PDF en español - Universidad de Córdoba

Rev.MVZ Córdoba 17(3):3209-3216, 2012.
ORIGINAL
Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular
de conejos: evaluación macroscópica y difractográfica
Implantation of hydroxyapatite-lignin in the medullary canal of
rabbits: macroscopic and difractografic evaluation
Mastoby Martínez M,1* M.Sc, Andrea Pacheco B,2 Ph.D, Mauricio Fontes F,2 Ph.D.
Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias
Pecuarias, Montería, Colombia. 2Universidad Federal de Viçosa, Departamentos de Veterinaria y
Suelo, Viçosa-MG, Brasil. *Correspondencia: mastobymvz@hotmail.com
1
Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Marzo de 2012.
RESUMEN
Objetivo. Evaluar macroscópica y difractograficamente la respuesta ósea al compuesto hidroxiapatita–
lignina implantado en canal medular tibial de conejos. Materiales y métodos. Se utilizaron 20
conejos de raza Nueva Zelanda, en cada uno, la tibia izquierda fue tratada con compuesto y la
tibia derecha no fue, sirviendo como control. Se realizó una falla ósea de 4 mm de diámetro en la
superficie lateral proximal tibial, hasta alcanzar el canal medular. Del compuesto, 1000 mg fueron
ablandados con 10 gotas de solución salina utilizando parte de la masa para revestir la rosca del
clavo intramedular de Schanz en acero F 138, de diámetro 2.5 mm para hueso cortical y la otra parte
introducida en el canal medular con el auxilio de catéter calibre 16 y jeringa. El clavo revestido se
introdujo al canal medular por la falla ósea. Los planos anatómicos fueron suturados. Lo mismo fue
realizado en el control, sin utilización del compuesto. La evaluación macroscópica y difractográfica del
contenido medular y del material que creció en las rocas de los clavos se hizo a los ocho, 30, 60, 90
y 120 días pos-cirugía. Resultados. Con cada fecha de evaluación la tendencia de la medula ósea
en los tratados fue a regenerarse y la del compuesto a perder visibilidad, lo que se demostró con la
difracción de rayos X, encontrándose tejido con cristalinidad compatible con el componente mineral del
hueso. Conclusiones. El compuesto puede guiar la formación de hueso hasta el clavo intramedular
sin afectar la regeneración de médula ósea.
Palabras clave: Clavos, evaluación, hidroxiapatita, médula ósea (Fuente:CAB).
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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012
ABSTRACT
Objective. Macroscopically and diffractografically evaluate bone response to hydroxyapatite - lignin
compound implanted in rabbit tibial medullary canal. Materials and methods. 20 New Zealand rabbits
were used. Each of their left tibias was treated with the compound; the right tibias were not treated,
serving as control. Bone fracture of approximately 4 mm in diameter in the lateral proximal tibia was
performed, reaching the medullary canal. From the compound, 1000 mg were dissolved in 10 drops
of saline solution using part of the mass to cover the twisted end of the intra-medullary pin, (Schanz
steel F 138, size 2.5 mm for cortical bone) and the rest was introduced in the medullary canal of the
group treated with the help of a catheter size 16 and disposable syringe. After introduction of 7 cm
in length of the pin in the medullary canal, the anatomical blueprint was closed. The same was done
in the control tibias, without use of the compound. Macroscopic and difractographic evauation of the
medullary content which grew at the base of the pins was assessed at eight, 30, 60, 90 and 120 days
post-surgery. Results. Each macroscopic evaluation date showed that the tendency of bone marrow
in the treated rabbits was to regenerate and lose compound visibility, which was shown through X-ray
diffraction, where crystalline tissue was found to be compatible with the mineral component of the
bone. Conclusion. The compound can lead bone formation of intra-medullary nail without affecting
the regeneration of bone marrow.
Key Words: Bone marrow, evaluation, hydroxyapatite, pins (Source:CAB).
INTRODUCCIÓN
Los substitutos óseos deben ser inertes,
degradables o absorbidos, además de favorecer
el crecimiento óseo por conducción y si es posible
por inducción. Estas características dependen de
las propiedades físicas y químicas del biomaterial,
que debe ser compatible con las reacciones
fisiológicas del hueso (1-3). En la actualidad,
uno de los biomateriales más investigados es
la hidroxiapatita que puede ser obtenida de
diferentes formas: a partir de corales marinos, del
propio hueso o sintetizada en laboratorio (4-6).
La hidroxiapatita ha sido utilizada en la corrección
de defectos óseos en el hombre y en varias
especies animales, con resultados satisfactorios
lo suficiente para ser indicada como alternativa
para la injerta ósea en la rutina clínica (7-9).
La estructura porosa de la hidroxiapatita funciona
como soporte pasivo para la neoformación
vascular que llevan factores inductores de la
aposición ósea (1). La superficie porosa de
la hidroxiapatita parece proveer un substrato
adicional a la proliferación del tejido óseo.
Además; permite la unión, proliferación,
migración y expresión fenotípica de células
óseas, resultando en formación de nuevo hueso
(8, 10-12).
La lignina es un componente de la pared celular
de las plantas leñosas que les provee rigidez
y actúa como agente permanente de unión
entre las células. Es un polímero complejo de
elevado peso molecular constituido por unidades
de fenilpropano (13-15). Un compuesto de
hidroxiapatita asociado a la lignina, podría unir
la excelente bio-actividad de la primera que no
posee cohesión y resistencia suficiente, con las
propiedades mecánicas y de adhesión celular de
la última (13).
Con el desarrollo de la difracción de rayos X,
se confirmó en 1926 que la fase inorgánica del
hueso era una apatita (10,16,18). La difracción
de rayos X es la principal técnica analítica
utilizada para identificar fases mineralógicas
y para estudiar estructuras cristalinas. La
técnica hace uso de la periodicidad con que los
átomos se distribuyen al formar la estructura
cristalina de los minerales y las distancias
entre los planos atómicos. Las difracciones son
fácilmente obtenidas con el uso de los actuales
difractómetros de rayos X. La hidroxiapatita es
un fosfato de calcio que se cristaliza en el sistema
hexagonal con parámetros de red a=b=9.417Å
ec=6.875Å, lo que genera picos característicos
en los diversos planos atómicos dentro de su
estructura, conforme muestra la figura 2 (fuente:
Laboratorio de mineralogía – Departamento de
Suelos – UFV-Brasil).
Teniendo en cuenta la propiedad óseo-conductora
de la hidroxiapatita y frente a los efectos
adversos que tiene la resina acrílica sobre el
tejido óseo a la hora de la fijación de prótesis
articulares en la ortopedia veterinaria y humana,
un grupo de investigadores de la UFV-Brasil en
trabajo conjunto con investigadores del sector
privado, se dispusieron en la tarea de conseguir
un biomaterial que pudiera guiar el proceso
de regeneración ósea hasta el canal medular
y que favoreciera la unión biológica del clavo
intramedular en este local.
Martínez - Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos
Por tal razón, el objetivo del presente trabajo
fue evaluar a la hidroxiapatita asociada a
lignina (HAP-91 - L) en el proceso de bioconducción ósea hasta un implante metálico
en canal medular tibial de conejos adultos de
la raza Nueva Zelanda. El estudio se basó en
la observación de los canales medulares y del
material que se adhirió a las roscas de los clavos
implantados como también, en la caracterización
de la cristalinidad del tejido que se formó en
ambos locales utilizando la técnica de difracción
de rayos X.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales. Fueron utilizados 20 conejos
machos de la raza Nueva Zelanda Albina,
esqueléticamente maduros a la confirmación
radiográfica, con edad entre 10 y 12 meses y
pesando entre 4-5 kg, oriundos del bioterio del
Departamento de Veterinaria de la UFV. Tuvieron
2 meses para aclimatación al nuevo ambiente,
en jaulas individuales donde recibieron una
dosis única de ivermectina 0.2 mL a 1% por la
vía subcutánea, alimento 2 veces al día y agua
a voluntad.
Compuesto. La hidroxiapatita sintética HAP
91® (JHS, Belo Horizonte-Br.) fue producida por
precipitación, después de adicionar gota a gota
H3PO4 sobre el Ca(OH)2 obtenido a partir de la
calcinación de la calcita y su posterior hidratación
por agitación constante. El precipitado fue
calcinado a 900°C. El Ca de la HAP-91 fue
determinado por volumetría y espectroscopia de
UV-V (1). Después de este proceso, de acuerdo
con el fabricante fue adicionado a la HAP-91, 1%
de lignina derivada del eucalipto para formar el
compuesto de HAP-91 – L. Con este material
se obtuvieron bloques circulares de 4.5 mm de
diámetro con peso de 200 mg con proporción de
99% de HAP-91 y 1% de lignina, que después
fueron esterilizados en oxido de etileno a 10% y
embalados en material plástico.
Procedimiento quirúrgico. En el preoperatorio
los conejos recibieron 40.000 UI/kg de penicilina
sódica y procainica por vía intramuscular, 30
minutos antes de la inducción anestésica.
Después fueron sedados con levomepromazina
en dosis de 2 mg/kg y anestesiados con
tiletamina/zolazepam en dosis de 20 mg/kg,
ambos por vía intramuscular. El tercio proximal
del fémur hasta el tercio distal de la tibia fueron
depilados y la grasa cutánea removida con éter.
La anestesia disociativa se complementó con
la técnica epidural lumbo-sacra utilizándose
lidocaína a 2% en asocio con epinefrina a dosis
de 1 mL/4kg. En seguida los animales fueron
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posicionados en decúbito lateral izquierdo. Se
realizó la antisepsia del campo operatorio, se
aisló la parte distal del miembro con venda
estéril y la zona quirúrgica se aisló con paños
de campo estériles. El abordaje quirúrgico fue
basado en la técnica descrita por Piermattei et al
(17) para perros y gatos y adaptada para conejos
de la siguiente forma: se realizó una incisión
cutánea parapatelar lateral desde el tercio distal
del fémur hasta la diáfisis proximal de la tibia.
Seguidamente y en el mismo sentido se cortó
con bisturí el tejido subcutáneo y la fascia lata,
quedando visibles y siendo separadas de la tibia
la musculatura cráneo-lateral. Inmediatamente
se desbridó el periostio de la zona para realizar
un defecto circular en la parte central de la
faceta lateral proximal de la tibia, a 2 cm de la
meseta, de aproximadamente 4 mm de diámetro
y profundad suficiente para alcanzar el canal
medular con el auxilio de un taladro manual y
broca de igual diámetro.
En un mismo animal se consideró la tibia
izquierda como tratada y la tibia derecha como
control.
En el grupo tratado se introdujo por el defecto
cortical un clavo intramedular de Schanz en
acero de calibre 1 mm con el que se practicaron
movimientos de fricción repetitivos con el
propósito de irritar el endostio, desprender la
médula ósea y facilitar su salida, para lo que se
inyectaron unos 10 cm de aire dentro del canal
medular con el auxilio de jeringa desechable y
catéter venular calibre 16, retirando la mayor
cantidad posible.
En un recipiente, cinco comprimidos del
compuesto de HAP-91 – L (1000 mg) fueron
ablandados con solución fisiológica 0.9% en una
relación de dos gotas por comprimido, resultando
una masa que se utilizó para revestir la rosca
del clavo intramedular de Schanz en acero de
diámetro 2.5 mm, donde la cantidad se determinó
como aquella que se necesitó para que la rosca
no fuera visible, dejándola secar por 10 min al
ambiente. Al resto de la masa se le adicionó
solución salina 0.9% en volumen suficiente para
completar los 2 mL, para ser introducida en el
canal medular por medio de jeringa desechable
y catéter calibre 16. La longitud del clavo fue
medida por medio de radiografía previa de la
tibia, desde el local determinado para el defecto
hasta la epífisis distal tibial, determinándose un
largo de 7 cm para todos los animales. Después
de cortado el clavo se introducido por el defecto
cortical y su calibre fue suficiente para ocupar
aproximadamente 90% de la cavidad medular.
Los tejidos separados e incisionados se suturaron
con naylon.
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El grupo control pasó por los mismos
procedimientos que el tratado con la excepción
de que no se utilizó HAP-91 – L. De esta forma el
espacio entre el clavo y el endostio fue ocupado
por el coágulo que se formó normalmente.
En el pos-operatorio los animales recibieron
morfina 3 mg/kg/12h/2días/sc y 40.000
UI/kg/24h/2días/im de penicilina sódica y
procainica como analgésico y antibiótico-terapia
respectivamente y las heridas cutáneas se
curaron con solución salina a 0.9% diariamente
por 10 días.
Estudio macroscópico y difractográfico. Para
los estudios macroscópicos y difractográficos de
los canales medulares a los ocho, 30, 60, 90 y
120 dias posteriores a las cirugías fue necesaria
la eutanasia de cuatro conejos por fecha de
evaluación con sobredosis de tiopental sódico
por vía intravenosa, previa tranquilización con
levopromacina por vía intramuscular.
Para la evaluación macroscópica del canal
medular fue necesario un corte longitudinal de
todas las tibias con cierra manual, donde un
observador determinó el color y distribución de
la medula ósea, además; en el grupo tratado se
observó la distribución del compuesto, siendo los
resultados presentados descriptivamente.
Las características observadas en el material
adherido a la rosca del clavo de todas las tibias
de ambos grupos, fueron el color (metálico, rojo,
blanquecino y oscuro) y la visibilidad del fondo de
las roscas y su superficie; siendo los resultados
presentados descriptivamente.
La medición del material adherido a la rosca
del clavo intramedular fue realizada con el
auxilio de un pie de Rey digital y los resultados
fueron interpretados comparando cada fecha de
observación entre los grupos tratado y control,
con análisis estadístico realizado por la prueba
de Friedman, significancia fijada en p<0.05. La
comparación de las evaluaciones dentro de cada
grupo fue analizada por la prueba de Dunn´s,
también con significancia estadística fijada en
p<0.05. El comportamiento de las medias para
ambos grupos se representó por medio de una
línea de tendencias.
Con el objetivo de determinar la naturaleza
(orgánica e inorgánica) del tejido presente
en la superficie rosqueada de los clavos
intramedulares y en los canales medulares de
las tibias de los conejos a los ocho, 30, 60, 90
y 120 días, se utilizó la prueba de difracción de
rayos X (DRX). Para tal, fue necesario el secado
de las tibias en estufa eléctrica a 70°C por 72
horas, para posterior retirada por raspado del
material contenido en el canal medular y en la
superficie rosqueada del clavo. Este material fue
molido para ser reducido a partículas menores
y colocado en lámina de vidrio escavada. Con
el propósito de evitar pérdidas de material, se
adicionó pegante comercial que permaneció por
12 horas a temperatura ambiente para su secado.
Después de este periodo, fue realizada la prueba
de DRX en un difractómetro de marca Rigaku
D-Max modelo Geiger Flex equipado con tubo de
cobalto (radiación Co-Kα, λ = 1.79026 Å), con
un monocromador de cristal curvo de grafito en
el eje difractado, operado con una diferencia de
potencia de 40 kV y una corriente eléctrica de 30
mA. Los barridos fueron realizados en el modo
paso a paso en intervalos de 15 a 50º 2q con 0.05º
y 2 seg de conteo de tiempo en cada paso. Este
procedimiento fue realizado en la muestras de los
grupos control y tratado. Los resultados obtenidos
de los difractogramas fueron presentados por medio
de gráficos y análisis descriptivo.
RESULTADOS
Al corte longitudinal de las tibias del grupo tratado
a los ocho y 30 días posteriores a las cirugías, se
observó en la evaluación macroscópica del canal
medular una distribución desigual del compuesto,
con mayor localización en la mitad proximal,
que se corresponde con la diáfisis proximal de
la tibia, siendo el espacio restante ocupado por
médula ósea (Figura 1). El compuesto dio al canal
medular una coloración blanca hidroxiapatita por
estar en mayor proporción que la medula ósea.
A los 60, 90 y 120 días posteriores a las cirugías
se observó en las tibias tratadas una distribución
mayor de médula ósea y menor presencia del
compuesto, dando al canal una coloración rojisa
propia de médula.
Es importante destacar que en uno de los
canales medulares a los 120 días de evaluación,
no fue visible el compuesto (Figura 1E). Esta
observación permite presumir que con el pasar
del tiempo, el compuesto puede ser absorbido en
el local de implantación y la medula ósea tiende
a regenerarse y retomar su normal distribución
dentro del canal medular.
La presencia del compuesto en mayor cantidad en
la mitad proximal del canal medular, posiblemente
se debió a diferentes razones: a la técnica de
introducción de aire a través de la jeringa que
no permitió retirar la suficiente medula ósea
de la mitad distal del canal medular, dejando
poco espacio para el compuesto; a la presión
Martínez - Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos
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Figura 1.Fotografías del canal medular de las tibias de conejos del grupo tratado con hidroxiapatita-lignina ilustrando
la distribución y coloración dentro del canal medular – A- a los ocho días, B- a los 30 días, C- a los 60 días,
D- a los 90 días y E- a los 120 días posteriores a las cirugías. Flecha roja: indica la presencia de hidroxiapatitalignina en el canal medular. Flecha azul: indica la médula ósea. Flecha amarilla: indica presencia de tejido
blanquecino semejante al tejido óseo revistiendo la rosca del clavo intramedular.
interna del canal que actúo como fuerza negativa
repeliendo al compuesto durante su introducción,
hecho favorecido por el ablandamiento previo
del compuesto con solución salina 0.9%;
a la desituación física del compuesto como
consecuencia de la introducción del clavo
intramedular que provocó su salida parcial; a
la hemorragia intra-operatoria del canal que
produjo desituación del compuesto blando o
a la combinación de razones anteriores que
imposibilitaron la distribución homogénea y en
cantidad suficiente en toda la extensión del canal
medular.
En las tibias del grupo control se observó
normalidad en la distribución y coloración de
la médula ósea en todos los días del estudio,
demostrando una recuperación rápida de la
misma.
En la evaluación macroscópica de las roscas de
los clavos intramedulares de las tibias tratadas
y control, a los ocho días de la evaluación, no
hubo adherencia de tejido sobre su superficie,
permitiendo la visibilidad de las mismas, teniendo
el clavo su color característico. Se observó solo
diferencia en el fondo de las roscas, donde el
grupo tratado tuvo presencia del compuesto.
Como la media de la circunferencia de los clavos
intramedulares tratados fue igual a la de los no
tratados, se sugiere que no hubo adherencia de
ningún tipo de tejido en ellas (Tabla 1).
A los 30, 60, 90 y 120 días de evaluación
posteriores a las cirugías en 75% de las roscas de
los clavos del grupo tratado y control se observó
Tabla 1. Medias de la circunferencia del punto
correspondiente a la rosca de los clavos
intramedulares (mm) después de su
extracción del canal medular de tibias
de conejos en los días de la evaluación,
donde; G.T. representa al grupo tratado
con hidroxiapatita sintética–lignina y G.C.
representa al grupo control.
Grupos
Días después de las cirugías
0
8
30
60
90
120
G.T.
1.18
1.18
1.39
1.35
1.40
1.59
G.C.
1.18
1.18
1.24
1.50
1.51
1.48
presencia de tejido con características de tejido
medular de coloración rojisa amarillenta, que
impedía ver el fondo de la misma y parcialmente
su superficie, sugiriendo una posible adherencia
de tejido. Solamente en dos roscas del grupo
tratado a los 90 días y dos a los 120 días
(25%,) se observaron presencia de tejido duro
de coloración blanquecina y dureza al tacto
compatible con hueso.
Al comparar estadísticamente las mediciones de
las circunferencias de las roscas de los clavos
intramedulares después de retirados del canal
medular, se encontró que en los días del estudio
entre los dos grupos, no hubo diferencia de
acuerdo con la prueba de Friedman. El análisis
estadístico entre días de un mismo grupo tanto
para o grupo tratado como para el control,
tampoco mostró diferencias de acuerdo con la
prueba de Dunn´s.
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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012
Al análisis difractográfico del compuesto
de hidroxiapatita-lignina se observó que la
cristalinidad de la apatita produce picos delgados
con una línea de base casi recta (Figura 2).
Figura 2. Difractograma del compuesto de hidroxiapatita
- lignina. *Picos de hidroxiapatita. (Fuente:
Laboratorio de Mineralogía - Departamento de
Suelos – UFV - Brasil).
En la Figura 3 se observa el grupo control en los
diferentes días de la evaluación, en los que se
puede notar la ausencia de material cristalino
y sí apenas una hombrera típica de materiales
orgánicos de baja cristalinidad.
Figura 3. Difractogramas del material obtenido del
canal medular y de las roscas de los clavos
intramedulares tibiales de los conejos del
grupo control en los días después de las
cirugías. *hombrera.
La Figura 4 muestra que a los ocho y 30 días de
la evaluación pos quirúrgica, la hidroxiapatita
sintética – lignina mantiene su integridad
cristalina por la presencia de todos sus picos
característicos. A los 60 días después de su
implantación, existe una pérdida gradual de
algunos picos y el desaparecimiento de otros. A
los 90 y 120 días se observa pérdida total de su
cristalinidad.
Figura 4. De abajo-arriba: difractograma del compuesto de hidroxiapatita - lignina, difractograma del material obtenido
del canal medular de las tibias y de las roscas de los clavos intramedulares de los conejos del grupo tratado
con HAP-91®- L en los días después de las cirugías y difractograma de la cortical tibial de conejo. *picos de
hidroxiapatita, **picos de hueso tibial, ***hombrera.
Martínez - Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos
DISCUSIÓN
La no presencia del compuesto de hidroxiapatita
– lignina en algunos canales medulares tratados
a los 120 días puede ser indicativo que este se
absorbe semejante a lo reportado por Borges et
al. (2) en análisis cuantitativos en perros donde
observaron que la hidroxiapatita se degrada,
a pesar de ser considerada clínicamente no
degradable (2). Según Overgaard et al. (21), en
un estudio experimental en humanos demostró
que los revestimientos con hidroxiapatita son
absorbidos a un ritmo de aproximadamente
20% anual, especialmente en locales en que
el revestimiento está en contacto directo con
médula ósea más no cuando se implanta en
hueso trabecular.
A los 30, 60, 90 y 120 días de evaluación
posteriores a las cirugías en 75% de las roscas
de los clavos del grupo tratado y control se
observó presencia de tejido con características
de médula ósea de coloración rojisa amarillenta,
que impedía ver el fondo de las mismas y
parcialmente su superficie, sugiriendo una
posible adherencia de tejido medular. Solamente
en dos roscas del grupo tratado a los 90 días
y dos a los 120 días (25%,) se observaron
presencia de tejido semejante al hueso por
su color blanquecino y dureza al tacto. Este
hecho sugiere una posible óseo-conducción
del compuesto de hidroxiapatita-lignina hasta
la rosca del clavo intramedular, semejante a
la conseguida por Vidigal y Goisman (22) que
utilizando implantes de titanio puro e implantes
de titanio revestidos con hidroxiapatita por
la técnica de aspersión térmica a plasma,
observaron que hubo mayor formación de tejido
óseo en torno de los implantes revestidos con la
hidroxiapatita.
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En cuanto a la pérdida de la cristalinidad del
material analizado por difracción de rayos X en
los últimos días de evaluación (90 y 120 días)
(figura 4) y el hecho que los picos registrados
semejen a los registros difractográficos de hueso
compacto, permiten presumir que el compuesto
posiblemente fue absorbido y que posiblemente
posibilitó el crecimiento de hueso hasta la
superficie rosqueada de los clavos, estando de
acuerdo con Borges et al. (2) quien dice que
la hidroxiapatita funciona como soporte pasivo
para la formación de tejido óseo. La superficie
porosa de la hidroxiapatita parece proporcionar
una matriz para el desarrollo del tejido óseo,
permitiendo la migración y proliferación de
células óseo-progenitoras (8, 13, 18, 19).
El compuesto del estudio presenta picos muy
semejantes a los obtenidos con la hidroxiapatita
sintetizada a 950ºC por Londoño et al. (10), que
formó cristales pequeños que la hacen absorbible
cuando es implantada en tejido óseo, reforzando
la posibilidad de absorción ósea de la HAP-91-L.
La evaluación macroscópica y difractográfica del
compuesto de hidroxiapatita-lignina permitió
concluir que el compuesto no interrumpe
la regeneración de médula ósea y además;
posibilita el crecimiento de hueso hasta el
implante metálico.
Agradecimientos
Los autores agradecen al laboratorio JHS por
proporcionar el compuesto experimentado, a
la Universidad de Córdoba – Colombia y a la
Universidad Federal de Viçosa – Brasil. Esta
investigación de tipo descriptiva fue aprobada
por la comisión de Ética del Departamento de
Veterinaria de la UFV (proceso Nº 58/2007).
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