2(b-d)); la
morfología de la cerámica cambia de granos semiesféricos,
a un arreglo de nanofibras porosas intercaladas. Esta
característica superficial es debido a una alta temperatura
de depósito que ayuda a incrementar la energía cinética
superficial y con ello producir una reacción pirolítica
completa del vapor incidente, lo cual resulta en una
cerámica más compacta y cristalina [12].
Figura 4. Grafica de viabilidad celular de las células osteoblásticas en
las superficies de oxido de circonio a una Ts = 500°C después de un
periodo de incubación de 1, 3, 5 y 7 días.
μg/ml). La biocompatibilidad celular fue evaluada
analizando dos procesos importantes: 1) la adhesión y 2) la
viabilidad de los osteoblastos relacionada a la toxicidad del
material. Para la respuesta de adhesión celular; los
osteoblastos fueron cultivados a una densidad de 1x103
células/mL sobre las cerámicas de ZrO2 a un tiempo de
cultivo de 6 y 12 horas. Pasado este tiempo, los sustratos
fueron lavados con buffer de fosfatos (PBS) para retirar las
células que no se adhirieron a las superficies.
Posteriormente las células adheridas se fijaron con 4% de
paraformaldehído por 5 minutos e incubadas con 0.1% de
toluidina por 4 horas. Para remover el colorante no
específico se realizaron 3 lavados con PBS y
posteriormente el colorante fue extraído con 500μL de
dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1%. De la solución
obtenida se tomaron 100μL que se colocaron en un pozo de
una placa de 96 pozos para obtener su absorbancia a una
longitud de onda de 605 nm. Los valores de la absorbancia
obtenidos fueron utilizados para obtener el porcentaje de
células adheridas a las cerámicas de ZrO2. Los cultivos
controles fueron las células sembradas sobre sustratos de
vidrio. Los experimentos de adhesión celular se realizaron
por triplicado.
Para evaluar el efecto de la topografía de las cerámicas
de ZrO2 depositadas a una Ts = 350°C en la viabilidad
celular se llevo a cabo el ensayo de azul de triazol (MTT)
basado en la habilidad de la enzima deshidrogenada
mitocondrial para oxidar una sal de tetrazolio (3-[4,5dimetiltiazol-2-y]-2-5 bromuro difeniltetrazolio) a un
producto insoluble de color azul. La generación del
producto azul es directamente proporcional a la actividad
oxidativa de la enzima deshidrogenasa; por ello, una
disminución en los valores de absorbancia a 570 nm nos
indicará una medida de la viabilidad celular que puede ser
relacionada a la toxicidad del material.
Las células osteoblásticas se sembraron a una densidad
de 2x104 por triplicado por 1, 3, 5 y 7 días de cultivo sobre
las superficies de las cerámicas de ZrO2. Después de cada
periodo experimental, las células fueron incubadas con una
solución de MTT (120 mg/ml) a 37°C por 4 horas. Pasado
este tiempo, el sobrenadante es removido y a cada pozo de
3.1. Biocompatibilidad celular
Los ensayos de biocompatibilidad se realizaron con el
objeto de investigar si la topografía a una Ts = 500°C de la
cerámica de ZrO2 -considerándose como la mejor
29
Tabla-1.
Contenido
porcentaje
atómico
oxígeno, circonio y cloro de las©cerámicas
depositadadepor
rocío pirolítico
ultrasónico
dependiente
de la
Superficies
y Vacíode
23(S)
27-30, agosto
dede
2010
Sociedad Mexicana
Ciencia
y Tecnología
de Superficies
y Materiales
temperatura de depósito analizadas por EDS.
Ts
(°C)
350
400
450
500
Oxígeno
(at. %)
58.8
61.9
63.8
64.2
Circonio
(at. %)
32.1
31.2
30.5
31.0
Cloro
(at. %)
5.9
4.3
3.3
3.1
citotóxicidad por parte del ZrO2 hacia las células
osteoblásticas, ya que las células muestran una adhesividad
mayor al 100% en las superficies cerámicas respecto a la
superficie del vidrio corning glass 7059 utilizado como
patrón de referencia, así como, una viabilidad celular
excelente. Basándonos en estos resultados, podemos
concluir que las cerámicas de ZrO2 proveen un medio
ambiente adecuado para la biocompatibilidad celular lo
cual representa un probable recubrimiento cerámico
biocompatible en materiales de implante dental.
superficie morfológicamente obtenida debido a una alta
porosidad y una excelente interconexión de fibras
superficiales- afecta la respuesta celular de los
osteoblastos, utilizando el sistema de cultivo celular in
vitro.
En la grafica de la Figura 3 se muestra la evaluación de
la adhesión de los osteoblastos después de un periodo de
incubación de 6 y 12 h. Los resultados se presentan como
porcentajes de células adheridas a la superficie de la
cerámica de ZrO2 en relación al cultivo control que son las
células osteoblásticas adheridas a la superficie de vidrio
Corning 7059. La adhesión de las células osteoblásticas se
ve favorecida excediendo el 100% de adhesión
encontrándose diferencias estadísticamente significativas a
p<0.05 cuando se compara el proceso de adhesión de las
células osteoblásticas en la cerámica de ZrO2 con el cultivo
control. Aunque es importante remarcar que un incremento
en la adhesión celular obtenida en las cerámicas de ZrO2 es
un buen indicador de que la superficie no es toxica; sin
embargo, nosotros llevamos a cabo un ensayo de
citotoxicidad para confirmarlo. Los resultados del ensayo
de viabilidad celular (citotoxicidad) son presentados como
absorbancia a 570 nm como se muestra en la Figura 4. Los
resultados del ensayo de viabilidad por la conversión de la
sal de MTT muestra un incremento en dicha reacción
comparada con el cultivo control a los días 3 y continuando
hasta el día 7. Este incremento es directamente
proporcional al incremento de las células metabólicamente
activas sobre las superficies de ZrO2; lo cual nos indica que
las células están proliferando, creciendo y no existe ningún
efecto citotóxico del material a las células osteoblásticas.
Esto concuerda con resultados de investigaciones recientes
que reportan que en la escala nanométrica del material (en
promedio de 13 a 100 nm) juega un papel esencial en
mediar la adhesión celular y posteriormente la proliferación
celular; y que el incremento en dichos procesos celulares es
dependiente solo cuando el nanomaterial presenta una
rugosidad superficial homogénea de entre (0.020 a 0.1 µm)
[13-16].
Agradecimientos
Los autores le dan agradecimientos a J. Guzmán, C.
Flores, H. Zarco, O. Novelo-Peralta y R. Reyes-Ortíz por
su asistencia técnica durante el curso de este estudio. Esta
investigación fue financiada por DGAPA-UNAM proyecto
IN200808 a MAAP.
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4. Conclusiones
En este estudio nos avocamos a determinar la
biocompatibilidad de células osteoblásticas sobre la
superficie de cerámicas a base de ZrO2 . Nuestros
resultados demuestran que no existen efectos de
30