Resúmenes de Tesis Doctorales Tesis nº: 0777 Area

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Doctorado en Ciencias Naturales
Facultad de Ciencias Naturales y Museo
Universidad Nacional de La Plata – Argentina
Resúmenes de Tesis Doctorales
Tesis nº: 0777
Area: Medicina
Gómez, María Atilia. Estudio de la transmisión vertical del virus del papiloma humano [VPH]: su
asociación con patologías neonatales y prevalencia en mujeres sintomáticas.
Director(es): Dulout, Fernando Noel
La Plata: Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo, 2002.
El Virus del Papiloma Humano (VPH) forma parte de la familia Papillomaviridae la subfamilia
Papillomavirus y el género Papilloma. Es un virus
pequeño, con cápside icosaédrica que
contiene una doble hebra de ADN y dependen absolutamente de la célula hospedadora para
efectuar la transcripción y la posterior replicación del ADN. Posee mecanismos moleculares
involucrados en procesos de inmortalización y/o transformación celular que conducen a la
formación de tumores y al cáncer.
El Virus del Papiloma Humano tiene un tropismo específico para infectar tejidos epiteliales y su
ciclo biológico está íntimamente ligado al estado de diferenciación del tejido infectado. Se han
encontrado lesiones producto de la infección con VPH en tracto anogenital, uretra, laringe,
mucosa traqueo-bronqueal, cavidad nasal, senos paranasales, cavidad oral, y esófago.
Más de 30 tipos de VPH están asociados a infecciones de las mucosas del tracto anogenital.
Son considerados según su acción, como virus de “bajo riesgo” y “alto riesgo”.
La infección por contacto sexual es la vía de contagio más frecuente. El cáncer genital en
hombres y mujeres es considerado actualmente
por la OMS (Organización Mundial de la
Salud) como una enfermedad de transmisión sexual (ETS). La transmisión vertical al feto
puede ocurrir como consecuencia de tragar o aspirar líquido anmiótico o secreciones vaginales
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durante el pasaje por el canal de parto o por medio de abrasiones instrumentales durante el
parto vaginal. A pesar de estar plenamente probado que la infección por VPH en los recién
nacidos ocurre durante el alumbramiento, existen otras fuentes de infección, tales como
intrauterina, perinatal y postnatal.
Existen patologías perinatales asociadas a la transmisión vertical del VPH como la
Papilomatosis Laríngea Juvenil (PLJ), otras son consideradas
supuestas infecciónes
asociadas como es el caso del Liquen Escleroso (LS) y aquellas como
la Hepatitis Giganto
Celular Neonaltal Idiopática (HGCNI) y la Atresia de Vías Biliares Extrahepática (AVBE) hasta
el momento no asociadas al Virus del Papiloma Humano.
Este trabajo de investigación tiene como objetivos principales:
1) Determinar la prevalencia poblacional de la infección por VPH en mujeres de la ciudad de La
Plata, de acuerdo a cada uno de los estadíos histopatológicos de la neoplasia cervical.
2) Describir la distribución de los tipos virales en cada estadio histopatológico en función del
análisis del genoma viral.
3) Establecer el rol de la infección por VPH en pacientes con Papilomatosis Laríngea Juvenil y
en niños con Liquen Escleroso.
4) Establecer una posible etiología común para la HGCNI y la AVBE por Virus del Papiloma
Humano y demostrar
la posible
transmisión vertical
del VPH, estudiando en forma
prospectiva a las madres de algunos de los casos estudiados con estas hepatopatías.
5) Determinar el rol potencial del gen DQ 1 como factor protector o predisponente en la
transmisión de la infección por VPH y el desarrollo de las hepatopatías neonatales.
MATERIAL Y METODOS
Población Ginecológica
Se estudió una población de 263 mujeres con sintomatología demostrable sugestiva de
infección por VPH. Los datos epidemiológicos de prevalencia, distribución de tipos virales y
distribución por edades de la infección por VPH se obtuvieron de una población de 797 mujeres
con sintomatología asociada pero no demostrable.
Población infantil infectada producto de la transmisión vertical:
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Se estudiaron 20 muestras pertenecientes a 12 pacientes de 1 a 17 años
de edad con
Papilomatosis Laríngea Juvenil (PLJ), 23 muestras de pacientes con Liquen Escleroso (LS) que
provenían de varones de 4 a 14 años de edad sido sometidos a cirugía por fimosis, 16 biopsias
hepáticas de pacientes con Hepatitis Gigantocelular Neonatal Idiopática (HGCNI)
que
provenían de neonatos de hasta 4 meses de edad y 62 biopsias hepáticas correspondientes a
pacientes con Atresia de Vías Biliares (AVB).
En 11 casos de hepatopatías neonatales fue posible obtener muestras de citología exfoliativa
cérvico-vaginal de las madres.
METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La toma de muestras fue realizada por profesionales médicos. De las muestras de
citología exfoliativa cervical y de las biopsias fijadas con formalina y embebidas en parafina de
todas las patologías neonatales estudiadas se extrajo ADN para la detección del genoma de
VPH.
Detección con Cebadores Generales: Las muestras de ADN fueron sometidas a amplificación
por PCR en dos etapas. Como cebadores externos se usaron los oligonucleótidos MY09 y
MY11. En la segunda etapa se usaron e cebadores internos a la secuencia obtenida en la
primera ronda de amplificación, GP5 y GP6.
Las muestras de amplificación negativa
fueron investigadas para la presencia de inhibidores de la PCR por medio de la amplificación
con los cebadores específicos para loci APP (“Amyloid precursor protein”) .
La identificación del tipo viral se realizó por el método de amplificación en dos etapas usando
como único cebador para la segunda ronda de amplificación, las sondas específicas de
secuencia.
Hibridación in situ
La hibridación in situ (ISH) se realizó con una sonda de 145 pb marcada con digoxigenina
obtenida por amplificación de ADN de VPH clonado (cedidos por el Doctor E. M. de Villers del
Instituto Pasteur de Paris, Francia).
Identificación de los Alelos del DQ 1 del HLA.
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La tipificación de los alelos de HLA DQ
se realizó mediante el empleo del kit AmpliType
(Perkin Elmer).
RESULTADOS
Prevalencia del VPH en la población ginecológica
En la población de mujeres con sintomatología sugestiva de infección con VPH se detectó
ADN-VPH en un 89,83 % de los casos analizados.
La distribución de la infección según rangos de edades preestablecidos fue: 25,60% en
menores de 25 años, 37,20% entre 25 y 34 años, 25,90% entre 35 y 44 años y 11,30% en
mayores de 45 años
Prevalencia de tipos virales
Se determinó que el 29,05% estaba infectada con el tipo VPH 6, el 43,72 % con los
tipos VPH 16 y VPH 18 (22,77% y 20,95% respectivamente) y el 10,34% por el tipo VPH 33.
El porcentaje de coinfecciones múltiples fue de 13,68% y detectó un 3,21% de tipos virales que
no correspondieron a los analizados, denominados como “otros”.
Distribución de Tipos virales por Edad
No se registraron diferencias estadísticamente significativas (p>0,25) entre los tipos virales de
VPH y los diferentes rangos de edad. En las muestras negativas para ADN-VPH, tampoco se
detectaron diferencias significativas entre los grupos de edad.
Distribución de tipos virales por Patología
Al compararse las frecuencias de cada uno de los tipos virales detectados en cada uno
de los estadíos que comprenden al sistema Bethesda, no se registraron diferencias
estadísticamente significativas (p>0,05).
Los resultados indican la alta prevalencia (50,20%) del CIN I o displasia leve seguido por los
Condilomas (19,40%) consideradas de bajo riesgo carcinogénico, al igual que las atipias
inflamatorias (5,30%) y la leucoplasia (6,50%). Por lo tanto, el 81,40% de nuestra población se
encuentra en estadíos tempranos y con lesiones leves o de bajo riesgo de desarrollo de
cáncer.
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ENFERMEDADES NEONATALES E INFANTILES RELACIONADAS CON LA PRESENCIA DE
ADN-VPH.
Papilomatosis Laríngea juvenil
El ADN-VPH fue hallado en todas las muestras analizadas, 9 de las cuales se detecto el tipo
viral 6-11.
Liquen escleroso
El ADN-VPH fue detectado en el 52,18% de las muestras estudiadas. El 66,66%, correspondió
a ADN-VPH tipo 6, el 16,66% a ADN-VPH 16 y el 16,66% a ADN-VPH 18.
La Hibridación in situ con sonda general para VPH y/o para tipos 6 y 11 reveló la evidencia de
secuencias de VPH en los núcleos de los coilocitos y en algunas células paraqueratósicas en
13 casos.
Hepatopatías neonaltales/ Población Control
Hepatitis giganto celular neonatal idiopática (HGCNI)
Se detectectó ADN-VPH en el 100% de las muestras analizadas, correspondiendo la
distribución de los tipos virales: 50% al 6, 25% al 16, 13% al 18, 6% al 33 y 6% a otros tipos
virales.
Atresia de Vías Biliares Extrahepática (AVBE).
De los 62 casos de Atresia de Vías Biliares Extrahepática, el 83,87 % arrojaron resultados
positivos para la presencia del genoma de ADN-VPH.
La distribución de los tipos virales fue la siguiente: 34% VPH 6, 26 % VPH 16, 21 % VPH 18 y
3 % otros tipos virales.
Población Control
Se estudió un grupo de 37 recién nacidos con hígado sano como población control para
ambas enfermedades hepáticas neonatales (HGCNI y AVBE), siendo todas ellas de resultado
negativo para la amplificación de ADN-VPH.
Madres de niños con Hepatopatías
Se estudiaron 11 madres ( 4 casos correspondientes a HGCNI y 7 casos de AVBE) sobre las
cuales fue posible realizar el estudio de muestras de citología exfoliativa cérvico-vaginal por
PCR en busca del genoma viral. Todos los casos fueron positivos para la amplificación de
ADN-VPH. Los tipos virales detectados +en las madres correspondieron con los encontrados
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en sus respectivos hijos. Esta observación sugiere un contagio entre madre e hijo y por lo
tanto abona la hipótesis de que la transmisión vertical sería posible en base ha este hallazgo.
Población Ginecológica vs Niños infectados
Cuando comparamos la distribución de los tipos virales en las hepatopatías (HGCNI + AVBE)
con los de la población general de mujeres consideradas en este estudio como '”Población
Cervical”, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p> 0.1) entre ambas
distribuciones.
Si consideramos a la Población Cervical como un reservorio viral de
mujeres infectadas y potenciales madres, vemos que en estas patologías se respetó la
distribución de tipos de la población de mujeres con lesiones asociadas a la presencia del VPH.
Alelos de DQ 1 y Hepatopatías
Se tipificaron 52 biopsias hepáticas para las variantes alélicas del gen DQ 1. Del análisis de
las frecuencias de los alelos del gen DQ 1, se desprende que sólo el alelo 0201 presenta una
diferencia significativa entre ambas poblaciones ( 2 = 4,14 p< 0,05). Para establecer cuál es
el riesgo que implica portar el alelo 0201 se calculó el Odds Ratio, dando como resultado un
valor de 0,227 (95% - IC 0,047 – 1,107), lo que indica el alelo 0201 se comportaría como
protectivo en los individuos que lo portan.
CONCLUSIONES
El análisis de los resultados obtenidos permiten arribar a las siguientes conclusiones:
-La población de mujeres estudiada muestra una alta prevalencia de infección por
VPH
(89,84%).
En la distribución de tipos virales:
- El VPH 6 de bajo riesgo representa un 29,10 %, VPH16/18/33 tipos de alto riesgo representan
un 67,74%.
-Las mujeres jóvenes de hasta 35 años representan el segmento etario de mayor riesgo
de contraer la infección.
-La población de mujeres estudiada manifiesta una alta prevalencia de lesiones de bajo grado
(LGSIL=69,20%) y un alto riesgo carcinogénico por la distribución de los tipos virales
encontrados. Es decir que aún en un estadío temprano del desarrollo de la neoplasia cervical,
posee una alta probabilidad de que las lesiones de bajo grado evolucionen hacia lesiones de
alto grado y finalmente al cáncer.
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En consecuencia, los resultados obtenidos sugerirían la transmisión vertical del virus, su
implicancia etiológica en las hepatopatías neonatales (AVBE y HGCNI), en la PLJ y su
asociación con el LiE, indicando además, que no todos los recién nacidos de madres
infectadas desarrollarían las patologías aquí estudiadas, jugando un rol importante los factores
propios del hospedador.
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