protesis e implantes medicos revestidos con hidruros

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 223 965
51 Int. Cl. : A61L 27/30
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A61L 31/08
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ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 01999228 .8
86 Fecha de presentación: 05.12.2001
87 Número de publicación de la solicitud: 1339437
87 Fecha de publicación de la solicitud: 03.09.2003
54 Título: Prótesis e implantes médicos revestidos con hidruros metálicos y biomoléculas que tienen biocom
patibilidad mejorada.
30 Prioridad: 06.12.2000 DK 200001829
73 Titular/es: Astra Tech AB.
Aminogatan 1
431 21 Mölndal, SE
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.03.2005
72 Inventor/es: Lyngstadaas, Staale, Petter y
Ellingsen, Jan, Eirik
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso
ES 2 223 965 T3
01.03.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Prótesis e implantes médicos revestidos con hidruros metálicos y biomoléculas que tienen biocompatibilidad mejorada.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a prótesis y a implantes médicos con biocompatibilidad mejorada.
Antecedentes de la invención
Se ha propuesto mejorar la biocompatibilidad, p.
ej. de una prótesis de titanio mediante superficies metálicas de recubrimiento de la misma con una capa de
hidruro de titanio, p. ej., por bombardeo de plasma o
por electrolisis.
Se ha propuesto también mejorar la biocompatibilidad de las prótesis o implantes uniendo o integrando
varias biomoléculas activas a la superficie de la prótesis, p. ej., sobre la superficie metálica de una prótesis de titanio. Éste ha sido el objetivo con implantes
preparados de este modo que han mejorado la adaptación; presentan un aumento de la adherencia del tejido y un aumento de la compatibilidad con el tejido; poseen una superficie biológicamente activa para el aumento del crecimiento, de la diferenciación y
de la maduración celular; presentan una inmunorreactividad reducida; presentan actividad antimicrobiana;
presentan un aumento de las capacidades de biomineralización; producen una mejor cicatrización de la
herida y/o del hueso; conducen a mejorar la densidad
del hueso; poseen un “tiempo de sobrecarga” reducido y producen menos inflamación.
Se ha propuesto con frecuencia realizar dicha
unión utilizando por ejemplo reactivos químicos con
dos funcionalidades reactivas tales como formalina
o glutaraldehído, pero la naturaleza reactiva de estos agentes conduce con frecuencia a que las biomoléculas se vuelvan biológicamente inactivas y/o con
aumento de inmunorreactividad, lo que no es deseable.
Compendio de la invención
Se ha descubierto ahora sorprendentemente que es
posible enclavar, unir, ocluir y/o integrar una amplia
variedad de biomoléculas en o con una capa de hidruro durante el proceso inorgánico de formación de
dicha capa de hidruro sobre metales por electrolisis.
Antes de esta observación se consideraba muy difícil
unir y estabilizar biomoléculas bioactivas, no modificadas sobre metales, para su utilización especialmente
como superficies bioactivas sobre metales para su utilización como implantes en el cuerpo del vertebrado
in vivo.
La invención se refiere por consiguiente a una prótesis o a un implante médico que contiene un material
(A) metálico seleccionado del grupo que consta de titanio o una de sus aleaciones, circonio o una de sus
aleaciones, tántalo o una de sus aleaciones, hafnio o
una de sus aleaciones, niobio o una de sus aleaciones y de una aleación de cromo-vanadio, en la que las
partes superficiales del material (A) metálico están recubiertas con una capa de un material (B) del hidruro correspondiente seleccionado de hidruro de titanio,
hidruro de circonio, hidruro de tántalo, hidruro de hafnio, hidruro de niobio e hidruro de cromo y/o vanadio,
respectivamente, caracterizado porque la capa de material (B) de hidruro comprende una o más sustancias
(C) biomoleculares asociadas a ésta.
La invención se refiere además a un método para preparar una prótesis o implante médico como se
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definió anteriormente, comprendiendo dicho método
someter las partes superficiales del material (A) metálico definido anteriormente a un tratamiento de electrolisis para formar la capa de material (B) de hidruro,
realizándose dicho tratamiento de electrolisis en presencia de una o más sustancias (C) biomoleculares.
Descripción detallada de la invención
En el presente contexto, la frase “prótesis e implante médico” incluye en su alcance cualquier producto destinado a ser implantado en el cuerpo de un
animal vertebrado, en particular un mamífero tal como un ser humano. Ejemplos no limitativos de dichas
prótesis son las prótesis médicas que reemplazan la
anatomía o restablecen una función del cuerpo tal como la articulación femoral de la cadera; la apófisis
femoral; el cotilo; el codo incluyendo hipófisis, diáfasis, las inserciones articulares; la rodilla, incluyendo
los componentes femorales y tibiales, hipófisis, diáfasis, las inserciones articulares o los componentes rotulianos; omoplatos incluyendo hipófisis y diáfisis; la
muñeca; los tobillos; la mano; los dedos de las manos;
los dedos de los pies; las vértebras; los discos vertebrales; las articulaciones artificiales; los implantes
dentales; los implantes plásticos de huesos pequeños;
los implantes en el oído medio incluyendo el yunque,
el martillo, el estribo, yunque-estribo, martillo-yunque, martillo-yunque-estribo, los implantes cocleares;
los aparatos ortopédicos de fijación tales como clavos, tornillos, grapas y placas; las válvulas cardíacas;
marcapasos; catéteres; recipientes; implantes de relleno de espacio; implantes para retención de audífonos;
implantes para fijación externa; y también dispositivos intrauterinos (DIU); y dispositivos bioelectrónicos tales como los dispositivos electrónicos intracocleares o intracraneales.
En el presente contexto, el término “biomolécula”
se destina a cubrir y comprender dentro de su significado una variedad muy amplia de moléculas biológicamente activas en el sentido más amplio de la palabra, sean biomoléculas naturales (es decir, moléculas
naturales procedentes de fuentes naturales), moléculas sintéticas (es decir, moléculas naturales preparadas por síntesis, así como moléculas o formas de moléculas no naturales preparadas por síntesis) o biomoléculas recombinantes (es decir, preparadas mediante
la utilización de técnicas recombinantes).
A continuación se da una lista no limitativa de
grupos y especies principales de biomoléculas que se
contemplan por ser adecuadas para la incorporación
en una capa de hidruro metálico (de modo estable y/o
fisiológicamente reversible) según la invención.
Biomoléculas extraídas
Bioadhesivos
Éstas son biomoléculas que intervienen en la
unión de las células, tejido, órganos u organismos en
superficies no biológicas como vidrio, roca, etc. Este
grupo de biomoléculas incluye las proteínas adherentes del mejillón marino, las proteínas de tipo fibrina,
las proteínas de la telaraña, los adhesivos procedentes
de plantas (resinas), los adhesivos extraídos de animales marinos y los adhesivos procedentes de insectos
(como las resilinas). Algunos ejemplos específicos de
adhesivos son:
Fibrina; fibroína; proteína del viso de Mytilus edulis (mefp1, “proteína adherente del mejillón”); otras
proteínas adherentes del mejillón; proteínas y péptidos con bloques ricos en glicina; proteínas y péptidos
con bloques de poli-alanina; y sedas.
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Factores de unión de las células
Los factores de unión de las células son biomoléculas que intervienen en la unión y en la propagación
de las células en las superficies biológicas o de otras
células y tejidos. Este grupo de moléculas contiene
normalmente moléculas que participan activamente
en la interacción célula-matriz y célula-célula durante
el desarrollo, neogénesis, regeneración y reparación
del vertebrado. Biomoléculas típicas de esta clase son
moléculas en la superficie externa de las células como la clase CD de receptores en los glóbulos blancos, immunoglobulinas y proteínas hemoaglutinantes
y moléculas/ligandos de la matriz extracelular que se
adhieren a dichas moléculas celulares. Ejemplos típicos de factores de la unión celular con potencial
para su utilización como recubrimiento bioactivo en
los implantes recubiertos de hidruro metálico son: anquirinas; caderinas (moléculas adhesivas dependientes del calcio); conexinas; sulfato de dermatán; entactina; fibrina; fibronectina; glicolípidos; glicoforina; glicoproteínas; sulfato de heparán; sulfato de heparina; ácido hialurónico; inmunoglobulinas; sulfato
de queratán, integrinas; lamininas; N-CAM (moléculas adherentes independientes del calcio); proteoglucanos; espectrina; vinculina y vitronectina.
Biopolímeros
Los biopolímeros son cualquier molécula preparada biológicamente que, dadas las condiciones apropiadas, se pueden montar en estructuras macromoleculares, poliméricas. Dichas moléculas constituyen
partes importantes de la matriz extracelular en la que
participan proporcionando resiliencia, resistencia, rigidez, integridad, etc. del tejido. Algunos biopolímeros importantes con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en implantes recubiertos
por hidruro metálico son: alginatos; amelogeninas;
celulosa; chitosán; colágeno; gelatinas; oligosacáridos y pectina.
Proteínas de la sangre
Esta clase de proteínas contiene normalmente
cualquier proteína disuelta o agregada que normalmente está presente en la sangre completa. Dichas
proteínas pueden participar en un amplio intervalo de
procesos biológicos como la inflamación, guiado de
células, coagulación, señalización de células, defensa, reacciones inmunitarias, metabolismo, etc. Ejemplos típicos con potencial para su utilización como
recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos
por hidruro metálico son: albúmina; albumen; citocinas; factor IX; factor V; factor VII; factor VIII; factor
X; factor XI; factor XII; factor XIII; hemoglobinas
(con o sin hierro); inmunoglobulinas (anticuerpos); fibrina; factores de crecimiento derivados de plaquetas
(PDGF); plasminógeno; trombospondina y transferrina.
Enzimas
Las enzimas son cualquier proteína o péptido que
tenga un efecto catalítico específico en uno o más
substratos biológicos que pueden ser prácticamente
cualesquiera de los azúcares sencillos que acomplejan
macromoléculas como ADN. Los enzimas son potencialmente útiles para desencadenar respuestas biológicas en el tejido por degradación de moléculas de
la matriz, o se podrían utilizar para activar o liberar
otros compuestos bioactivos en el recubrimiento del
implante. Algunos ejemplos importantes con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo
en los implantes recubiertos de hidruro metálico son:
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abzimas (anticuerpos con capacidad enzimática); adenilatociclasa; fosfatasa alcalina; carboxilasas; colagenasas; ciclooxigenasa; hidrolasas; isomerasas; ligasas; liasas; metaloproteasas de la matriz (MMP); nucleasas; oxidorreductasas; peptidasas; peptidohidrolasa; peptidil-transferasa; fosfolipasa; proteasas; sucrasa-isomaltasa; TIMP y transferasas.
Proteínas y biomoléculas de la matriz extracelular
Células especializadas, p. ej. fibroblastos y osteoblastos, producen la matriz extracelular. Esta matriz
participa en varios procesos importantes. La matriz es
crucial, entre otros, para la cicatrización de la herida,
la homeostasis del tejido, el desarrollo y la restauración, la resistencia del tejido y la integridad del tejido. La matriz también decide el medio extracelular
como pH, fuerza iónica, osmolaridad, etc. Además las
moléculas de la matriz extracelular son cruciales para la inducción y el control de la formación biomineral (hueso, cartílago, dientes). Importantes proteínas y
biomoléculas extracelulares con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en implantes
recubiertos de hidruro metálico incluyen: ameloblastina; amelina; amelogeninas; colágenos (I a XII); dentina-sialo-proteína (DSP); dentina-sialo-fosfo-proteína (DSPP); elastinas; enamelina; fibrinas; fibronectinas; queratinas (1 a 20); lamininas; tuftelina; carbohidratos; sulfato de condroitina; sulfato de heparán;
sulfato de heparina; ácido hialurónico, lípidos y ácidos grasos; lipopolisacáridos.
Factores de crecimiento y hormonas
Los factores de crecimiento y las hormonas son
moléculas que se unen a las estructuras de la superficie celular (receptores) y generan una señal en
la célula diana para iniciar un proceso biológico específico. Ejemplos de dichos procesos son el crecimiento, la muerte celular programada, la liberación
de otras moléculas (p. ej. las moléculas de la matriz
extracelular o el azúcar), la diferenciación celular y la
maduración, la regulación del ritmo metabólico, etc.
Ejemplos típicos de dichas biomoléculas con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos de hidruro metálico
son: activinas (Act); anfirregulina (AR); angiopoyetinas (Ang 1 a 4); Apo3 (inductor débil de apóptosis también conocido como TWEAK, DR3, WSL-1,
TRAMP o LARD); Betacelulina (BTC); Factor de
crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, FGF-b);
Factor de crecimiento ácido de fibroblastos (aFGF,
FGF-a); Ligando 4-1BB; Factor neurótrofo procedente del cerebro (BDNF); Boloquina procedente del
pecho y del riñón (BRAK); Proteínas morfógenas
óseas (BMP); Quimiocina 1 que atrae linfocitos B
quimioatrayentes/linfocitos B (BLC/BCA-1); CD27L
(ligando CD27); CD30L (ligando CD30); CD40L
(ligando CD40); Ligando inductor de proliferación
(APRIL); Cardiotrofina-1 (CT-1); Factor neurótrofo
ciliar (CNTF); Factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF); citocinas; 6-cisteína quimiocina (6Ckine); factores de crecimiento epidérmicos (EGF); Eotaxina (Eot); proteína 78 activadora neutrófila procedente de las células epiteliales (ENA-78); eritropoyetina (Epo); factores de crecimiento de fibroblastos (FGF 3 a 19); Fractalcina; factores neutrópos derivados del glial (GDNF); ligando receptor de TNF
inducido por glucocorticoides (GITRL); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); factor estimulante de colonia de granulocitos macrófagos (GM-CSF); proteínas quimiotácticas de granulo3
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citos (GCP); hormona del crecimiento (GH); I-309;
oncógeno relacionado con el crecimiento (GRO); inhibinas (Inh); linfocito T alfa quimioatrayente inducible por interferón (I-TAC); ligando Fas (FasL); heregulinas (HRG); factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento epidérmico que se une a la heparina (HB-EFG); ligando de tirosina cinasa 3 de
tipo fms (Flt-3L); quimiocinas de hemofiltrado CC
(HCC-1 a 4); factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF); insulina; factores de crecimiento de tipo insulina (IGF 1 a 2); proteína 10 inducible por interferón gamma (IP-10); interleucinas (IL 1 a 18); interferón gamma (INF-gamma); factor de crecimiento de queratinocitos (KGF); factor 2 de crecimiento
de queratinocitos (FGF-10); leptina (OB); factor inhibidor de la leucemia (LIF); Linfotoxina beta (LTB); Linfotactina (LTN); factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CFS); quimiocina procedente
de macrófagos (MDC); proteína estimulante de macrófagos (MSP); proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP); Midcina (MK); proteínas quimioatrayentes de monocitos (MCP-1 a 4); monocina inducida por
IFN-gamma (MIG); MSX 1; MSX 2; sustancia inhibidora de Müller (MIS); factor 1 inhibidor progenitor
mieloide (MPIF-1); factor de crecimiento de nervios
(NGF); neurotrofinas (NT); péptido 2 activador neutrófilo (NAP-2); Oncostatina M (OSM); Osteocalcina; OP-1; Osteopontina; ligando OX40; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF aa, ab y bb);
factor 4 de plaquetas (PF4); pleyotrofina (PTN); quimiocina pulmonar y regulada por activación (PARC);
linfocitos T normales, regulados en activación, expresados y segregados (RANTES); factor procedente de
neuronas sensitivas y motrices (SMDF); miembro 26
de la subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas
(SCYA26); factor de células madre (SCF); factor 1
procedente de las células del estroma (SDF-1); quimiocina del timo y regulada por activación (TARC);
quimiocina expresada en el timo (TECK); ligando
1 expresado en leucocitos relacionados con ApoL y
TNF (TALL-1); ligando inductor de apoptosis relacionada con TNF (TRAIL); citocina inducida por activación relacionada con TNF (TRANCE); expresión
inducible por linfotoxina y en competencia con glucoproteína D de HSV para el receptor de linfocitos
T de HVEM (LIGHT); factor de crecimiento de la
placenta (PIGF); Trombopoyetina (Tpo); factores de
crecimiento transformantes (TGF alfa, TGF beta 1,
TGF beta 2); factores de necrosis tumoral (TNF alfa y beta); factores de crecimiento vascular endotelial (VEGF-A,B,C y D); calcitoninas y compuestos
esteroideos tales como las hormonas sexuales naturales como por ejemplo estrógeno, progesterona, testosterona, así como sus análogos. Por lo tanto, se podrían contemplar determinados implantes tales como
los IUD (dispositivos intrauterinos) que comprenden
p. ej., estrógenos o progesterona o sus análogos.
Ácidos nucleicos (ADN)
El ADN codifica los genes para las proteínas y
péptidos. Asimismo, el ADN contiene un amplio conjunto de secuencias que regulan la expresión de los
genes contenidos. Existen varios tipos de ADN, dependiendo de la procedencia, función, origen y estructura. Ejemplos típicos de moléculas basadas en ADN
que se pueden utilizar como recubrimientos de liberación lenta, bioactivos en implantes (terapia génica
local) son: A-ADN; B-ADN; cromosomas artificia4
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les que llevan ADN de mamíferos (YAC); ADN cromosómico; ADN circular; cósmidos que llevan ADN
de mamífero; ADN; ADN de doble cadena (ADNds);
ADN genómico; ADN semi-metilado; ADN lineal;
ADNc de mamífero (ADN complementario; ADN copia de ARN); ADN de mamífero; ADN metilado;
ADN mitocondrial; fagos que llevan ADN de mamífero; fagómidos que llevan ADN de mamífero; plásmidos que llevan ADN de mamífero; plástidos que
llevan ADN de mamífero; ADN recombinante; fragmentos de restricción de ADN de mamífero; retroposones que llevan ADN de mamífero; ADN de una sola cadena (ADNss); transposones que llevan ADN de
mamífero; T-ADN; virus que llevan ADN de mamífero; Z-ADN.
Ácidos nucleicos (ARN)
El ARN es una transcripción de la información codificada por el ADN. (A veces (en algunos virus) el
ARN es la unidad que codifica la información esencial). Además de ser un intermediario de la expresión de los genes, el ARN ha demostrado tener varias
funciones biológicas. Los ribozimas son moléculas de
ARN sencillas con acción catalítica. Estos ARN pueden catalizar la escisión y la unión del ADN y del
ARN, hidrolizar péptidos y son el núcleo de la traducción del ARN en los péptidos (el ribosoma es un ribozima). Ejemplos típicos de moléculas de ARN con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en implantes recubiertos con hidruro metálico
son: ARN de transferencia acetilado (ARNt activado,
ARNt con carga); ARN circular; ARN lineal; ARN
nuclear heterogéneo de mamífero (ARNhn), ARN
mensajero de mamífero (ARNm); ARN de mamífero; ARN ribosómico de mamífero (ARNr); ARN de
transferencia de mamífero (ARNt); ARNm; ARN poliadenilado; ARN ribosómico (ARNr); ARN recombinante; retroposones que llevan ARN de mamífero;
ribozimas; ARN de transferencia (ARNt); virus que
llevan ARN de mamífero.
Receptores
Los receptores son biomoléculas de la superficie
celular que unen señales (p. ej. ligandos de hormonas
y factores de crecimiento) y transmiten la señal sobre la membrana celular y en el sistema interno de las
células. Diferentes receptores se “conectan” de forma
diferente imponiendo diferentes respuestas intracelulares incluso al mismo ligando. Esto hace posible que
las células reaccionen de forma diferente a las señales
externas variando la configuración de los receptores
en su superficie. Los receptores se unen normalmente
a su ligando de forma reversible, haciéndoles adecuados como vehículos de factores de crecimiento que
son para liberarse en el tejido. De este modo al recubrir implantes con receptores de factor de crecimiento
y a continuación cargar estos receptores con sus ligandos principales, se consigue una superficie bioactiva
que se puede utilizar para la liberación controlada de
los factores de crecimiento en los tejidos circundantes después de la implantación. Ejemplos de receptores adecuados con potencial para su utilización como
recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos
con hidruro metálico incluyen: La clase CD de receptores CD; receptores de EFG; receptores de FGF; receptor de fibronectina (VLA-5); receptor del factor de
crecimiento, proteínas de unión a IGF (IGFBP 1 a 4);
integrinas (incluyendo VLA 1-4); receptor de laminina; receptor de PDGF; receptores alfa y beta del fac-
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tor de crecimiento transformante; receptores de BMP;
Fas; receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (Flt-1); receptor de vitronectina.
Biomoléculas sintéticas
Las biomoléculas sintéticas son moléculas que se
basan en (simular) biomoléculas naturales. Sintetizando dichas moléculas se puede introducir un amplio
conjunto de modificación química y estructural que
puede estabilizar la molécula o hacerla más bioactiva o específica. De este modo si una molécula es demasiado inestable o no específica para ser utilizada
a partir de extractos es posible modificarlas genéticamente y sintetizarlas para su utilización como recubrimientos de la superficie del implante. Además,
muchas biomoléculas son tan poco abundantes que la
extracción a escalas industriales es imposible. Dichas
biomoléculas raras se han de preparar por síntesis, p.
ej. mediante tecnología recombinante o por (bio-) química. A continuación se relacionan varias clases de
moléculas sintéticas que pueden ser potencialmente
útiles para implantar recubrimientos:
ADN sintético
A-ADN; ADN de cadena complementaria; BADN; ADN complementario (ADNc); ADN modificado químicamente; ADN estabilizado químicamente; ADN; análogos de ADN; oligómeros de ADN;
polímeros de ADN; híbridos de ADN-ARN; ADN
de doble cadena (ADNds); ADN semimetilado; ADN
metilado; ADN de una sola cadena (ADNss); ADN
recombinante; ADN de triple cadena; T-ADN; ZADN.
ARN sintético
ARN de cadena complementaria; ARN modificado químicamente; ARN estabilizado químicamente;
ARN nuclear heterogéneo (ARNhn); ARN mensajero
(ARNm); ribozimas; ARN; análogos de ARN; híbridos de ARN-ADN; oligómeros de ARN; polímeros
de ARN; ARN ribosómico (ARNr); ARN de transferencia (ARNt).
Biopolímeros sintéticos
Liposomas catiónicos y aniónicos; acetato de celulosa; ácido hialurónico; ácido poliláctico; alginato
de poliglicol; ácido poliglicólico; poliprolinas y polisacáridos.
Péptidos sintéticos
Decapéptidos que contienen DOPA y/o diDOPA;
péptidos con la secuencia “Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
Pro Thr Tyr Lys”; péptidos en los que Pro está sustituido con hidroxiprolina; péptidos en los que uno o
más Pro está sustituido con DOPA; péptidos en los
que uno o más Pro está sustituido con diDOPA; péptidos en los que uno o más Tyr está sustituido con DOPA; hormonas de péptido; secuencias de péptido basadas en las proteínas extraídas relacionadas anteriormente; péptidos que contienen un motivo (Arg Gly
Asp) de RGD.
Proteínas recombinantes
Todos los péptidos y proteínas preparados de forma recombinante.
Inhibidores sintéticos de enzima
Los inhibidores sintéticos de enzimas varían desde moléculas sencillas, como determinados iones metálicos, que bloquean la actividad enzimática uniéndose directamente al enzima, hasta moléculas sintéticas que simulan el sustrato natural de un enzima
y de este modo compiten con el sustrato principal.
Un recubrimiento del implante que incluye inhibidores enzimáticos podría ayudar a estabilizar y con-
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trarrestar la destrucción de otras biomoléculas presentes en el recubrimiento, de modo que se consiga más tiempo de reacción y/o mayor concentración
del compuesto bioactivo. Ejemplos de inhibidores enzimáticos son: Pepstatina; poli-prolinas; D-azúcares;
D-aminoácidos; cianuro; fluorofosfatos de isopropilo (DFP); iones metálicos; N-tosil-I-fenilalaninaclorometil cetona (TPCK); Fisostigmina; Paratión; Penicilina.
Vitaminas (sintéticas o extraídas) para la incorporación en el hidruro
Biotina; calciferol (vitaminas D; vitales para una
buena mineralización); citrina; ácido fólico; niacina;
nicotinamida; dinucleótido de nicotinamida adenina
(NAD, NAD+); fosfato del dinucleótido de nicotinamida adenina (NADP, NADPH); ácido retinoico (vitamina A); riboflavina; vitaminas B; vitamina C (vital
para la síntesis del colágeno); vitamina E; vitamina K.
Otras moléculas bioactivas para la incorporación en
el hidruro
Difosfato de adenosina (ADP); monofosfato de
adenosina (AMP); trifosfato de adenosina (ATP);
aminoácidos; AMP cíclico (AMPc); 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA); 5’-di(dihidroxifenil-L-alanina
(diDOPA); diDOPA quinona; o-difenoles de tipo DOPA; ácidos grasos; glucosa; hidroxiprolina; nucleósidos; nucleótidos (bases de ARN y de ADN); prostaglandina; azúcares; 1-fosfato de esfingosina; rapamicina; hormonas sexuales sintéticas tales como análogos de estrógeno, progesterona o testosterona, p. ej
Tamoxifeno; moduladores del receptor del estrógeno (SERM) tal como Raloxifeno; bis-fosfonatos tales
como alendronato, risendronato y etidronato; estatinas tales como cerivastatina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina y 3,5-dihidroxi-7-[3-(4-fluorofenil)-1-(metiletil)-1H-indol-2il]- hept-6-enoato de sodio.
Fármacos para la incorporación en los recubrimientos de hidruro
Los fármacos incorporados en la capa de hidruro
se podrían utilizar para efectos locales como mejorar
la resistencia local frente a la invasión de microbios, el
control del dolor local, la inhibición local de la síntesis de prostaglandina, la regulación de la inflamación
local, la inducción local de la biomineralización y la
estimulación local del crecimiento del tejido. Ejemplos de fármacos adecuados para la incorporación en
las capas de hidruro metálico incluyen: antibióticos;
inhibidores de ciclooxigenasa; hormonas; inhibidores
de inflamación; NSAID; analgésicos; inhibidores de
la síntesis de prostaglandina; esteroides; tetraciclina
(también como agente de biomineralización).
Iones biológicamente activos para la incorporación
en recubrimientos de hidruro
Los iones son importantes en diversos mecanismos biológicos. Al incorporar iones biológicamente
activos en las capas de hidruro metálico en los implantes es posible estimular localmente los procesos biológicos como la función enzimática, el bloqueo enzimático, la absorción celular de biomoléculas, el direccionamiento de células específicas, la biomineralización,
la apoptosis, la secreción celular de biomoléculas, el
metabolismo celular y la defensa celular. Ejemplos de
iones bioactivos para incorporación en el hidruro metálico incluyen: calcio; cromo; cobre; fluoruro; oro;
yoduro; hierro; potasio; magnesio; manganeso; selenio; plata; sodio y cinc.
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Biomoléculas marcadoras
Los marcadores biológicos son moléculas que generan una señal detectable, p. ej. emitiendo luz, actividad enzimática, radioactividad, color específico,
magnetismo, densidad de rayos-x, estructura específica, antigenicidad, etc., que se puede detectar mediante instrumentos específicos, por microscopía, por un
método detector de imagen como rayos-x o por resonancia magnética. Los marcadores se utilizan para
controlar procesos biológicos en la investigación y desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento biomédico. En implantes, dichos marcadores se emplearían
de forma típica para controlar procesos como la biocompatibilidad, formación del tejido, neogénesis del
tejido, biomineralización, inflamación, infección, regeneración, restauración, homeostasis del tejido, destrucción del tejido, renovación del tejido, liberación
de biomoléculas de la superficie del implante, bioactividad de las biomoléculas liberadas, absorción y expresión de los ácidos nucleicos liberados de la superficie del implante y capacidad antibiótica de la superficie del implante para proporcionar validación de “la
prueba del principio”, del efecto, de la eficacia y de la
seguridad antes de los estudios clínicos.
Las biomoléculas marcadoras adecuadas para su
incorporación en los recubrimientos de hidruro incluyen:
Calceína; alizarán; ed; tetraciclinas; fluorescinas;
fura; luciferasa; fosfatasa alcalina; aminoácidos radiomarcados (p. ej. marcados con 32 P, 33 P, 3 H, 35 S,
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C, 125 I, 51 Cr, 45 Ca); nucleótidos radiomarcados (p.
ej. marcados con 32 P, 33 P, 3 H, 35 S, 14 C); péptidos y
proteínas radiomarcados; ADN y ARN radiomarcados; complejos inmuno-oro (partículas de oro con
anticuerpos unidos); complejos inmuno-plata; complejos inmuno-magnetita; proteína verde fluorescente (GFP); proteína roja fluorescente (E5); proteínas
y péptidos biotinilados; ácidos nucleicos biotinilados;
anticuerpos biotinilados; conectadores al carbono biotinilados; genes indicadores (cualquier gen que genere una señal cuando se expresa); yoduro de propidio;
diamidino amarillo.
El dispositivo o implante según la invención se
puede utilizar para numerosos fines. Ejemplos de dichos fines incluyen la utilización para: inducir localmente la formación del tejido duro (p. ej. tejido óseo)
en el punto de implantación; controlar el crecimiento
y/o la invasión microbiana en el punto de la implantación o de forma generalizada; reducir la inflamación
en el punto de la implantación o de forma generalizada; estimular la restauración, regeneración o formación del ligamento; inducir la formación del cartílago;
crear núcleos, controlar y/o crear plantillas de biomineralización; mejorar la unión entre implantes y tejidos; mejorar la integración ósea de los implantes; mejorar la adherencia del tejido a un implante; impedir
la adherencia del tejido a un implante (semipermanente o temporal); mejorar el contacto entre tejidos
o tejidos e implantes; mejorar el cierre del tejido de
una herida (quirúrgica); inducir la apoptosis (muerte
celular) en las células indeseables (p. ej. células cancerosas); inducir la diferenciación y/o maduración celular específica, aumentando la resistencia a la tensión
del tejido; mejorar la cicatrización de la herida; acelerar la cicatrización de la herida; modelar la formación
del tejido; guiar la formación del tejido; terapia génica local; estimular el crecimiento del nervio; mejorar
la vascularización en los tejidos adyacentes a un im6
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plante; estimular la síntesis de la matriz extracelular
local; inhibir la destrucción de la matriz extracelular
local; inducir la liberación del factor de crecimiento
local; aumentar localmente el metabolismo del tejido; mejorar la función de un tejido o de una parte del
cuerpo; reducir el dolor y las molestias localmente. El
objetivo dependerá del tipo de implante así como de la
naturaleza y/o de la concentración de la biomolécula
presente en la capa de hidruro en el implante.
Cuando el material (A) metálico es una aleación
de titanio, circonio, tántalo, hafnio o niobio, puede ser
una aleación entre uno o más de estos elementos metálicos; o puede ser una aleación que contenga uno u
otros más metales tales como aluminio, vanadio, cromo, cobalto, magnesio, hierro, oro, plata, cobre, mercurio, estaño o cinc; o ambos.
Es preferible que el material (A) metálico sea titanio o una aleación de éste, p. ej. una aleación con
circonio, tántalo, hafnio, niobio, aluminio, vanadio,
cromo, cobalto, magnesio, hierro, oro, plata, cobre,
mercurio, estaño o cinc. En una realización particularmente preferida, el material (A) metálico es el titanio.
El correspondiente material (B) de hidruro es preferentemente hidruro de titanio.
La cantidad de sustancia (C) biomolecular presente sobre o en la capa (B) de hidruro de las partes de la
prótesis, producto o implante recubierto con el hidruro puede variar dentro de amplios límites, p. ej. dependiendo de las características químicas y biológicas de
la sustancia o sustancias biomoleculares en cuestión.
De este modo, la sustancia (C) biomolecular asociada
con el material (B) de hidruro puede estar presente en
cantidades que oscilan desde tan bajas como 1 picogramo por mm2 hasta tan altas como 1 mg por mm2
de superficie del producto o del implante recubierta
de hidruro. Sin embargo, se contempla que los recubrimientos de biomolécula más útiles varíen desde 0,1
nanogramos hasta 100 microgramos por mm2 .
Tal como se indicó anteriormente, el método de
la invención implica someter a las partes superficiales
del material (A) metálico a un tratamiento de electrolisis para formar la capa (B) de hidruro, realizándose
dicho tratamiento en presencia de una o más sustancias biomoleculares tal como se expuso anteriormente. Se ha observado que es importante que las condiciones en el electrolito (pH, fuerza iónica, etc.) sean
tales que la biomolécula tenga una carga positiva neta. Por lo tanto presenta ventajas que la mayoría de
las biomoléculas sean anfolitos, es decir sean ácidos
(o bases) débiles que carguen su carga neta según la
fuerza iónica y el pH de la solución en que están disueltas. Por consiguiente, el asunto principal para la
incorporación de éstas en una capa de hidruro es la
estabilidad en las condiciones necesarias para la preparación del bio-hidruro, es decir un medio que suministre suficientes iones H+ para la preparación del
hidruro y al mismo tiempo mantenga la carga neta
positiva de la biomolécula en cuestión. Esto significa principalmente que el electrolito debería tener una
concentración de sal y por consiguiente fuerza iónica
elevada; una temperatura comparativamente elevada,
aunque preferentemente por debajo de cualquier temperatura de desnaturalización de la sustancia biomolecular; y un pH bajo.
Por lo tanto, el electrolito puede ser cualquier solución salina, preferentemente acuosa, p. ej. una solución de cloruro de sodio, sulfato de sodio, fosfato de
calcio, cloruro de calcio, solución salina tamponada
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con fosfato (PBS), solución salina, una solución salina que simule las condiciones fisiológicas, bicarbonatos, carbonatos, etc., en los que se disuelva la biomolécula deseada. La fuerza iónica de la sal es normalmente 1M, pero se pueden ajustar concentraciones tan
bajas como 0,01 M y tan altas como 10 M según las
propiedades químicas y la concentración de la(s) biomolécula(s).
La temperatura del electrolito que contiene la biomolécula puede variar desde la ambiente (20ºC) hasta tan alta como el punto de ebullición del electrolito, normalmente alrededor de 100ºC, aunque la utilización de temperaturas en la parte superior de este
intervalo depende obviamente de la capacidad de la
biomolécula para resistir dichas temperaturas sin alteración. Si la biomolécula puede resistirlas, una temperatura óptima para la formación del hidruro es alrededor del 80ºC.
El pH del electrolito se ajusta normalmente al
pH deseado mediante un ácido fuerte, p. ej. HCl,
HF, H2 SO4 , etc. aunque debería tenerse en cuenta
que un pH por debajo de 2 producirá una superficie de implante irregular, corroída en el titanio mientras que un pH por encima de 2 conserva la superficie original. El pH se ajusta según la relación hidruro/biomolécula deseada; el pH bajo produce una
superficie del implante con una proporción elevada de hidruro/biomolécula (= más hidruro metálico),
mientras que un pH alto próximo al pI de la biomolécula en cuestión producirá una superficie con
una proporción baja de hidruro/biomolécula (= más
biomoléculas). Por consiguiente, aunque se puede utilizar cualquier pH entre 0 y 10, el pH preferido para
la preparación de hidruro está entre 5 y 2, dependiendo de las características químicas y de la concentración de la(s) biomolécula(s), del electrolito utilizado y de la proporción hidruro/biomolécula preferida.
Para proporciones hidruro/biomolécula(s) mayores (=
más hidruro), se ajusta el pH más ácido, para proporciones hidruro/biomolécula(s) más bajas (= más
biomolécula(s)) se ajusta el pH próximo a, pero no
por encima de, pIBIOMOLÉCULA . El único requisito es que
existan iones hidrógeno (H+ ) y biomoléculas cargadas positivamente (Biomolécula+ , carga neta) presentes en el electrolito.
La concentración de la(s) biomolécula(s) (una o
cualquier combinación de dos o más) en el electrolito
puede variar en todo un intervalo muy amplio, dependiendo del tipo de bioactividad, del tipo de molécula,
de las características químicas y biológicas, de la toxicidad, de la potencia, del modo de acción, si se ha
de liberar o no de la capa de hidruro, de la estabilidad in vivo, de la estabilidad en el electrolito, de la
disponibilidad, del pH óptimo, etc. De este modo, la
concentración de la(s) biomolécula(s) en el electrolito puede estar comprendida dentro del intervalo de 1
pg a 50 mg por mililitro. Un intervalo preferido está
comprendido entre 10 pg y 1 mg por mililitro, pero
la concentración de biomolécula óptima debería determinarse siempre por último en experimentos pilotos con cada biomolécula o mezcla de biomoléculas.
Además, la duración durante la que se realiza la electrolisis puede variar pero influye principalmente en el
espesor de la capa de hidruro y por consiguiente en la
concentración de las biomoléculas en la capa de hidruro.
Una celda de electrolisis para su utilización en el
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método de la invención puede ser de cualquier diseño
convencional pero normalmente es una celda de dos
cámaras sin ninguna conexión de conducción entre las
cámaras excepto para el electrolito. El implante metálico que debe ser modificado por el hidruro se coloca
en la cámara del cátodo (es decir, el electrodo cargado
negativamente) mientras que el ánodo (electrodo cargado positivamente), normalmente hecho de carbono,
se coloca en una cámara independiente. Los electrolitos de cada cámara se conectan a través de un filtro de vidrio o porcelana poroso permitiendo pasar la
corriente sin resistencia pero sin ningún intercambio
de electrolitos entre las dos cámaras. Esto es importante porque los productos en la reacción del ánodo,
p. ej. cloruro o hipocloritos, etc., podrían interferir potencialmente con la formación de la capa de hidruro
de la biomolécula o destruir o modificar la biomolécula en el electrolito del cátodo. La separación de las
dos celdas permite asimismo la utilización de un volumen más pequeño de electrolito del cátodo y de este
modo una utilización más eficaz de las biomoléculas
así como la posibilidad de utilizar un sistema de dos
electrolitos que permita la optimización del proceso
electrolítico, p. ej. un electrolito óptimo para las biomoléculas en el lado del cátodo y un electrolito en el
lado del ánodo que está optimizado para la eficacia de
la electrolisis por sí mismo (conductividad, evitando
productos tóxicos, o incluso produciendo subproductos/recubrimientos útiles).
Tal como se indicó anteriormente, la temperatura
en la celda del cátodo (Tcat ) debería ser tan alta como
fuera posible con un óptimo para la preparación del
hidruro a 80ºC.
El propio proceso electrolítico produce también
calor que puede plantear dos problemas; los constituyentes del electrolito se evaporarán de modo que el
volumen disminuye y la fuerza iónica y la concentración de las biomoléculas aumenta por encima del
intervalo preferido, y el aumento de la temperatura
puede producir precipitación, coagulación, desnaturalización, degradación o destrucción de la(s) biomolécula(s) presente(s). Por lo tanto, el compartimento
del cátodo de la célula de electrolisis está equipado
preferentemente con una tapa enfriada para la condensación del electrolito vaporizado y una carcasa de
radiador regulada por temperatura para estabilizar las
temperaturas y los volúmenes durante la electrolisis.
Al ajustar la corriente, la carga y la composición
del electrolito puede ser también posible proporcionar
un medio favorable para la carga positiva de la mayoría de las biomoléculas. Si no es así, un sistema de
electrolisis en campo pulsado en el que la polaridad
de los electrodos está cambiando en ciclos controlados durante la preparación de la capa de bio-hidruro
podría ser una manera de omitir un problema de carga
neta negativa.
El suministro de potencia normalmente consiste
en la denominada bomba de corriente, es decir un dispositivo que libera una corriente constante incluso si
varía la resistencia dentro del circuito. Aunque se pueden utilizar voltajes entre 0,1 y 1000 voltios, el voltaje
está típicamente por debajo de 10 voltios. La densidad
de corriente durante la electrolisis está normalmente
comprendida en el intervalo de 0,1 mA a 1 A por centímetro cuadrado (cm2 ) de la muestra del implante.
Una densidad de carga preferida es 1 mA/cm2 aunque
ajustes en el electrolito, el pH y la temperatura para
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aumentar la compatibilidad de la biomolécula pueden
ordenar desviaciones menores o mayores de este valor.
La duración del proceso depende de varios parámetros tales como del espesor deseado de la capa de
bio-hidruro, de la composición y características del
electrolito, de las características de la biomolécula, de
la temperatura y del pH, de la proporción de hidruro/biomolécula deseada, del tamaño de la muestra de
implante, del volumen del electrolito del cátodo, de la
concentración de la biomolécula, etc. De este modo,
la duración del proceso puede estar comprendida entre 0,5 horas y varios días. Sin embargo, una duración
óptima está comprendida generalmente entre 8 y 24
horas.
Para controlar el proceso del bio-hidruro, se puede colocar normalmente un electrodo de calomelanos
en la cámara del cátodo. Cuando el proceso de formación de la capa de hidruro en el cátodo es óptimo, se
observa una diferencia de -1 voltios entre el electrodo
de calomelanos y el cátodo. Si la corriente se diferencia mucho de este valor, el proceso se desarrollará
en condiciones sub-óptimas y se debería considerar
un cambio en el sistema. Además, se pueden colocar
normalmente una sonda de temperatura y una sonda
de pH en la cámara del cátodo para controlar que el
proceso se desarrolle dentro de los límites deseados
de pH y temperatura. Un dispositivo de agitación, tal
como un agitador magnético, se puede también aplicar en la celda del cátodo para mezclar en continuo
el electrolito y mantener la temperatura homogénea y
evitar variaciones en la fuerza iónica local, pH y concentraciones de biomoléculas.
Después de la etapa de electrolisis, el actual dispositivo o implante metálico recubierto de biomoléculas/hidruro se separa inmediatamente del electrolito y se trata según el requisito de la(s) biomolécula(s)
en cuestión. Normalmente, la muestra de dispositivo
o de implante se deja secar al aire y a continuación se
envasa en una bolsa de plástico esterilizada, estanca
al aire, en la que se almacena hasta su utilización para
la implantación. Sin embargo, algunas moléculas podrían ser sensibles al secado y por consiguiente podría
ser deseable un sistema de almacenaje húmedo, p. ej.,
similar al enlatado o almacenaje en un fluido como
solución salina o simplemente el electrolito del proceso de fabricación. Aunque la electrolisis puede desarrollarse en condiciones asépticas o incluso estériles,
la necesidad de hacer esto se puede evitar incluyendo
una etapa de esterilización antes de la utilización, utilizando métodos convencionales tales como radiación
ionizante, calentamiento, esterilización en autoclave
o gas óxido de etileno, etc. La selección del método
dependerá de las características y propiedades específicas de la(s) biomolécula(s) presente(s) en la capa de
hidruro metálico.
Antes del tratamiento de electrolisis, el dispositivo de implante se debería limpiar a fondo. Esto puede
consistir normalmente en pretratar mecánicamente el
implante por electropulido o limpieza con chorro de
arena para modificar la estructura de la superficie si
se desea, y posteriormente limpiar a fondo utilizando sosa cáustica caliente seguido de una etapa de desengrasado, p. ej. en tricloroetileno, etanol o metanol
concentrados, antes de tratar en una solución de decapado, p. ej. ácido fluorhídrico, para eliminar los óxidos y las impurezas en la superficie. Después del decapado se lava a fondo la muestra de implante en agua
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de intercambio iónico, destilada dos veces, caliente.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, no limitativos, cuyos ejemplos 1
a 4 describen los experimentos realizados y los experimentos 5 a 11 ilustran los ejemplos de trabajo contemplados.
Ejemplo 1
Preparación de una capa superficial del implante del
hidruro que contiene una proteína de la matriz extracelular
Se utilizó una celda de electrolisis de dos cámaras para preparar una capa de hidruro de titanio que
contiene la molécula de amelogenina de la matriz extracelular en cinco implantes de titanio cada uno con
un área superficial de 0,6 cm2 expuesta al electrolito.
Se utilizaron como controles cinco artículos similares
estando presentes en la cámara del electrolito, pero no
conectados a la corriente de electrolisis. El electrolito
en ambas cámaras fue NaCl 1M en agua esterilizada,
pH ajustado a 4 mediante la utilización de HCl, y la
concentración inicial de amelogenina fue 0,1 mg/ml.
Para la electrolisis se utilizó un voltaje de 10 voltios
a una densidad de carga de 1 mA/cm2 . La temperatura de la cámara del cátodo se fijó en 70ºC. Se dejó
seguir la electrolisis durante 18 horas después de las
cuales se separaron los implantes de titanio de la celda
de electrolisis, se lavó en agua esterilizada y se dejó
secar al aire en un desecador.
Después del secado las muestras de la prueba de
titanio y de referencia se lavaron cada una tres veces en 1 ml de solución salina a pH 6,5. Después de
los lavados, se disolvió cualquier proteína restante en
las superficies de titanio hirviendo la muestra de titanio en 0,5 ml de tampón de muestra 2×SDS-PAGE
(0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol, 0,02 g de
azul de bromofenol y 4,4 g de glicerol en 10 ml de
Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8). Se precipitaron las soluciones de lavado y el tampón de la muestra 2xSDSPAGE con la posible proteína en éste con un volumen igual de ácido perclórico 0,6 M y se eliminó el
sobrenadante por centrifugación. Los sedimentos de
precipitación, que contengan sal y posibles moléculas
orgánicas, se disolvieron a continuación en 50 µl de
tampón de muestra 2×SDS-PAGE y se hirvió durante cinco minutos. Todas las muestras se sometieron
a continuación a electroforesis en un gel de SDS al
12%-poliacrilamida a 80 mA toda la noche. Después
de la electroforesis, se transfirieron las proteínas en
el gel sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) mediante la técnica de electrotransferencia
“en capas” semi-seca. Se detectaron a continuación
las proteínas de amelogenina mediante un análisis inmunitario utilizando un anticuerpo de IgG primario
específico de amelogenina de conejo y un anticuerpo secundario de IgG anti-conejo de cabra marcado
con biotina. La transferencia Western mostró cantidades significativas de amelogeninas presentes en los
extractos procedentes de las muestras de la prueba y
por consiguiente ocluidas en la capa de hidruro de titanio en éstos, en tanto que no se detectaron amelogeninas en los extractos de las muestras de referencia
que no estaban conectadas a la corriente de electrolisis.
Este experimento demuestra claramente que se incorporó una cantidad significativa de amelogenina en
la capa de hidruro durante el proceso electrolítico. Las
proteínas de amelogenina no estaban presentes meramente como un solo recubrimiento, ya que no existen
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pruebas de las proteínas en las soluciones de lavado
inicial. Únicamente con la combinación de un detergente (SDS) fuerte, un agente reductor (mercaptoetanol) y alta temperatura (100ºC) podrían extraerse las
amelogeninas de la capa superficial de hidruro de titanio y detectarse por transferencia Western. Se calculó
por comparación con un patrón de amelogenina que la
cantidad de proteína extraída era de 50 µg/cm2 . Esta
cifra está comprendida dentro del intervalo de bioactividad de esta proteína de la matriz extracelular.
Ejemplo 2
Producción de una capa de la superficie del implante
de hidruro de titanio que contiene amelogenina
Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para producir una capa de hidruro de titanio que contenía la
molécula de amelogenina de la matriz extracelular en
implantes de titanio electropulidos con un área superficial de 0,35 cm2 expuesta al electrolito. El electrolito
en ambas cámaras fue NaCl 1M en agua esterilizada,
se ajustó el pH a 4 mediante la utilización de HCl y la
concentración inicial de amelogenina fue 0,1 mg/ml.
Para la electrolisis se utilizó un voltaje de 10 voltios
a una densidad de carga de 1 mA/cm2 . La Tcat se fijó
en 70ºC. Se dejó continuar la electrolisis durante 18
horas después de las cuales se retiraron los implantes
de titanio de la celda de electrolisis, se lavó en agua
esterilizada y se dejó secar al aire en un desecador.
Después del secado las muestras de titanio se lavaron tres veces en 1 ml de solución salina a pH
6,5. Después de los lavados, se disolvieron las proteínas restantes en las superficies de titanio hirviendo
la muestra de titanio en 0,1 ml de tampón de muestra
2×SDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol en 10 ml de Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8). La cantidad de amelogenina disuelta en la solución de SDS
en las superficies de titanio enjuagadas se analizó a
continuación por fotometría estándar midiendo la absorbancia de la luz a 280 y 310 nm frente a un blanco
de tampón de la muestra 2×SDS y comparando los
resultados con una serie de dilución patrón de amelogenina en tampón de la muestra 2×SDS. Se repitió
el experimento dos veces en series de 16 implantes,
ambas veces con 5 referencias internas negativas en
forma de implantes de titanio idénticos que estaban
presentes en la cámara de reacción durante el proceso
total, pero no unidos al cátodo.
Este experimento demuestra claramente que se incorporó una cantidad significativa de amelogenina en
la capa de hidruro durante el proceso electrolítico. Las
proteínas de amelogenina no estaban presentes únicamente como un solo recubrimiento, ya que no existen
pruebas de las proteínas en las soluciones de lavado
inicial. Únicamente con la combinación de un detergente (SDS) fuerte, un agente reductor (mercaptoetanol) y alta temperatura (100ºC) podrían extraerse las
amelogeninas de la capa superficial de hidruro de titanio. Se calculó por comparación con el patrón de
amelogenina que la cantidad de proteína extraída estaba comprendida entre 57 y 114 µg/cm2 con un valor
medio de 87 µg de alogenina por cm2 . Esta cifra está
comprendida dentro del intervalo de bioactividad de
esta proteína de la matriz extracelular. Implantes de
referencia idénticos que habían estado presentes en
la misma celda electrolítica que los implantes experimentales, pero que no estaban conectados al cátodo,
no presentaban cantidades significativas de proteínas
de amelogenina unidas a la superficie (<1 µg/cm2 ).
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Ejemplo 3
Producción de una capa en la superficie del implante
de hidruro de titanio que contiene ácido nucleico
Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para producir una capa de hidruro de titanio que contenía ácidos
nucleicos en forma de ADN total de placenta humana
radiomarcado en implantes de titanio electropulidos
con un área superficial de 0,35 cm2 expuesta al electrolito. El electrolito en ambas cámaras fue NaCl 1M
en agua esterilizada. Se ajustó pH a 2 mediante la utilización de HCl. La concentración inicial de ADN en
el electrolito fue 10 µg/ml. Para la electrolisis se utilizó un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga
de 1 mA/cm2 y a una Tcat de 75ºC. Se dejó seguir la
electrolisis durante 16 ó 24 horas después de las cuales se separaron las muestras de titanio de la celda de
electrolisis, se lavaron tres veces en cantidades abundantes de tampón Tris-EDTA (tampón TE; Tris-Cl 10
mM y EDTA 1 mM en agua esterilizada, pH 7,6) y se
dejó secar al aire toda la noche en un desecador.
Se radiomarcó el ADN utilizando un kit de marcado del cebador aleatorio Stratagene Prime-It® II para la producción de sondas de alta actividad específica y [α-32 P]dATP (Amersham). Después del marcado
del ADN, se midió la radioactividad específica de la
sonda de ADN en un contador de centelleo Packard
Tricarb® que era 3,0x108 desintegraciones por minuto por microgramo de ADN marcado (dpm/µg).
Después de secar las muestras de titanio con ácidos nucleicos experimentales unidos, se colocaron en
una pantalla de fósforo (Fujii®) durante 15 minutos.
A continuación se separaron las muestras y se hizo un
barrido de la pantalla de fósforo en una máquina de
detección por imagen de fósforo BioRad® midiendo
el número de desintegraciones ocurridas en la superficie de cada implante utilizando una rejilla de 100
µm (12265 puntos por implante). Se repitió el experimento dos veces en una serie de 16 implantes, ambas
veces con 5 controles internos negativos en forma de
implantes de titanio idénticos que estaba presente en
la cámara de reacción durante todo el proceso, pero
que no estaban conectados al cátodo. Para la primera
serie el tiempo de reacción fue de 24 horas, para la
segunda fue de 16 horas. Se calculó el número total
de dpm por implante y se transformó en µg de ADN
por centímetro cuadrado (µg de ADN/cm2 ).
La cantidad de ADN presente en los implantes varió entre 0,25 y 0,75 µg/cm2 con un valor medio de
0,43 mg de ADN por cm2 cuando el tiempo de reacción era de 24 horas. Cuando se redujo el tiempo de
reacción a 16 horas, los valores respectivos variaron
entre 0,19 y 0,32 µg/cm2 con un valor medio de 0,30
µg de ADN por cm2 . Esta cifra está comprendida dentro del intervalo aplicable para la terapia génica, las
vacunas de ADN y otras aplicaciones de la medicina
molecular. Implantes de referencia idénticos que habían estado presentes en la misma celda electrolítica
que los implantes experimentales, pero que no estaban
conectados al cátodo, presentaban solamente cantidades muy pequeñas (picogramos) de ADN unido a la
superficie.
Este experimento demuestra claramente que durante el proceso electrolítico se incorporó una cantidad significativa de amelogenina en la capa de hidruro. El ADN no estaba meramente presente como
simple recubrimiento porque el ADN no se disolvió
o lavó los implantes de la prueba durante el enjuague
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con TE. Además, el hecho de que la cantidad de ADN
incorporado en la capa superrficial de hidruro de titanio aumentase linealmente con el tiempo de reacción
también demuestra que ajustar el tiempo de reacción
es una manera fácil de controlar la cantidad de biomoléculas en la capa de hidruro.
Ejemplo 4
Preparación de una capa superficial de implante de
hidruro de titanio que contiene ácido ascórbico
Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa de hidruro de titanio que contenía ácido
ascórbico (vitamina C) en implantes de titanio electropulidos en forma de moneda con un área superficial
total expuesta al electrolito de 0,35 cm2 . El electrolito
en ambas cámaras fue solución salina con el pH ajustado a 3 mediante ácido fosfórico. La concentración
inicial de ácido ascórbico fue 10 mg/ml. Se utilizó
electrolisis con un voltaje de 6 voltios a una densidad
de carga de 2 mA/cm2 y una temperatura de la cámara catódica de 20ºC. Se dejó continuar la electrolisis
durante 16 horas después de las cuales se retiran los
implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan dos veces en agua esterilizada y se dejan secar
en un desecador.
Después de secar durante la noche se disolvió el
ácido ascórbico experimental en las muestras de titanio sumergiendo las muestras en 1 ml de tampón TrisEDTA (TE-tampón; Tris-Cl 10 mM y EDTA 1mM en
agua esterilizada) a pH 8,0 durante 1 hora en agitación. Se analizó a continuación la cantidad de ácido
ascórbico en las muestras de tampón midiendo la absorción de la luz a 250 nm y comparando los resultados con una curva patrón para ácido ascórbico en
TE, pH 8,0 a esta longitud de onda. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma célula electrolítica como
implantes experimentales, pero no conectados al cátodo. Se repitió el experimento dos veces en una serie
de 16 implantes, ambas veces con 5 referencias internas negativas.
Se calculó la cantidad de ácido ascórbico extraído
de las muestras de titanio en el intervalo entre 28 y 76
µg/cm2 con un valor medio de 39 µg de ácido ascórbico por cm2 , por comparación con el patrón de ácido
ascórbico. Esta cifra está dentro del rango de bioactividad de esta vitamina (la concentración normal en
el plasma en el hombre varía entre 8 y 15 µg/ml). Las
muestras de referencia internas que han estado presentes en la misma celda electrolítica como implantes
experimentales pero que no se conectaron al cátodo,
presentan sólo cantidades diminutas de ácido ascórbico unidas a la superficie (<4µg/cm2 ). Este experimento demuestra claramente que se puede incorporar
o unir una cantidad de ácido ascórbico biológicamente significativa a la capa de hidruro de titanio durante
el proceso electrolítico.
Ejemplo 5
Preparación de una capa superficial de implante de
hidruro de titanio que contiene un péptido basado en
el factor de crecimiento sintético
Se puede utilizar la instalación del Ejemplo 1 para
preparar una capa de hidruro de titanio que contiene
un péptido del factor 4 de crecimiento de fibroblastos
completo (37 aminoácidos) sobre implantes de titanio
electropulidos, en forma de moneda con un área superficial total expuesta al electrolito de 0,6 cm2 . Los
electrolitos, el pH, el voltaje, la densidad de corriente
y el tiempo de electrólisis pueden ser propiamente co10
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mo en el Ejemplo 1. La concentración inicial de FGF4 puede ser propiamente 0,1 mg/ml, y la temperatura de la cámara del cátodo puede ser propiamente de
50ºC.
Después del lavado en solución salina y tampón
2×SDS-PAGE, de la precipitación, de la centrifugación, de la redisolución en SDS-PAGE, de la ebullición y de la electroforesis como en el Ejemplo 1, la
proteína en el gel puede transferirse a una solución
de coloración con plata y los péptidos FGF-4 sintéticos completos presentes observarse como una banda
diferenciada en el gel. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos incorporados en la misma celda electrolítica como implantes
experimentales, pero no conectados al cátodo.
Ejemplo 6
Preparación de una capa superficial de implante de
hidruro de titanio que contiene un antibiótico
Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para preparar
una capa de hidruro de titanio que contenía el agente
antibiótico amoxicilina (aminopenicillium) en un implante de titanio electropulido en forma de moneda
con un área superficial expuesta al electrolito de 0,6
cm2 . El electrolito en ambas cámaras es propiamente
NaCl 1 M en agua esterilizada con el pH ajustado a
2 mediante HCl y la concentración inicial de amoxicilina es propiamente 5 mg/ml. Para la electrolisis se
puede utilizar un voltaje de 10 voltios a una densidad
de carga de 1 mA/cm2 y una temperatura de la cámara
catódica de 50ºC. Se puede dejar continuar la electrolisis de forma apropiada durante 24 horas, después de
las cuales se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y
se dejan secar en un desecador.
Después del secado se puede evaluar la cantidad
de amoxicilina ocluida en la capa de hidruro en los
implantes de titanio por su efecto antibacteriano sobre la bacteria sensible a la penicilina de la especie
Escherichia coli (E. coli), cepa K12, en cultivos líquidos. Los cultivos se inoculan apropiadamente con una
colonia de E. coli K12 en 5 ml de caldo de cultivo LB.
Después de la inoculación los implantes y referencias
modificados se colocan en el cultivo y se incuban los
cultivos a 37ºC toda la noche. Al día siguiente se puede evaluar la cantidad de bacteria presente en los cultivos por fotometría y comparación con una dilución
patrón. Se pueden utilizar como referencias implantes
de referencia idénticos presentes en la misma celda
electrolítica como implantes experimentales, pero no
conectados al cátodo.
Ejemplo 7
Preparación de una capa superficial de implante de
hidruro de titanio biomineral-inductora
Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para
preparar una capa de hidruro de titanio que contiene un péptido de poli-prolina sintético que tiene potenciar para actuar como nucleador biológico de formación mineral en soluciones saturadas de fosfato de
calcio. La biomolécula se puede incorporar en una capa de hidruro en la superficie electropulida de los implantes de titanio, en forma de moneda en forma de
moneda con un área superficial expuesta al electrolito
de 0,6 cm2 . El electrolito en ambas cámaras puede ser
propiamente NaCl 1 M en agua esterilizada con el pH
ajustado a 2 mediante HCl y la concentración inicial
de la poli-prolina sintética puede ser propiamente 0,1
mg/ml. Para la electrolisis se puede utilizar un voltaje
de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm2
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y una temperatura de la cámara catódica de 70ºC. Se
puede dejar continuar la electrolisis de forma apropiada durante 18 horas, después de las cuales se retiran
los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se
enjuagan en agua esterilizada y se dejan secar al aire
en un desecador.
Después del secado los implantes y referencias de
titanio con péptido de nucleación mineral experimental unido se colocan en 5 ml de solución saturada de
fosfato de calcio. Después de la incubación durante 4
horas a temperatura ambiente, se retiran los implantes
de la solución mineral, se enjuagan en agua esterilizada y se secan al aire en un desecador. Cuando están
secos, los implantes se pueden someter directamente
a microscopía de barrido electrónico para la evaluación de número de focos minerales presentes en las
superficies modificadas. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes
en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.
Ejemplo 8
Preparación de una capa superficial de implante de
hidruro de titanio-biomolécula (relleno del espacio)
de esponjamiento
Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para
preparar una capa de hidruro de titanio que contiene nanosferas de alginato de calcio (Pronova AS) en
implantes de titanio electropulidos, con forma de moneda con un área total expuesta al electrolito de 0,6
cm2 . El electrolito en ambas cámaras es propiamente
CaCl2 1M en agua esterilizada con pH ajustado a 5,5
por medio de HCl y la concentración inicial de alginato de calcio es propiamente 1% p/v. Para la electrolisis se puede utilizar un voltaje de 10 voltios a una
densidad de carga de 1 mA/cm2 y una temperatura de
la cámara catódica de 35ºC. Se deja continuar la electrolisis apropiadamente durante 48 horas, después de
las cuales se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y
se dejan secar al aire en un desecador.
Después del secado, los implantes de titanio con
una capa de hidruro-alginato se sumergen de forma
apropiada en solución salina esterilizada, se secan con
azul de bromofenol (0,02 g/ml) y se incuban durante
una hora a 37ºC con la superficie modificada de cara
a la solución. Después de la incubación en la solución
salina seca se enjuagan los implantes y referencias en
agua destilada y se observa con una lupa la retención
del colorante azul dentro de la capa experimental de
alginato esponjada. El espesor de las capas de alginato se puede evaluar asimismo observando los bordes
de los implantes en un microscopio óptico calibrado.
Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.
Ejemplo 9
Preparación de una capa doble de biomolécula-hidruro de titanio en la superficie del implante
Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa doble biomolécula conteniendo
hidruro de titanio en la superficie de los implantes de
titanio electropulidos, con forma de moneda con un
área total expuesta al electrolito de 0,6 cm2 . La capa interna se puede preparar utilizando amelogenina
como biomolécula según el método del Ejemplo 1.
Inmediatamente después de este procedimiento y sin
secado con aire en medio, se pueden cambiar el elec-
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trolito y las condiciones a las del Ejemplo 3 utilizando ADN humano genómico como biomolécula. De
esta manera se pueden preparar implantes de titanio
con una capa externa de hidruro de titanio-ADN solapándose con una capa interna de hidruro de titanioamelogenina. Después de la electrolisis se retiran los
implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y se dejan secar al aire en
un desecador.
Después del secado las muestras de titanio con
ácidos nucleicos y proteínas experimentales unidos se
enjuagan apropiadamente tres veces en tampón TrisEDTA (tampón TE; Tris-Cl 10 mM y EDTA 1 mM en
agua esterilizada). En cada enjuague el pH se aumenta partiendo de un pH 7,4, a continuación se enjuaga
a pH 7,6 y por último a pH 8,0. Después del enjuague
en TE se eliminan por último el ADN restante y la
proteína en los implantes de titanio utilizando NaOH
0,1 N. Se dividen a continuación en dos las fracciones
del enjuague; una parte para análisis de ácido nucleico y la otra para análisis de proteínas. Las fracciones
de ADN se precipitan de manera apropiada con un volumen igual de alcohol absoluto a -20ºC durante 1 hora y a continuación se eliminan del sobrenadante por
centrifugación a 13.000 g a 4ºC. Se disuelve a continuación el sedimento en 50 µl de tampón TE a pH
7,4 y la cantidad de ADN de las 4 soluciones de enjuague se evalúa por análisis fluorométrico utilizando
colorante Hoechst (Boehringer Mannheim).
Las fracciones para el análisis de proteínas se precipitan apropiadamente con un volumen de ácido perclórico 0,6 N y se eliminan los sobrenadantes por centrifugación. Los sedimentos de la precipitación que
contienen sales y proteínas se disuelven a continuación en 50 µl de tampón de la muestra 2×SDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol, 0,02 g
de azul de bromofenol y 4,4 g de glicerol en 10 ml
de Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8) y se hierven durante
cinco minutos. Se someten a continuación todas las
muestras a electroforesis en un gel de SDS al 10%poliacrilamida a 80 mA durante 4 horas. Después de
la electroforesis las proteínas en el gel se transfieren a
una solución coloreada de plata y se observa la amelogenina presente en las fracciones como bandas diferenciadas en el gel.
Se pueden utilizar como referencias implantes de
referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.
Ejemplo 10
Preparación de una zona doble en la superficie de implante con capas de biomolécula-hidruro de titanio
Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para
preparar dos zonas independientes de capas de hidruro de titanio. Los implantes de titanio electropulidos,
en forma de varilla, con un área total de 2 cm2 se trataron según los Ejemplos 3 y 6. En primer lugar se
colocaron los implantes en el electrolito del Ejemplo
3, de modo que solamente la mitad de cada implante se sumergió en el electrolito. Después de terminar
el procedimiento del Ejemplo 3, se dio la vuelta a los
implantes y se colocaron en nuevo electrolito similar
al utilizado en el Ejemplo 6, de modo que la mitad no
tratada de cada implante se sumergió ahora en el electrolito. Se realizaron a continuación el procedimiento
y las condiciones de reacción de los Ejemplos 6, después de lo cual se retiró la muestra del titanio de la
celda de electrolisis, se enjuagó en agua esterilizada y
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se dejó secar en un desecador.
Después de la electrolisis los implantes con zona
doble se cortan en dos en el centro. Las mitades estratificadas con hidruro de titanio-péptido FGF-4 sintético se pueden someter a análisis según el Ejemplo
2. Las demás mitades de los implantes, estratificadas
con hidruro de titanio-amoxicilina, se pueden analizar
en el ensayo de crecimiento bacteriano según el Ejemplo 5. Se pueden utilizar como referencias implantes
de referencia idénticos presentes en la misma celda
electrolítica como implantes experimentales, pero no
conectados al cátodo.
Ejemplo 11
Preparación de una capa superficial de implante de
hidruro de titanio osteoinductiva que contiene una
biomolécula
Se colocan implantes preparados como en el
Ejemplo 1 (hidruro de titanio-amelogenina) en anomalías de huesos calibrados en el hueso de la tibia
de conejos, asegurándose de que las perforaciones en
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la médula ósea por debajo de los implantes permiten
la migración de las células osteogénicas a las superficies modificadas del implante, utilizando un modelo normalizado y validado (Rφnold y Ellingsen, European Society for Biomaterials Conference, Amsterdam, Octubre de 2000). Un día después de la intervención quirúrgica y cada una de las siguientes semanas
se administra a los conejos una inyección intravenosa de calceína (Sigma) de 10 mg/kg de peso corporal.
A las cuatro semanas después de la colocación de los
implantes modificados y de los implantes de referencia se sacrificarán los conejos y se extrae la tibia, se
fija en formaldehído al 4% y se hace una inclusión
para la preparación de secciones molidas de todo el
hueso y del material de implante integrado. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia
idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al
cátodo.
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REIVINDICACIONES
1. Una prótesis o implante protésico médico que
contiene un material (A) metálico seleccionado del
grupo que consta de titanio o una de sus aleaciones,
circonio o una de sus aleaciones, tántalo o una de sus
aleaciones, hafnio o una de sus aleaciones, niobio o
una de sus aleaciones y de una aleación de cromovanadio, en la que las partes superficiales del material
(A) metálico están recubiertas con una capa de un material (B) del hidruro correspondiente seleccionado de
hidruro de titanio, hidruro de circonio, hidruro de tántalo, hidruro de hafnio, hidruro de niobio e hidruro de
cromo y/o vanadio, respectivamente, caracterizado
porque la capa de material (B) de hidruro comprende
una o más sustancias (C) biomoleculares asociadas a
ésta.
2. Una prótesis o un implante según la reivindicación 1, en el que el material (A) metálico es titanio o
una de sus aleaciones, preferentemente titanio.
3. Una prótesis o un implante según la reivindicación 1 ó 2, en el que la sustancia (C) biomolecular se selecciona de los siguientes tipos de sustancias:
Bioadhesivos naturales o recombinantes; factores de
unión de células naturales o recombinantes; biopolímeros naturales, recombinantes o sintéticos; proteínas
de la sangre naturales o recombinantes; enzimas naturales o recombinantes; proteínas de la matriz extracelular naturales o sintéticas; biomoléculas de la matriz extracelular naturales o recombinantes; factores
de crecimiento y hormonas naturales o recombinantes; hormonas de péptidos naturales, recombinantes o
sintéticas; ácidos desoxirribonucleicos naturales, recombinantes o sintéticos; ácidos ribonucleicos naturales, recombinantes o sintéticos; receptores naturales
o recombinantes; inhibidores enzimáticos; fármacos;
aniones y cationes biológicamente activos; vitaminas;
monofosfato de adenosina (AMP), difosfato de adenosina (ADP) o trifosfato de adenosina (ATP); biomoléculas marcadoras; aminoácidos; ácidos grasos; nucleótidos (bases de ADN y de ARN) y azúcares.
4. Una prótesis o un implante según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia (C) biomolecular está presente en la superficie del
material (B) del hidruro u ocluida en el material del
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hidruro.
5. Una prótesis o un implante según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia
o sustancias (C) biomolecular(es) está(n) asociada(s)
con el material (B) del hidruro en una cantidad de 1
picogramo por mm2 a 1 mg por mm2 , preferentemente
de 0,1 nanogramo a 100 microgramos por mm2 .
6. Una prótesis o un implante según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia
o sustancias (C) biomolecular(es) está(n) asociada(s)
con superficies que están en contacto con el hueso u
otro tejido cuando el producto se despliega en el cuerpo de un mamífero.
7. Una prótesis o implante según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que reemplaza la anatomía o restablece una función del cuerpo tal como la
articulación femoral de la cadera; la apófisis femoral; el cotilo; el codo incluyendo las hipófisis, las cuñas, las inserciones articulares; la rodilla, incluyendo
los componentes femorales y tibiales, las hipófisis, las
cuñas, las inserciones articulares o los componentes
rotulianos; los omoplatos incluyendo la hipófisis y la
diáfisis; la muñeca; los tobillos; la mano; los dedos
de las manos; los dedos de los pies; las vértebras; los
discos vertebrales; las articulaciones artificiales; los
implantes dentales; los implantes plásticos de huesos
pequeños; los implantes en el oído medio incluyendo el yunque, el martillo, el estribo, yunque-estribo,
martillo-yunque, martillo-yunque-estribo, los implantes cocleares; aparatos ortopédicos de fijación tales
como clavos, tornillos, grapas y placas; las válvulas
cardíacas; marcapasos; catéteres; recipientes; implantes de relleno de espacio; implantes para retención de
audífonos; implantes para fijación externa; dispositivos intrauterinos (DIU); y dispositivos bioelectrónicos tales como los dispositivos electrónicos intracocleares o intracraneales.
8. Un método para preparar una prótesis o implante médico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho método el
someter las partes superficiales del material (A) metálico a un tratamiento de electrolisis para formar una
capa de material (B) de hidruro, realizándose dicho
tratamiento de electrolisis en presencia de una o más
sustancias (C) biomoleculares.
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