Anisotropia de fluorescencia - Laboratorio de Fisicoquimica Biologica

Anisotropia de fluorescencia
F. Luis González Flecha
Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas
Universidad de Buenos Aires - Argentina
Radiación electromagnética
Luz polarizada
Los polarizadores más usados son:
(1) dispositivos dicroicos, que operan absorbiendo selectivamente un
plano de polarización (e.g., láminas Polaroid tipo-H: alcohol
polivinilico impregnado con iodo y estirado en caliente)
(2) cristales de calcita (CaCO3) polarizantes por doble refracción,
dispersan diferencialmente los dos planos de polarización (e.g.
prismas de Nicol, prismas de Wollaston y polarizadores de tipo Glan
como los Glan-Foucault, Glan-Thompson y Glan-Taylor)
Fotoselección
En 1920, F. Weigert descubrió que la fluorescencia emitida por las
soluciones de varios colorantes (entre otros, fluoresceina, eosina y
rodamina) estaba polarizada. Encontró que el grado de polarización
de la fluorescencia emitida dependía de la temperatura y la viscosidad.
Dispositivo experimental
Determinación de la anisotropia de
fluorescencia
I VV − G I VH
r=
I VV + 2 G I VH
I HV
G=
I HH
Anisotropia fundamental
r=
Ι II − Ι ⊥
Ι − Ι⊥
= II
Ι II + 2 ⋅ Ι ⊥
ΙT
2  3 cos2 β − 1 
ro = 

5 
2

Espectro de anisotropia (excitación) del ácido 9-antroiloxi
esteárico (9-AS) en propilen glicol a –52°C.
Decaimiento de la anisotropia
r ( t ) = r0 e
−
t
φ
Tiempo de correlación rotacional (φ)
cos ω = e-1
r ( t ) = ∑ r0 j e
−
t
φj
Decaimiento de la anisotropia
r ( t ) = r0 e
∞
r=
∫ r (t ) I
0
∞
T
(t ) dt
∞
∫I
0
T
(t ) dt
∫r
0
=
0
e
−
−
t
φ
t
φ
I T ( t ) = I T (0) e
I T (0) e
−
t
τ
∞
dt
=
∞
∫I
T (0)
e
−
t
τ
dt
0
ro
r=
1+ τ φ
−
r0 I T (0) ∫ e
0
∞
t
τ
−
I T (0) ∫ e
0
t
φ
−
e
t
τ
−
dt
t
τ
dt
Ecuación de Perrin
ro
r=
1+ τ φ
si τ << φ, las partículas practicamente no rotarán durante el tiempo
de vida del fluoróforo y r se aproximará a la anisotropía medida en
ausencia de difusión (ro)
si τ >> φ, los dipolos de emisión de las moléculas alcanzarán una
distribución al azar y r tomará un valor cercano a cero
La anisotropia será sensible a factores que afecten los
movimientos rotacionales cuando τ ≅ φ
Anisotropia de fluorescencia de
proteínas
Determinación del volumen
hidrodinámico
r
Perrin
r=
Stokes-EinsteinDebye
o
1+ τ φ
η⋅V
φ=
k ⋅T
ro
η ⋅ ro
=
r=
τ⋅k ⋅T
η+c
1+
η⋅V
V=
τ⋅k ⋅T
= 163 ± 13 nm 3
c
Aplicaciones
Campo
Información
Espectroscopia
Distinción entre estados excitados
Polímeros
Dinámica de la cadena
Viscosidad local en el entorno de los polímeros
Orientación (en polímeros sólidos)
Sistemas micelares
Microviscosidad interna de micelas
Fluidez y parámetros de orden
Membranas biológicas
Fluidez y parámetros de orden
Temperaturas de transición de fases
Efectos de aditivos
Proteínas
Propiedades hidrodinámicas
Desnaturalización
Interacciones
Inmunología
Interacciones antígeno anticuerpo