Universidad de Colima Facultad de Medicina EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE WRN Y PAI-1 EN RATON NORMAL Y TRANSGENICO PARA WRN Y EL POSIBLE PAPEL DE WRN COMO FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE PAI-1 TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS PRESENTA Q.F.B. VLADIMIR OVIEDO RODRÍGUEZ ASESORES Dra. ELENA MARGRITA CASTRO RODRÍGUEZ Dr. RAFAEL JOSÉ COLL CÁRDENAS Colima, Col., Junio 2004 Este trabajo fue realizado con el financiamiento SEP- CONACyT clave 34543-N DEDICADO: A mi Dios por darme fuerzas en este momento importante de mi vida. A mis padres. José Guadalupe Oviedo Ávila y Maria Rodríguez Guízar. A mis hermanos. Edwin, Isis Jael y Miriam A mi novia. Maria Concepción Pérez Robles. AGRADECIMIENTO: Muy especial. A la Dra. Elena Margarita Castro Rodríguez y al Dr. Rafael José Coll Cárdenas por sus apreciadas enseñanzas, su confianza y apoyo. Dr. Charles E. Ogburn, Miriam Salas Guillen, Guadalupe Saray Orozco Hernández, José Ramón Farías Hernández y Cristina Fabiola Zepeda Peña por el apoyo brindado en el trabajo del laboratorio. A los profesores. Al Dr. Benjamín Trujillo Hernández, Dr. José Clemente Vásquez Jiménez, Dr. Oscar Uribarren Berrueta, Dr. Ernesto Reynoso Zúñiga, Dr. José Rafael Cuauhtemoc Acoltzin Vidal y al Ing. Martín Eliseo Isais Ramírez. A mis compañeros y amigos del CUIB especialmente. Al Ing. Eduardo López Gil, Dr. Enrique Higareda Almaraz, Dr. Everardo Paredes Molina. A la Universidad de Colima, Facultad de Medicina por haberme brindado la oportunidad de realizar este posgrado. INDICE RESUMEN---------------------------------------------------------------------------------------------1 ABSTRACT--------------------------------------------------------------------------------------------3 INTRODUCCIÓN-------------------------------------------------------------------------------------4 ANTECEDENTES------------------------------------------------------------------------------------6 Patobiología del Síndrome de Werner---------------------------------------------------6 Biología molecular del SW -------------------------------------------------------------------7 La helicasa de Werner-------------------------------------------------------------------------9 La aterosclerosis-----------------------------------------------------------------------------11 Importancia de PAI-1 en el proceso aterosclerótico y su relación con WRN-----------------------------------------------------------------------------------------------11 JUSTIFICACIÓN------------------------------------------------------------------------------------14 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA--------------------------------------------------------15 HIPÓTESIS-------------------------------------------------------------------------------------------15 HIPOTESIS ESTADISTICA----------------------------------------------------------------------15 Hipótesis nula---------------------------------------------------------------------------------15 Hipótesis alterna------------------------------------------------------------------------------15 OBJETIVO GENERAL ---------------------------------------------------------------------------16 OBJETIVOS ESPECIFICOS---------------------------------------------------------------------16 MATERIAL Y METODO--------------------------------------------------------------------------17 Tipo de Estudio--------------------------------------------------------------------------------17 Unidad de Estudio----------------------------------------------------------------------------17 Tamaño de la Muestra-----------------------------------------------------------------------17 Operacionalización de Variables--------------------------------------------------------18 Aspectos Éticos-------------------------------------------------------------------------------19 Control de Calidad---------------------------------------------------------------------------19 Extracción del Tejido------------------------------------------------------------------------24 Extracción del RNA--------------------------------------------------------------------------24 Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de cDNA generado por la Transcriptasa Inversa (RT) a partir de RNA (RT-PCR)----25 Electroforesis en Agarosa-----------------------------------------------------------------27 Ensayo de Western blotting---------------------------------------------------------------27 Gel de Poliacrilamida------------------------------------------------------------------------28 Sonda para Western blot-------------------------------------------------------------------28 Ensayos de Retardamiento de la Movilidad Electroforética (Movility Shift)---------------------------------------------------------------------------------28 RNA Antisentido------------------------------------------------------------------------------29 Transfección de Células Eucariotas por el Método de Lipofección--------29 RESULTADOS--------------------------------------------------------------------------------------31 DISCUSION------------------------------------------------------------------------------------------45 CONCLUSIONES-----------------------------------------------------------------------------------48 PERSPECTIVAS------------------------------------------------------------------------------------49 ANEXOS----------------------------------------------------------------------------------------------50 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS-----------------------------------------------------------55 INDICE DE FIGURAS 1.- Síndrome de Werner-----------------------------------------------------------------6 2.- La helicasa en el proceso de desenrrollamiento del DNA--------------8 3.- Polimorfismo en el gen WRN----------------------------------------------------10 4.- Actividad de PAI-1 y PA en la regulación de procesos trombótico, hemorrágico y aterogénico-------------------------------------13 5.- Metodología de la expresión de PAI-1 y WRN------------------------------20 6.- Detección de WRNp y PAI-1p por Western blot---------------------------21 7.- Metodología de la expresión de la RR-PAI-1 y WRNp recombinante--------------------------------------------------------------------------22 8.- Metodología de la sobreexpresión de PAI-1 en cultivos celulares--23 9.- Análisis electroforético de los productos de RT-PCR-------------------32 10.- Expresión de WRN en tejido de ratón normal----------------------------34 11.- Expresión de PAI-1 en tejidos de ratón normal--------------------------36 12.- Sobreexpresión de PAI-1 en ratones transgénicos---------------------38 13.- Análisis de la expresión de WRNp y PAI-1p en ensayos de Western blot-------------------------------------------------------------------------------------40 14.- Retardamiento de la movilidad electroforética de la región reguladora de PAI-1 debido a la unión por WRNp recombinante--42 15.- Eliminación de la expresión del gen WRN por un Antisentido-----43 16.- Expresión del gen PAI-1---------------------------------------------------------44 RESUMEN La aterosclerosis es una de las características más importantes que se presentan en los pacientes con Síndrome de Werner (SW: o envejecimiento prematuro) y una de las principales causas de muerte. La relación de PAI-1 (inhibidor de los activadores del plasminogeno tipo 1 con un gen recientemente clonado llamado helicasa de Werner (WRNp) y su relación con el proceso aterosclerótico es lo que se pretende estudiar en este proyecto. Una gran variedad de estudios apuntan al hecho de que una fibrinólisis defectuosa, a través de una sobreproducción de PAI-1p (una proteína de respuesta aguda) es causa inequívoca de aterosclerosis y se ha demostrado que PAI-1p es expresada a altos niveles en tejido vascular de individuos de edad avanzada y en cultivo de fibroblastos con fenotipo senescente, comparado con sus contrapartes jóvenes. Además PAI-1p es sobreexpresada dramáticamente (750-1000 veces más) en cultivos primarios de fibroblastos de pacientes con SW comparada con fibroblastos de individuos normales. Recientemente se ha desarrollado en ratón transgénico, el cual no expresa la proteína WRNp. El presente estudio se diseñó para demostrar la relación que existe entre la expresión de WRN y la sobreexpresión de PAI-1, puesto que suponemos que WRNp, actúa como factor de transcripción, que regula la expresión del gen PAI-1. Por ello, la primera parte de este estudio fue observar los niveles de expresión de WRNp y PAI-1p en ratones normales mediante RT-PCR en diferentes tejidos y a diferentes edades; así como demostrar la falta de regulación de la expresión (sobreexpresión) de PAI-1, cuando WRNp no esta presente (ratones transgénicos). La asociación de WRNp como factor de transcripción de PAI-1, fue estudiada mediante ensayos de retardamiento de la movilidad electroforética y comprobada por ensayos de Western blot. 1 Nuestros resultados indican que la proteína WRNp tiene actividad supresora de la expresión del gen PAI-1, por lo tanto, cuando el gen WRN es inhibido, la expresión de la proteína PAI-1p es elevada. 2 ABSTRACT Atherosclerosis is one of the most important features of Werner Syndrome (or premature aging; WS) patients, and one their major cause of death. We want to study the relationship between Werner helicase (WRNp), overexpression of PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor –type 1) gene, and atherosclerosis process. Several studies point, that a defective fibrinolisis, through a PAI-1p overproduction is unequivocal cause of atherosclerosis and has been demonstrated that PAI-1 is high level expressed in vascular tissue at elderly individuals and in cultured fibroblasts with senescent phenotype compared with their youth counterparts. Moreover, PAI-1 is dramatically overexpressed (750 – 1000 times) in primary cultured fibroblasts from SW patients compared to fibroblasts from normal individuals. Recently has been made a transgenic mouse, which does not express WRNp. This study was designed in order to demonstrate the relationship between WRN expression and PAI-1 overexpression. We thought that WRNp acts as transcription factor regulating expression of PAI-1 gene. The first part of this study, was to measure the expression levels of WRN and PAI-1 in normal mice through RT-PCR in several tissues and at several ages; and to demonstrate the fault of regulation (overexpression) of PAI-1, when WRNp is not present (transgenic mice). Association of WRN as transcription factor of PAI-1 was studied through electrophoretic mobility shift assay and verified by Western blot assays. Our results shown, that WRNp has suppression activity on expression of PAI-1 gene. Therefore, when WRN gene in inhibited, the expression of PAI-1 protein is elevated. 3 INTRODUCCION La aterosclerosis es una de las más importantes características en los pacientes con Síndrome de Werner (SW) y una de las principales causas de muerte. El gen causante de esta enfermedad (helicasa WRN) ha sido recientemente clonado y secuenciado. Algunos reportes describen la asociación del polimorfismo del extremo C- terminal de la proteína WRN (1367 Cisteina / Arginina (Cys/Arg) y 1074 Leucina / Fenilalanina (Leu/Phe)), con una disminución en el riesgo de infarto al miocardio y con una mayor oportunidad de longevidad. Estas asociaciones son de suma importancia para el estudio de la actividad de la helicasa de Werner en el organismo. Debido a las características que presentan los individuos enfermos con SW, este síndrome es llamado también síndrome de envejecimiento prematuro. La aterosclerosis es una de las primeras causas de muerte e incapacidad en el mundo desarrollado; es un proceso que inicia desde la infancia y produce en los adultos mayores gran cantidad de complicaciones vasculares (entre ellas infarto al corazón e infartos cerebrales); es por esto que la aterosclerosis esta relacionada directamente con el envejecimiento. La aterosclerosis es de etiología multifactorial, sin embargo, la sobreexpresión o la disminución de ciertos factores (sobre todo aquellos que tienen función reguladora) se han relacionado con aparición y progresión de la aterosclerosis; tal es el caso de la proteína PAI-1 (inhibidor del activador del plasminogeno tipo 1) que es clave en el proceso de fibrinólisis. Se ha demostrado que PAI-1p es expresada a altos niveles en tejido vascular de individuos de edad avanzada y en cultivo de fibroblastos con fenotipo senescente, comparado con sus contrapartes jóvenes. 4 Además PAI-1p es sobreexpresada dramáticamente (750-1000 veces más) en cultivos primarios de fibroblastos de pacientes con SW comparada con fibroblastos de individuos normales. PAI-1p actúa principalmente sobre el activador del plasminogeno tisular (tPA), el cual ha sido recientemente aprobado como tratamiento de isquemia cerebral por la Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA), éstos datos respaldan la relevancia del sistema fibrinolítico tPA-PAI-1 en el proceso aterosclerótico. Debido a la relación que existe entre el gen WRN y la sobrexpresión de PAI-1 y en vías de determinar su relación con aterogénesis, lo que se pretende en este trabajo es: 1. Evaluar, en ratones normales (WRN +/+) y ratones transgénicos (WRN -/-) la expresión de PAI-1p y observar si la falta de WRNp provoca la sobreexpresión de PAI-1. 2.- Demostrar que la helicasa de Werner (WRNp) se une directamente con la región reguladora del gen PAI-1. 3.- Observar la sobreexpresión de PAI-1, en cultivos celulares, cuando la expresión de WRN es inhibida mediante un oligonucleótido antisentido. 5 ANTECEDENTES Patobiología del Síndrome de Werner El síndrome de Werner (SW) es un síndrome Autosómico recesivo, caracterizado por la aparición prematura y progresión acelerada de múltiples desórdenes relacionados con envejecimiento (1,2,4) . Los pacientes tienen la apariencia de envejecimiento acelerado con encanecimiento, adelgazamiento y caída del cabello; cambios en la cantidad y distribución de tejido adiposo, incluyendo atrofia de grasa subcutánea; fibrosis, atrofia y ulceración de la piel (figura 1). Estos pacientes desarrollan múltiples desórdenes comúnmente asociados con senescencia, los cuales incluyen cataratas oculares bilaterales, gran susceptibilidad a desarrollar diabetes mellitus tipo 2, atrofia gonadal, hiperlipidemia, osteoporosis y varias formas de aterosclerosis, así como una gran susceptibilidad a varias formas de neoplasmas benignos y malignos. Las más frecuentes causas de muerte de los pacientes con SW son infarto al miocardio y cáncer (2). Mujer de 48 años con signos característicos de Síndrome de Werner FIGURA 1.- Paciente con Síndrome de Werner que presenta las manifestaciones clínicas tomado de Epstein et al, 1996. 6 (3) , Biología Molecular del SW El SW resulta de la herencia de dos copias de mutaciones nulas de un gen presente en el cromosoma 8 humano, llamado WRN. El RNA mensajero (RNAm) tiene 5208 bases y origina una helicasa (WRNp) de 1432 amino ácidos. Las helicasas son proteínas que usan energía derivada de la hidrólisis de ATP o GTP y desdoblan la molécula duplex de DNA, exponiendo las cadenas simples a los complejos de transcripción, recombinación, "splicing" y reparación. Las mutaciones nulas que originan el SW, forman proteínas truncadas en el dominio C-terminal (5, 6), las cuales eliminan una señal de localización nuclear (7). La helicasa es llamada también proteína de Werner (WRNp). Estudios bioquímicos de esta proteína han demostrado que contiene 5 dominios con actividad exonucleasa y 7 dominios con actividad helicasa (5) . La proteína humana recombinante de WRN (WRNp) es homóloga a la helicasa RecQ de E. coli (8- 10). A nivel celular, los procesos tales como segregación de cromosomas, translocación y proliferación celular pueden ser perturbados en ausencia de las funciones normales de la helicasa. En bacterias la ausencia de las funciones normales de las helicasa pueden incluso perturbar el ensamble de los ribosomas. Helicasas mutadas son responsables de la inestabilidad del DNA en algunos otros síndromes genéticos. Tales mutaciones pueden ocasionar el no reconocimiento o eliminación de nucleótidos dañados durante la replicación (9,10). El papel que juegan las helicasas en el proceso de desenrrollamiento del DNA (figura 2), ha proporcionado una explicación razonable para el hecho de que los individuos con SW, sufran también de una gran variedad de neoplasmas, pero poco se sabe acerca de que el desdoblamiento del DNA y la inestabilidad genómica 7 derivada de las funciones defectuosas de las helicasas, puedan ser asociadas con aterosclerosis y por consiguiente con enfermedades cardiovasculares. FIGURA 2.- La helicasa o proteína de Werner actúa desenrollando la doble hebra del DNA en el proceso de la replicación (11) . 8 La Helicasa de Werner Como dijimos antes, las mutaciones nulas que originan el SW, originan proteínas truncadas en el dominio C-terminal, las cuales eliminan una señal de localización nuclear. Durante el estudio de las mutaciones, se identificaron diversos polimorfismos en el gen humano WRN (6,7,12). Se demostró que uno de estos polimorfismos, llamado 1367 Cisteina / Arginina, debido a que la substitución nucleotídica Timina / Citosina (T/C) origina un cambio de Cys por Arg en el residuo 1367 de la proteína, está asociado con disminución en el riesgo de infarto al miocardio en una población Japonesa (13). Otro de los polimorfismos, el cual también se encuentra localizado en el extremo C-terminal de la proteína, es el llamado 1074 Leu/Phe debido a que la substitución nucleotídica Timina / Guanina (T/G) origina un cambio de Leu por Phe en el residuo 1074 de la proteína, ha sido asociado a una mayor oportunidad de longevidad en poblaciones Mexicana y Finlandesa. (Poblaciones con alta incidencia de aterosclerosis; (14) )(figura 3). Estos resultados demuestran la importancia de la helicasa WRNp en el proceso aterosclerótico. 9 FIGURA 3.- El polimorfismo del gen WRN donde el alelo L esta asociado a protección contra EC isquémico y enfermedad arterio coronaria. El alelo R está asociado a protección contra infarto al (15) miocardio en una población japonesa . 10 La Aterosclerosis La aterosclerosis es una enfermedad progresiva de las arterias que empieza en la niñez. Las lesiones están formadas por células y matriz extracelular que se acumulan progresivamente hasta el punto potencial de la obstrucción total de los vasos sanguíneos. Las lesiones ateroscleróticas progresan en tres estados: en el primero hay una acumulación de células llenas de lípidos (células espumosas) en el espacio subendotelial, el segundo estado es una lesión proliferativa, donde una capa fibrosa producida por células de músculo liso, cubre un núcleo de lípidos formado de colesterol y esteres extracelulares. El tercer estado es una lesión complicada, la cual puede manifestar, calcificación, hemorragia, ulceración y trombosis. La aterosclerosis es una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad, asociadas con envejecimiento (16) , un proceso que esta grandemente acelerado en SW. La aterogénesis incluye procesos que producen fibrina, un componente primordial en el coágulo sanguíneo, y procesos que previenen la remoción de esta fibrina (fibrinólisis defectuosa (17) ). Una proteína de fase aguda muy importante en la regulación de la fibrinólisis es el inhibidor de activadores del plasminogeno (PAI-1p). Importancia de PAI-1p en el proceso aterosclerótico y su relación con WRN La fibrina en el organismo es formada en respuesta a un daño vascular, es un factor muy importante en la formación del coagulo sanguíneo. Los mecanismos de regulación de la formación y eliminación de fibrina son importantes para evitar una coagulación deficiente (excesiva ó insuficiente). 11 Uno de estos mecanismos es el que forma la plasmina; esta proteína es la encargada de degradar la fibrina formada durante el daño vascular. La plasmina es formada a partir del plasminogeno por la acción de los activadores del plasminogeno de tejido y de urokinasa (tPA y uPA), y su formación es inhibida por los inhibidores de los activadores del plasminogeno (PAI-1 y PAI-2). El eje de tPA-PAI-1 es el eje de regulación de plasmina más importante en la vasculatura. El equilibrio entre estos dos factores de regulación (tPA y PAI-1) es de suma importancia ya que la plasmina, además de degradar la fibrina, activa la matriz metalo proteasas (MMP) responsables de la degradación de la matriz extracelular. Un exceso de PAI-1 puede ocasionar una cantidad deficiente de plasmina cuyo resultado final, puede ser una trombosis y un crecimiento de las lesiones (figura 4). PAI-1p esta directamente involucrada en la degradación de la fibrina, es considerada un factor de riesgo para la recurrencia de infarto al miocardio y su sobreexpresión es causa inequívoca de aterosclerosis (18) (figura 4). El gen de PAI-1p (PAI-1), es expresado a altos niveles en tejidos vasculares de individuos de edad avanzada,(19) (la edad es sin duda, un factor de riesgo para la aterogénesis). PAI-1p se encuentra sobreexpresada, aproximadamente 11 veces más en células IMR90 (fibroblastos de pulmón humano fetal), en estado de senescencia replicativa, comparado con fibroblastos jóvenes (20, 21) y es sobreexpresada hasta 1,000 veces más en fibroblastos de pacientes con SW comparados con fibroblastos provenientes de individuos sanos (22, 23) . Estas evidencias nos hacen pensar en la existencia de una relación directa entre la expresión de los genes WRN y PAI-1. Esta interacción, provoca que cuando WRN es defectuoso (SW), se produce una enorme sobreexpresión (hasta 1,000 veces más) de PAI-1. 12 FIGURA 4.- La regulación de la proteína PAI-1 esta involucrada en el proceso de la degradación de la fibrina. 13 JUSTIFICACION La aterosclerosis es uno de los problemas de mortalidad y morbilidad en nuestra población Mexicana. Los riesgos de tener infarto al miocardio y otras enfermedades vasculares ó degenerativas son más frecuentes con la presencia de este factor. En 2001, la SSA reporto 17,950 muertes por enfermedades isquémicas del corazón y enfermedad cerebrovascular en individuos de edad productiva entre 15 y 64 años de edad en la República Mexicana. Reportó también en ese mismo año 495,639 casos nuevos de hipertensión arterial, enfermedades isquémicas del corazón y enfermedades cerebrovasculares(24). En Colima, aparecieron solamente 633 casos nuevos, lo cual equivale al 0.13% del total para la República Mexicana (24). La mayoría de estos pacientes reciben solamente tratamientos que retardan la aparición de complicaciones que pueden ocasionar su muerte. El conocimiento de la regulación a nivel génico de PAI-1, el cual es uno de los más importantes factores de riesgo para la aterogénesis (que es lo que se pretende estudiar en este trabajo), puede sentar las bases para el desarrollo de nuevos fármacos y estrategias terapéuticas, y para conocer y dar tentativas de solución por los problemas de mortalidad y morbilidad ocasionados por la aterosclerosis en nuestra población. Si estas nuevas estrategias a mediano y largo plazo se utilizaran, solamente en Colima, esto equivaldría a tener tratamiento para al menos un 0.13% de población total de México. 14 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ¿ La helicasa WRNp es un factor que regula la expresión de PAI-1? HIPOTESIS La helicasa WRNp actúa como factor supresor de la transcripción de PAI-1 de modo que cuando la helicasa esta afectada (como es el caso de SW), la supresión es inhibida y la transcripción se lleva a cabo en forma desmedida (sobreexpresión de PAI-1). HIPÓTESIS ESTADÍSTICA Hipótesis nula La helicasa WRNp no es un factor de transcripción que regule la expresión de PAI-1 (si falta WRNp, la expresión de PAI-1 no se modifica). Hipótesis alterna La helicasa (WRNp) es un factor de transcripción que regula la expresión de PAI-1. 15 OBJETIVO GENERAL - Estudiar el papel de la helicasa WRNp en el control de la transcripción de PAI-1, determinando si existe una relación física directa entre la helicasa WRNp y la región reguladora de PAI-1. Y si la falta de WRNp provoca la sobreexpresión de PAI-1. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1.- Determinar cuales son los niveles de expresión de los genes PAI-1 y WRN en diferentes tejidos y a diferentes etapas de desarrollo en ratones normales (WRN+/+). 2.- Determinar los niveles de expresión de PAI-1 en ratones transgénicos que no expresan WRN (WRN-/-). 3.- Demostrar la asociación física entre la proteína WRNp y la región reguladora del gen PAI-1 (RRPAI-1). 4.- Eliminar la expresión del gen WRN en un cultivo celular con un oligonucleótido antisentido para el RNA mensajero de la helicasa WRNp. Y observar la sobreexpresión de PAI-1. 16 MATERIAL Y METODOS Tipo de Estudio Experimental “in vitro” e “in vivo” Unidad de Estudio DNA celular, RNA celular, oligonucleotidos, cultivos celulares transfectados, ratones transgénicos y normales de la cepa C57BL/6. Tamaño de la Muestra Como la secuencia del DNA celular, la expresión de genes y los cultivos celulares transfectadas son únicas entonces se trabajará con la unidad de estudio. 17 Operacionalización de Variables VARIABLE NATURALEZA INTERRELACION NIVEL DE MEDICION EXPRESION DEL GEN WRN SEMICUANTITATIVA INDEPENDIENTE RAZON DENSIDAD DE MARCA EN UN GEL DE AGAROSA EXPRESIÓN DEL GEN PAI-1 SEMICUANTITATIVA DEPENDIENTE RAZON DENSIDAD DE MARCA EN UN GEL DE AGAROSA CUALITATIVA DEPENDIENTE NOMINAL CUALITATIVA DEPENDIENTE NOMINAL UNION DE WRN CON LA REGION REGULADORA DE PAI-1 (RRPAI-1) SOBREEXPRESION DE PAI-1 POR LA ELIMINACION DE WRN CON ANTISENTIDO 18 INDICADORES RETARDAMIENTO DE LA MOVILIDAD ELECTROFORETICA PRESENCIA ó AUSENCIA EN UN GEL DE AGAROSA AL 1% PRUEBA ESTADISTICA MEDIA DES. ESTA. MEDIA DES. EST. _ _ Aspectos Éticos Este proyecto se clasifica SIN RIESGO de acuerdo al reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud. Articulo 17, categoría I, sin embargo, se observan reglas para evitar contaminación ambiental con material biológico transformado o material peligroso. Con la finalidad de la protección propia y para asegurar la integridad de las muestras, el investigador usó guantes, cubreboca y bata mientras realiza su trabajo. El material biológico se inactivó con hipoclorito de sodio o esterilización, antes de ser desechado; el material peligroso, en su lugar, se incineró para evitar riesgos al medio ambiente. Control de Calidad El presente estudio se basa en los protocolos de Current Protocols In Molecular Biology(25) y Molecular Cloning (26), ya que estos protocolos están establecidos para cualquier método de Biología Molecular. 19 En este estudio fueron utilizados ratones de la cepa C57BL/6 normales y transgénicos (mutación K477M (6) en el gen WRN; mutación dominante negativa). No expresa WRN a diferentes edades. La expresión de WRN y PAI-1 fue evaluada semicuantitativamente mediante RT-PCR (Transcripción Reversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa) en diferentes tejidos (páncreas, cerebro, corazón y testículo) (figura 5). FIGURA 5.- Método de la expresión del gen PAI-1 y WRN. 20 Los productos de RT-PCR fueron sometidos a electroforesis y analizados por densitometría a partir de imágenes obtenidas con un documentador de geles (Gel,Doc de BIO-RAD). Los niveles de expresión fueron normalizados con los valores de expresión de β-actina para cada muestra, la presencia de proteína fue evaluada por ensayos de hibridación (Wester blot) (figura 6). FIGURA 6.- Método de detección de WRNp y PAI-1p por Western blot 21 Para evaluar la unión física de WRNp con la región reguladora del gen PAI-1 (RRPAI-1) está fue amplificada a partir de DNA genómico humano mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). La unión específica de la proteína WRN recombinante (27) a la RRPAI-1 se evaluó por el retardamiento en el corrimiento electroforético de la RR-PAI-1 en un gel de agarosa (figura 7). FIGURA 7.- Método del ensayo de retardamiento. 22 Se intentó observar la sobreexpresión de PAI-1 en cultivos celulares (mediante RT-PCR), en respuesta a la inhibición de la traducción de WRN mediante la transfección de un oligonucleótido antisentido especifico (figura 8). FIGURA 8.- Método para evaluar si la eliminación de WRNp en cultivos celulares, ocasiona la sobreexpresión de PAI-1. 23 Extracción del Tejido(26) Se utilizaron 35 ratones normales y 35 ratones transgénicos (no expresan WRN) de la cepa C57BL/6, para la extracción de los tejidos (páncreas, cerebro, corazón y testículo). Los ratones fueron colocados en una cámara cerrada con cloroformo para ser sacrificados, en grupos de 5 normales y 5 transgénicos de la misma edad de 0, 3, 6, 9, 15, 21 y 24 meses, se extrajo el corazón, el páncreas, testículo y cerebro de cada ratón. Todos los tejidos fueron colocados en 7 ml de TRIZOL TM (isotiocianato de guanidina y fenol: INVITROGENTM 15596-026). El tejido fue disgregado con un homogenizador de pistilo PRO250 durante 2 min. a 250 rpm (revoluciones por minuto) se extrajo el RNA y se determinó la expresión de PAI-1 y WRN, mediante RT-PCR. Extracción de RNA(26) Este método involucra la lisis de las células con una solución de fase orgánica donde el DNA y las proteínas son extraídos del RNA restante (sobrenadante acuoso). El RNA total se precipito de la fase acuosa con isopropanol. Para tejidos se lavó el trozo de tejido 30 seg. de 1 a 6 veces con agua estéril y se homogenizaron las muestras con una apropiada cantidad de trizol. Para células se lavaron las células con PBS 1X estéril, se dejo reposar la caja por 30 seg., se removió la mayor cantidad de PBS posible, se le adicionaron 3 ml de trizol pipeteando varias veces para romper las células, se recolectó el trizol y las células libres en un tubo de 15 ml. 24 Se adicionaron 0.2 ml de cloroformo por cada ml de trizol, se agitaron los tubos vigorosamente por 15 seg. en vortex se incubaron los tubos a temperatura ambiente por 3 min. y se centrifugaron a 9000 rpm a 4°C por 15 min. Se transfirió la fase acuosa de cada muestra a un tubo limpio y se agregaron 0.5 ml de alcohol isopropilico por 1 ml de trizol utilizado al principio de la homogenización, se incubaron las muestras a temperatura ambiente por 10 min. y se centrifugaron a 12000 rpm a 4°C por 10 min. Se removió el sobrenadante, se lavó el botón de RNA con 1 ml de etanol al 75%, se mezcló la muestra en el vortex y se centrifugó a 12000 rpm a 4°C por 5 min. Se removió el etanol y se dejo secar el botón del RNA al aire libre aproximadamente 10 min. El RNA total se resuspendió en agua tratada con Dietil Pirocarbonato (H2O-DEP) libre de RNAsas. Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de cDNA generado por la Transcriptasa Inversa (RT) a partir de RNA (RT-PCR) Este es un método usado para amplificar copias de cDNA (DNA codificante) obtenidos a partir de RNA. El RT-PCR es usado para generar grandes cantidades de cDNA de cantidades pequeñas de RNAm (RNA mensajero). Los detalles de la técnica puede variar de un protocolo a otro, pero los conceptos fundamentales son constantes y relativamente simples; donde el primer paso es la conversión enzimática de RNA de una sola hebra a un templado de cDNA. Un “primer” oligodeoxinucleotido es hibridizado con el RNAm y este es extendido por una DNA polimerasa dependiente de RNA (RT) para crear una copia de cDNA que puede ser amplificada por PCR. 1µg de RNA total de cada muestra estudiada, fue utilizado para la evaluación de la expresión de los genes WRN y PAI-1 mediante RT-PCR, utilizando para ello, el kit Super Script One Step RT-PCR (INVITRO GEN; catalogo 10928-034), y siguiendo las indicaciones del productor. 25 Los “primers” iniciadores utilizados para amplificar fueron: WRN F: CTGGAACATCTAAGTGACCC (Con 55°C de temperatura de WRN R: GCCTGGAGTCTGGTCTACTG alineamiento) PAI-1 F: CAAGGATGAGATCAGCACCACAG (Con 65°C de temperatura de PAI-1 R: GGGTTCCATCACTTGGCCCATG alineamiento) β-actina F: GCTGATCCACATCTGCTGG (Con 55°C de temperatura de β-actina R: CCAGCAGATGTGGATCAGC alineamiento) Brevemente: 1µg de RNA total fue colocado en un tubo eppendorf con los siguientes componentes: - 200 µg de dNTP´s - 50 µM de oligo dT - 0.2 µM de cada “primer” (F yR) - Mezcla de RT/Taq Polimerasa - 1.2 mM de Sulfato de Magnesio (4U de c/u) Cada reacción fue sometida al siguiente protocolo de temperatura en un termociclador iCycler de (BIO-RAD). - 1 Ciclo de 30 min a 50°C / 2 min a 94°C. - 40 Ciclos de desnaturalización a 94°C / 15 seg. alineamiento a (55°C para actina y WRN; 65°C para PAI-1) / 30 seg de polimerización 72°C / 1 min. - 1 Ciclo 72°C / 5 min. Los tubos fueron colocados a 4°C hasta que las muestras fueron sometidas a electroforesis en agarosa. 26 Electroforesis en Agarosa(26) Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en agarosa al 3% en TBE (89 mM de Tris-borato, 2 mM de EDTA), durante 2 horas a 100 V, usando como buffer de corrimiento, TBE al 0.5 X. Los geles fueron teñidos colocándolos en un baño de agua con Bromuro de Etidio. Se obtuvieron imágenes de los geles con un documentador de geles Gel.Doc (BIO-RAD), los cuales fueron sometidos a densitometría con un software del equipo para obtener valores numéricos. Ensayo de Western blotting(26) Esta técnica separa electroforeticamente proteínas que son transferidas de un gel a un soporte sólido y sondeadas con reactivos que son específicos para secuencias particulares de aminoácidos. Las sondas usualmente son anticuerpos que reaccionan específicamente con epitopes antigénicos de las proteínas blancos en el soporte sólido. El Western blotting es por lo tanto extremadamente útil para la identificación y cuantificación de proteínas especificas en muestras complejas de proteínas. La técnica es casi tan sensitiva como el radioinmunoensayo en fase sólida estándar e inmunoprecipitación diferencial, no se requiere que la proteína blanco este radioetiquetada, además la separación electroforética de proteínas es conducida bajo condiciones desnaturalizantes, para eliminar problemas de solubilidad, agregación, y cooprecipitación de las proteínas blancos con proteínas agregadas. En Western blotting, las muestras examinadas son solubilizadas con detergentes y agentes reductores, separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS, y transferidos a un soporte sólido (usualmente una nitrocelulosa o filtro PVDF). El filtro es subsecuentemente expuesto a un anticuerpo específico 27 (para la proteína blanco) sin etiquetar. Finalmente, la unión del anticuerpo es detectado por uno de varios reactivos inmunológicos. Gel de Poliacrilamida(26) Se prepararó un gel de corrimiento de acrilamida al 7% con Tris 180mM pH 8.8, SDS 1% y un gel concentrador de acrilamida al 4% con Tris 65mM pH 6.8, SDS 1%. Fueron colocados 50µl de cada muestra por línea y el gel fue corrido toda la noche a 35 V usando como buffer en el cátodo, una solución de Tris-base 100 mM, Tricina 100mM, SDS 10% (pH 8.25) y como buffer en el ánodo, una solución de Trisbase 200mM pH 8.9. Las proteínas separadas, fueron electrotransferidas a membranas Immobilon-PMR (Millipore) en un buffer de transferencia a 35 mA durante toda la noche. Sondas para W estern blot(26) Las membranas fueron prehibridadas con el buffer que contiene (5% de leche carnation sin grasa, 0.02% de azida de sodio, 0.02% de Tween 20 en PBS; (130mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 10 mM de Na 2HPO4 y 2 mM de KH2PO4) durante una hora a 37ºC. La presencia de WRNp o PAI-1p, fue evaluada mediante el reconocimiento de anticuerpos policlonales específicos como primer anticuerpo, el anticuerpo secundario fue un anticuerpo monoclonal Anti conejo acoplado a biotina, para ambas proteínas. Para revelar las membranas se utilizó un sistema biotina avidina (VectastinMR; VECTOR) y el reactivo RPN2109MR (Amersham) para detección con peroxidasa. Las membranas fueron expuestas a placas de rayos X para obtener imágenes. Ensayos de Retardamiento de la Movilidad Electroforética (Movility Shift) (26) Para determinar la unión entre la helicasa WRN y la secuencia reguladora de PAI-1. La proteína WRN recombinante pura (amablemente donada por el Dr. Mattew Grey del Departamento de Patología de la Escuela de Medicina de la Universidad de 28 Washington), se incubaron con la RRPAI-1 (obtenida por PCR a partir de DNA genómico humano), durante 30 min a 25ºC en concentraciones de 100 ng de fragmento por 1, 2 y 5 pmol de proteína. El retardamiento en la movilidad electroforética (se corrió en un gel de agarosa al 1% y teñidos con bromuro de etidio), fue evaluada con respecto al corrimiento de los fragmentos solos. La especificidad de dicha unión no fue evaluada. RNA Antisentido El RNA antisentido fue un oligonucleótido sintético de 23 bases con un grupo "psoralen" (28) en el extremo 5’ (5’-GAT CCA GTC CAA CAG GTC TTC TT-3’). Este RNA Antisentido es complementario al fragmento 124-147 del RNAm de WRN. Transfección de Células Eucariotas por el Método de Lipofección(26). Este método es usado para introducir DNAs exógenos dentro de cultivos celulares de mamíferos. El DNA es recubierto por un lípido para ser transfectado, lo cual interactúa directamente con la membrana plasmática de la célula y es llevada dentro de la célula por endocitosis. Se utilizaron 16 cajas de cultivos celulares de la línea de fibroblastos de ratón 3T3 donde 8 cajas de cultivo se utilizaron para la transfección con el oligonucleótido Anti-WRN y las otras 8 cajas de cultivo se utilizaron para la transfección sin Anti-WRN. Se coloco en un tubo de 15 ml 10µg de Anti-WRN y 200µl de Opti-MEM, posteriormente se coloco en otro tubo de 15 ml 200µl de Opti-MEM y 20µl de lipofectina, se incubaron ambos tubos durante 1 hora a temperatura ambiente. Se combinaron el contenido de ambos tubos, se incubaron 15 minutos a temperatura ambiente sin mover. Se retiro el medio del cultivo de las células y se lavaron una vez con Opti-MEM sin suero, se elimino el medio lo mejor posible (inclinando la caja de 29 cultivo). Se agrego 3.2 ml de Opti-MEM a la mezcla del Anti-sentido y lipofectina y se le adiciono a las células. Se incubaron 12 horas a 37°C en atmósfera con 5% de CO2. Se cambio el medio de cultivo y se incubo a 37°C durante 24 horas. Se monitoreo la expresión de la transfección lisando las células, se llevo a cabo un RTPCR para monitorear la expresión de WRN y PAI-1. 30 RESULTADOS Expresión de WRN y PAI-1. Mediante la técnica de RT-PCR, se evaluó semicuantitativamente la cantidad de RNAm de WRN y PAI-1 presente en muestras de diferentes tejidos (páncreas, corazón, cerebro y testículo) obtenidos de ratones normales (WRN +/+) a diferentes edades (0, 3, 6, 9, 15, 18 y 24 meses). Lo mismo se hizo para ratones transgénicos (WRN -/-). Los productos de RTPCR, fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 3% y teñidos con bromuro de etidio. Los valores numéricos de la cantidad de RNAm fueron obtenidos sometiendo dichos geles a densitometría mediante un documentador digital. La figura 9 muestra un ejemplo de estos geles, utilizando muestras de los cuatro tejidos estudiados, en ratones normales y transgénicos de 3 meses de edad. La expresión de β-actina sirvió como control positivo de la expresión, así como para normalizar los valores obtenidos de los otros dos genes (WRN y PAI-1). 31 FIGURA 9.-Se analizó la expresión de WRN y PAI-1 mediante RT-PCR. Se escogieron muestras al azar de diferentes tejidos de ratones adultos de 3 meses, control (WRN+/+) y transgénicos (WRN-/-). Para observar la expresión de los genes, se amplificaron fragmentos de 732 pb y 484 pb de PAI-1 y WRN respectivamente, con “primers” que no presentaban complementariedad mutua. Los productos fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 3% y teñidos con Et Br. A partir de estos geles, se obtuvieron valores numéricos mediante un análisis densitométrico por medio de un analizador de geles Gel. Doc (BIO-RAD). Los valores numéricos fueron normalizados mediante la comparación de la expresión del gen de β-actina cuyo fragmento amplificado fue de 1053 pb. M: Marcadores de peso molecular (100pb ladder), P: páncreas, Co: corazón, Ce: Cerebro, T: testículo 32 La evaluación semicuantitativa de la expresión mediante RT-PCR de WRN en diferentes tejidos de ratón normales, se resume en la figura 10. Los valores son unidades arbitrarias obtenidos del análisis densitométrico de los productos de RTPCR (RNAm), sometidos a electroforesis en geles de agarosa y teñidos con bromuro de etidio. La media y desviación estándar de 5 ratones diferentes fueron normalizados con los valores para β-actina de las mismas muestras. Se puede observar que el testículo es el tejido que expresa mayor cantidad de RNAm de WRN, seguido por el corazón, el páncreas y el cerebro. Se observa también que a mayor edad de los ratones, la expresión de WRN, disminuye, encontrándose en individuos de 24 meses valores por debajo de la mitad (en páncreas y cerebro) de los valores obtenidos para los ratones recién nacidos. Un dato importante es que en testículo y corazón (en ratones de las mismas edades), los valores disminuyen hasta 1/3 parte de los valores iniciales. 33 FIGURA 10.- Evaluación semicuantitativa por RT-PCR, de la cantidad de RNAm del gen WRN en páncreas, corazón, cerebro y testículo de ratones normales a diferentes edades. Los valores mostrados son el promedio y la desviación estándar de 5 muestras diferentes. 34 La figura 11 muestra las diferencias en expresión del gen PAI-1 en diferentes tejidos de ratones normales a diferentes edades. Los valores mostrados son la media y la desviación estándar de RNAm de PAI-1, normalizados con los valores obtenidos de la expresión de β-actina. La cantidad de RNAm esta mostrada en valores arbitrarios obtenidos mediante densitometría de los productos de RT-PCR sometidos a electroforesis en geles de agarosa. Se puede observar que la expresión de PAI-1 tiende a aumentar, cuando los individuos envejecen, encontrándose valores hasta tres veces mayores (0 meses = 1.5 y 24 meses = 4.02) en páncreas, (0 meses = 0.9 y 24 meses = 3.2) corazón y hasta 2 veces mayores (0 meses = 0.63 y 24 meses = 1.3) en cerebro y (0 meses = 0.25 y 24 meses = 0.5) en testículo. En testículo, la expresión de WRN disminuyo hasta menos de un tercio (0 meses = 0.82 y 24 meses = 0.22 figura 10) y la expresión de PAI-1, aumento menos de 2 veces (0 meses = 0.25 y 24 meses = 0.5 figura 11). 35 FIGURA 11.- Evaluación semicuantitativa por RT-PCR, de la cantidad de RNAm del gen PAI-1 en páncreas, corazón, cerebro y testículo de ratones normales (WRN +/+) a diferentes edades. Los valores mostrados son el promedio y la desviación estándar de 5 muestras diferentes. 36 Sobreexpresión de PAI-1 La comparación de la expresión de PAI-1 en los diferentes tejidos, los ratones transgénicos (WRN -/-) y ratones normales (WRN +/+), se presentan en la figura 12. La cantidad de RNAm de PAI-1 (evaluada por RT-PCR), se muestra como media todos los ratones estudiados a todas las edades y ha sido normalizada con la expresión de β-actina. La expresión de PAI-1 en los ratones normales independientemente del valor, ha sido tomada como 1, de tal modo que los valores obtenidos de los ratones transgénicos se ha tomado como el número de veces que sobrepasa este valor (sobreexpresión). El cerebro es el tejido que menor cantidad de PAI-1 sobreexpresa (20.5 veces) y el corazón es el tejido que sobreexpresa mas PAI-1 (92.7 veces). Este es un dato importante ya que se debe recordar que los individuos con SW mueren principalmente de infarto al corazón. 37 FIGURA 12.- Comparación de niveles de expresión de PAI-1 en ratones normales y transgénicos en los diferentes tejidos estudiados. Los valores mostrados son una media de todos los ratones de todas las edades. 38 La presencia de las proteínas WRNp y PAI-1p en los diferentes tejidos se demostró mediante Western blot. La figura 13 muestra los resultados utilizando los diferentes tejidos extraídos de ratones de 3 meses de edad. Se muestran el páncreas, corazón, cerebro y testículo de un ratón normal y solamente el corazón de un ratón transgénico. Pueden observarse las dos isoformas de PAI-1 (4.4 KD y 2.9 KD), presentes en todos los tejidos ensayados. 39 FIGURA 13.- Presencia de WRN y PAI-1 en ratones normales (WRN+/+) y ratones transgénicos (WRN-/-) por Western blot. Se escogieron muestras al azar de diferentes tejidos de ratones adultos de 3 meses. Para observar la presencia de WRN y PAI-1, se obtuvieron lisados celulares de los diferentes tejidos y se sometieron a electroforesis PAGE-SDS. Los geles fueron electrotransferidos a membranas de nitrocelulosa (Immobilon-P MR Millipore) e hibridados con anticuerpos policlonales específicos para PAI-1 y WRN; se utilizó un anticuerpo anti conejo acoplado a biotina como segundo anticuerpo. Las membranas fueron reveladas con un kit biotina-avidina (Vectastin MR MR ; VECTOR) y el reactivo RPN2109 (Amersham) para detección con peroxidasa. 40 Con el fin de demostrar la interacción directa entre la proteína WRNp y el gen de PAI-1, se llevo a cabo un ensayo de retardamiento de la movilidad electroforética de la región reguladora del gen PAI-1 (obtenido mediante PCR a partir de DNA genómico de humano) cuando WRNp está presente. Los resultados de dicho ensayo se muestran en la figura 14. Se puede observar que RR-PAI-1 solo, tiene mayor movilidad electroforética que cuando WRNp está presente en la solución. Las bandas obtenidas cuando WRNp está presente en la solución, puede interpretarse como la unión entre WRNp y RR-PAI-1. 41 FIGURA 14.- La región reguladora del gen PAI-1, obtenida por PCR a partir de DNA genómico humano, fue incubada 30 min a 25°C con diferentes concentraciones de WRN recombinante (5, 50, 200 nM) en buffer conteniendo: 100 mm de Tris (pH7.5), 10 mM de MgCl2, 200 mM de NaCl, 500 µg/ml de BSA y 10 mM de DTT. 25 µl de cada mezcla fue analizada por electroforesis en geles de agarosa al 3 %. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio. Las imágenes fueron obtenidas con un analizador de imágenes Gel. Doc de BIO-RAD. 42 La expresión de WRN fue inhibida mediante un oligonucleótido antisentido, transfectado en fibroblastos de ratón 3T3 cultivados “in vitro”. La expresión de WRN y PAI-1 fue evaluada mediante RT-PCR a diferentes tiempos post-transfección. La figura 15 muestra los resultados de la expresión de WRN y la figura 16 los resultados de la expresión de PAI-1. FIGURA 15.- Expresión de la proteína de WRN en diferentes tiempos de transfección de ANTI-WRN. 43 FIGURA 16.- Expresión de la proteína de PAI-1 en diferentes tiempos de transfección de ANTI-WRN. 44 DISCUSION Hemos estudiado el papel, que la helicasa WRNp tiene sobre la expresión de PAI-1 y se encontró que probablemente interviene en la regulación de su expresión, actuando como un represor. Según los datos obtenidos en este estudio, la expresión de WRN tiende a disminuir con el envejecimiento (figura 10), mientras que la expresión de PAI-1 tiende a aumentar (figura 11) en todos los tejidos estudiados. Además, la ausencia de WRNp en el organismo (WRN-/-), causa sobreexpresión de PAI-1 (figura 12). El mayor efecto de la falta de WRNp se encontró en corazón y testículo, tejidos que se ven más afectados en los individuos con SW. La actividad reguladora que tiene WRNp posiblemente se extiende a genes que tienen diferentes funciones según el tipo celular en donde WRN se exprese y que es ésta la causa de que las mutaciones en WRN puedan ocasionar gran cantidad de trastornos relacionados con diabetes, aterosclerosis, hipogonadismo, atrofia de la piel, atrofia de grasa subcutánea, etc. En humanos sanos el RNAm de WRNp se ha encontrado en células epiteliales de tubos seminíferos y células de Leydig en testículos; en células hacinares de páncreas y las zonas fascicular y reticular en la corteza de las glándulas adrenales.(29) Los factores de transcripción SP1 y AP2 (que regulan WRN) aparecieron de una manera edad dependiente en aquellas regiones donde WRN se expresó (SP1 en testículo y adrenales y AP2 en páncreas; 29) En este estudio, la expresión de PAI-1, se elevó hasta 68.6 veces y 58.8 veces en testículo y páncreas respectivamente, en los ratones transgénicos (WRN -/-; figura 12) indicando que estos son los principales órganos afectados cuando WRNp no está presente en el organismo. Sin embargo en este estudio, el corazón fue el órgano que sobreexpresó PAI-1 en mayor cantidad (92.7 veces; figura 12) posiblemente el mismo efecto se lleve a cabo en humanos y esta sea la causa de que gran parte de los individuos afectados con SW, mueran de infarto al corazón. Hasta hace poco se pensaba que los individuos con SW no presentaban alteraciones del sistema nerviosos central relacionados con la edad, sin embargo recientemente se demostró que los individuos con SW pueden tener alteraciones en 45 el sistema nervioso central, que incluyen la acumulación del péptido beta (30) . En nuestro estudio en ratones, el cerebro también expresó gran cantidad de WRN y se elevó la expresión de PAI-1 (hasta 20.5 veces; figura 12), cuando WRNp no estuvo presente. Los resultados anteriores, nos hicieron pensar que WRNp posiblemente podría intervenir directamente en la expresión de PAI-1, como un factor regulador de la expresión. Estudiando ésta interacción por medio de ensayos de retardamiento de la movilidad electroforética, nosotros encontramos que WRNp se une específicamente a la región reguladora del gen PAI-1 (figura 14) y posiblemente actúe como regulador negativo de dicha expresión. Nosotros quisimos demostrar la sobreexpresión de PAI-1 inhibiendo la expresión de WRN en un cultivo celular de fibroblastos, sin embargo no pudimos demostrar el aumento en la expresión de PAI-1. Aún así, nuestros resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que WRNp está actuando como un factor de transcripción del gen de PAI-1. No es raro encontrar casos en los que los factores de transcripción tienen actividad de helicasa (31; 32) y este parece ser el caso de la actividad de WRNp sobre la expresión de PAI-1, encontrada en el presente estudio. Recientemente se ha demostrado que WRNp interviene en la transcripción de una RNA Polimerasa demostró que WRNp se une al surco menor de una DNA Polimerasa (34) es regulada y fosforilada por una proteína cinasa dependiente de DNA (33) . Se y que WRNp (35; 36) , lo que habla de su naturaleza regulatoria. Todos estos hechos, apoyan nuestras observaciones de que WRNp está actuando en la regulación de la expresión de PAI1 y posiblemente en la regulación de la expresión de otros muchos genes que aún no han sido estudiados. Es importante hacer notar que los tejidos más afectados en los individuos con SW, son aquellos donde WRN se expresa en mayor nivel (páncreas, testículo, corazón, piel; 5), de tal modo que posiblemente, la actividad de factor de transcripción regulador de WRNp, no se limite a PAI-1, sino que esté involucrada en la regulación de otros genes y que, cuando WRN falta (como es el caso del SW), se origine el mal funcionamiento de los tejidos a través de la sobreexpresión o subexpresión de estos 46 genes. En páncreas, actuando en genes que, cuando están desregulados producen diabetes. En testículo y ovarios, actuando sobre genes que, cuando están desregulados pueden ocasionar hipogonadismo, etc. Algunos otros genes sobre los cuales WRN pudiera actuar como factor de transcripción son: la molécula de adhesión intracelular tipo 1 (ICAM-1; que también se ha postulado como posible factor de riesgo para aterosclerosis), la fibronectina (indispensable para la diferenciación de fibroblastos) y el receptor activado por proliferador de peroxisomas gamma (PPARγ; el cual se ha descrito como receptor a drogas sensibles a insulina y cuyos genes blanco regulan la diferenciación de adipositos y regulan la concentración de glucosa y lípidos en plasma (37). La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial, casi todos los estudios encaminados a entender el proceso aterosclerótico se basan en el hecho de que, independientemente del agente etiológico que la dispare, la aterosclerosis es producida por un daño en la pared vascular, este daño debe ser sistémico, ya que una persona que tiene un proceso aterosclerótico avanzado, está propensa a sufrir gran cantidad de trastornos (diabetes mellitus, infarto al miocardio, infarto cerebrovascular, obesidad, etc.) Posiblemente los genes que promueven el estado aterosclerótico, no sean muchos, pero el efecto debe ser solamente cuestión de susceptibilidad (polimorfismos) del tejido que es afectado mas fácilmente por estos genes desregulados. Esto nos habla de que los genes desregulados posiblemente tengan también actividad de regulación de la transcripción, esto es, que sean factores de transcripción, como es el caso de WRNp. 47 CONCLUSIONES En ratones normales los niveles de expresión de WRN disminuyeron con el envejecimiento de los individuos. En ratones normales los niveles de expresión de PAI-1 aumentaron con el envejecimiento de los individuos. Los niveles de expresión de PAI-1 aumentan decenas de veces, cuando WRNp no está presente (individuos WRN -/-). La proteína WRNp puede unirse a la región reguladora del gen PAI-1 demostrando su posible actividad reguladora. 48 PERSPECTIVAS En los pacientes con SW, los tejidos que primero desarrollan problemas relacionados con aterosclerosis, son aquellos donde WRNp se expresa en mayor cantidad, en condiciones normales; esto es, los tejidos más afectados son aquellos en donde la actividad o actividades de WRNp hacen falta: páncreas (diabetes mellitus), corazón (infarto al miocardio) piel (fibrosis, atrofia y ulceración) tejido adiposo (atrofia), gónadas (atrofia;1, 2, 4), además se ha observado que estos mismos tejidos sobreexpresan PAI-1 cuando sufren algún daño, aun cuando este no sea ocasionado por la falta de WRNp: páncreas (38) ; corazón (39) , piel (40; 41; 42) ; gónadas (43, 44). Tal parece ser que los tejidos mas afectados cuando WRNp hace falta en el organismo, son aquellos relacionados con la línea fibroblástica. Ya que WRNp es importante en la regulación de genes que intervienen en el proceso aterosclerótico, es muy importante conocer las vías en las cuales WRNp actúa. Recientemente se ha demostrado que además de PAI-1, existe una elevada concentración de la molécula de adhesión intracelular tipo 1 (ICAM-1) en sangre de individuos con SW (23) . Se ha encontrado también un aumento en la producción de fibronectina en cultivos de fibroblastos provenientes de pacientes con SW (45). De tal manera que las perspectivas de este trabajo serían determinar si WRNp actúa también como factor regulador en la expresión de estas proteínas (ICAM-1 y fibronectina), además de estudiar el mismo efecto, sobre el gen PPARγ que es un regulador de la diferenciación de adipositos, implicado en la patología de numerosas enfermedades que incluyen obesidad, diabetes, aterosclerosis y cáncer y requiere la misma vía de señalización de la proteína PAI-1 fisiológica con diabetes mellitus. 49 (46) , además de que tiene conexión ANEXOS Glosario. Anticuerpo: Es una proteína (inmunoglobulina) producida por los linfocitos B que reconoce un “antígeno” extraño particular, y pone así en marcha la respuesta inmune. Antisentido: Es la cadena de DNA que dirige la síntesis de RNAm por medio de los pares complementarios de bases. DNA Polimerasa: Es una enzima que puede sintetizar una nueva cadena de DNA a partir de una cadena molde. RNA Polimerasa: Es una enzima que sintetiza RNA utilizando un molde de DNA (descrita formalmente como RNA polimerasa-DNA dependiente). RNA Replicasa: Es una enzima que sintetiza RNA utilizando un molde RNA (utilizada para la replicación por los virus RNA). Cariotipo: Es el complemento cromosómico completo de una célula o de una especie (tal y como se ve durante la mitosis). Clon: Describe un gran numero de células o de moléculas idénticas a una molécula o célula ancestral única. Código Genético: Es la correspondencia entre los tripletes en el DNA (o RNA) y los aminoácidos de las proteínas. Codon: Es un triplete de nucleótidos que representa un aminoácido o una señal de terminación. 50 Correpresor: Es una pequeña molécula que pone en marcha la represión de la transcripción uniéndose a una proteína reguladora. Cromosoma: Es una unidad discreta del genoma que transporta muchos genes. Cada cromosoma consiste en una molécula muy larga de DNA dúplex y una masa aproximadamente igual de proteínas. Sólo es visible como entidad morfológica durante la división celular. Desnaturalización: Del DNA o del RNA describe su conversión desde la cadena doble al estado de cadena sencilla; la separación de las cadenas se consigue sobre todo mediante calentamiento. Dominio: De una proteína es una parte continua discreta de la secuencia de aminoácidos que se puede asimilar con una función en particular. Endonucleasas: Son enzimas que rompen uniones dentro de una cadena de un ácido nucleico; pueden ser especificas para el RNA o bien para DNA de cadena sencilla o doble. Enzimas de Restricción: Son las que reconocen secuencias cortas especificas del DNA y rompen el dúplex (a veces en un sitio blanco, a veces en otro, dependiendo del tipo). Exón: Es cualquier segmento de un gen interrumpido que esta representado en el producto del RNA maduro. Exonucleasas: Estas rompen los nucleótidos uno cada vez desde el extremo de una cadena de polinucleótidos; pueden ser especificas bien para el extremo 5´ o 3´ del DNA o del RNA. 51 Fenotipo: Es el aspecto u otras características de un organismo, que resulta de la interacción de su constitución genética con el medio. Fosfatasa: Es una enzima que elimina grupos fosfato de los sustratos. Fragmento de Okasaki: Son fragmentos cortos de 1000-2000 bases, que se producen durante la replicación, ellos actúan en la cadena retrasada del DNA. Gen: Es el segmento de DNA involucrado en producir una cadena polipeptídica; comprende regiones que preceden y siguen a la región codificadora (líder y cola) así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificadores individuales. Gen Regulador: Es el que codifica un RNA o un producto proteínico cuya función es controlar la expresión de otros genes. Genotipo: Es la constitución genética de organismo. Helicasa: Es una enzima que separa las cadenas de DNA, utilizando por lo general la hidrólisis del ATP para proporcionar la energía necesaria. Hibridación: Es el apareamiento de cadenas complementarias de DNA y RNA para dar lugar a un híbrido DNA-RNA. Hibridación en Situ: Es la que se lleva a cabo desnaturalizando el DNA de células aplastadas sobre un cristal portaobjetos de manera que es posible la reacción con un DNA o RNA de cadena sencilla añadidos; la preparación añadida es etiquetada de forma radiactiva y su hibridación se sigue mediante autorradiografía. Horquilla: Describe una región de doble hélice formada por apareamiento de bases entre secuencias complementarias adyacentes (invertidas) en una cadena única de RNA o DNA. 52 Horquilla de Replicación: Es el punto en el que se separan las cadenas del DNA dúplex parental de manera que se puede llevar a cabo la replicación. Intrón: Es un segmento de DNA que se transcribe, pero que es eliminado del interior de la transcripción por un splicing entre las secuencias de los (exones) situados a cada lado del mismo. Marcador: (DNA) fragmento de tamaño conocido que se usa para calibrar un gel de electroforesis. Mutación Nula: Es la que elimina completamente la función de un gen, por lo general porque lo borra físicamente. Oncogenes: Son genes cuyos productos tienen la capacidad de transformar células eucarióticas de manera que crecen de manera análoga a las células tumorales. Los oncogenes transportados por retrovirus tienen nombres de la forma v-onc. Origen (ori): Es una secuencia de DNA donde se inicia la replicación. Par de Bases (pb): Es un apareamiento de A con T o de C con G en una doble hélice de DNA; se pueden formar otros pares en el RNA bajo determinadas circunstancias. PCR (Reacción en cadena de polimerasa): Describe una técnica en la que se utilizan ciclos de desnaturalización, primers y extensión con DNA polimerasa para amplificar el número de copias de una secuencia blanco de DNA hasta > 106 veces. Polimorfismo: Se refiere a la presencia simultanea en la población de genomas que muestran variaciones alélicas (como se ven bien en alelos que producen fenotipos diferentes o, por ejemplo, en cambios en el DNA que afectan al patrón de restricción). 53 Primers: Es una secuencia corta (a menudo de RNA) que está apareada con una cadena de DNA y proporciona un extremo libre 3´-OH donde un DNA polimerasa comienza la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos. Promotor: Es una región del DNA que participa en la unión de la RNA polimerasa para iniciar la transcripción. Proteínas de Acción Cis: Tienen la propiedad excepcional de actuar solamente en la molécula de DNA a partir de la cual se expresan. Proteínas Reguladoras Positivas: Son las necesarias para la activación de una unidad de transcripción. Replicación: Es la que se logra separando las cadenas de un dúplex parental, actuando entonces cada una de las cadenas como molde para la síntesis de una complementaria. Splicing: Describe la eliminación de intrones y la unión de los exones en el RNA; así, los intrones se eliminan, mientras que los exones se empalman unos con otros. Supresor: Es habitualmente un gen que codifica un RNA mutante que lee el codón mutado bien en el sentido del codón original o para dar un sentido alternativo del significado original. Traducción: Es la síntesis de proteínas sobre el molde de RNAm. Transcripción: Es la síntesis del RNA sobre un molde de DNA. Transfección: De células eucarióticas es la adquisición de nuevos marcadores genéticos por la incorporación de un DNA añadido. 54 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1.- Epstein CJ, GM Martin, AL Schultz, AG Motulsky (1966) Werner's syndrome: a review of its symptomatology, natural history, pathologic features, genetics and relationships to the natural aging process; Medicine. 45: 172-221. 2.- Martin GM (1978) Genetic syndromes in man with potential relevance to the pathology of aging. Birth Defects; 14: 5-39. 3.- Epstein CJ, AG Motulsky (1996) Werner Syndrome: entering the helicasa era. Bio Essays; 18:1025-1027. 4.- Tollefsbol TO, HJ Cohen (1984) Werner's syndrome: An underdiagnosed disorder resembling premature aging. Age; 7: 75 – 88. 5.- Yu CE*, Oshima J*, Fu YW*, F Hisama, EM Wijsman, R Alisch, S Matthews, J Nakura, T T Miki, S Ouais, GM Martin, J Mulligan, GD Schellenberg (1996). Positional cloning of the Werner's syndrome gene. 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