Estudio de metabolitos relacionados en la síntesis de novo de
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V SEMINARIO INTERNACIONAL EN MEDIO AMBIENTE, BIODIVERSIDAD Y DESARROLLO V SEMINARIO DE QUIMICA APLICADA PARA LA AMAZONIA Estudio de metabolitos relacionados en la síntesis de novo de pirimidinas mediante HPLC-ESI-MS/MS. Paula Galeano-García,a,b Chiara Carazzone.a a Laboratorio de Fitoquímica y Etnofarmacia, Departamento de Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia. b Programa de Química, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad de la Amazonia, Florencia, Colombia. Email: pl.galeano10@uniandes.edu.co, paulalg@uniamazonia.edu.co, c.carazzone@uniandes.edu.co Resumen Introducción. La metabolómica se ha convertido en una herramienta de mucha importancia en diversas áreas de investigación (Krishnan, Kruger, & Ratcliffe, 2005). Comprende el conjunto de metabolitos en un organismo y representa los productos finales de la expresión de los genes y la modulación de la función de las proteínas (Allwood et al., 2011). Además, define el fenotipo bioquímico de las células o tejidos (Fiehn et al., 2000), proporcionando un dispositivo de lectura de las diferencias en las rutas metabólicas, lo cual puede ser usado para el entendimiento de los mecanismos biológicos (Vinayavekhin, Homan, & Saghatelian, 2009) En bioquímica de plantas, los nucleótidos de purina y pirimidina son metabolitos importantes que participan en muchos procesos, son bloques de construcción en la síntesis de ácidos nucleicos, precursores de productos primarios como sacarosa y fosfolípidos, así como de metabolitos secundarios. V SEMINARIO INTERNACIONAL EN MEDIO AMBIENTE, BIODIVERSIDAD Y DESARROLLO V SEMINARIO DE QUIMICA APLICADA PARA LA AMAZONIA La importancia del estudio de la regulación de la biosíntesis de pirimidinas radica principalmente en dos razones: En primer lugar, puede ser una de las más antiguas rutas bioquímicas; enzimáticamente, la síntesis de novo es invariante entre todas las formas de vida examinados. En segundo lugar, los nucleótidos son componentes clave en una infinidad de reacciones celulares y son absolutamente esenciales para el crecimiento y normal desarrollo (Cordell, Hill, Ortori, & Barrett, 2008; Stasolla, Katahira, Thorpe, & Ashihara, 2003). Objetivo. Para entender el metabolismo de pirimidinas en plantas de Solanum lycopersicum y su posteriormente la interacción planta- patógeno con el microorganismo hemibiotrófo Phytophthora infestans, se plantea el desarrollo de una metodología analítica que consiste en la extracción, separación y detección por HPLC-ESI-MS/MS de los intermediarios de la síntesis de novo de pirimidinas. Metodología. Para el desarrollo de los análisis por espectrometría de masas se empleó un LCQ Fleet™ Ion Trap Mass Spectrometer (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA), equipado con ionización electrospray (ESI), operado en modo positivo y negativo. Posteriormente, los análisis LC-MS/MS fueron realizados en un cromatografo líquido Dionex UltiMate 3000 (Thermo Electron Corporation, San Jose), operado a una temperatura del automuestreador 4°C; volumen de inyección 10 L; temperatura de la columna 15 °C; y flujo 100 L/min. Para la optimización de parámetros MS/MS y LC, se empleó una solución de 10 mg/L de cada metabolito (UMP, UDP-Glu, UTP, ATP, CTP, GTP, orotato, DHorotato, uridina, DHuracilo, aspartato, glutamina y carbamoilaspartato). Posteriormente cada analito fue analizado mediante infusión directa al espectrómetro de masas a un flujo de 10 L/min. La separación cromatográfica se realizó usando una columna LUNA NH2 (Aminopropil) (250 V SEMINARIO INTERNACIONAL EN MEDIO AMBIENTE, BIODIVERSIDAD Y DESARROLLO V SEMINARIO DE QUIMICA APLICADA PARA LA AMAZONIA mm x 2 mm, 5 m Phenomenex, Torrance, CA), y gradiente de elución con solución buffer 20 mM de CH3COONH4/NH4OH pH: 9.45: Acetonitrilo (Bajad et al., 2006). Resultados y conclusión. Las características de los iones precursores de cada metabolito, la fragmentación MS2 , al igual que los tiempos de retención de la separación cromatográfica se observan en la tabla 1. Tabla 1. Tiempos de retención de los intermediarios de la síntesis de novo de pirimidinas, modo positivo y negativo. Compuesto Ion precursor (m/z) CE (eV) Ion resultante (m/z) RT UMP 325 (M+H)+ (20): 307 (M+H-H2O)+ 22.94 (+) UDP-Glu 565 (M-H)- (34): 323 (M-C6H12O6-PO2)- 24.62 (-) UTP 483 (M-H)- (25): 385 (M-H2PO3-H2O)- 35.42 (-) ATP 506 (M-H)- (28): 408 (M-H3PO4)- 35.79 (-) CTP 482 (M-H)- (25): 384 (M-H3PO4)- 35.49 (-) GTP 524 (M+H)+ (26): 426 (M+H-H3PO4)+ 33.68 (+) Orotato 155 (M-H)- (9): 111 (M-CO2)- ND DHorotato 157 (M-H)- (10): 113 (M-CO2)- ND DHouracilo 115 (M+H)+ (9): 74 (M+H-C2HO)+ 6.79 (+) Uridina 243 (M-H)- (12): 200 (M-CO-NH2)- 10.25 (-) Aspartato 134 (M+H)+ (9): 116 (M+H-H2O)+ 15.74 (+) Glutamina 147 (M+H)+ (9): 129 (M+H-H2O)+ 12.93 (+) Carbamoilaspartato 177 (M+H)+ (9): 133 (M+H-CO2)+ 22.59 (+) V SEMINARIO INTERNACIONAL EN MEDIO AMBIENTE, BIODIVERSIDAD Y DESARROLLO V SEMINARIO DE QUIMICA APLICADA PARA LA AMAZONIA Las condiciones HPLC-ESI-MS/MS permitieron la separación e identificación de la mayoría de los compuestos. Sin embargo, el orotato y DHorotato, componentes importantes en el metabolismo de pirimidinas, no lograron ser detectados, por lo cual es necesario plantear nuevas alternativas de análisis. Palabras clave: Metabolómica; síntesis de novo de pirimidina; HPLC-ESI-MS/MS. - Allwood, J. W., De Vos, R. C. H., Moing, A., Deborde, C., Erban, A., Kopka, J., et al. (2011). Chapter sixteen - Plant Metabolomics and Its Potential for Systems Biology Research: Background Concepts, Technology, and Methodology. In M. V. a. H. V. W. Daniel Jameson (Ed.), Methods in Enzymology (Vol. Volume 500, pp. 299-336): Academic Press. - Bajad, S. U., Lu, W. Y., Kimball, E. H., Yuan, J., Peterson, C., & Rabinowitz, J. D. (2006). Separation and quantitation of water soluble cellular metabolites by hydrophilic interaction chromatographytandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1125(1), 76-88. - Cordell, R. L., Hill, S. J., Ortori, C. A., & Barrett, D. A. (2008). Quantitative profiling of nucleotides and related phosphate-containing metabolites in cultured mammalian cells by liquid chromatography tandem electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 871(1), 115-124. - Fiehn, O., Kopka, J., Dörmann, P., Altmann, T., Trethewey, R. N., & Willmitzer, L. (2000). Metabolite profiling for plant functional genomics. Nature Biotechnology, 18(11), 1157-1161. - Lu, W. Y., Kimball, E., & Rabinowitz, J. D. (2006). A high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for quantitation of nitrogen-containing intracellular metabolites. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 17(1), 37-50. - Stasolla, C., Katahira, R., Thorpe, T. A., & Ashihara, H. (2003). Purine and pyrimidine nucleotide metabolism in higher plants. Journal of Plant Physiology, 160(11), 1271-1295. - Vinayavekhin, N., Homan, E. A., & Saghatelian, A. (2009). 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