Informe Final D03I1137

PROYECTO FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO INFORME FINAL
COPIA TITULO DEL PROYECTO
ELABORACIÓN Y COMERCIALIZACIÓN DE UNA VACUNA
DIVALENTE PARA CONTROLAR LOS AGENTES PISCIRICKETTSIA
SALMONIS Y VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA
INFECCIOSA (P.s - IPNV) EN LA INDUSTRIA SALMONERA
CÓDIGO DEL PROYECTO: D03I1137
FECHA DE EMISION: 29 / 07 /2008
SERGIO MARSHALL GONZÁLEZ
DIRECTOR DEL PROYECTO
TABLA DE CONTENIDOS I. ACTA DE TÉRMINO DEL PROYECTO. 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. IDENTIFICACIÓN DEL PROYECTO. EJECUCION DEL PROYECTO. PLAN DE CONTINUIDAD. TABLA DE CONFORMIDAD. __________________________________________________ II. INFORME EJECUTIVO. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. RESUMEN EJECUTIVO (CASTELLANO E INGLÉS). CUADRO DE SÍNTESIS DE RESULTADOS Y DE OBJETIVOS. INFORME FINANCIERO A LA FECHA DE TÉRMINO. EVALUACIÓN DE LA EJECUCIÓN DEL PROYECTO. PROPUESTA DE CONTINUIDAD DE CADA INSTITUCIÓN BENEFICIARIA. INFORME DE GESTIÓN. 3.1. OBJETIVOS DEL PROYECTO. 3.2. 3.3. RESULTADOS DEL PROYECTO. GESTIÓN DEL PROYECTO. III. IV. INFORME CIENTÍFICO TECNOLÓGICO Y ECONÓMICO SOCIAL. 4.1.
4.2. 4.3. INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO REALIZADOS POR EL PROYECTO. NEGOCIOS TECNOLOGICOS Y PRODUCTIVOS. IMPACTOS PRODUCIDOS Y ESPERADOS. ANEXOS. V. ANEXO 1. ANEXO 2. ANEXO 3. ANEXO 4. ANEXO 5. ANEXO 6. EVALUACIÓN ECONÓMICA SOCIAL Y PRIVADA. PLAN DE MANTENCIÓN DE LA INFRAESTRUCTURA HABILITADA, BIENES, EQUIPOS Y OTROS ELEMENTOS ADQUIRIDOS. SOLICITUDES Y REGISTROS DE PROTECCION DE PROPIEDAD INTELECTUAL. PUBLICACIONES. DOCUMENTOS DE CONFORMIDAD DE lAS EMPRESAS (O DE OTRA ENTIDAD SOCIA). <Nombre del nuevo anexo a incluir>. I.
ACTA DE TÉRMINO DEL PROYECTO 1
1.1. IDENTIFICACIÓN DEL PROYECTO
TITULO DEL
PROYECTO
ELABORACIÓN Y COMERCIALIZACIÓN DE UNA
VACUNA DIVALENTE PARA CONTROLAR LOS
AGENTES PISCIRICKETTSIA SALMONIS Y VIRUS DE
LA NECROSISI PANCRÉATICA INFECCIOSA (P.sIPNV) EN LA INDUSTRIA SALMONERA
CÓDIGO FONDEF
D03I1137
DIRECTOR(A) DEL
PROYECTO
INSTITUCIÓN(ES)
BENEFICIARIA(S)
SERGIO MARSHALL GONZÁLEZ
PONTIFICIA
VALPARAÍSO
UNIVERSIDAD
CATÓLICA
DE
EMPRESAS Y
PHARMAQ AS
OTRAS ENTIDADES
SOCIAS
1.2. EJECUCIÓN DEL PROYECTO 2
FECHA DE TOMA DE RAZON POR
LA CONTRALORÍA GENERAL DE
LA REPÚBLICA
PLAZO CONTRACTUAL (indicado
en el convenio, en meses)
FECHA EFECTIVA DE INICIO
FECHA EFECTIVA DE TÉRMINO.
DURACIÓN EFECTIVA (desde la
fecha efectiva de inicio hasta la
fecha efectiva de término, en
meses)
19 de Octubre 2004
30 MESES
28/10/2004
30/06/2008
44 MESES
1
Se solicita al(a la) Director(a) del Proyecto que responda esta sección con información oficial del proyecto. Esta acta debe ser firmada en el punto 1.3 por los representantes legales de las instituciones beneficiarias de FONDEF y en el punto 1.4 por los representantes de las instituciones, empresas y de las otras entidades socias del proyecto. 2
Cualquier diferencia entre la duración contractual y la duración efectiva se explica por las prórrogas autorizadas. 1.3. PLAN DE CONTINUIDAD.
Las instituciones se comprometen a:
a.b.-
c.d.-
Nº
1
La mantención y consolidación de las líneas de investigación
asociadas al proyecto, por un plazo no inferior a 3 años.
El uso de la infraestructura y equipamiento asociado al proyecto en el
apoyo a proyectos de I&D o servicios C&T con alto impacto
económico social.
La valorización, comercialización y transferencia de los resultados del
proyecto que se requiera para maximizar los impactos.
La protección de los resultados así como el beneficio en términos
razonablemente onerosos para la institución a partir de las rentas
que de ellos se obtengan.
Nombre Institución
Beneficiaria
PONTIFICIA
UNIVERSIDAD
CATÓLICA DE
VALPARAÍSO
Nombre Representante
Legal
Firma
ALFONSO MUGA
NAREDO
LAS INSTITUCIONES BENEFICIARIAS DECLARAN
ESTAR EN
CONOCIMIENTO Y DE ACUERDO CON EL CONTENIDO TOTAL DE ESTE
INFORME Y QUE LOS DATOS REGISTRADOS EN ESTA DECLARACIÓN
CORRESPONDEN A UN RESUMEN DE LOS DETALLADOS EN ÉL.
1.4. TABLA DE CONFORMIDAD 3
Nº
1
Nombre Institución,
Empresa u Otra
Entidad Socia
PHARMAQ CHILE
(ALPHARMA)
Nombre
Representante Legal
ASMUND BAKLIEN
¿Se adjunta Documento
de Conformidad en
Anexos? 4
NO
3 Sólo se debe incorporar a las instituciones, empresas u otras contrapartes que efectivamente hayan realizado aportes al proyecto, sean estos incrementales o no. 4 Los (las) Representantes Legales de cada institución, empresa u otra entidad socia del proyecto declaran estar en conocimiento y de acuerdo con el contenido total de este informe. 4
II. INFORME EJECUTIVO
2.1. RESUMEN EJECUTIVO 5
Versión en castellano.
ELABORACION Y COMERCIALIZACON DE UNA VACUNA DIVALENTE PARA
CONTROLAR LOS AGENTES PISCIRICKETTSIA SALMONIS Y VIRUS DE LA
NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (P.s – IPNV) EN LA INDUSTRIA
SALMONERA
El Consorcio Pontificia Universidad Católica de Valparaíso – ALPHARMA, tiene
comprobados éxitos en el campo de la acuicultura aplicada. La primera, al haber
generado un inmunógeno protector contra la bacteria Piscirickettsia salmonis (P.s)
derivada de un proyecto FONDEF (1038), con petición de patente en varios países
y en fase de comercialización como vacuna proteica. La segunda, por ser
actualmente líder en el mercado salmonicultor chileno en la venta de la única
vacuna eficiente contra el Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV). La
natural obsolescencia que en un plazo estimativo no superior a cuatro años tendrá
cada vacuna individual, nos lleva hoy a adelantarnos y aprovechar la sinergia
existente entre estas dos Instituciones para generar una sola vacuna divalente
reforzada, más eficiente y renovada, contra los dos agentes en cuestión (P.s –
IPNV). La vacuna, aplicable en una sola dosis, y en etapa de pre-smoltificación,
asegurará que un alto porcentaje de los peces puedan alcanzar el estado adulto
debidamente protegidos para resistir la immunosupresión que produce el estrés de
los cultivos confinados, situación que naturalmente se traduce en una mayor
susceptibilidad a agentes patógenos como los indicados. La vacuna,
comercializable en Chile, podrá ser aplicada también en otras latitudes (Canadá,
Escocia y Noruega) donde el problema sigue estando, aunque controlado, vigente
y latente.
La propuesta consiste en innovar biotecnológicamente la componente proteica de
la vacuna monovalente contra P.s. pronta a entrar al mercado. De esta proteína
(ChaPs) se usará un fragmento correspondiente al extremo carboxilo de la misma,
que aparenta ser la región de mayor immunogenicidad y que también parece ser la
5
A partir del proyecto ejecutado, en no más de una página describa lo realizado, destacando los resultados y sus impactos. Este resumen debe ser diferente al resumen ejecutivo incluido en el proyecto reformulado. (ATENCIÓN: ESTE RESUMEN EJECUTIVO SERÁ PÚBLICO). 5
que confiere la mayor protección inmunológica. Usando las proteínas homólogas
recuperadas de clones de tres de las cepas de P.s. que han sido aisladas de
epizootías naturales en Chile y Noruega, y tres variantes quiméricas generadas a
partir de recombinantes entre los DNA que las codifican mediante la técnica de
evolución molecular (DNA Shuffling), evaluaremos la capacidad de cada una de
las seis formas proteicas de inducir respuesta inmune en peces inyectados. El
análisis se hará después de una cinética de tiempo entre 0 y 45 días en que se
obtendrán los sueros correspondientes de grupos de animales sacrificados. Al día
45, grupos de peces inyectados al tiempo “cero” serán desafiados con la cepa tipo
de la bacteria (P.s. – LF-89) para determinar en un plazo de DOS MESES, la
capacidad de sobrevida de cada grupo al contagio inducido. Mientras tanto, con los
sueros obtenidos pre-desafío, se evaluará el potencial de éstos de inhibir la
capacidad infectiva de P.s sobre la línea celular susceptible CHSE-214. El
resultado de este análisis constituirá un referente de que esperar de los
experimentos in vivo, a la vez que si se correlacionan, se consolida como una
forma simple y eficiente de evaluar la variación antigénica de peces naturalmente
infectados en centros de cultivo nacionales Con la mejor componente proteica
seleccionada, ALPHARMA formulará la vacuna divalente incorporando la quimera
o recombinante P.s elegida a la formulación de la vacuna contra IPNV existente,
protegida por secreto industrial. Se evaluará entonces in vivo la capacidad
protectora de la forma híbrida Anti-P.s.-IPNV al desafiar grupos de peces tanto
con P.s como con IPNV para reconfirmar la capacidad protectora de la nueva
vacuna. ALPHARMA se encargará de su formulación y comercialización en
consorcio con la P.UCV que llevará un porcentaje de los beneficios que de ello se
derive. Se espera que la capacidad protectora de la nueva vacuna sea de
aplicación transversal a las tres especies de salmónidos cultivables en Chile,
salmón coho, salmón del atlántico y trucha arcoiris (Oncorhynchus kisutch, Salmo
salar, Oncorhynchus mykiss, respectivamente). Adicionalmente, durante todo el el
proyecto, y posterior al témino del mismo, se evaluará la presencia de variantes de
la proteína ChaPs en brotes naturales de P.s en diferentes pisciculturas de las
regiones X y XI del país, mediante la técnica de PCR en tiempo real. Este
procedimiento nos permitirá mejorar y/o tener nuevas alternativas de formas
proteicas presentes en el campo para enriquecer, secuencialmente, la capacidad
de protección eficiente y sostenida de salmónidos en cultivos confinados con una
vacuna de última generación renovable.
La evaluación económica privada indica que el proyecto es altamente atractivo
debido a que presenta un VAN de $176 millones con una TIR del 490% para la
empresa productiva, comenzando el período de régimen al 2009 (2 años después
de iniciadas las ventas) con ventas cercanas a los M$17.000. Para la institución
beneficiaria del negocio tecnológico correspondiente a la Pontificia Universidad
6
Católica de Valparaíso el proyecto resulta altamente atractivo con VAN de $ 4.000
millones y una TIR del orden del 1624%, considerando un plazo de evaluación de
15 años
Respecto a la evaluación social cabe señalar que el proyecto presenta importantes
beneficios a nivel país, con una TIR del 339% y un VAN de 382% .
Versión en inglés.
TITLE:
Generation and Marketing of a divalent vaccine to control the agents
Piscirickettsia salmonis and Infectious Pancreatic Necrosis Virus in the
Chilean Salmon Industry
The Partnership Pontifical Catholic University of Valparaiso - ALPHARMA, has
verified successes in the field of applied aquaculture. The former, by the generation
of an active protective immunogen against the bacterial agent Piscirickettsia
salmonis (P.s), derived from a FONDEF project (1038), with request of patent in
several countries and ready to be commercialized as a protein-like vaccine. The
latter, by being at present the leader in the Chilean salmonicultor market selling the
only efficient vaccine against Infectious Necrosis Pancreatic Virus ( IPNV) one of
the devastating agent continuosly threatening aquaculture development in Chile.
Knowing that obsolescence of natural vaccines is expected on an estimated 2 - 4
year period, we take advantage today of this fact and based upon the sinergy
existing between the two leading institutions, we plan to generate a reinforced
divalente vaccine, more efficient and renewed than the individual pre-existing
against the two agents P.s and IPNV. The vaccine, applicable in a single dose, and
applied at the pre-smoltification stage, will assure that a high percentage of the
inected fish could reach the adult state properly and able to resist the stressderived immunosupressive stage detected in fish-confined cultures, situation that
naturaly is translated into greater susceptibilies towards pathogenic agents like the
indicated above. The vaccine, commercializeable in Chile, could also be applied in
other latitudes (Canada, Scotland and Norway) where the problem continues being,
although controlled, effective and latent. The proposal consists on a biotecnological
innovation based on the protein component of the monovalent vaccine against
P.s. ready to enter the market. The one protein component (ChaPs) will be
fragmented towards its Carboxy terminus, the one epitope that seems to be the
region of greater immunogenity and that as such, could also be infered to be the
one that confers the greater immunological protection. Using recovered
homologous proteins of three cloned stocks of P.s. isolated from natural epizootic
outbreaks in Chile and Norway, and of three DNA-chimerical variants generated
7
from the stock strains by molecular evolution (DNA shuffling), we will evaluate the
capacity of each of the six protein forms in their capacity to induce immune
responss in P.s.-injected fish. The analysis will be done after a time-kinetics
between 0 and 45 days in which the corresponding sera from sacrificed animal
groups will be obtained and evaluated. At day 45, groups of injected fish at time 0,
will be challenged with theprototype bacteria P.s. LF-89) to determine in a twomonth period their capacity to survive induced infection. Meanwhile, with sera
obtained pre-challenge (0 – 45 days), WE will evaluate their potential to inhibit P.s
infectity over the susceptible fish cell line CHSE-214. The result of this analysis will
constitute a reference
parameter to what to expect from the challenging
experiment. If a direct correlation does exist, it might constitute an efficient and
simple form to evaluate, in the future, antigenic variation of naturally infected fish in
national culture centers. With the best protein component selected, ALPHARMA
will formulate the divalent vaccine incorporating the chimera/recombinant P.s.
selected to the formulated pre-existing IPNV vaccinewhich is already protected by
industrial secrecy. A new trial will be performed on fish groups challenged with
either P.s. or IPNV to reconfirm the enhanced protective capacity of the hybrid
form Anti-P.s.-IPNV new vaccine. Thereafter, ALPHARMA will be in charge of its
formulation and commercialization in partnership with the P.UCV that will take a
percentage of the benefits derived. Ideally, the protective capacity of the new
vaccine should be cross-sectional involvivg the three salmon species cultured in
Chile, coho salmon, tlantic salmon and rainbow trout (Onchorynchus kisutch, Salmo
salar and Onchorynchus mykiss, respectively). Additionally, throughout the project,
and thereafter, we will evaluate by means of the accurate quantutative technique of
real time PCR, the expression of variants of the ChaPs protein in naturallyoccurring P.s. outbreaks in centers of regions X and XI of Chile. This procedure will
allow us to improve and/or to have new alternatives of the presence of alternative
immunoreactive ChaPs-protein forms in the field, to enrich our vaccine potential
tosequentially enrich and/or maintain confined fish capacity to efficiently protect and
enhance salmon production with a renewable generation of vaccines.
The private economic evaluation shows that the project is very attractive since the
calculated VAN is $2511 millions with a TIR of 69% . With the regime period
starting in 2009 (2 years after the beginning of sales), this means an approximate
amount of $630 millions.
Regarding the social evaluation, it is worth mentioning that the project presents
important benefits for the country, with a TIR of 339% and a VAN of $382 millions
of chilean pesos, coming from the lost cost to produce salmon in Chile, and to
increasing the benefits of the companies, in the future period of more competive.
8
2.2. CUADRO DE SÍNTESIS DE RESULTADOS Y DE OBJETIVOS 6
OBJETIVOS DEL PROYECTO
OBJETIVOS GENERALES
1. Generar una vacuna divalente contra los agentes patógenos de salmones
Piscirickettsia salmonis
y Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (P.s –
IPNV).
2. Producir y comercializar la vacuna divalente (P.s – IPNV) por el Consorcio
P.UCV – ALPHARMA.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Expresar los clones del extremo COOH de la proteína inmunogénica ChaPs
de tres variantes de P.s. (LF-89; NOR-92 y CI-95) en E. coli.
2. Generar quimeras por DNA shuffling entre las tres variantes de P.s. – ChaPs.
3. Seleccionar tres de las quimeras con mayor variabilidad en sus DNAs.
4. Clonar y expresar las quimeras seleccionadas en E. coli.
5. Evaluar in vivo e in vitro el potencial inmunogénico de las tres variantes y de
las tres quimeras.
6. Evaluar el potencial inmunogénico – protector de las variantes y quimeras.
7. Seleccionar las moléculas recombinantes de mayor potencial protector para
el desarrollo de la vacuna
8. Producir en forma masiva la mejor molécula recombinante seleccionada
9. Evaluar en campo la mejor dupla divalente anti-(Ps-IPNV- ALPHA JECT
1000)
10. Generar un modelo de empresa biotecnológica para instalar en Chile una
spin-off de origen PUCV dedicada al descubrimiento eficiente de nuevos
medicamentos.
6
Los resultados deben corresponder a todos aquellos resultados comprometidos y vigentes en el sistema de Seguimiento y Control (S+C) de proyectos FONDEF. 9
Resultados de Producción
Nombre
Descripción
Descripción de
logro
Selección del mejor inmunógeno mediante ensayo de campo
realizado en el Laboratorio SGS Aquatic Health.
Basado en el análisis in vitro (ELISA) utilizando suero de peces
naturalmente infectados, fueron seleccionados los diferentes
inmunógenos para la realización de la prueba de campo.
Mix de los diferentes inmunógenos COOH-ChaPs, dieron un
RPS de 67% para la formulación 2 (Dilución 1:10) y 63.2%
para la formulación 1(no diluida). Detalles en el Informe que se
adjunta de SGS Aquatic Health, Mayo 2008, como anexo 1
Objetivos
asociados 7
5,6,7
Resultados de Producción
Nombre
Descripción
Descripción de
logro
Elaboración de una vacuna alternativa mediante el uso de una
bacterina inactivada mediante luz UV pulsada.
Piscirickettsia salmonis purificada de órganos de peces
naturalmente infectados
fue inactivada mediante luz UV
pulsada.
Esta nueva modalidad de vacuna fue ensayada en pruebas de
campo en el Laboratorio de Patología Animal de la Universidad
Austral de Valdivia., lográndose un RPS de 65.7% para la
formulación 1 (100ug/ml proteína total) y un RPS de 62.5% para
la formulación 2 (50ug/ml proteína total).
Objetivos
asociados 8
Resultado
adicional al
proyecto
(Informe 4)
Resultados de Protección
Nombre
Resultados de
producción
asociados
Descripción de
logro
Objetivos
asociados
SOLICITUD DE REGISTRO DE PATENTE
Estudio de patentabilidad realizado por CT Valparaíso S.A.
El Proyecto programó un estudio de patentabilidad, el cual fue
entregado oportunamente a FONDEF en el año 2006, siendo
éste aprobado por el comité ejecutivo del fondo concursable. El
proyecto generó una patente referente a un método de
producción de una proteína inactivada con luz laser UV pulsada
(láser eximero)
10
7
8
Indique el numeral identificador del (de los) objetivo(s) relacionado(s). Indique el numeral identificador del (de los) objetivo(s) relacionado(s). 10
Objetivos
asociados
Resultados de Transferencia y Negocios
Nombre
Resultados de
producción
asociados
Descripción de
logro
Prueba de dos tipos de dosis de proteína contra SRS
Prototipo probado a Nivel Precomercial o Comercial
Realizadas las pruebas en el hatchery de SGS, resultaron
alentadoras respuestas con 63% y 67% respectivamente de
RPM. Con este resultado, se envió el informe con una carta al
director del área acuícola de Pharmaq AS, Asumnd Baklien,
solicitando su opinión y la decisión de la empresa de llevar el
producto a escala industrial o su decisión de dejar en manos de
la universidad el destino de estos resultados.
En estos momentos se está a la espera de la respuesta por
parte de la empresa, que por razones del periodo estival se
espera pueda conocerse a finales del mes de septiembre.
Resultados de Producción Científica Categoría Evento Publicación Tesis o Proyecto de título Cooperación Internacional recibida o entregada Nuevo Proyecto Generado Cantidad Lograda 1 2 2 No hay 3 Resultados de Formación de Capacidades Categoría Cantidad Lograda 4 Capacidades profesionales desarrolladas o fortalecidas 3 Capacidades de formación de redes o de equipos de trabajo Capacidades materiales o de infraestructura 11
2.3. INFORME FINANCIERO A LA FECHA DE TÉRMINO 9 Montos Comprometidos por Convenio (1) Montos Efectivamente Aportados (2) Gastos Totales del Proyecto (3) % (5) 250.000.000 245.279.320 245.279.320 43,33%
120.000.000 120.000.000 120.000.000 20,80%
180.000.000 35,88%
$ 545.279.320 100%
FONDEF Institución Beneficiaria PONTIFICIA
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO
Entidades socias PHARMAQ AS Totales 180.000.000 180.000.000 $ 550.000.000. $ 545.279.320 Monto Reintegrado a FONDEF (6) 0 Costo Final del Proyecto (4) $ 545.279.320 9
1) Montos Comprometidos por Convenio: Son los montos señalados como aportes comprometidos en el convenio firmado entre CONICYT y la(s) institución(es) beneficiaria(s). 2) Montos Efectivamente Aportados: Es la suma de las remesas de fondos o aportes realizados al proyecto por FONDEF, por la(s) institución(es) beneficiaria(s) y por las empresas y otras entidades socias al proyecto. 3) Gastos Totales del Proyecto: Es la suma de los gastos informados por el proyecto y aprobados por FONDEF. 4) Costo Final del Proyecto: Es la suma de las remesas de fondos y aportes realizados al proyecto, menos el monto reintegrado a FONDEF. 5) %: Porcentaje de participación en el Gasto Total del Proyecto, por fuente de financiamiento. 6) Monto Reintegrado a FONDEF: Fondos girados por FONDEF a la(s) institución(es) beneficiaria(s), que no fueron utilizados en el proyecto, por lo cual fueron devueltos a CONICYT. Es la diferencia entre el monto efectivamente aportado por FONDEF y los gastos aprobados financiados por FONDEF. 12
2.4. EVALUACIÓN DE LA EJECUCIÓN DEL PROYECTO 10
2.4.1. El Representante Institucional de cada Institución Beneficiaria
Para la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, reviste de gran relevancia, el
desarrollo y aplicación de nuevas tecnologías en diversas áreas, que conduzcan a
una diferenciación y liderazgo en materias de innovación.
Institucionalmente, el proyecto permite a la universidad mantener una línea de
investigación biotecnológica, permitiendo una implementación tecnológica en
equipos de avanzada para el laboratorio de genética e inmunología molecular,
inyectando importantes aportes para su desarrollo. La investigación realizada por
la Universidad, permite de igual forma, la generación de tesis de pre y post grado
de alumnos, que conducen a la creación de bibliotecas de investigación, producto
al trabajo realizado en el proyecto.
Para la Universidad, es de suma importancia una relación directa y constante con
las empresas socias del proyecto y aquellas que participan en trabajos específicos
de desarrollo, generando un fuerte vinculo entre ellas, provocando en definitiva
una sinergia empresarial, que conduce a futuros desarrollos de investigación
aplicada.
10
Realice un resumen del punto 3.3.5, análisis realizado después de terminar la ejecución del proyecto, el cual tiene como objetivo revisar los resultados, considerando aciertos y dificultades ocurridos durante el proyecto. Para este caso se solicita un análisis por las siguientes personas. 13
2.4.2. El Director(a) del proyecto
El objetivo central del proyecto fue la generación y comercialización de una
vacuna divalente contra los agentes patógenos de salmones Piscirikettsia
salmonis y virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (P.s – IPNV), siendo un
tema de suma importancia para la industria de la acuicultura Chilena y mundial,
producto a los nefastos impactos económicos que estos patógenos representan
para el sector.
Es importante señalar además, que en las actuales condiciones de la industria,
con los constantes ataques a nivel mundial y el freno de las compras que en
algunos mercados se ha producido al salmón chileno, hace suponer estar
presentes en un momento ventajoso para buscar soluciones que mejoren las
condiciones de cultivo del salmón, como asimismo, la búsqueda de nuevas
vacunas para proteger de enfermedades a esta industria, donde por medio del
presente proyecto, se buscó dar nuevas soluciones a la gran problemática actual
del sector acuícola nacional y mundial.
14
2.5. PROPUESTA DE CONTINUIDAD DE CADA INSTITUCIÓN BENEFICIARIA
Nuestro laboratorio continúa en el desarrollo de herramientas biotecnológicas para
la erradicación de enfermedades que afectan la acuicultura nacional. Con respecto
a lo anterior, se han implementado nuevas líneas de investigación que van desde
el desarrollo de vacunas orales a través del uso de microalgas; hasta la
elaboración de virinas para ser probadas como eficientes medidas profilácticas
contra el virus ISA.
15
III. INFORME DE GESTIÓN
3.1. OBJETIVOS DEL PROYECTO 11
3.1.1 Objetivo(s) General(es)
1. Generar una vacuna divalente contra los agentes patógenos de salmones
Piscirickettsia salmonis y Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (P.s –
IPNV).
El laboratorio de Genética e Inmunología Molecular de la PUCV, desarrolló en
forma exitosa la contraparte correspondiente a la selección del mejor inmunógeno
contra P. salmonis (ver anexo informe SGS). La generación de la vacuna divalente
(P.s – IPNV), con la adición del inmunógeno contra IPNV por parte de
PHARMAQ no se llevó a cabo puesto que la empresa no estaba proclive a la
producción de una nueva vacuna divalente, teniendo a la fecha dos de ellas en el
mercado. La empresa deja a libre disposición el uso del inmunógeno contra P.
salmonis.
2. Producir y comercializar la vacuna divalente (P.s – IPNV) por el Consorcio
PUCV – ALPHARMA
La producción y comercialización de la vacuna divalente (P.s – IPNV) por el
Consorcio P.UCV – ALPHARMA no se dio ha lugar por lo expuesto en el punto
3.1.1 (1)
3.1.2 Objetivos Específicos
1. Expresar los clones del extremo COOH de la proteína inmunogénica
ChaPs de tres variantes de P.s. (LF-89; NOR-92 y CI-95) en E. coli.
Los clones del extremo COOH de la proteína inmunogénica ChaPs de tres
variantes de P.s. (LF-89; NOR-92 y CI-95) fueron exitosamente expresadas en E.
coli BL21 codonplus (Informe 1).
11
Señale los objetivos generales y específicos programados. Informe los LOGRADOS, los NO LOGRADOS, así como los NUEVOS objetivos incorporados durante el desarrollo del proyecto. Señálelos como tales. (Deben estar debidamente visados por el respectivo comité de área de FONDEF). 16
2. Generar quimeras por DNA shuffling entre las tres variantes de P.s. –
ChaPs.
Las quimeras por DNA shuffling entre las tres variantes de P.s. – ChaPs fueron
construidas y analizadas mediante ELISA. Sin embargo, su potencial inmunogénico
fue menor al presentado por los extremos COOH originales de ChaPs.
3. Seleccionar tres de las quimeras con mayor variabilidad en sus DNAs
Las quimeras no fueron seleccionadas en base a su variabilidad de DNA ya que el
diseño de ellas fue diferente al propuesto originalmente en el proyecto. Fueron
seleccionadas en base a su respuesta inmunológica. Pero al presentar un potencial
inmunogénico menor frente a los COOH de ChaPs, fueron estos últimos los
seleccionados para ser ensayados como potencial vacuna. 4. Clonar y expresar las quimeras seleccionadas en E. coli.
Al no haber quimeras seleccionadas, no hay quimeras que expresar.
Se continuó solamente con la expresión de los diferentes COOH de ChaPs (cepas
de P. salmonis).
5. Evaluar in vivo e in vitro el potencial inmunogénico de las tres variantes y
de las tres quimeras
La evaluación in vitro (Test de ELISA) con sueros de peces naturalmente
infectados se realizó con las variantes COOH-ChaPs individualizadas y también
como una mezcla de ellas (mix). El mejor resultado obtenido se logró con el mix,
siendo este último elegido para realizar las pruebas de campo en SGS Aquatic
Health (ver anexo adjunto).
17
6. Evaluar el potencial inmunogénico – protector de las variantes y quimeras
El potencial inmunoprotector de mix fue probado en ensayos de campo realizados
en SGS Aquatic Health, entregando una protección de 63.2 % y un 67%
(formulación 1 y formulación 2, respectivamente).
7. Seleccionar las moléculas recombinantes de mayor potencial protector
para el desarrollo de la vacuna.
Los resultados obtenidos en el ensayo de campo validan al mix para ser utilizado
como potencial vacuna contra SRS. Cabe hacer notar que cualquier inmunógeno
que arroje un RPS superior al 60%
puede ser viable en la elaboración de
cualquier vacuna.
8. Producir en forma masiva la mejor molécula recombinante seleccionada
No se realizó producción masiva del mix, ya que sólo se realizó el ensayo de
mediana escala programado en SGS Aquatic Health.
18
9. Evaluar en campo la mejor dupla divalente anti-(Ps-IPNV- ALPHA JECT
1000)
Se evaluó en hatchery dos variantes de la proteína contra la P.s, resultando con un
RPS de un 63% y 67% respectivamente. Estos resultados, fueron enviados a
Pharmaq As. Noruega para que ellos incorporen la proteína contra IPN y se evalúe
el producto en su totalidad. Se espera que al finalizar el periodo de vacaciones
previsto para fines del mes de septiembre, la Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso, reciba la respuesta definitiva de la empresa.
10. Generar un modelo de empresa biotecnológica para instalar en Chile una
spin-off de origen PUCV dedicada al descubrimiento eficiente de nuevos
medicamentos.
El Centro de transferencia tecnológica de la Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso, se encuentra desarrollando una guía de orientación para desarrollar el
negocio biofarmaceutico en base a la proteína contra el agente patógeno P.s.
Con este documento se espera realizar la búsqueda de un socio que junto a la
Universidad, inviertan en el desarrollo de un negocio tecnológico en base a
proteína para vacunas, en el caso que la empresa Pharmaq As. no se encontrara
interesada en el desarrollo del producto comercial.
19
3.2. RESULTADOS DEL PROYECTO
3.2.1. Resultados de Producción
Nombre
Selección del mejor inmunógeno mediante ensayo de campo
realizado en el Laboratorio SGS Aquatic Health.
Categoría
Producto probado a nivel de laboratorio y a mediana escala
Descripción
La selección de los diferentes inmunógenos para la
realización de la prueba de campo estuvo basado en el
análisis in vitro (Test de ELISA) utilizando suero de peces
naturalmente infectados.
Calidad
Producto pre-comercial (producto viable – RPS > 60%)
Descripción del
Mix de los diferentes inmunógenos COOH-ChaPs, dieron un
logro (refiérase a
RPS de 67% para la formulación 2 (Dilución 1:10) y 63.2%
los atributos)
para la formulación 1(no diluida). Detalles en el anexo 1
(Informe SGS, Mayo 2008).
Nombre
Categoría
Descripción
Calidad
Descripción del
logro (refiérase a
los atributos)
Elaboración de una vacuna alternativa mediante el uso de
una bacterina inactivada mediante luz UV pulsada.
Producto probado a nivel de laboratorio y a mediana escala
P. salmonis purificada de órganos de peces naturalmente
infectados fue inactivada mediante luz UV pulsada.
Producto pre-comercial (producto viable – RPS > 60%)
Esta nueva modalidad de vacuna fue ensayada en pruebas
de campo en el Laboratorio de Patología Animal de la
Universidad Austral de Valdivia, lográndose un RPS de
65.7% para la formulación 1 (100ug/ml proteína total) y un
RPS de 62.5% para la formulación 2 (50ug/ml proteína total).
20
3.2.2. Resultados de Protección
Nombre
Solicitud de registro
Resultado de
Estudio de patentabilidad realizado por CT Valparaíso S.A.
Producción
asociado
Descripción del
El Proyecto programo un estudio de patentabilidad, el cual fue
logro
entregado oportunamente a FONDEF en el año 2006, siendo
éste aprobado por el comité ejecutivo del fondo concursable.
El proyecto generó una patente referente a un método de
producción de una proteína inactivada con luz laser UV
pulsada (láser eximero)
3.2.3. Resultados de Transferencia y Negocios
Categoría
Nombre
Resultado de
Producción
asociado
Descripción
logro
Patentamiento
Prueba de dos tipos de dosis de proteína contra SRS
Prototipo probado a Nivel Precomercial o Comercial
del Realizadas las pruebas en el hatchery de SGS, resultaron
alentadoras respuestas con 63% y 67% respectivamente de
RPM. Con este resultado, se envió el informe con una carta al
director del área acuícola de Pharmaq AS, Asumnd Baklien,
solicitando su opinión y la decisión de la empresa de llevar el
producto a escala industrial o su decisión de dejar en manos
de la universidad el destino de estos resultados.
En estos momentos se está a la espera de la respuesta por
parte de la empresa, que por razones del periodo estival se
espera pueda conocerse a finales del mes de septiembre.
21
3.2.4. Resultados de Producción Científica
Categoría
Eventos nacionales
Eventos internacionales
Publicación: artículo científico en revista
nacional
Publicación: artículo científico en revista
internacional de corriente principal
Publicación: libro o capítulo de libro
Tesis o Proyecto de título (Magíster)
Tesis o Proyecto de título (Doctorado)
Cooperación Internacional recibida o
entregada
Nuevo Proyecto Generado
Cantidad Comprometida
Cantidad Lograda
5
4
No hay
2
No hay
No hay
4
No hay
4
3.2.5. Resultados de Formación de Capacidades
Categoría Capacidades profesionales desarrolladas o fortalecidas Capacidades de formación de redes o de equipos de trabajo Capacidades materiales o de infraestructura Cantidad Comprometida Cantidad Lograda 6 5 22
3.3. GESTIÓN DEL PROYECTO
3.3.1. Plazos efectivamente utilizados vs. plazos considerados inicialmente
El proyecto inicialmente programó acciones para ejecutarse durante 30 meses de
Trabajo de investigación y desarrollo, los cuales según el calendario Gantt,
presentado en el proyecto reformulado, finalizaba el día 27 de abril de 2007, sin
embargo, producto a diversas actividades realizadas posterior a la fecha final,
inicialmente programada, se solicitó a FONDEF, una extensión de plazo que
permitiera realizar las pruebas y desafíos realizadas en la empresas SGS Chile,
con el principal propósito de comprobar la efectividad real de la vacuna.
FONDEF, mediante una respuesta formal, autorizó la solicitud de prórroga,
aplazando la fecha de finalización de proyecto para el día 30 de junio de 2008.
La extensión de plazo solicitada no conllevó una entrega adicional de recursos por
FONDEF, sino un alargamiento de las actividades finales, las cuales fueron
financiadas con recursos provisionados del proyecto.
3.3.2. Gastos ejecutados versus lo presupuestado inicial
Al momento de ser aprobado el proyecto, el monto comprometido por convenio fue
por la suma de $250.000.000, por parte de FONDEF, del cual se considera la
suma de $4.720.680.- correspondientes a los gastos comunes del proyecto, de
manera que si no contemplamos este último valor, lo realmente aportado para la
ejecución del proyecto, por parte de FONDEF fue por la suma de $245.279.320.cantidad que fue utilizada íntegramente. Cabe señalar, que se realizaron todas las
actividades programadas para dar cumplimiento a la investigación y desarrollo del
proyecto.
Por parte de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, entidad beneficiaria
del proyecto, aportó la cantidad $120.000.000. Por su parte, la empresa asociada
Pharmaq As. Noruega, aportó un monto de $180.000.000, dineros que son
respaldados en el presente informe mediante los respectivos certificados.
23
A continuación, se entrega el detalle de las remesas recibidas por parte de
FONDEF, para el desarrollo de las actividades contempladas en el proyecto.
•
•
•
•
•
•
•
•
Primer monto $27.000.000.- recibido con fecha 18/11/2004
Segundo monto $125.031.409.- recibido con fecha 29/12/2004
Tercer monto $20.683.730.- recibido con fecha 19/10/2005
Cuarto monto $13.213.904.- recibido con fecha 28/11/2005
Quinto monto $5.648.031.- recibido con fecha 09/03/2006
Sexto monto $34.271.519.- recibido con fecha 12/04/2006
Séptimo monto $3.397.321.- recibido con fecha 13/11/2006
Octavo monto $16.033.406.- recibido con fecha 11/01/2007
Para informar sobre los gastos y acciones del proyecto, se detalla a continuación
las declaraciones de gastos efectuadas durante la ejecución del proyecto.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Primera declaración por la suma de $27.484.409.- enviada noviembre 2004
Segunda declaración, por la suma de $97.563.396.- enviada marzo 2005
Tercera declaración, por la suma de $5.108.260.- enviada abril 2005
Cuarta declaración, por la suma de $17.879.074.- enviada mayo 2005
Quinta declaración, por la suma de $21.973.904.- enviada julio 2005
Sexta declaración, por la suma de $7.836.523.- enviada diciembre 2005
Séptima declaración, por la suma de $6.053.090.- enviada enero 2006
Octava declaración, por la suma de $7.186.265.- enviada febrero 2006
Novena declaración, por la suma de $15.944.606.- enviada marzo 2006
Décima declaración, por la suma de $6.859.550.- enviada junio 2006
Décima primera declaración, por la suma de $16.229.902 enviada octubre
2006
Décima segunda declaración, por la suma de $12.320.341.- enviada febrero
2007
Décima Tercera declaración, por la suma de $ 540.000.- enviado mayo
2008
Décima Cuarta declaración, por la suma de $2.000.000.- enviada julio 2008
Décima Quinta declaración, por la suma de $300.000.- enviada julio 2008
La información antes señalada, refleja la cantidad recibida mediante remesas de
dinero depositadas por parte de FONDEF y la misma cantidad declarada por la
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso.
24
3.3.3. Participación de las Instituciones y Empresas (u otras entidades
socias)
El proyecto contó con la participación de la Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso, como entidad beneficiaria, aportando la suma de $120.000.000,
realizando investigaciones básicas, investigaciones aplicadas y las primeras
evaluaciones de los inmunógenos para la vacuna divalentes a niveles
experimentales de laboratorio.
Por su parte la empresa asociada, PHARMAQ AS. Aportó la suma de
$180.000.000 distribuidos durante el proyecto, participando activamente con
personal técnico calificado para desarrollar trabajos específicos del proyecto y el
uso de su infraestructura para labores de desarrollo de actividades.
3.3.4. Organización y equipo de trabajo
a) Organigrama funcional del proyecto
Sergio Marshall
Director General
Laboratorio de Genética
e inmunología
Molecular
CT Valparaíso S.A.
Vacuna IPNV
Investigación Aplicada
ALPHA JECT 1000
Áreas
Transferencia
Tecnológica
Asmund Baklien
Pharmaq As.
Proteómica
Verónica Rojas
Jorge Olivares
Daniela Campos
Genómina
Experimentación in vivo
Inmunología
Sergio Marshall
Vitalia Hnríquez
Patricio Cataldo
NN (Técnico)
(Argentina)
Anticuerpos Monoclonales
25
Nº
1
2
3
4
5
6
12
b) Descripción del rol individual en el equipo de trabajo 12
Nombre
Institución o Capacidad/Competencia
Función
Empresa (o
desempeñada
entidad socia)
SERGIO
Dr. Microbiología y
DIRECTOR
PUCV
MARSHALL
Genética Molecular
PROYECTO
PHARMAQ
ASMUND
DIRECTOR
AS
BAKLIEN
ALTERNO
(APHARMA)
JORGE
PUCV
Biólogo
INVESTIGADOR
OLIVARES
PATRICIO
PUCV
Microbiólogo
INVESTIGADOR
CATALDO
VITALIA
PUCV
Doctora en Ciencias
INVESTIGADOR
HENRIQUEZ
VERONICA
PUCV
Doctora en Biomédica
INVESTIGADOR
ROJAS
DESARROLLO
CT
DE PRODUCTO
VALPARAÍSO
TRANSFERENCIA
S.A.
TECNOLÓGICA
Debe incluirse al personal de las empresas y de otras entidades socias 26
3.3.5. Evaluación de la ejecución del proyecto 13
a) El (la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiaria
Para la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, reviste de gran relevancia, el
desarrollo y aplicación de nuevas tecnologías en diversas áreas, que conduzcan a
una diferenciación y liderazgo en materias de innovación.
Institucionalmente, el proyecto permite a la universidad mantener una línea de
investigación biotecnológica, enfocada principalmente en la producción de
vacunas abocadas al sector acuícola, permitiendo una implementación tecnológica
en equipos de avanzada para el laboratorio de genética e inmunología molecular,
inyectando importantes aportes para su desarrollo. La investigación desarrollada
por la Universidad, permite de igual forma, la generación de tesis de pre y post
grado de alumnos, que conducen a la creación de bibliotecas de investigación,
producto al trabajo realizado en el proyecto.
Para la Universidad, es de suma importancia una relación directa y constante con
las empresas socias del proyecto y aquellas que participan en trabajos específicos
de desarrollo, generando un fuerte vinculo entre ellas, que provoca en definitiva
una sinergia empresarial, que conduce a futuros desarrollos de investigación
aplicada.
La universidad, está en una constante búsqueda de desarrollo, donde se relaciona
directamente con un área de investigación de origen gubernamental, estrechando
un fuerte vínculo con FONDEF en el desarrollo de nuevas tecnologías,
b) El (la) Director(a) del proyecto
El objetivo central del proyecto fue la generación y comercialización de una
vacuna divalente contra los agentes patógenos de salmones Piscirikettsia
salmonis y virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (P.s – IPNV), siendo un
tema de suma importancia para la industria de la acuicultura Chilena y mundial,
producto a los nefastos impactos económicos que estos patógenos representan
para el sector.
13
Este análisis es posterior a la ejecución del proyecto, y tiene como objetivo revisar los resultados, considerando aciertos y dificultades ocurridas durante el proyecto. Refiérase además a la participación de las instituciones, empresas y otras entidades socias. Para este caso se solicita un análisis por las siguientes personas: 27
Es importante señalar además, que en las actuales condiciones de la industria,
con los constantes ataques a nivel mundial y el freno de las compras que en
algunos mercados se ha producido al salmón chileno, hace suponer estar
presentes en un momento ventajoso para buscar soluciones que mejoren las
condiciones de cultivo del salmón, como asimismo, la búsqueda de nuevas
vacunas para proteger de enfermedades a esta industria, donde por medio del
presente proyecto, se buscó dar nuevas soluciones a la gran problemática actual
del sector acuícola nacional y mundial.
28
IV. INFORME
SOCIAL
CIENTÍFICO
TECNOLÓGICO
Y
ECONÓMICO
4.1. INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO REALIZADOS POR EL PROYECTO
Conforme a los Hitos de Investigación y Desarrollo trazados en el proyecto,
podemos decir que la mayoría de ellos han sido logrados satisfactoriamente. Entre
los resultados concretos encontramos el clonamiento, expresión, escalamiento a
nivel piloto en la producción, purificación y la selección de 14 clones (Tabla 1) con
alto potencial inmunogénico, el cual, fue medido por el grado de reactividad de los
mismos frente a sueros de peces naturalmente infectados con el patógeno
Piscirickettsia salmonis.
TABLA 1
Clon Cepa Característica Tamaño kDa ChaPs LF‐89 Proteína completa 58 ChaPs NOR‐92 Proteína completa 58 ChaPs CI‐95 Proteína completa 58 CHaPs EM‐90 Proteína completa 58 13/8 LF‐89 Extremo COOH 17 13/8 NOR‐92 Extremo COOH 17 13/8 CI‐95 Extremo COOH 17 13/8 EM‐90 Extremo COOH 17 11/12 LF‐89 Sección Intermedia 18 9/4 LF‐89 Extremo NH2 24 15/12 LF‐89 Sub‐clon fragmento 13/8
6 Quimera ‐ 1 LF‐89 Quimera – 2 LF‐89/NOR‐92 Epítopes Inmunoreactivos 13/8‐15/12 ligados 9/2 LF‐89 (70% del gen) 7.2 16.3 42.3 29
Evaluación de la capacidad inmunoreactiva de todas las proteínas expresadas
mediante el test de ELISA utilizando suero de peces naturalmente Infectados
Para seleccionar la proteína con mayor potencial inmunogénico, se realizó test de
ELISA con todas las proteínas expresadas. El mejor resultado de capacidad
inmunogénica fue obtenido por el mix de los extremos COOH de la proteína
inmunogénica ChaPs (Figura 1), de esta forma fue precisamente este inmunógeno
el que fue producido en forma masiva para ser probado en ensayos de campo por
la empresa SGS Aquatic Health. Los resultados de esta prueba arrojaron un RPS
de 67% para la formulación 2 (Dilución 1:10) y 63.2% para la formulación 1(no
diluida). (Figura 2).
Figura 1.
ELISA reconocimiento de variantes de la proteína
inmunogénica ChaPs de P. salmonis
COOH MIX Absorbancia 650 nm
2,7
2,5
2,3
2,1
1,9
C-
1,7
S+
1,5
S+
1,3
1,1
0,9
0,7
ChaPs
LF89
ChaPs
EM90
ChaPs
Nor92
ChaPs
CI95
COOH
LF89
COOH
Nor92
COOH
CI95
NH2
LF89
15/8
LF89
MixCOOH
Distintas Proteínas
Mortalidad acumulada post desafio con P. salmonis por grupo
Control
100
% mortalidad acumulada
90
Formulacion
1
Formulacion
2
80
70
Figura 2.
. 60
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
30
Resultado adicional del Proyecto
Como una investigación anexa surgida en este mismo proyecto se elaboró una
bacterina basada en la inactivación absoluta de los ácidos nucleicos de la bacteria
sin alterar su estructura ni configuración externa, para ser usada como potencial
vacuna.
Una vez sometida la bacteria al tratamiento con luz ultravioleta se determinó la
capacidad infectiva (ingreso a células) de las bacterias tratadas (Figura 3), la
capacidad de replicación (Figura 4) y su capacidad de transcripción (Figura 5). Para
validar el potencial real de su uso como vacuna fue realizada una prueba de campo
en dependencias de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile con
un RPS de 65.7% para la formulación 1 (100ug/ml proteína total) y un RPS de
62.5% para la formulación 2 (50ug/ml proteína total) (Figura 6).
A
B
Figura 3: Microscopía de Fluorescencia utilizando anticuerpos
contra P. salmonis A: Bacterias no tratadas B: Bacterias tratadas.
Demostrando que las bacterias tratadas no pierden su capacidad
infectiva
31
8
L o g 1 0 N ú m e r o d e b a c te ri a s
7
6
5
UV tratadas
4
Control
3
2
1
0
Día 1
Día 3
Día 5
Día 7
Días post Infección
Figura 4: Gráfico que demuestra la inhibición de la capacidad de replicación de
la bacteria tratada con luz UV-pulsada mediante PCR en tiempo real a los 1, 3, 5
y 7 días post-infección.
8
7
6
L o g 10 N ú m ero d e co p ias
5
Control
4
Bact UV Tratadas
3
2
Figura 5: Gráfico que demuestra
la inhibición de la capacidad de
transcripcional de la bacteria
tratada con luz UV-pulsada
mediante PCR en tiempo real
comparados
con
dos
housekeeping genes
1
0
ChaPs
Factor sigma
Ge ne s e valuados
32
70
60
% mortalidad acumulada
50
% Control
40
% Dosis 1
% Dosis 2
30
20
10
31
27
29
25
23
19
21
17
15
13
11
7
9
3
5
0
1
Días Post-desafío
Figura 6: Gráfico mortalidad acumulada en ensayo inmunización desafío
utilizando dos dosis de la bacterina tratada con luz UV-pulsada
33
4.2. NEGOCIOS TECNOLÓGICOS Y PRODUCTIVOS
4.2.1. Síntesis de actividades realizadas en Transferencia
En este proyecto se planteó desarrollar en conjunto, entre la Pontificia UCV y
Pharmaq S.A., una vacuna divalente donde la Universidad dispondría una proteína
recombinante contra P. salmonis y la empresa farmacéutica de capitales
noruegos, el antígeno contra Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNv). Al finalizar
el proyecto se cuenta con los dos elementos constitutivos de la vacuna, es decir,
para P. salmonis e IPNv. La protección contra P. salmonis arrojó Porcenajes
Relativos de Sobrevivencia (RPS) de un 63,2% y 67% que responden a dos
formulaciones distintas. Antecedentes específicos se pueden ver en el Informe
Final emitido por SGS Aquatic Health: “Evaluación de eficacia de vacunas
experimentales contra Piscirickettsia salmonis”. Pharmaq es especialista en
vacunas para peces, especialmente en IPNv, siendo líder mundial en el suministro
de este producto, disponiendo en el mercado una vacuna trivalente que incluye
SRS y lanzará pronto al mercado una tetravalente. Cerca de la finalización del
período de extensión del proyecto (30 de junio de 2008), esta empresa
farmacéutica informa a la Pontificia UCV sobre su decisión de no utilizar la
proteína recombinante contra SRS desarrollada en el proyecto para producir la
bivalencia con su producto IPNv, por considerar que no está en su prioridad, dado
que su actual énfasis se encuentra en encontrar una solución a la enfermedad del
ISA en salmónidos, añadiendo además que cuenta con vacunas en versiones
tetravalentes que registran posición ganada y liderazgo en el mercado.
Ante esta situación, este proyecto de I+D culminó en una instancia en que la
Pontificia UCV quedó liberada para poder ofrecer y transferir esta alternativa de
vacuna contra SRS a otros productores y comercializadores. Los acuerdos de
desarrollo establecidos con la empresa Pharmaq en este proyecto I+D y su
prioridad para tomar la primera opción, hacían imposible realizar actividades de
transferencia tecnológica adicionales a las estrictamente establecidas entre la
Universidad y esta compañía que podría haber sido la que introdujera el producto
al mercado. De acuerdo a la forma asociativa considerada para llevar adelante
este proyecto I+D, las actividades de transferencia tecnológica para terceros
podían efectuarse solamente una vez que este finalizara, encontrándose
actualmente en esta condición.
Para la transferencia de esta vacuna contra SRS, es necesario señalar que
mientras se ejecutaba el proyecto I+D la industria farmacéutica avanzó
rápidamente hacia la producción de vacunas polivalentes, encontrándose
actualmente en vigencia las trivalentes, versión que en este mismo año
comenzarán a estar obsoletas al ser sustituidas por versiones tretravalentes.
34
Considerando que este proyecto I+D planteaba originalmente una vacuna
divalente, resulta evidente que es una versión que perdió vigencia en el mercado.
Por este motivo, cualquier esfuerzo que se realice para transferir este producto
contra SRS, tendrá que considerar el proveer esta proteína recombinante a una
compañía o laboratorio farmacéutico que esté interesado en lanzar al mercado
una vacuna tetravalente.
Por otra parte, es importante considerar que las empresas y laboratorios
farmacéuticos que han logrado establecerse en el negocio de las vacunas para
salmones tienen una predisposición limitada a cambiar su producto Con esto se
hace referencia a Bayer, Veterquímica, Centrovet, el propio Pharmaq, lo
comercializado por Europharma, Intervet y Recalcine. Por esta razón surge como
alternativa el localizar un nicho de mercado distinto a estas empresas que
tradicionalmente han estado presente en este negocio. Podría corresponder a
emprendedores y empresas que se conforman con una pequeña cuota de
mercado con el fin estratégico de ingreso a esta industria que registra fuertes
barreras de entrada. Los esfuerzos de transferencia tecnológica podrían dirigirse a
identificar y capturar este eventual nicho.
Para que una nueva vacuna polivalente que incluya SRS sea exitosa en el
mercado, será necesario transferir a un productor farmacéutico que posea un
coadyuvante de alta calidad, considerando que es un elemento fundamental para
incrementar la capacidad de protección. El porcentaje relativo de sobrevivencia
puede aumentar en 20 punto porcentuales, sobre la conseguida con la proteína
pura. Esto quiere decir que el RPS del 67% puede verse mejorado a un 87%. En
este sentido toma real importancia la empresa a la cual se transfiere este material
contra SRS, siendo posible trabajar en su mejora mediante la localización de un
excelente coadyuvante.
Cabe mencionar que en el contexto de este proyecto Fondef I+D, se obtuvo como
resultado una vacuna bacterina inactivada con tecnología de luz láser Ultra Violeta
Pulsada. Este es un producto derivado con solicitud de patente de invención
industrial en el DPI de Chile, ampliando el portafolio de tecnologías disponibles en
la Pontificia UCV que apuntan a resolver problemas de salud de peces en la
industria salmonera. Al igual que el caso de la vacuna recombinante SRS, se
encuentra recientemente disponible para transferirla, considerando que
el
proyecto en convenio con Pharmaq ha finalizado.
35
4.2.2. Diagrama del Modelo de Negocios
CASO 1:
Licencia de explotación económica de la patente de vacuna SRS a empresa
farmacéutica con producción propia
Pontificia UCV
Licencia de patente
de invenci—n de la
vacuna
F‡bricaci—n
de vacunas
Comercializaci—n
de vacunas
CLIENTE
Empresa farmac utica
Empresas salmoneras
CASO 2:
Licencia de explotación económica de la patente de vacuna SRS a empresa
olaboratorio farmacéutico con producción realizada por un tercero
Empresa comercializadora de
productos farmac uticos
Adquisici—n
de vacunas
Fabricante y
proveedor
de vacunas
Comercializaci—n
de vacunas
CLIENTE
Pontificia UCV
Licencia de patente
de invenci—n de la
vacuna
Empresas salmoneras
36
37
4.3. IMPACTOS PRODUCIDOS Y ESPERADOS 14
4.3.1. Impactos Económico-Sociales
Con este proyecto Fondef I+D se desarrolló una nueva alternativa de vacuna,
proteína recombinante, que registra un grado de protección importante contra P.
salmonis, bacteria que afecta letalmente a los salmónidos en proceso de cultivo
en Chile. Es un producto que puede ser competitivo en el mercado si su eficacia
se mejora con un coadyuvante potenciador de esta funcionalidad. Sin embargo,
después de haber finalizado esta I+D, es un producto que ha perdido su grado
original de atractividad como negocio, porque son varias las vacunas que se han
incorporado contra esta enfermedad en estos tres últimos años. Por otra parte, la
divalencia es un atributo rápidamente sustituido por vacunas tri y tetravalentes.
Considerando que es una vacuna con protección similar a otras experimentales,
es un producto que puede llegar al mercado, debiendo para ello buscar asociarse
con una empresa farmacéutica que posea un coadyuvante igualmente competitivo
y que tenga en desarrollo una versión tetravalente, con el propósito de ganar
vigencia tecnológica y comercial en la industria salmonera.
En caso de introducir este producto en la industria farmacéutica, podría
posicionarse en un segmento de mercado para evitar una mortandad global que
tiene un costo de US$105 millones para la industria, debiendo adicionarse la
sustitución de US$9 millones en antibióticos. En resumen la aplicación de esta
vacuna podría llegar a significar la recuperación de peces que a precio de venta
representaría unos US$408 millones. De este total, se estima que esta vacuna
podría abordar un 15% del mercado, lo que representado en términos de estas
mismas partidas económicas, corresponderían a un impacto evaluado en US$15
millones de mortalidad, US$1,35 de antibiótico y US$61,2 millones de venta
respectivamente.
14
Describa cómo los resultados del proyecto generarán impactos en cada una de las áreas que se indican a continuación. Para cada tipo de impacto, establezca: a) cuáles ya se han producido o se están produciendo; b) cuáles se producirán en el futuro. Señale las principales acciones que serán implementadas en cada área para asegurar la obtención de estos impactos. 38
4.3.2. Impactos Científico-Tecnológicos
El proyecto FONDEF entregó la oportunidad de formación a más de 7 personas en el
ámbito de la biología Molecular referida al desarrollo de vacunas recombinantes. Esto se
ve reflejado en la realización de tesis doctorales y de pre-grado, además de la
incorporación de un académico a la planta de profesores del Instituto de Biología de la
PUCV.
PUBLICACIONES
1. Marshall, S.H., P. Conejeros, M. Zahr, J. Olivares, F. Gómez, P. Cataldo and V.
Henríquez. 2007. Immunological characterization of a bacterial protein isolated
from salmonid fish naturally infected with Piscirickettsia salmonis. Vaccine 25;11:
2095-2103.
2. Cadoret, J.P., M. Bardor, P. Lerouge, M. Cabigliera, V. Henríquez and A. Carlier.
2008. Les microalgues comme usine cellulaires productrices de molécules
recombinantes. Médecine Sciences 24;4:375-382.
3. Verónica Rojas, M., Olivares P., J., del Río, R., Marshall, S.H. 2008
Characterization of a novel and genetically different small infective variant of
Piscirickettsia salmonis Microbial Pathogenesis 44 (5), pp. 370-378.
ORGANIZACIÓN DE CONGRESOS Y OTROS EVENTOS
1. Organización del Simposio Internacional de Biotecnología Marina en el
Hemisferio Sur “Waking up a Sleeping Beauty”. Viña del Mar, Diciembre 2007.
Patrocinado por nuestra universidad. Este evento trajo a científicos expertos
2. Curso de vacunación de peces (PUCV-PHARMAQ): Este curso fue realizado a
fines del año 2006 en la Piscicultura Río Blanco (Los Andes)
39
4.3.3. Impactos Institucionales
• Desarrollo y aplicación de nuevas tecnologías en diversas áreas, que conduzcan
a una diferenciación y liderazgo en materias de innovación.
• Permite a la universidad mantener una línea de investigación biotecnológica.
• Permite una implementación tecnológica en equipos de avanzada para el
laboratorio de genética e inmunología molecular, inyectando importantes aportes
para su desarrollo.
• La investigación desarrollada por la Universidad, permite la generación de tesis
de pre y post grado de alumnos, que conducen a la creación de bibliotecas de
investigación, producto al trabajo realizado en el proyecto.
• Relación directa y constante con las empresas socias del proyecto generando un
fuerte vinculo entre ellas, que provoca en definitiva una sinergia empresarial
4.3.4. Impactos Ambientales
El presente proyecto, no presenta impactos ambientales, por cuanto no se realizaron
ensayos masivos en el mar.
4.3.5 Impactos Regionales
V REGION
1. Formación de profesionales y académicos en el ámbito de la Biología Molecular
2. Desarrollo de vacunas recombinantes
X REGION
1. Vinculación ciencia empresa (PUCV- ADL; PUCV-Marine Harvest; PUCVSERNAPESCA)
40
V.
ANEXOS
ANEXO 1. EVALUACIÓN ECONÓMICA SOCIAL Y PRIVADA 15
A1.1. Evaluación Económica Social
A1.1.1. ¿Qué productos, servicios o procesos se ha considerado en la
evaluación económica social?
Para la evaluación económica social de ha considerado el producto vacuna
divalente contra Piscirickettsiosis y Necrosis Pancreática Infecciosa, y la vacuna
monovalente para las enfermedades anteriormente nombradas pero
individualmente. Para evaluar la disminución en costos que se produce al utilizar la
vacuna divalente antes que las monovalentes para ambas enfermedades.
El producto vacuna divalente fue desarrollado por Pharmaq A.S en conjunto con la
Universidad Católica de Valparaíso.
Actualmente en el mercado se presentan productos sustitutos como:
Provisional
1739-BP
1740-BP
1742-BP
Nombre del Producto
Vacuna inactivada contra
Furunculosis atípica,
Vibriosis y Necrosis
Pancreática Infecciosa,
Emulsión inyectable. Alpha
Ject 3-3
Vacuna inactivada contra
Vibriosis, Furunculosis y
Necrosis Pancreática
Infecciosa, Emulsión
inyectable Compact VIAS
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Empresa
Comercializadora
Especie de
destino
Pharmaq AS Chile
Ltda.
Salmón del
Atlántico
Intervet Chile Ltda
Salmón del
Atlántico
Pharmaq AS Chile
Ltda.
Salmón del
Atlántico Trucha
15
Utilizando el formato de evaluación desarrollado para la presentación inicial del proyecto, recalcule los indicadores económicos del proyecto con base en los resultados obtenidos, el análisis del estado del arte y las condiciones económicas actuales. Analice las principales diferencias con la evaluación ex–ante (Informe de síntesis enviado a las instituciones en la adjudicación). Informe los indicadores obtenidos. Incluya los detalles de la evaluación económica social, económica privada y memoria de cálculo utilizada. Esta evaluación debe ser consistente con los impactos indicados en el punto 4.3. (INCLUYA FORMATO ACTUALIZADO QUE SE UTILIZA EN LA POSTULACION) 41
Infecciosa, Emulsión
inyectable Alpha Ject 1000
arcoiris
1743-BP
Vacuna inactivada contra
Piscirickettsia salmonis,
Emulsión inyectable Agrovac
SRS
Agrovet Ltda.
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Salmón
chinook Trucha
arcoiris
1761-BP
Vacuna inactivada contra
Vibriosis y Necrosis
Pancreática Infecciosa,
Emulsión inyectable Alpha
Ject 2-3
Pharmaq AS Chile
Ltda.
Salmón del
Atlántico
1762-BP
Vacuna contra Necrosis
Pancreática Infecciosa,
Emulsión inyectable
Compact IPN
Intervet Chile Ltda
1763-BP
Vacuna para la prevención
del Síndrome Rickettsial del
salmón, Emulsión inyectable
Rickettvac Oleo
Recalcine S.A.
1768-BP
Vacuna subunitaria contra el
Síndrome Rickettsial del
Salmón Bayovac SRS
Bayer S.A.
1776-BP
Vacuna inactivada para la
prevención de la Necrosis
Pancreática Infecciosa,
Emulsión inyectable
Recalcine S.A.
1782-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Infecciosa, Emulsión
inyectable Aquavac IPN
Schering Plough
Cia. Ltda.
1783-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Infecciosa, Emulsión oral
Aquavac IPN Oral
Schering Plough
Cia. Ltda.
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Trucha
arcoiris
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho)
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Trucha
arcoiris
Salmón del
Atlántico Trucha
arcoiris
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Trucha
arcoiris
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Trucha
42
arcoiris
Novartis Chile
S.A.
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Trucha
arcoiris
Novartis Chile
S.A.
Salmón del
Atlántico
Novartis Chile
S.A.
Salmón del
Atlántico
1843-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Infecciosa, Emulsión
inyectable Agrovac IPN
Agrovet Ltda.
Salmón del
Atlántico Salmón
del Pacífico
(coho) Salmón
chinook Trucha
arcoiris
1853-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreatica
Infecciosa, Suspensión
acuosa para inmersión IpeVac Inmersión
Veterquímica
Ltda.
Salmón del
Atlántico
1785-BP
1808-BP
1809-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Infecciosa, Emulsión
inyectable Birnagen Forte
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Infecciosa y Vibriosis,
Emulsión inyectable
Birnagen Forte V
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática
Infecciosa, Vibriosis y
Furunculosis, Emulsión
inyectable Birnagen Forte
AV
1854-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreatica Infecciosa,
Emulsión inyectable
Centrovet
Ltda.
Salmón del Atlántico
Salmón del Pacífico
(coho) Salmón
chinook Trucha
arcoiris
1867-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática Infecciosa,
Vibrio ordalii y Piscirickettsia
salmonis, Emulsión inyectable
Novartis
Chile S.A.
Salmón del Atlántico
43
Birnagen Forte 3
Vacuna inactivada contra
1868-BP Síndrome Rickettsial del Salmón,
Emulsión inyectable
1885-BP
1898-BP
1899-BP
1914-BP
1915-BP
1930-BP
Centrovet
Ltda.
Vacuna inactivada contra
Furunculosis atípica, Vibriosis,
Síndrome Rickettsial del salmón Pharmaq AS
y Necrosis Pancreática
Chile Ltda.
Infecciosa, Emulsión inyectable.
Alpha Ject 4-1
Vacuna inactivada contra
Síndrome Rickettsial del Salmón,
Agrovet
Necrosis Pancreática Infecciosa,
Ltda.
Vibriosis, Furunculosis, Emulsión
inyectable Agrovac 4
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática Infecciosa,
Vibrio ordalii, Furunculosis
Novartis
atípica y Piscirickettsia salmonis,
Chile S.A.
Emulsión inyectable Birnagen
Forte 4
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática Infecciosa
Novartis
y Piscirickettsia salmonis,
Chile S.A.
Emulsión inyectable Birnagen
Forte 2
Vacuna inactivada contra
Síndrome Rickettsial del Salmón,
Agrovet
Necrosis Pancreática Infecciosa,
Ltda.
Vibriosis, Emulsión inyectable
Agrovac 3
Vacuna inactivada contra
Vibriosis, Síndrome Rickettsial
Pharmaq AS
del salmón y Necrosis
Chile Ltda.
Pancreática Infecciosa, Emulsión
inyectable. Alpha Ject Micro 3
Salmón del Atlántico
Salmón del Pacífico
(coho) Salmón
chinook Trucha
arcoiris
Salmón del Atlántico
Trucha arcoiris
Salmón del Atlántico
Salmón del Atlántico
Salmón del Pacífico
(coho) Trucha
arcoiris
Trucha arcoiris
Salmón del Atlántico
44
1936-BP
1956-BP
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática Infecciosa,
Vibrio ordalii y Piscirickettsia
salmonis, Emulsión inyectable
Vacuna inactivada contra
Necrosis Pancreática Infecciosa
y Piscirickettsia salmonis,
Emulsión inyectable
Centrovet
Ltda.
Salmón del Atlántico
Centrovet
Ltda.
Salmón del Atlántico
De las vacunas ubicadas en la tabla, la de mayor aceptación actualmente es
ALPHA JECT 4-1, desarrollada y producida por la farmacéutica de origen noruego
PHARMAQ AS y que pasó a ser la primera vacuna, que posee cuatro antígenos
(contra IPN, SRS, Vibrio Ordalii y Aeromonas).
A1.1.2. ¿Cuáles son los beneficios y tipo de impactos económico-sociales
cuantificados?
a) Indique cuáles serán los principales ítems de beneficios a nivel país.
El uso de la vacuna divalente por parte de las empresas chilenas productoras de
salmón, presenta beneficios a nivel país, por ser el sector acuícola un sector clave
en la economía chilena.
Al comenzar con la utilización de esta vacuna se obtiene una reducción de la tasa
de mortalidad de un 15-10% a un 5%, lo que implica una disminución en los costos
de producción de salmones, y por ende un aumento en la rentabilidad de las
salmonicultoras.
Entre los beneficios cuantificables que el país percibe gracias a la creación de la
vacuna divalente se encuentran:
ƒ
ƒ
ƒ
Drástica Disminución de Costos, gracias a un control mas eficiente de las
enfermedades, abarcando la cura de dos enfermedades en una misma
vacuna, por lo cual se reducen los costos de aplicación además de los
asociados a la necesidad de pre-smolt, la menor cantidad de alimento y los
costos de remoción de peces muertos.
Incremento Sostenido en Niveles de Rentabilidad, ya que al implementar la
utilización de esta vacuna en la industria, esta se ve beneficiada con
aumentos sostenidos en la rentabilidad. Se espera que para el 2010 el
sector debe generar ingresos del orden de US$3000 millones.
Mejor Utilización de los Recursos Naturales, al evitar la pérdidas de presmolt muertos y disminuir el exceso de crianza que se genera por la
posibilidad de muerte por enfermedades.
45
ƒ
ƒ
Disminución de contaminación.
Preservación y protección de un sector clave de la economía nacional
b) Indique cuáles son las variables más críticas
Las que serán las mismas que Ud. deberá destacar en la planilla de evaluación
económica-social en la sección correspondiente. Indique los valores máximos, los
valores mínimos y los valores más probables (que pueden ser iguales al máximo o
mínimo). Recuerde que los flujos deberán desarrollarse mediante fórmulas que
estén referidas a las celdas que contienen los valores más probables.
Las variables críticas se vinculan con los beneficios esperados a nivel nacional por
el uso de la vacuna.
Estas variables son:
ƒ Tasa de Mortalidad Esperada con el uso de la Vacuna Divalente, la cual se
espera que disminuya con la utilización de la nueva vacuna, la estimación
es de un 5% con un máximo de 6% y mínimo de 3%.
ƒ Tasa de Mortalidad Esperada con el uso de la Vacuna Monovalente,
utilizada para la comparación de la situación con proyecto con respecto a la
sin proyecto.
Esta tasa es de un 10% con un máximo de 18% y un mínimo de 9%.
ƒ Costo de la Vacuna Divalente, el precio de esta depende del precio de la
vacuna monovalente, por lo cual se estima un precio por vacuna divalente
de 15 centavos de dólar por unidad, cuyo rango puede moverse entre los
14 y 17 centavos.
ƒ Costo de la Vacuna Monovalente, el costo es de 12, y puede moverse en
un rango de 8 y 13 centavos de dólar.
c) Indique cuál es la velocidad de logro del impacto.
Como esta evaluación está hecha a contar del año 2008 en adelante, el proyecto
ya presenta impactos a nivel país, en el área de salmonicultura, disminuyendo
pérdidas económicas por muerte de peces. Además esto provoca un impacto
ambiental positivo disminuyendo el número de smolt requeridos. Siendo necesario
un menor nivel de explotación del recurso natural.
46
A1.1.3. ¿Cuál es el horizonte de evaluación y la curva de adopción?
Con respecto a esta evaluación, se espera que a partir del periodo cero la tasa de
captura de mercado para la adopción de la tecnología, proveniente del horizonte
en que se evaluó el proyecto con anterioridad sea de un 65% y en el periodo 1
también. Luego se espera un aumento en el 8% al periodo siguiente, seguido por
uno del 7%, el cual se mantendrá por los siguientes 8 periodos de evaluación.
Manteniéndose en ese nivel puesto que se espera que las nuevas investigaciones
generen un producto mejorado al de la vacuna divalente.
A1.1.4. ¿Cuál es la situación actual? (En la cual no se consideran
proyecciones con el proyecto).
El país pierde anualmente cerca de US$100 millones solo por concepto de
enfermedades mal tratadas en salmónidos, con tasas de mortalidad en los peces
smolt del orden del 15 a 10%.
Tal situación es en extremo preocupante, no sólo por el hecho de las pérdidas que
año a año va registrando la industria, sino por el hecho de riesgos de descontrol
de enfermedades que terminen por provocar cuantiosos daños a la industria local
de salmónidos, tal como ocurrió en Noruega el año 1998 durante el cual se
sufrieron pérdidas por 40 mil toneladas, situación que impactó con fuerza en la
industria, destruyendo empleos y provocando quiebra de empresas.
Actualmente en el país existen una serie de métodos para la prevención y control
de ciertas enfermedades, los que han permitido mantener las actuales tasas de
mortalidad en los parámetros señalados anteriormente. Tales métodos de
detección son insuficientes para controlar las enfermedades puesto que no
mantienen niveles de pérdida aceptables para la industria, situándose las vacunas
monovalentes como las alternativas más adecuadas hasta ahora para hacer frente
a la IPN y Piscirickettsia.
Las proyecciones del crecimiento de exportaciones en la industria señalan un
crecimiento sostenido en la cantidad de exportaciones hasta el 2018, situación que
frente a las tasas actuales de mortalidad requerirá altos niveles de gasto en presmolts que no llegarán a la edad adulta, incrementándose el nivel de pérdida a la
par del incremento en el nivel de exportaciones, proyectándose pérdidas de 200
millones de dólares para el último año de evaluación.
47
Actualmente se presentan en el mercado productos mejorados con respecto al
generado con el apoyo Fondef, estos productos abarcan una mayor cantidad de
patógenos que el producto inicial, es de esperar que con los avances las mejoras
a este tipo de producto sigan en constante crecimiento.
A1.1.5. ¿Cuál será la situación futura a causa de la ejecución del proyecto?
Esta vacuna contra SRS en salmónidos se encuentra en un contexto nuevo para
transferirla a la industria farmacéutica. Se trata del desarrollo de una monovalencia
a la que se tendrá que adicionar otras funciones antimicrobianas para formular un
único producto que sea polivalente. Además, al no participar Phramaq en esta
implantación en el mercado, el trabajo de transferencia tendrá que realizarse con
otra compañía sin el liderazgo de esa empresa se origen Noruego. En
consecuencia la repercusión en la industria salmonera será menor a lo establecido
originalmente, situación que también se visualiza a nivel de negocio privado. Con
un esfuerzo de introducción de este producto en el mercado podría lograrse un
15% de participación, lo que es equivalente a la venta de 9,75 millones de dosis,
equivalente a ingresos de US$1 millón para la empresa que la comercilice. Esto
contribuirá en ocasionar una disminución de mortalidades de peces evaluadas en
US$65 millones.
A1.1.6. ¿Cuáles son los beneficios económico-sociales no cuantificados?
Entre los beneficios cualitativos económico-sociales que conlleva este proyecto
podemos encontrar:
•
•
•
•
Reducción de la posibilidad de consumir salmónidos con residuos provenientes
del uso de antibióticos, procurando una mejor salud para Chile y el mundo
consumidor de salmónidos.
Aumento en la imagen del producto nacional frente a los mercados
internacionales, debido al impacto positivo que provoca en la calidad de los
salmónidos el uso de la vacuna divalente. Logrando de esta forma superar
barreras de entrada a la exportación en ciertos países con requisitos mayores
en los productos que importan.
Posicionamiento de la industria nacional en términos de competitividad,
asumiendo un liderazgo en la industria mundial. Gracias a los puntos anteriores
con los cuales el producto chileno obtendrá mejores calificaciones,
aumentando progresivamente la cuota de mercado en el mercado exportador
mundial de salmónidos.
Conocimiento en el desarrollo de la vacuna divalente que pueda ser utilizado
para el desarrollo de soluciones hacia especies distintas a los salmónidos.
48
•
Aumento en la calidad de vida de la comunidad que gira en torno a la industria
salmonera, y a la sociedad en general debido a los importantes incrementos en
las utilidades del sector.
A1.1.7. ¿Cuál es el impacto regional del proyecto?
Este proyecto se realizó en la quinta región de Chile, pero el impacto se ve
representado en las zonas de cultivo a las cuales pertenecen las empresas de alta
importancia en la acuicultura del país, estas están ubicadas principalmente en la
décima región.
A1.1.8. ¿Cuáles son los indicadores de la evaluación económica-social?
VAN (8%)
millones de pesos
$765.910
TIR
%
126%
A1.2. Evaluación Económica Privada
A1.2.1. ¿Cuáles son los negocios considerados en la evaluación económica
privada?
a)
Negocio Tecnológico para la Institución y Contrapartes (Considere el
principal)
El proceso de trasferencia fue efectuado por la Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso, por medio de la vacuna divalente. Esta transferencia se realizó por
medio de CT Valparaíso hacia la empresa productora final de la vacuna Pharmaq
AS.
La transferencia se realiza por medio de licencias de utilización por lo cual la
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso recibirá un royalty del 3% anual
sobre las ventas de la vacuna divalente que realice la empresa productora.
Este negocio reporta a la Universidad un VAN de 15.500 millones de pesos.
b) Negocio Productivo o de servicio (Considere el principal)
Este negocio cuenta con un agente intermedio de investigación que es la Pontificia
Universidad Católica de Valparaíso, pero la empresa que comercializará, producirá
y distribuirá los productos en Pharmaq A.S.
49
El agente productor, poseerá un negocio de continuidad en el tiempo, a pesar de
que el producto pueda variar por nuevas investigaciones en la materia, con las
cuales se puede crear un producto mejorado y por ende de mayor aceptación en
el mercado además de que puede implicar mejoras a la economía nacional.
Con respecto a la evaluación, en esta se han considerado las inversiones iniciales
otra vez realizadas, en la menor magnitud, ya que se ha asociado a reinversiones
en maquinarias, modificaciones, etc.
Como se dijo con anterioridad, el proyecto comenzó a generar beneficios el 2007,
por lo cual se espera que la cuota de mercado adquirida en esta primera instancia
vaya en aumento y así mismo el reconocimiento del producto.
A1.2.2. ¿Qué horizonte de evaluación se ha considerado?
a) Negocio Tecnológico para la Institución
La continuidad del proyecto será evaluada a un plazo de 10 años a partir del 2008,
en los cuales se puede ver con claridad la entrega del royalty por parte de
Pharmaq A.S y los beneficios que trae esto a la Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso.
b) Negocio productivo
El negocio productivo ha sido evaluado a 10 años, de manera de poder observar
las variables dentro de un rango adecuado al comportamiento histórico de las
enfermedades asociadas al proyecto.
A1.2.3. ¿Cuáles son los indicadores económicos del negocio tecnológico
principal para la institución de I&D?
VAN
MM$15.420
Tasa de
descuento
12%
TIR
%
169%
A1.2.4. ¿Cuáles son los indicadores económicos del negocio productivo o de
servicios principal para un agente intermedio tipo?
VAN
MM$23.498
Tasa de
descuento
12%
TIR
%
486%
50
A1.2.5. ¿Cuáles son los indicadores económicos del negocio productivo o de
servicios principal para la suma de todos los posibles agentes intermedios?
VAN
MM$22.316
Tasa de
descuento
12%
TIR
%
832%
A1.3. Memorias de Cálculo.
A1.3.1. Memoria de cálculo de la evaluación económico-social.
Situación Sin Proyecto
a) Identificación de Variables Críticas
Las variables críticas asociadas al proyecto son:
•
•
•
•
Tasa de mortalidad esperada con la utilización de vacuna divalente, cuyo valor
fluctúa entre el 3% y el 6%, con un escenario mas probable de 5%.
Tasa de mortalidad esperada con la utilización de vacuna monovalente, cuyo
valor fluctúa entre 9% y 18% con un escenario más probable de 10%.
Costo vacuna divalente (dependencia directa del costo de la vacuna
monovalente), el costo de esta fluctúa entre los 14 y 17 centavos de US$, con
un escenario más probable de 15 centavos de US$.
Costo vacuna monovalente, cuyo costo fluctúa entre los 8 y 13 centavos de
US$ con un escenario más probable de 12 centavos de US$.
b) Cálculo de Ingresos:
Los ingresos fueron calculados como la producción de salmónidos en kilogramos,
multiplicado por el precio de venta de 4,2 US$/kilo, llevado todo lo anterior a
moneda nacional. La información de la producción de salmónidos a nivel nacional
y el precio de venta del kilo de salmón, proviene de Salmón Chile.
51
c) Cálculo de Costos:
Para el cálculo de los costos se consideraron:
• costo presmolt, el cual es 1,5US$/pez
• costo de los alimentos, el cual es de 1,2 kg/kg salmónido, a 1.1 US$/kg
• costo de antibióticos, el cual es 0,14 US$/kg
• costo de la remoción y recolección de peces muertos, esto es 0,07
US$/kg muerto
• costo vacunas individuales es de 0,12 US$ por pez, y por 2 veces para
satisfacer la necesidad de prevenir ambas enfermedades
• costo de suministro de vacunas, este es 0,02 US$ por pez y por 2 veces ya
que son dos vacunas
• costos adicionales, ya sean equipamientos, anestesia, etc. cuyo costo es
0,01 US$ por pez y por 2
Los costos utilizados anteriormente como el presmolt, alimentos y costo vacunas
monovalentes fueron obtenidos de Salmón Chile.
Los otros costos asociados a la vacuna monovalente y su aplicación fueron
obtenidos de Pharmaq.
d) Cálculo de Inversiones:
En este caso no se consideran inversiones, ya que son inexistentes en el caso de
la evaluación social.
Situación Con Proyecto
a) Identificación de Variables Críticas:
Las variables críticas asociadas al proyecto son:
• Tasa de mortalidad esperada con la utilización de vacuna divalente, cuyo
valor fluctúa entre el 3% y el 6%, con un escenario más probable de 5%
• Tasa de mortalidad esperada con la utilización de vacuna monovalente,
cuyo valor fluctúa entre 9% y 18% con un escenario más probable de 10%
• Costo vacuna divalente (dependencia directa del costo de la vacuna
monovalente), el costo de esta fluctúa entre los 14 y 17 centavos de US$,
con un escenario más probable de 15 centavos de US$
52
• Costo vacuna monovalente, cuyo costo fluctúa entre los 8 y 13 centavos de
US$ con un escenario más probable de 12 centavos de US$.
b) Cálculo de Ingresos:
Los ingresos fueron calculados como la producción de salmónidos en kilogramos,
multiplicado por el precio de venta de 4,2 US$/kilo, llevado todo lo anterior a
moneda nacional. La información de la producción de salmónidos a nivel nacional
y el precio de venta del kilo de salmón, proviene de Salmón Chile. El cálculo es el
mismo que para la situación sin proyecto, puesto que la evaluación se orienta a la
reducción de costos, y por esto los ingresos se mantienen constantes.
c) Cálculo de Costos:
Para el cálculo de los costos se consideraron:
• Costo presmolt de 1,5us$
• Costo de los alimentos, el cual es de 1,2 kg/kg salmónido, a 1.1 US$/kg
• Costo de antibióticos, el cual es 0,14 US$/kg
• Costo de la remoción y recolección de peces muertos, esto es 0,07 US$/kg
muerto
• Costo vacuna divalente, es de 0,15 US$ por pez
• Costo de suministro de vacunas, este es 0,02 US$ por pez
• Costos adicionales, ya sean equipamientos, anestesia, etc. cuyo costo es
0,01 US$ por pez
Los costos utilizados anteriormente como el presmolt, alimentos y costo vacunas
monovalentes fueron obtenidos de Salmón Chile.
Los otros costos asociados a la vacuna divalente y su aplicación fueron obtenidos
de Pharmaq.
d) Cálculo de Inversiones:
En este caso no se consideran inversiones, ya que son inexistentes en el caso de
la evaluación social.
53
A1.3.2. Memoria de cálculo de la evaluación económica privada
Negocio Tecnológico para la Institución (Considere el principal)
a) Cálculo de Ingresos
Los ingresos están dados por el royalty que obtiene la institución, el cual
representa un 3% de las ventas. Estas ventas están asociadas al análisis de
demanda de la vacuna divalente
b) Cálculo de Costos
Los costos en esta etapa no hay costos involucrados ni fijos ni variables
c) Cálculo de Inversiones
La institución no realiza inversiones en esta etapa
Negocio Productivo o de Servicios Tecnológicos (Considere el principal)
a) Cálculo de Ingresos
Los ingresos provienen del análisis de demanda, para el cual se consideraron los
porcentajes de demanda correspondientes a la evaluación inicial del proyecto.
Alcanzando en el año 2014 un 80% el cual se mantendrá constante en los años
siguientes
b) Cálculo de Costos
Los costos fijos están asociados a las remuneraciones del personal de producción,
estos son:
Remuneraciones
Personal de Producción
Gerente Producción
Jefe de Planta
Técnicos
Total
Costo
Mensual
Unitario
Número de Puestos Miles $
1
1500
1
1200
4
600
6
3300
Costo
Mensual
Total
Miles $
1500
1200
2400
5100
Costo
Anual
Total
Miles $
18000
14400
28800
61200
54
Los costos variables representan un 20% de las ventas.
c) Cálculo de Inversiones
Las inversiones para esta etapa de evaluación fueron las siguientes:
Inversión Inicial
Maquinaria,
mantenimiento
reposición
Inmobiliario
Adecuación Planta
Total
Monto Total
Miles $
y/o
200000
1000
45000
246000
Estas se consideraron para mantener el nivel de demanda del producto y las
mejoras a las inversiones realizadas al inicio del proyecto.
55
ANEXO 2. PLAN
DE
MANTENCIÓN
DE
HABILITADA, BIENES, EQUIPOS
ADQUIRIDOS 16
LA
INFRAESTRUCTURA
Y OTROS ELEMENTOS
A2.1. Listado de obras de infraestructura 17
Nombre y
descripción de
Nº
la
infraestructura
Usos
Unidad
Institucion
al
Dirección (calle, Nº, ciudad)
Para el desarrollo del presente proyecto, no fueron contempladas obras de
infraestructura, razón por la cual, no se presenta su respectivo detalle.
16
Identifique cada obra de infraestructura y cada equipo cuyo valor facturado sea mayor a US$5.000. 17
Listado definitivo, identificando la obra, descripción, superficie construida, la unidad institucional responsable y la dirección del lugar en que se encuentra
56
A2.2. Listados de bienes (equipos y otros) 18
Nº Nombre del equipo
Marca
1 Bio 1 D Incluye PC
sistema de revisión
de células
2 Transiluminador Ecx
20 m con filtro de
luz blanca
3 Sistema de Foto
Captura
De transluminador –
bio.print 008
4 Agitador Orbital
VILBER
LOURM
AT
VILBER
LOURM
AT
VILBER
LOURM
AT
5
6
7
8
9
10
NEW
BRUNS
WICK
Accesorio
para NEW
Unidad de control y BRUNS
Energía
WICK
Sistema
THERM
Centrifugación
O
Incluye Rotor y 15 JOUAN
MI Y Rotor Swin
Liofilizador
termo THERM
Jouan
O
Unidad
refreg JOUAN
LL3000
Sistema
NEW
Biofermentación
BRUNS
Bioflol
WICK
Detector
PH/ NEW
Oxigeno con bomba BRUNS
WICK
Centrifuga
THERM
refrigerada Grai
O
Seri
e
Modelo
C24
Nº
inventario
Precio de
compra (MM$)
58696-53
$3.570.000
58695-61
$1.855.742
58698-37
$4.165.000
59099-33
$5.355.000
59091-L0
$5.980.000
59097-5M
$5.980.000
59096-6K
$5.980.000
59095-78
$5.980.000
59094-86
$5.906.384
59092-k2
$5.980.000
18
Listado definitivo, identificando el equipo, su nombre, características y código del equipo y de inventario, precio facturado, la unidad institucional a que está asignado, el responsable de la unidad y la dirección del lugar en que se encuentra. 57
JOUAN
11 Cromo 4, Detector
de PCR en tiempo
real, CPU p.4
12 Refrigerador
13 Lector múltiple de
fluorocencia
para
microplacas
14 Autoclave
vertical
60 Lts.
15 Sistema
de
incubación
refrigerada
con
cubierta
FENSA
THERM
O
JOUAN
59098-41
$23.166.675
FR 3200 59016-9M
59668-53
$141.690
$14.518.000
60911-5M
$$2.687.020
59092-K2
$5.980.000
LL3000
(Continuación tabla anterior)
Unidad
Dirección (calle N°, ciudad)
Nº
Usos 19
Institucional
Laboratorio
de genética e
INVESTIGAC
1
inmunología Av. Brasil 2950, Valparaíso
IÓN
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
INVESTIGAC
Av. Brasil 2950, Valparaíso
2
inmunología
IÓN
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
INVESTIGAC
3
inmunología Av. Brasil 2950, Valparaíso
IÓN
molecular,
PUCV
Laboratorio
INVESTIGAC
4
de genética e Av. Brasil 2950, Valparaíso
IÓN
inmunología
19
Usos dentro de las líneas de Investigación y Desarrollo del proyecto: (1) Docencia, (2) Investigación, (3) Servicios, (4) Capacitación,(5) Asesorías , Otros describir 58
molecular,
PUCV
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Laboratorio
de genética e
INVESTIGAC
5
inmunología
IÓN
molecular,
PUCV
6
INVESTIGAC
IÓN
7
INVESTIGAC
IÓN
9
INVESTIGAC
IÓN
10
INVESTIGAC
IÓN
11
INVESTIGAC
IÓN
12
INVESTIGAC
IÓN
13
INVESTIGAC
IÓN
Laboratorio
de genética e
inmunología
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
inmunología
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
inmunología
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
inmunología
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
inmunología
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
inmunología
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Av. Brasil 2950, Valparaíso
59
inmunología
molecular,
PUCV
Av. Brasil 2950, Valparaíso
Laboratorio
de genética e
INVESTIGAC
14
inmunología
IÓN
molecular,
PUCV
Laboratorio
de genética e
INVESTIGAC
15
inmunología Av. Brasil 2950, Valparaíso
IÓN
molecular,
PUCV
A2.3. Plan de mantenimiento 20
La Universidad cuenta con una póliza general para todos aquellos equipamientos
contemplados en el desarrollo y ejecución de los proyectos. Cabe destacar, que la
Universidad renueva en forma anual dicha póliza, con ello asegura que todo el
equipamiento adquirido, cuente con las coberturas necesarias ante cualquier
eventualidad de siniestro.
Una vez terminada la ejecución del proyecto, la póliza de garantía por el
equipamiento adquirido sigue vigente hasta la total tramitación del finiquito del
proyecto y hasta poner el equipamiento al inventario de activos fijos de la
Universidad, luego de ser traspasado el comodato de éste.
El plan de mantención del equipamiento de Laboratorio se encuentra a cargo de la
Dirección de Investigación de la PUCV., que anualmente recibe un presupuesto
para la realización de este tipo de trabajo y para enfrentar el pago de las
reparaciones de equipos, adquisición de pólizas de repuesto y encargos en el
extranjero de parte y componentes necesarios para su buen uso.
20
El contrato de finiquito incluirá el plan de mantenimiento, operación y cuidado de equipos y mantención de obras así como los seguros de rigor. El plan de mantenimiento se debe realizar según estándares establecidos por la institución. 60
En el caso preciso de mantención, la Dirección de Investigación presupuesta un
monto para que al menos una vez al año el equipamiento sea sometido a revisión,
agrupándolo por tipo y marca, y solicitando al servicio técnico autorización la visita
respectiva.
61
ANEXO 3. SOLICITUDES Y REGISTROS DE PROTECCION DE PROPIEDAD
INTELECTUAL 21
21
Copia de las solicitudes presentadas durante la ejecución del proyecto. Por ejemplo, solicitudes de patentes, registros de marca, etc. Debe corresponder con la tabla: 3.2.2. Resultados de Protección. 62
63
64
65
ANEXO 4. PUBLICACIONES Y EVENTOS 22
PUBLICACIONES
1. Marshall, S.H., P. Conejeros, M. Zahr, J. Olivares, F. Gómez, P. Cataldo
and V. Henríquez. 2007. Immunological characterization of a bacterial
protein isolated from salmonid fish naturally infected with Piscirickettsia
salmonis. Vaccine 25;11: 2095-2103.
2. Cadoret, J.P., M. Bardor, P. Lerouge, M. Cabigliera, V. Henríquez and A.
Carlier. 2008. Les microalgues comme usine cellulaires productrices de
molécules recombinantes. Médecine Sciences 24;4:375-382.
3. Verónica Rojas, M., Olivares P., J., del Río, R., Marshall, S.H. 2008
Characterization of a novel and genetically different small infective variant of
Piscirickettsia salmonis Microbial Pathogenesis 44 (5), pp. 370-378.
EVENTOS NACIONALES
VII JORNADAS DE SALMONICULTURA
Puerto Varas 25 – 27 Octubre 2006
VIGILANCIA Y GESTIÓN TECNOLÓGICA EN LA INDUSTRIA DEL SALMÓN. “Estrategias de
prevención para el desarrollo de la Salmonicultura en Chile”
Conferencia: “Que esfuerzos necesitamos en chile y cuáles son las perspectivas de las nuevas
vacunas”
Taller “Avances y perspectivas de vacunas en salmonicultura”
INTESAL 8 julio 2005. Puerto Montt, Chile.
XLVIII REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA
Pucón 13 y 16 de octubre de 2005
“Relación del proceso apoptótico con la infección del patógeno intracelular Piscirickettsia salmonis
en una línea celular de macrófagos de peces”. Rojas, M.V., Paredes, R., Galanti, N. y Marshall, S.
22
Copia de todas las publicaciones científico‐tecnológicas, eventos, tesis, etc. realizadas a partir de las actividades desarrolladas por el proyecto. Debe corresponder con la tabla 3.2.4. Resultados de Producción Científica. Inserte una lista con estructura bibliográfica por cada categoría y señale si se encuentra en prensa: Presentaciones a eventos nacionales, Presentaciones a evento internacionales, Artículos científicos en revistas nacionales, Artículos científicos en revistas internacionales de corriente principal, Libros, Capítulos de libros, Tesis Magíster, Tesis Doctorado, Proyectos de Título, Cooperación internacional recibida o entregada, Nuevos proyectos generados, Otras publicaciones científicas. 66
XXX REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Chillán Septiembre 2007
“Validación de genes de referencia para evaluar la expresión diferencial de genes en cultivos
celulares infectados con Piscirickettsia salmonis”. Peña, A., Rojas, V., Gonzalez, M., Marshall, S.
XXX REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Chillán Septiembre 2007.
“Piscirickettsia. salmonis induce la apoptosis de macroafagos y monolitos de salmon en cultivo”
Rojas, V., R., Galanti, N., Marshall, S.
EVENTOS INTERNACIONALES
SIMPOSIO INTERNACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA MARINA EN EL HEMISFERIO SUR
“WAKING UP A SLEEPING BEAUTY”
Viña del Mar, Diciembre 2007
IDENTIFICATION OF GENES INVOLVED IN THE RESPONSE OF SALMONIDS TO
PISCIRICKETTSIA SALMONIS BY SUPPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION
Andrea Peña and Sergio Marshall. Laboratorio de Genética e Inmunología Molecular, Pontificia
Universidad Católica de Valparaíso. Valparaíso, Chile. Contact: andrea.pena@ucv.cl
IDENTIFICATION
OF
CHLOROPLAST
SEQUENCES
FROM
THE
MICROALGAE
HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS: CONSTRUCTION OF SPECIFIC EXPRESSION VECTORS
Javier Gimpel, Carolina Escobar, Sergio Marshall and Vitalia Henríquez
Laboratorio de Genética e Inmunología Molecular. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso
DGGE AS AN ALTERNATIVE TECHNIQUE TO TYPIFY POLYMORPHISM IN EPIZOOTICDERIVED PISCIRICKETTSIA SALMONIS STRAINS. ADVANTAGES OVER REAL TIME PCR
PROCEDURE.
Gómez D, Marshall S. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Valparaíso. Chile. Contact:
danielagomeza@gmail.com
EVALUATION OF IMMUNOGENIC POTENTIAL OF NEW ANTIGENIC PROTEINS USING
PISCIRICKETTSIA SALMONIS NATURALLY INFECTED FISH
Fernando Gómez, Jorge Olivares and Sergio Marshall. Laboratorio de Genética e Inmunología
Molecular, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.
Contacto: Fernando Gómez fernando.gomez@ucv.cl
CHARACTERIZATION OF A NOVEL AND GENETICALLY DIFFERENT SMALL INFECTIVE
VARIANT OF Piscirickettsia salmonis.
M. Verónica Rojas 1, Jorge Olivares P1, Rodrigo del Río2 and Sergio H. Marshall 1. 1 Laboratorio de
Genética e Inmunología Molecular, Instituto de Biología. 2 Laboratorio de Electroquímica, Instituto
de Química. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.
Contact: S. H. Marshall, smarshal@ucv.cl.
IUMS 2005, MICROBES IN A CHANGING WORLD
23 A 28 DE JULIO SAN FRANCISCO, CALIFORNIA, USA.
“In vitro Reassociation of Chimeric Sub Clones of a Piscirickettsia salmonis Immunogenic Protein:
Looking for efficient protection”. J. Olivares, P. Cataldo & S. Marshall.
67
FIFTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON AQUATIC ANIMAL HEALTH
2 – 6 SEPTIEMBRE 2006 SAN FRANCISCO, CALIFORNIA. USA.
“Evaluation of the Putative Immunogenic Protection of Chimeric Forms of a Surface Protein from
Piscirickettsia salmonis” . Marshall, SH & Olivares, J.
BIOTECHNOLOGY HAVANA
DECEMBER 2005. CUBA.
“A novel approach for fish vaccines: DNA shuffling over target immunogenic proteins of
Piscirickettsia salmonis ". Sergio H. Marshall and Jorge Olivares.
PROYECTOS DII
“RELACIÓN DE LA VÍA APOPTÓTICA CON LA INFECCIÓN PRODUCTIVA DEL PATÓGENO
INTRACELULAR PISCIRICKETTSIA SALMONES EN CÉLULAS DE CULTIVO DE PECES
SALMONÍDEOS”
DI 122.780/2004
SERGIO MARSHALL G., INVESTIGADOR RESPONSABLE
“EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA CHAPERONA CHAPS (60KDA) Y DERIVADOS DE
SUBGENÓMICOS DE PISCIRICKETTSIA
SALMONES SOBRE LA SOBREVIDA DE 6 LÍNEAS CELULARES DE DIFERENTES ORÍGENES
EVOLUTIVOS”
DI 122.785/2005.
SERGIO MARSHALL G., INVESTIGADOR RESPONSABLE
DESARROLLO DE UN PROCESO DE PRODUCCIÓN Y RECUPERACIÓN DE LA PROTEÍNA
ANTIGÉNICA DE PISCIRICKETTSIA SALMONIS EN CÉLULAS RECOMBINANTES DE
ESCHERICHIA COLI
DI 203.732/2003-2004.
SERGIO MARSHALL G., INVESTIGADOR RESPONSABLE
VINCULACIÓN A OTROS PROYECTOS
"DISEÑO, GENERACIÓN, EVALUACIÓN Y COMERCIALIZACIÓN DE UNA NUEVA
ALTERNATIVA PROFILÁCTICA PARA EL CONTROL Y ERRADICACIÓN DEL VIRUS DE LA
NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (IPNV) DEL CULTIVO DE PECES SALMONIDEOS"
FONDOS CORFO. 2006-2012.
SERGIO MARSHALL G., INVESTIGADOR RESPONSABLE
"SELECCIÓN DE ALELOS DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC)
PARA EL DISEÑO DE PRODUCTOS QUE INDIQUEN RESISTENCIA COMO SUSCEPTIBILIDAD
A PISCIRICKETTSIA SALMONIS EN ESPECIES SALMONIDEAS EN CULTIVO"
FONDOS CORFO 2007 - 2009
SERGIO MARSHALL G., INVESTIGADOR RESPONSABLE
PROYECTO DI-313/2007. “IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CLOROPLASTÍDICAS DE
HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS: CONSTRUCCIÓN DE VECTORES ESPECÍFICOS DE
EXPRESIÓN”
68
PROYECTO EJECUTADO E INFORMADO EN MARZO 2008. LOS RESULTADOS DE ESTE
PROYECTO FUERON PRESENTADOS EN EL PRIMER SIMPOSIO INTERNACIONAL DE
BIOTECNOLOGÍA MARINA. VIÑA DEL MAR, DICIEMBRE 2007.
PROYECTO DI-2008. MODALIDAD GRUPAL, “BIOTECNOLOGÍA ACUÍCOLA APLICADA AL
DESARROLLO DE VACUNAS ORALES EN SALMÓNIDOS”
VITALIA HENRÍQUEZ, SERGIO MARSHALL, JOSÉ GALLARDO Y PATRICIO CARVAJAL.
69
SECCIÓN ANEXOS 70
INFORME EMPRESA SGS; Evaluación de eficacia de vacunas experimentales contra Piscirikettsia salmonis 71
PAPER CIENTIFICO 72
73
74
75
76
77
78
79
80
TESIS DE TITULO
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
INFORME SOBRE ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO 152
Informe
Electroforesis en Campo Pulsado
(PFGE)
153
Practica Profesional
Dagoberto Sepúlveda A
2006
Reactivos
Buffer de Suspensión Celular
10 mM Tris, pH 7.2
20 mM NaCl
50 mM EDTA
Buffer de Lisis
10 mM Tris, pH 7.2
50mM NaCl
0.2% Deoxicolato de Sodio
0.5% Lauril Sarcosina de Sodio
1 mg/ml de lisozima
Buffer de Lavado
20 mM Tris, Ph 8.0
50mM EDTA
Buffer de Proteinasa K
100 mM EDTA, pH 8.0
0.2 % Deoxicolato de sodio
1 % Lauril Sarcosina de Sodio
1 mg/ml Proteinasa K
Agarosa 2% Low Melt
154
Procedimiento
Este protocolo está estandarizado para las diferentes cepas de E.coli.
• Realizar un cultivo de 5 ml de la cepa de E.coli deseada en medio LB con
el agente de selección adecuado
• Incubar toda la noche a 37°C a 250rpm
• Traspasar el inóculo a un matráz de 250 ml con 20 ml de caldo LB con
agente de selección adecuado, y mantener a 37°C a 250rpm., hasta que
alcance valor de OD600 entre 0.7-0.8
Nota: Esta OD se alcanza aproximadamente en 1 hora 30 minutos en la cepa Top Ten.
• Cuando el cultivo alcance la OD600 esperado, agregar cloramfenicol a una
concentración final de 180 µg/ml y continuar la incubación por 1 hora en las
mismas condiciones.
Nota: En el caso de que la cepa sea resistente a Cloramfenicol, se realizará con Tetraciclina
a una concentración final de 120µg/ml.
• Pasado este tiempo, sacar los matraces del Shaker y realizar un conteo de
las bacterias en cámara de neubauer, usando para esto 10 µl del cultivo
bacterias, 2 µlt de Tinción de cristal violeta y 188 µlt de PBS estéril,
incubandolo por 10 minutos en un tubo de 1.5 ml a temperatura ambiente.
• En un tubo estéril de 8 ml, agregar el volumen de cultivo correspondiente a
4x109 bacterias
• Centrifugar 20 minutos 3000rpm a 4°C.
• Resuspender en 500µlt de
eppendorf de 1.5ml.
Buffer de Suspensión Celular en un tubo
Nota: Esta cantidad de bacterias se utiliza cuando se desea realizar cortes con enzimas de
restricción. Cuando se desee realizar separación de plásmido sin cortes con enzimas, es
necesario aumentar la cantidad de bacterias, dependiendo del número de copias del
plásmido como también el tamaño de este.
155
Por ejemplo para pET27b+ se utiliza tres veces la cantidad de células. En el caso de plásmido de
bajo número de copias se utilizan 5 veces o más la concentración de bacterias en el procedimiento
normal.
Nota: Cuando se desea realizar un análisis rápido, la cantidad de bacterias que es requerida
se encuentra en 2.5ml de cultivo cuanto el O.D600 se encuentra entre los valores señalados.
Las variaciones de cantidades de bacterias no producen cambios en la intensidad de las
bandas en el gel .Con esto se evita el paso de conteo de bacterias
• Mantener en HeatBlock a 50°
• Mezclar con el mismo volumen (500µlt) de Agarosa Low Melt 2% a 65°C,
que es la temperatura a la cual se funde la azarosa low melt.
Nota: El volumen de resuspensión de bacterias y de la agarosa low melt puede variar
dependiendo de los plugs (cubitos) que se desean realizar. Ej: Si se quieren realizar dos
cubos, se realiza con 100 µlt de la resuspensión de bacterias y 100 µlt de azarosa low melt.
Para esto se tiene que considerar que la cantidad de células indicadas anteriormente son
tomando en cuenta que se tienen que resuspender en 500 µlt de buffer y 500 µlt de agarosa
• Homogenizar y tranferir al molde de los plug (cada plug es de 100µlt).
• Permitir de los plugs de agarosa se solidifiquen por 20 minutos a 4°C.
• Sacar los plugs con herramienta especial sobre un vidrio y cortarlos en dos
transversalmente.
• Ambos trozos del plug colocarlos en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
• Agregar 500 µlt de Buffer de lisis, manteniendo el tubo invertido en rack
especiales.
• Incubar 1 hora a 37°C.
• Transcurrido el tiempo, eliminar el buffer de lisis y agregar 700µlt de buffer
de lavador por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
Cada 10 minutos mezclar por inversiones suaves.
Nota: Manteniendo los tubos eppendorf invertidos se evita que los cubos se rompan de
forma mecánica por el extremo angosto de estos tubos.
• Este paso se repite 3 veces
156
• Agregar 500µlt de buffer de proteinasa K e incubar toda la noche a 50°C en
HeatBlock.
• Colocar los tubos invertidos a 4°C durante 20 minutos.
Nota: Este último paso se realiza como precaución para no romper los plugs con la punta de
las micropipetas.
• Lavar dos veces con buffer de lavado, de la misma forma como se hizo
anteriormnte
• Lavar con 500µlt PMSF 1mM por 1 hora a temperatura ambiente con
agitación suave (tubos invertidos).
• Realizar un último lavado con 800µlt de buffer de lavado.
Nota: Para la separación de plasmados del DNA cromosomal se utilizan los plugs hasta
este paso. En el caso de hacer un perfil de corte se tiene que continuar con el protocolo.
• Lavar los plugs con buffer de lavado 0.1X (Esto se realiza para disminuir la
concentración de EDTA, ya que este es un inhibidor de las enzimas de
restricción)
• Traspasar los plugs con mucho cuidado a un tubo eppendorf de 1.5 ml
nuevo con 300µlt del buffer correspondiente a la enzima 1X.
• Incubar 1hora a temperatura ambiente
• Agregar 40U de la enzima a cada tubo y agitar suavemente por
inversiones.
• Incubar a 37ºC por el tiempo indicado.
Nota: Se ha probado con EcoRI y con Sal I y tienen un corte eficiente en 6 horas
• Eliminar el buffer la enzima y lavar 10 min con buffer de lavado.
• Eliminar el buffer de lavado y guardar las muestras invertidas a 4ºC.
Nota: En el caso de las muestras sometidas a enzimas de restricción deben ser utilizadas en
un corto plazo (1 semanas), ya que al estar sin buffer de lavado, los plugs se deshidratan.
En el caso de que las muestras no hayan sido sometidas a cortes con enzimas de
restricción se deben guardar con buffer de lavado ya que, tanto plásmidos como el DNA
157
genómico no difunden fácilmente por la agarosa de los plugs, lo que si realizan los
fragmentos más pequeños (<50kb).
Marcadores (Ladders)
Los marcadores se realizarán para un carril
Marcador de 48kb
6µlt de marcador
19µlt de agua MQ esteril
25µlt de Agarosa 2% low melt
Marcador 10 kb
3.5µlt de marcador
21.5µlt de agua MQ esteril
25µlt de Agarosa 2% low melt
Electroforesis en campo pulsado (PFGE)
Equipo: CHEF DRIII. BIO-RAD
•
•
•
•
Preparar 2.2 litros de TBE 0.5X
De este buffer agregar aproximadamente 1.5 litros de TBE a la cámara
Encender la bomba peristáltica con una velocidad de 80.
Cuando se haya completado el circuito con TBE encender el Chiller a 14ºC
Si se prende el Chiller cuando no hay flujo de buffer porque la bomba se encuentra
apagada, se produce un congelamiento de buffer. Para resolver esto hay apagar el
Chiller y la bomba peristáltica y esperar aproximadamente 1 hora hasta que el
buffer congelado dentro del Chiller se descongele en forma natural.
• Preparar el gel de agarosa TBE 0.5X con el porcentaje adecuado
(dependiendo de la muestra que se va ha tratar)
• Agregar las muestras en los wells y presionarlos suavemente hasta el fondo
• Con agarosa low melt 1% sellar los wells de las muestras y esperar 5
minutos hasta que solidifiquen
• Colocar el Gel en la posición central dentro de la cámara cuando la
temperatura del buffer sea la adecuada
• Llenar la cámara con el buffer restante, hasta tapar el gel completamente
• Esperar 15 minutos para que el gel adquiera la temperatura del buffer
• En el panel de control seleccionar los parámetros deseados y presionar
start
158
Muestras Realizadas
10/05/05
26/4/05
Muestras
TopTen Cortada con
Sal I
Muestras
TopTen Cortada con
Sal I
Condiciones
Gel: 1.1 %
Switch Time inicial: 0.3s
Switch Time final: 0.9s
Tiempo Total: 9 hr
Voltage: 7.8 V
Ángulo: 120°
Condiciones
Gel: 1 %
Switch Time inicial: 0.3s
Switch Time final: 0.9s
Tiempo Total: 9.5 hr
Voltage: 7.6 V
Ángulo: 120°
Plásmidos
pET27b+: 5.4 kb
pRR10: 5.0 kb
pRR54: 8.3 kb
pRK290: 20kb
pRP4: 60kb
159
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Muestras
1: Cromosoma Top Ten Sin Cortar
2: Cromosoma Top Ten. cortado con
Sal I
3: Cromosoma Top Ten Sin Cortar
4: Cromosoma Top Ten. cortado con
Sal I
5: Plasmido pET27b+, 0.5µgr.
6: Plasmido pET27b+, 0.75 µgr
7: Plasmido pET27b+, 1 µgr.
8: Plasmido pET27b+, 1.5 µgr.
9: Plasmido pET27b+, 2.5 µgr.
10: Plasmido pET27b+, 5 µgr
Condiciones
Gel: 1%
Switch Time inicial: 0.3s
Switch Time final: 1.0s
Tiempo Total: 7.5 hr
Voltage: 7.6 V
Á
l 120°
26-08-05
160
1
10
2
3
4
5
6
7
8
Muestras
1: Marcador 48 kb
2: pET27b purificación miniprep
3: Cromosomal Top Ten, 1 µgr
4: Top Ten + pET27b, 1 µgr.
5: Cromosomal Top Ten 1.8µgr
6: Top Ten + pET27b, 1.8µgr
7: Cromosomal Top Ten, 2.6µgr
8: Top Ten + pET27b, 2.6 µgr
9: Cromosomal Top Ten, 3.4µgr
10: Top Ten + pET27b, 3.4 µgr
48.5kb
-------38.4kb
33.5kb--------
-------29.9kb
-
19.4kb ------17.1kb
15.0kb
12.2kb-------10.0kb--------
Condiciones
Gel: 1%
Switch Time inicial:0.3s
Switch Time final: 1.0s
Tiempo Total: 7.5 hr
Voltage: 7.6 V
Ángulo: 120º
-
8.6kb
9
--------
---------------
7-10-05
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Muestras
1: Marcador 48kb
2: Cromosomal Top Ten 3.4µgr
3: Top Ten + pET27b 3.4 µgr
4: Miniprep pRR10
5: Top Ten + pRR10 3.4 µgr
6: Miniprep pRR54
7: Top Ten + pRR54 3.4 µgr
8: Miniprep pRK290
9: Top Ten + pRK290 3.4 µgr
10: Miniprep pRP4
11: Cepa E.coli + pRP4 3.4
Condiciones
Gel: 1%
Switch Time inicial: 0 3s
8-11-05
161
1
Muestras
1: Marcador PFGE S.Cerevisiae
2: CHSE 214
3:Top Ten Cortada con Eco RI
4: P.salmonis
2 3 4
Condiciones
Gel: 1%
Switch Time inicial: 0.3s
Switch Time final: 1.0s
Tiempo Total: 14 hr
Voltage:7.6V
Ángulo: 120º
23-12-05
1 2 3 4
13
5
6
7
8
9
10 11 12
Muestras
1: Marcador 48kb
2: Cromosomal Top Ten
3: Miniprep pRR10
4: Top Ten + pRR10
5: Miniprep pET27b
6: Top Ten + pET27b
7: Miniprep pRR54
8: Top Ten + pRR54
9: Miniprep pRK290
10: Top Ten + pRK290
11: Genoma P.Salmonis
12: Genoma CHSE 214
13: Marcador 3 kb
Condiciones
Gel: 1%
Switch Time inicial: 0.3s
Switch Time final: 1.0s
Tiempo Total: 7.5 hr
Voltage: 7.6 V
Ángulo: 120º
13-01-06
162
INFORME ECONÓMICO-SOCIAL
N°4
163
PROYECTOS FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
INFORME DE AVANCE
ECONOMICO - SOCIAL
Título del Proyecto:
ELABORACION Y COMERCIALIZACION DE UNA VACUNA DIVALENTE PARA
CONTROLAR LOS AGENTES Piscirickettsia salmonis Y Virus de la Necrosis Pancreática
Infecciosa (IPNv) EN LA INDUSTRIA SALMONICULTORA CHILENA
Código del Proyecto: D03I1137
Nombre Ejecutivo(a) de FONDEF:
Nombre Director(a) del Proyecto : Sergio MARSHALL González
Institución(es) Beneficiaria(s): Pontificia Universidad Católica de Valparaíso
Empresa(s) y Otras Socias Contraparte: Pharmaq AS Chile Ltda.
Fecha de emisión : 7/5/2008
Periodo Correspondiente a Este informe:
Entre el
COMISION NACIONAL DE INVESTIGACION CIENTIFICA Y TECNOLOGICA
BERNARDA MORIN 495 • CASILLA 297-V• CORREO 21• FONO: 56 2 365 44 00 • FAX: 56 2 655 13 94 • SANTIAGO, CHILE
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INFORME DE AVANCE ECONOMICO - SOCIAL.
OBJETIVOS
El presente informe corresponde a uno de los informes específicos solicitados
para el seguimiento y control de proyectos de I+D correspondiente a períodos
anuales y con plazo de presentación máximo, según lo estipulado por FONDEF y
programado en la plataforma de S+C.
INSTRUCCIONES
Este informe se compone de dos partes:
I.- Informe de Avance de avance del proyecto:
Este es una síntesis de avance del proyecto en el cual el(la) Director(a) del
Proyecto debe enfocarse fundamentalmente a informar sobre el avance obtenido a
la fecha de entrega del informe en los temas de Transferencia Tecnológica y
Negocios, con el fin último de actualizar la información sobre el impacto
económico-social que espera lograr el proyecto.
Este Informe no debe tener más de 20 páginas de extensión con Letra tamaño 12
y espaciado sencillo.
II.- Anexos:
Corresponde a información adicional que permita sustentar o ampliar la
información entregada en el Informe de Avance de avance del proyecto. Se debe
entregar como anexo toda la información disponible con relación al avance
obtenido por el proyecto en el período que se informa. Por ejemplo: estudios de
mercado, prospecciones de mercado, encuestas, entre otros.
Los Informes de Avance Económico-Social que debe entregar el(la) Director(a) del
Proyecto deben corresponder al período comprendido entre la fecha de entrega
del último informe de avance económico social y el actual. Sólo el primer informe
de avance debe considerar información desde el inicio del proyecto hasta la fecha
en que se entrega el informe.
Sólo debe enviarse en forma impresa a FONDEF un ejemplar del Informe de
Avance del proyecto y con el cuidado de no incluir los anexos. Además, se debe
adjuntar un CD con todo el Informe de Avance Económico-Social, el cual incluye el
Informe de Avance de Avance y esta vez con los anexos.
165
Por último, no olvide actualizar el sistema de SyC con esta información, de lo
contrario el envío del informe aparecerá como no realizado.
Tal como se indica en pantalla en el sistema de SyC, ingrese al menú de la
izquierda en la opción “Actualización de Avance” (1) y luego a “Programación
Actividades S&C” (2) como muestra la figura de más abajo, en ella se muestra la
programación de la entrega del informe de Avance E&S.
Ud. deberá ingresar en “Informar” (3) y se desplegará una nueva ventana en la
cual deberá ingresarse la “Fecha de Logro” del Informe y adjuntar sólo el archivo
correspondiente al Informe de Avance de Avance del Proyecto sin anexos.
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INFORME DE AVANCE ECONÓMICO-SOCIAL.
INDICE
I) INFORME DE AVANCE DEL PROYECTO.
1.- Información de Mercado.
1.1.- Resultados Comprometidos del Proyecto.
1.2.- Mercado Potencial de los Resultados del Proyecto.
1.3.- Mercado Objetivo de los Resultados del Proyecto.
2. Diagrama Modelo de Negocios.
3.- Plan de Acción.
3.1.- Objetivos Específicos del Proyecto.
3.2.- Actividades restantes del Proyecto.
3.3.- Estructura Presupuestaria.
3.4.- Nuevas empresas u otros socios.
3.5.- Resultados esperados.
II) ANEXOS.
167
I) INFORME DE AVANCE DEL PROYECTO.
1.- Información de Mercado.
1.1.- Describa brevemente los resultados comprometidos del proyecto para los
cuales se realizará este análisis.
El resultado que corresponde describir, es el Prototipo probado a nivel
precomercial. Con la ejecución del proyecto I+D correspondió generar una vacuna
basada en una proteína recombinante con capacidad inmunogénica demostrada
contra P. salmonis a nivel de laboratorio. Con el propósito de saber la efectividad
real que pueda llegar a tener esta vacuna aplicada a los salmones en proceso de
producción, se optó por realizar ensayos inmunización-desafío en una empresa de
servicios que garantiza la calidad de los resultados, seleccionándose SGS por
contar con una capacidad profesional, técnica y de infraestructura de alto nivel
para realizar este tipo de análisis en Chile. El ensayo en esta empresa comenzó a
realizarse a finales de octubre 2007, esperándose obtener resultados concretos en
enero de 2008. Se está trabajando con dos formulaciones, una con 25 µg y otra
con 100 µg. Las experiencias comenzaron con una inmunización en el día 1,
mientras que en el día 45 se desafiarán los peces con el patógeno P. salmonis. Si
todo este proceso se realiza sin inconvenientes, se espera que a fines de
diciembre comiencen a producirse mortandades de los ejemplares de los grupos
control.
Una vacuna como la señalada es interesante para una compañía farmacéutica
que sea líder en el mercado, si se establece que protege al menos en un 80%. La
eficiencia podría ser mejorada por la empresa farmacéutica mediante la adición de
adyuvantes seleccionados por ellas mismas. Si el producto de este proyecto
genera ese nivel de protección o superior, existirán altas probabilidades de que la
nueva vacuna pueda ser licenciada para su producción y comercialización masiva
a compañías con mayor presencia en el mercado, mientras que si resulta inferior
será más dificultosa su transferencia por esta vía, debiendo realizarse a empresas
farmacéuticas con menores expectativas de ventas dado su inferior
posicionamiento. Considerando que actualmente en el mercado existen diferentes
alternativas de vacunas contra esta enfermedad, es importante que el grado de
eficacia supere a la de los productos actualmente en el mercado. No obstante,
esta superioridad en la protección es relativa porque solamente algunas empresas
farmacéuticas proveen un producto de elevada eficacia, mientras que la mayoría
no consigue resultados competitivos, de manera que es este nicho donde la oferta
de esta vacuna podrá ser igualmente atractiva como producto para lanzarlo al
mercado, supeditándose si este fuera el caso, a que las ventas de unidades
168
resulte inferior a la máxima expectativa que corresponden aproximadamente a 45
millones de dosis al año.
1.2.- Refiérase al mercado potencial* de los resultados del proyecto.
(Identificación, cambios con respecto a la propuesta inicial, volumen, tasa de
crecimiento, otros oferentes, etc.)
Mercado potencial de los usuarios
La vacuna en desarrollo en este proyecto, está pensada para suministrarla en
salmones en su fase pre-smolt, es decir, peces que todavía se encuentran en la
fase de agua dulce y próximos a ser transferidos a agua de mar. De acuerdo a las
estimaciones originalmente proyectadas en el proyecto Fondef I+D, en el año
2008 se pronosticaba una producción total de estos ejemplares en la industria que
sería cercana a los 284 millones de peces. Al recalcular con estadísticas
actualizadas utilizando información de Salmonchile (2007), se estableció que en
este mismo año se producirían igualmente cerca de 300 millones de ejemplares,
con un crecimiento persistente en los años siguientes. A continuación se presenta
un cuadro con las estimaciones del tamaño del mercado potencial para esta
vacuna:
Proyección
(Millones de
pre-smolts)
Fondef I+D
D03I1137
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
284
326
375
413
454
500
549
169
Mercado potencial de licenciantes de la proteína para producir vacunas
Si bien este proyecto está orientado a descubrir una vacuna para emplearla en
peces, otro resultado que surge del mismo es el producto tecnológico propiamente
tal, que tiene como referencia de mercado potencial a todas las compañías
farmacéuticas que se encuentran en el negocio de la fabricación y ventas de
vacunas para la industria piscícola. En estos once años que lleva la aplicación de
esta clase de medicamento, son varias las empresas que se encuentran con
registros solicitados en el SAG y que participan activamente en este mercado en
Chile, siendo este conjunto considerado como el que potencialmente puede llegar
a adquirir licencia de esta tecnología farmacéutica una vez que se encuentre
íntegramente comprobada en su funcionalidad protectora contra la bacteria. Las
ocho empresas farmacéuticas se identifican en el siguiente cuadro:
Nº
1
2
3
4
5
6
7
8
Nombre de la empresa
Agrovet Ltda..
Centrovet Ltda.
Intervet Chile Ltda.
Laboratorios Recalcine S.A.
Novartis Chile S.A.
Pharmaq AS Chile Ltda.
Schering Plough Cía. Ltda.
Veterquímica Ltda..
* Todas estas vacunas están licenciadas por el SAG
1.3.- Refiérase al mercado objetivo* de los resultados del proyecto. (Identificación,
cambios con respecto a la propuesta inicial, volumen, tasa de crecimiento,
atractivo de mercado) y a la disposición a pagar de los usuarios finales.
El mercado total para una empresa que se dedique a fabricar y comercializar esta
vacuna, está representado para aplicarla en 284 millones de peces en el año
2008, previéndose un crecimiento promedio de un 11,6% anual. De este total, se
vacunarían hasta 90 millones de individuos contra P. salmonis e IPN, lo que
representa un 32% de la población de salmónidos producidos anualmente, siendo
equivalente al mercado potencial para este producto. Si la vacuna es introducida al
mercado por una empresa farmacéutica con un histórico liderazgo en este rubro,
es probable que tenga como segmento el 50% de este total, con ventas que
170
alcanzarían 45 millones de dosis al año. Si la licencia de este producto la adquiere
una empresa seguidora y en segunda posición en el mercado, realizaría ventas
que acumularían 18 millones de dosis anuales, mientras que la adquisición del
derecho de fabricación y comercialización por parte de una compañía situada en
tercera posición, lograría la comercialización de 7,2 millones de vacunas.
171
2. Diagrama Modelo de Negocios
Para llevar al mercado esta vacuna orientada a la protección de salmónidos en
Chile, es fundamental la concurrencia de esta propia Universidad con su equipo de
investigadores, como así también de una empresa farmacéutica que adopte la
tecnología licenciándola para poder producirla y comercializarla masivamente.
Para que llegue el producto a ser aplicado en los peces se requiere la
participación de empresas que prestan servicios de vacunación, los que finalmente
serán las atiendan a los productores de salmones y truchas.
En cuanto a modelo de negocio, se puede señalar que la Universidad hace la
venta de la tecnología mediante una licencia exclusiva de explotación productiva y
comercial de la proteína antibacteriana, la que es asumida y ejecutada por una
única compañía farmacéutica. A esta le comprarán las empresas salmoneras lotes
de dosis, debiendo contratar servicios externos de vacunación a terceros para
asegurar el suministro a los peces o recurriendo a la propia farmacéutica, si ella
extiende esta función a modo de servicio post-venta.
En este proyecto se encuentran participando la Pontificia UCV y la compañía
farmacéutica Pharmaq AS Chile Ltda., la que eventualmente puede adquirir los
derechos de explotación económica, seguramente con el interés de producir la
multivalencia de esta vacuna, originalmente pensada para P. Salmonis e IPN, pero
puede ser incrementada, porque es la modalidad más avanzada y conveniente de
aplicación del producto en los salmones y truchas, siendo una clara tendencia en
el mercado. Esto ayuda a ampliar el mercado originalmente visualizado para la
vacuna en desarrollo.
172
Esquema representativo del modelo de negocio generado en torno al
descubrimiento de la proteína para formular una vacuna para aplicar en
salmónidos:
173
3.- Plan de Acción.
En base a la información entregada en los puntos anteriores indique qué cambios
sería pertinente realizar en los siguientes aspectos:
3.1.- Objetivos Específicos del Proyecto.
Será una conclusión disponible en plazo post-proyecto el resultado de la adición
de la bivalencia originalmente planteada para esta vacuna de P. salmonis,
añadiéndole la versión IPN en la compañía farmacéutica Pharmaq. Es muy
probable que se opte por incrementar aún más la polivalencia para lanzar una
vacuna competitiva en el mercado. El lanzamiento del producto al mercado estará
supeditado a la adopción de la licencia que extienda la Pontificia UCV a una
compañía farmacéutica. La definición de la compañía farmacéutica receptora de la
misma, dependerá del grado de protección de la proteína que se logre en las
pruebas actualmente en proceso. Dependiendo del grado de protección
alcanzado, el producto será atractivo para una empresa líder, seguidora o con baja
participación en este mercado en la industria salmonera. Por este motivo, las
estrategias de comercialización de esta tecnología deberán establecerse una vez
disponible el resultado de las pruebas de eficacia esta proteína.
3.2.- Actividades restantes del Proyecto.
Finalizadas las pruebas y los desafíos realizados en la empresa SGS Chile, se
han enviado los resultados de estas acciones a la empresa Pharmaq AS en
Noruega para que indique formalmente su interés de trabajar con el fin de escalar
comercialmente esta vacuna. El informe enviado por la empresa SGS Chiloe, con
fecha 5 de mayo, permitirá que Pharmaq evalúe los niveles de eficacia del
producto e indique formalmente las acciones y pasos técnicos a seguir para el
desarrollo del producto.
3.3.- Estructura Presupuestaria (FONDEF, Institución(es), Empresas y Otras
Contrapartes) o requerimiento de nuevos aportes.
No existen cambios
3.4.- Nuevas empresas u otros socios.
No existen nuevas cambios
174
3.5.- Resultados esperados.
Los resultados obtenidos en las pruebas realizadas en SGS Chile permiten
vislumbrar un alto porcentaje de protección de una de las dosis desafiadas, que
cubre un 67%, considerando que sólo se hicieron las pruebas con el inmunógeno,
podemos asegurar estar en una situación favorable, frente a estos resultados y a
la incorporación de los coadyuvantes que la empresa interesada en el desarrollo
del producto comercial debe incorporar al producto.
Se está a la espera de una comunicación oficial de Pharmaq AS Noruega
indicando las acciones a seguir para el desarrollo técnico y comercial del producto.
175
II) ANEXOS.
Índice de Anexos.
No existen anexos asociados
176
EVALUACION DEL INFORME EyS
(Esta sección será completada sólo por el(la) Ejecutivo(a) de FONDEF o por
Evaluadores Designados para tal efecto, por favor no incluya nada aquí.)
Nombre Evaluador(a):
Fecha de Revisión
:
1-. Comentarios al Informe y Recomendaciones:
2.- Sugerencias de cambio de estado del proyecto (Marque con una X donde
Corresponda):
Normal
Alerta
Firma del (de la) Evaluador(a):
177
INFORME CIENTIFICO TECNOLÓGICO
178
PROYECTOS FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
INFORME DE AVANCE
CIENTIFICO – TECNOLOGICO
Titulo del Proyecto:
ELABORACION Y COMERCIALIZACION DE UNA VACUNA DIVALENTE PARA
CONTROLAR LOS AGENTES Piscirickettsia salmonis y Virus de la Necrosis
Pancreática Infecciosa (IPNv) EN LA INDUSTRIA SALMONICULTORA CHILENA
Código del Proyecto: D03I1137
Nombre Ejecutivo(a) de FONDEF: Esteban Zapata
Nombre Director(a del Proyecto): Sergio Marshall
Institución(es) Beneficiaria(s): Pontificia Universidad Católica de Valparaíso
Empresa(s) y Otras Socias Contraparte: Pharmaq AS Chile Ltda.
Fecha de emisión : 12/11/2007
Periodo Correspondiente a Este informe:
Entre el 1/11/2004 y el 12/11/2007
COMISION NACIONAL DE INVESTIGACION CIENTIFICA Y TECNOLOGICA
BERNARDA MORIN 495 • CASILLA 297-V• CORREO 21• FONO: 56 2 365 44 00 • FAX: 56 2 655 13 94 • SANTIAGO, CHILE
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INFORME DE AVANCE CIENTIFICO- TECNOLOGICO
OBJETIVOS
El presente informe corresponde a uno de los informes específicos solicitados
para el seguimiento y control de proyectos de I+D correspondiente a períodos
anuales y con plazo de presentación máximo, según lo estipulado por FONDEF y
programado en la plataforma de S+C.
INSTRUCCIONES
Este informe se compone de dos partes:
I.- Informe de Avance de avance del proyecto:
Este es una síntesis de avance del proyecto en el cual el(la) Director(a) del
Proyecto debe enfocarse fundamentalmente a informar si el avance obtenido a la
fecha permite asegurar la obtención de los resultados esperados (considerando
atributos específicos) y a determinar las acciones a realizar con el objetivo de
maximizar el impacto del proyecto.
Este Informe de Avance no debe tener más de 20 páginas con letra tamaño 12 y
espaciado sencillo.
II.- Anexos:
Corresponde a información adicional que permita sustentar o ampliar la
información entregada en el Informe de Avance de avance del proyecto. Se debe
entregar como anexo toda la información disponible con relación al avance
obtenido por el proyecto en el período que se informa.
Por ejemplo: estudios de diagnóstico, informes con resultados de intervenciones
representativas (educación) o ensayos piloto (salud), estudios técnicos
específicos, informes de resultados de pruebas de laboratorio, planta piloto o
prueba a escala industrial, layouts, planos de ingeniería, planos de ingeniería de
detalle, diagramas de flujo, entre otros.
Los Informes de Avance Científico Tecnológico que debe entregar el(la)
Director(a) del Proyecto deben corresponder al período comprendido entre la
fecha de entrega del último informe de avance científico tecnológico y el actual.
Sólo el primer informe de avance debe considerar información desde el inicio del
proyecto hasta la fecha en que se entrega el informe.
180
Sólo debe enviarse en forma impresa a FONDEF un ejemplar del Informe de
Avance del proyecto y con el cuidado de no incluir los anexos. Además, se debe
adjuntar un CD con todo el Informe de Avance Científico Tecnológico, el cual
incluye el Informe de Avance de Avance y esta vez con los anexos.
Por último, no olvide actualizar el sistema de SyC con esta información, de lo
contrario el envío del informe aparecerá como no realizado. Tal como se indica en
pantalla en el sistema de SyC, ingrese al menú de la izquierda en la opción
“Actualización de Avance” (1) y luego a “Programación Actividades S&C” (2) como
muestra la figura de más abajo, en ella se muestra la programación de la entrega
del informe de Avance C&T.
Ud. deberá ingresar en “Informar” (3) y se desplegará una nueva ventana en la
cual deberá ingresarse la “Fecha de Logro” del Informe y adjuntar sólo el archivo
correspondiente al Informe de Avance de Avance del Proyecto sin anexos
181
INFORME DE AVANCE CIENTIFICO- TECNOLOGICO
INDICE
I) INFORME DE AVANCE DE AVANCE DEL PROYECTO.
1.- Estado del Arte.
1.1.- Nuevas Investigaciones.
1.2.-Realice un análisis de amenazas y oportunidades.
1.3.- Referencias.
2.- Hipótesis planteadas por el proyecto.
2.1.- Hipótesis del proyecto (Científicas y Tecnológicas).
2.2.- Análisis crítico de los planteamientos originales.
3.- Plan de Acción.
3.1.- Objetivos Específicos del Proyecto.
3.2.- Actividades restantes del Proyecto.
3.3.- Estructura Presupuestaria.
3.4.- Nuevas empresas u otros socios.
3.5.- Resultados esperados.
II) ANEXOS.
182
I) INFORME DE AVANCE DE AVANCE DEL PROYECTO
1.- Estado del Arte.
1.1.-Refiérase a nuevas investigaciones, proyectos, publicaciones, desarrollos u
otros eventos que pudiesen impactar positiva o negativamente los objetivos
específicos, resultados e impactos esperados del proyecto.
Actualmente el desarrollo de vacunas en la salmonicultura es uno de los temas
más en boga en la ciencia aplicada en nuestro país. La siguiente tabla muestra las
vacunas vigentes en al mercado.
Recientemente la aparición en el mercado de una vacuna divalente IPN-SRS se
presenta como la principal competencia a nuestro producto. Sin embargo, no se
conoce su eficacia en el impacto que tendrá en los futuros brotes de la
183
enfermedad. El alto número de vacunas en el mercado (Bacterinas, virinas,
proteínas recombinantes) hace suponer que ninguna de ellas es altamente eficaz.
El respaldo de esta apreciación es la carencia de estudios de prevalencia
protectora de las mismas en el tiempo, que en nuestro caso está considerado
como se explicita en los resultados obtenidos.
1.2.-Realice un análisis de amenazas y oportunidades.
Como se estipuló en el párrafo anterior el alto número de vacunas presentes en el
mercado hace suponer que ninguna de ellas es realmente eficaz. De allí que
nuestra vacuna entrará a competir de igual a igual con el resto de las vacunas
presentes en el mercado. Haciendo un análisis más exhaustivo de las propiedades
mismas de la vacuna, una formulación que incluye inmunógenos provenientes de
las cuatro cepas más importantes hace que su permanencia en el tiempo sea
mucho mayor que las vacunas ya existentes, haciendo prescindible una mejora de
la misma en períodos cortos de tiempo.
1.3.-Indique referencias que sirvieron de base para los puntos anteriores.
1. Perez, C.: Disponibilidad de vacunas para agua dulce. Para Salmónidos.
AQUA, La revista de la acuicultura. Nº 116: 28-33.
2. Aguila, M.P.: Una aproximación hacia el estado de la acuicultura. AQUA,
La revista de la acuicultura. Nº 118: 68-76.
184
2.- Hipótesis planteadas por el proyecto.
La vacunación de peces salmonídeos juveniles en etapa de pre-smoltificación con
una vacuna divalente anti- P. salmonis / IPNV , inducirá una protección prolongada
y sinérgica en los peces cultivados en condiciones de densidad creciente,
disminuyendo las frecuencias y mortandades de brotes epizoóticos característicos
de las etapas pre-productivas o de engorda”.
2.1.- Indique cuáles son las Hipótesis sobre las que se sustenta el proyecto
(Científicas y Tecnológicas)
Las hipótesis fundamentales sobre las cuales está sustentado este proyecto son:
la capacidad natural que presentan las proteínas inmunogénicas de ser utilizadas
como potenciales vacunas y la capacidad que tienen los diferentes organismos de
reconocerlas. De esta forma la capacidad de conferir protección estaría
determinada por el grado de eficiencia de un determinado inmunógeno.
2.2.-Realice un análisis crítico de los planteamientos originales e indique si éstos
se mantienen o si es necesario realizar alguna modificación.
El planteamiento original del proyecto consistió en la elaboración y construcción
de quimeras derivadas de la proteína inmunogénica ChaPs generadas por ADN
shuffling. Si bien, fueron construidas más de 10 quimeras sólo fueron los extremos
COOH de las cuatro diferentes cepas de Piscirickettsia salmonis en su uso
combinado, los que dieron los mejores resultados al efectuar el análisis con los
sueros de peces naturalmente infectados. Es por ello que precisamente fueron
estos inmunógenos los elegidos para realizar las diferentes ensayos de campo
propuestos originalmente en el proyecto. Desafortunadamente ninguno de ellos
arrojó resultados concluyentes ya que siempre problemas técnicos truncaron
nuestros experimentos. Esta vez se subcontrató a la empresa SGS, de reconocido
prestigio en pruebas de soluciones medicas en la acuicultura. Actualmente se está
realizando en las dependencias de SGS en el sur de Chile ensayos inmunización
desafío, cuyos resultados definitivos serán obtenidos la primera semana de enero.
Con esto definiremos al mejor inmunógeno contra el SRS que será entregado a la
empresa Noruega Pharmaq.
185
Modificaciones obligadas por el derecho de propiedad intelectual y
comercialización en el país de la vacuna Alphaject-1000 anti-IPNV de parte de
Pharmaq Inc. Empresa acompañante.
Considerando que:
-
La empresa farmacéutica Pharmaq tiene patentada la vacuna contra IPNV
(Virus de la necrosis pancreática) que comercializa en Chile bajo secreto
industrial
-
Que la evaluación de nuestros inmunógenos contra P. salmonis debiese
haber sido complementando dicha vacuna para hacerla divalente
-
Que esa condición no era aceptable ni para la empresa ni para la eventual
evaluación protectora de los antígenos anti P. salmonis.
-
La evaluación que la PUCV realiza para cumplir el convenio con Pharmaq
es de una combinación de inmunógenos anti P. salmonis bajo un esquema
de monovalencia de formulación propia.
-
En estas condiciones esperamos un RPS mayor o igual al 70% que permita
a Pharmaq formular la vacuna divalente (P.salmonis-IPNV) en las
condiciones que ellos estimen adecuadas.
186
3.- Plan de Acción.
3.1.- Objetivos Específicos del Proyecto.
1.- Expresar los clones del extremo COOH de la proteína inmunogénica ChaPs de
tres variantes de P.s. (LF-89; NOR-92 y CI-95) en E. coli.
2.- Generar quimeras por DNA shuffling entre las tres variantes de P.s. – ChaPs.
3.- Seleccionar tres de las quimeras con mayor variabilidad en sus DNAs.
4.- Clonar y expresar las quimeras seleccionadas en E. coli.
5.- Evaluar in vivo e in vitro el potencial inmunogénico de las tres variantes y de
las tres quimeras.
6.- Evaluar el potencial inmunogénico – protector de las variantes y quimeras.
7.- Seleccionar las moléculas recombinantes de mayor potencial protector para el
desarrollo de la vacuna.
8.- Producir en forma masiva la mejor molécula recombinante seleccionada
9- Evaluar en campo la mejor dupla divalente anti-(Ps-IPNV- ALPHA JECT 1000)
10- Generar un modelo de empresa biotecnológica para instalar en Chile una
spin-off de origen PUCV dedicada al descubrimiento eficiente de nuevos
medicamentos.
11- Comercializar la vacuna divalente
3.2.- Actividades restantes del Proyecto
Actualmente se esta llevando a cabo ensayo inmunización-desafío en el Módulo
de pruebas de la empresa SGS que nos permitirá comprobar de forma efectiva la
capacidad protectora de nuestro inmunógeno para luego ser adicionado al
inmunógeno desarrollado por Pharmaq.
3.3.- Estructura Presupuestaria (FONDEF, Institución(es), Empresas y Otras
Contrapartes) o requerimiento de nuevos aportes.
No se precisan nuevos aporte
3.4.- Nuevas empresas u otros socios.
No hay cambios de empresa contraparte
187
3.5.- Resultados esperados.
El presente informe tiene por objetivo dar cuenta del estado final de los resultados
esperados mencionado y conforme a los Hitos de Investigación y Desarrollo (Ver
Anexo) trazados en él podemos decir que la mayoría de ellos han sido logrados
satisfactoriamente. Entre los resultados concretos encontramos los siguientes:
-
Clonamiento, expresión y purificación a nivel analítico de 14 clones
derivados de la proteína inmunogénica ChaPs (Tabla 1).
-
Selección de cuatro de los clones con mayor potencial inmunogénico el cual
fue medido por el grado de reactividad de los mismos frente a sueros de
peces naturalmente infectados con el patógeno Piscirickettsia salmonis (En
rojo en tabla 1).
-
Escalamiento a nivel piloto (25 litros) en la producción y purificación de los
clones seleccionados.
-
Prueba de campo con la mezcla de los clones seleccionados en la empresa
SGS.
Clon
Cepa
Característica
Tamaño kDa
9/8
LF-89
Proteína completa 58
9/8
NOR-92
Proteína completa 58
9/8
CI-95
Proteína completa 58
9/8
EM-90
Proteína completa 58
13/8
LF-89
Extremo COOH
17
13/8
NOR-92
Extremo COOH
17
13/8
CI-95
Extremo COOH
17
13/8
EM-90
Extremo COOH
17
11/12
LF-89
Sección Intermedia 18
9/4
LF-89
Extremo NH2
15/12
LF-89
Quimera - 1
LF-89
Sub-clon fragmento 6
13/8
Epítopes
7.2
Inmunoreactivos
24
188
Quimera – 2
LF-89/NOR-92 13/8-15/12 ligados
16.3
9/2
LF-89
42.3
(70% del gen)
Tabla 1
Actividades realizadas de acuerdo a los resultados presentados en el proyecto
1 Resultado 1: Clonamiento, expresión y purificación a nivel analítico de 14
clones derivados de la proteína inmunogénica ChaPs.
Expresión de cada variante de ChaP.s. en la cepa de E. coli BL 21 CodonPlus
Tubos que contenían 1 ml de medio LB con los antibióticos apropiados (50ug/ml
Kn; 34 ug/ml Cam y 75 ug/ml Sm) fueron inoculados con 50 ul de clones
criogenizados (Guardados a -80ºC en 10% de dlicerol) de la cepa BL-21
CodonPlus tranformados con el plásmido pET27b+, conteniendo el constructo
correspondiente de cada un de los clones mencionados. Los tubos fueron
incubados por 2h 30m a 37ºC y 250 rpm de agitación. Después del tiempo
mencionado anteriormente se agregó IPTG a una concentración final de 1mM
como molécula inductora.
Luego de transcurridas 2h, los cultivos fueron centrifugados a 4000 rpm por 20
minutos. Se eliminó el sobrenadante y el pellet fue guardado a -80ºC para su
posterior análisis. Este pellet fue resuspendido y lavado en 10 mM tris pH: 8.0,
para finalmente ser resuspendido en 10 ul del mismo tampón. Finalmente se
cargaron 5 ul por carril en geles SDS-PAGE al 10% y teñidos con azul de
Comassie. Figura 1: Proteína completa 9/8 de cada una de las cepas de P.
salmonis. Figura 2: Extremo COOH 13/8 de cada una de las cepas de P. salmonis.
Figura 3: Expresión fragmento 9/4. Figura 4: Expresión quimera 1
189
PM
1
2
3
4
5
6
7
1168–
66 –
45 –
35 –
25 –
Fig. 1: Gel 10% A/Bis Archilamida Expresión de la
proteína ChaPs completa 9/8 de las diferentes cepas
de P. salmonis . Carriles: 1: LF-89 sin inducir Vacío; 2:
LF-89 inducida; 3: EM-90 sin inducir; 4: EM-90 inducida;
5: NOR-92 sin inducir; 6: NOR-92 inducida; 7: CI -95 sin
inducir; 8: CI -95 inducida. Flecha roja: Expresión de las
variantes de ChaP.s
190
1
2
3 4
5 MW
- 116
- 66
- 45
- 35
Fig. 2: Gel 10% A/Bis Archilamida Expresión del extremo
COOH de la proteína ChaPs de las diferentes cepas de P.
salmonis . Carriles: 1: LF-89 inducida; 2: EM-90 inducida;
3: NOR-92 inducida; 4: CI -95 inducida; 5: Cultivo no
inducido Flecha roja: Expresión de los diferentes extremos
COOH
- 25
- 18
- 14
PM
1
2
116 kDa
66 kDa
45 kDa
35 kDa
3 4
5
6
Fig. 3: Gel Tris-Glicina SDS 10%.
Expresión fragmento 9/4. Carriles:
PM: Peso molecular en kDa. 1 - 5:
Cultivo expresado; 6: Cultivo no
expresado.
25 kDa
1
2
3
PM
Fig 4 Gel Tris-Tricina Urea 18%. Expresión de la
quimera 1. 1-3: Quimera expresada; PM: peso
molecular en kDa.
Purificación de cada uno de los fragmentos
191
El procedimiento utilizado para purificar las proteínas expresadas fue la
electro-elusión desde geles de acrilamida. Para ello cultivos expresados de 50 ml
fueron centrifugadas en frío a 4000 rpm por 30 minutos. Luego fueron lavadas con
50 ml de PBS 1x y centrifugadas nuevamente a 4000 rpm por 20 minutos.
Se eliminó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 25 ml de Tris 10 mM a
pH 8.0 y en 10 ml de solución cargadora. Las muestras fueron corridas en geles
de Tris-glicina SDS al 12%, de 20 x 20 cm., en un equipo Protean II xi Cell®
(BioRad). Luego se cortó a lo largo una delgada porción del gel y se tiñó con azul
de coomasie para determinar el lugar de bandeo de cada una de las proteínas. A
continuación cada una de la bandas fue cortada con un bisturí.
Posteriormente las proteínas fueron purificadas desde gel por electro-elusión, en
un equipo Electro-Eluter modelo 422 (BioRad), siguiendo las instrucciones de
manufactura. La concentración de proteínas totales fue determinada por el kit BCA
Protein Microplate Assay (Pierce) y los resultados fueron interpolados en una
curva de calibrado.
2 Selección de la molécula con mayor potencial inmunogénico a través de la
reacción con sueros de peces infectados naturalmente.
Con el fin de determinar el potencial inmunogénico de las nuevas proteínas,
derivadas de ChaPs, se realizaron pruebas de inmuno-reactividad a través del
método de ELISA. Para ello se utilizaron sueros de peces provenientes de
epizootias de P. salmonis registradas en el año 2005 en el sur de Chile.
En primer lugar las condiciones experimentales debieron ser estandarizadas. Para
ello se utilizó a la proteína de ChaPs completa, como referente, en distintas
concentraciones (0.1 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.5 µg/ml y 1 µg/ml) frente a dos sueros
provenientes de peces artificialmente infectados (inyectados intraperitonealmente
con la bacteria) y un suero de un pez sano como control negativo.
Una vez estandarizadas las condiciones experimentales y con el fin de comprobar
la efectividad y reproducibilidad del experimento, se tomaron 70 sueros
provenientes de distintos peces naturalmente infectados, recolectados de diversas
epizootías. Para ello se usó la dilución de sueros 1:100 y la concentración de
ChaPs de 0.5 µg/ml (Figura 5A y B)
Finalmente se realizó la detección del potencial inmunogénico de las proteínas
recombinantes producidas. Para ello se tomaron los dos sueros positivos que
presentaron la mejor respuesta en la prueba anterior (Sueros 1 y 38) y un control
negativo que correspondió a suero proveniente de un pez sano. Se utilizaron como
192
referente a la proteína ChaPs completa, su extremo carboxilo (COOH) y un lisado
de proteínas de Escherichia coli.
Las proteínas testeadas fueron diluidas en una concentración final de 0.5 µg/ml en
buffer carbonato estéril (100 mM Na2CO3 + 100 mM NaHCO3, pH 9.4) y fueron
pegadas en una microplaca de 96 pocillos por 20 horas a 4ºC. Posteriormente las
microplacas fueron lavadas tres veces con Buffer de lavado (PBS 1X + 0.05%
Tween 20). Posteriormente se agregó a cada pocillo solución de bloqueo (BSA 1%
en PBS 1X) y se incubó por dos horas a temperatura ambiente.
Después de haber lavado tres veces los pocillos, se agregaron los sueros en una
dilución 1:100. a continuación se incubaron por 8 horas a 20ºC. Transcurridas las
8 horas se lavaron los pocillos seis veces con solución de lavado y se les agregó
50 µl del anticuerpo Anti-Inmunoglobulina de Salmónidos (Rabbit anti-salmonid
Immunoglobulin, Microtek), diluido 5000 veces en solución BSA 1% y fueron
incubados por 12 horas a 4ºC.
Posteriormente los pocillos fueron lavados tres veces con solución de lavado y se
les agregó 50 µl de anticuerpo Anti-inmunoglobulinas de conejo (Goat anti-rabbit
IgG Peroxidase, Pierce) diluído 3000 veces en solución de lavado, incubándose
por una hora a 37ºC. A continuación la placa se lavó tres veces con solución de
lavado y se agregó a cada posillo 100 µl del agente revelador Dako® TM Blue,
incubándose a temperatura ambiente y en oscuridad por 30 minutos. Finalmente la
microplaca fue medida en el lector de espectrofotometría Synergy HT (BIO-TEK) a
una absorbancia de 650 nm.
En la figura 6 se puede observar la respuesta de las diferentes proteínas
expresadas frente al suero de peces naturalmente infectados. Siendo aquellos con
mejor reacción los elegidos para el escalamiento posterior a 25 litros.
193
Absorbance (OD650)
A
3,2
Antigenic Potential
of ChaPs
Potencial
antigénico
de
Ch P
2,8
2,4
2
1,6
1,2
Figura 5:
Reacción de la
proteína
inmunogénica
ChaPs frente a
sueros de
0,8
0,4
0
C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Sera
Antigenic Potential of Chaps
Absorbance (OD650)
B
3,2
2,8
2,4
2
1,6
1,2
0,8
0,4
0
C- 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
Sera
194
3
2,5
OD 650
2
C7+
1,5
8+
1
0,5
0
Full
Full
Full
Full COOH COOH COOH NH2
1
2
3
4
5
6
7
ChaPs ChaPs ChaPs ChaPs LF89 Nor92 CI95
LF89
10
LF89 EM90 Nor92 CI95
15/8
LF89
8
COOH
9
EM-90
Figura 6: Reacción de las diferentes proteínas expresadas frente a sueros de peces
naturalmente infectados. 1: 9/8 LF-89; 2: COOH EM-90; 3: 9/8 NOR-92; 4: 9/8 CI-95; 5:
COOH LF-89; 6: COOH NOR-92; 7: COOH CI-95; 8: NH2 LF-89; 9: 15/8 LF-89; 10:
Quimera 1
3 Escalamiento a nivel Piloto de los clones seleccionados
Con el objetivo de producir las proteínas seleccionadas para realizar un desafío a
mediana escala se procedió al escalamiento de cultivos de 25 litros. Para ello fue
necesaria la optimización de un medio mucho más económico que aquel usado a
nivel analítico, con este fin se probó con un medio semi-definido que bajaba en un
30% los costos de producción del nuevo inmunógeno. La composición del medio
se detalla en la tabla 1
Nutrientes
Glucosa
(NH4)2SO4
KH2PO4
K2HPO4
NaCl
MgSO4*7H2O
Extracto de
levadura
Sales
Concentración
(g/l)
6
5.47
2.64
13.2
1.33
0.0706
Tabla 1: Composición medio
semi-definido utilizado en cultivos
de 25 litros de cada uno de los
clones seleccionados.
2
195
CaCl2*2H2O
FeSO4*7H2O
Elementos
traza
ZnSO4*7H2O
CoCl2*6H2O
CuSO4*5H2O
MnCl2*4H2O
Na2MoO4
0.0505
0.0065
0.0061
0.0039
0.0054
0.005
0.003
Para lograr este resultado placas con medio LB suplementado con Kanamicina 50
µg/ml, Cloranfenicol 34µg0ml y Streptomicina 75µg/ml fueron sembradas con
100 ul de cada uno de los clones y mantenidas a 37ºC por 16 horas. A partir de
estas placas, matraces de 1 L conteniendo 300 ml del medio semidefinido
suplementado con los antibióticos nombrados, fueron inoculados e incubados por
16 horas a 37ºC. Finalmente el reactor fue inoculado con un 10% del volumen total
del reactor, es decir 3 litros obteniendo un cultivo final de 25 litros, y se realizó una
cinética de crecimiento hasta alcanzar una densidad óptica (DO) 1,61 para luego
ser inducidos con 1,4 mM de IPTG por 3 horas. En la figura 7 se puede apreciar
un gráfico de cinética de crecimiento de los clones expresados. Finalmente una
vez finalizados los cultivos estos fueron analizados por geles SDS-PAGE para
comprobar la inducción o no de la proteína recombinante.
196
C in é tic a d e C r e c im ie n to
Figura 7. Gráfico que
muestra una cinética de
crecimiento
del
clon
COOH EM-90. Flecha
roja indica el tiempo de la
2
1 ,6
OD.
1 ,2
0 ,8
0 ,4
0
0
60
120
180
240
300
360
420
tie m p o (m in )
3.1 Purificación a mediana escala de las proteínas seleccionadas
En la purificación de las proteínas a mediana escala se probaron diversos
métodos, sin embargo sólo uno de ellos fue el más eficiente. El método de
purificación utilizado se basa en el uso de un equipo fabricado por BIO-Rad que
separa las proteínas según su PI en rangos muy pequeños de pH. Para ello los
cultivos de 25 litros fueron divididos en 5 fracciones. Cada fracción fue
centrifugada a 4000 rpm por 20 minutos. El pellet obtenido fue resuspendido en
200 ml de buffer 8M urea y 50 mM DTT. La suspensión fue sonicada en 4 round
seguidos por 10 segundos e intervalos de 1 minuto. A continuación las muestras
fueron centrifugadas en dos oportunidades a 12000 x g y las proteínas de pellet y
sobrenadante fueron cuantificadas. Para fraccionar la muestra frente a un campo
eléctrico los pellets obtenidos fueron resuspendidos en 60 ml de buffer 4% p/v
CHAPS, 8 M Urea, 20 mM DTT, 2% p/v anfolito 3-10 y dejando una cantidad de 2
gr de proteína total por corrida.
Con el fin de eliminar la alta concentración de que urea presentaban las
muestras las fracciones obtenidas en el rotofor fueron llevadas a una extracción en
fase sólida mediante columnas Sep-Pak Vac C-18. En esta etapa de purificación
se procedió a pasar la muestras por una columna de Sep-Pak Vac C-18 (Waters
Associates) equilibrada con agua acidificada con 0.05% de ácido Trifluoracético
(TFA). Después de haber pasado la muestra por la columna y haber realizado un
lavado con agua ácida, la muestra fue eluída con 20 ml de 5%, 20%, 40% y 80%
de Acetonitrilo (ACN). Los eluídos fueron liofilizados por 12 horas y resuspendidos
197
en 800 µl de agua MQ. La concentración de proteínas totales fue determinada por
el kit BCA Protein Microplate Assay (Pierce), según indicaciones de manufactura y
los resultados fueron interpolados en una curva de calibrado. Las fracciones
resultantes fueron visualizadas en geles de Tris-Tricina Urea a 18% (SDS-PAGE),
cargando en el gel una concentración total de 10µg por cada eluído de ACN.
En las figuras 7 y 8 podemos apreciar la quimera 1 y el fragmento13/8 EM-90
purificados de desalinizados, respectivamente.
1
PM
Figura 8: Gel Tris-Tricina Urea 18%. Quimera
Purificada vía rotofor y post tratamiento con Seo
Pak. PM: Peso Molecular en kDa. La flecha roja
26.6 kDa
16.9 kDa
14.4 kDa
6.5 kDa
PM
1
2
96 kDa
66 kDa
45 kDa
35 kDa
25 kDa
Figura 8: PM: Marcador de pesos
moleculares en KDa.
1 y 2: Fragmento 13/8 EM-90
purificado por Rotofor y desalinizado
por Sep-pak Vac C-18.
18 kDa
14 kDa
198
4 Ensayo inmunización-desafío con los clones seleccionados en la empresa SGS
A continuación se presenta el protocolo de inmunización-desafío desarrollándose
actualmente en la empresa SGS
1 TITULO
Evaluación de eficacia de vacunas experimentales contra Piscirickettsia salmonis
2 OBJECTIVOS
2.1 Evaluar en términos de eficacia peces S. salar vacunados vía intraperitoneal
con vacunas contra P. salmonis al ser desafiados con este patógeno.
3. CRONOGRAMA
Día
Chequeo Sanitario
Aclimatación
-21
O
0
I
O
Vacunación
14
64
65
95
O
I
I
O-I
Inmunización
O
Desafío con P. salmonis
Termino del ensayo
I
O-I
O: Inicio
I: Termino
199
4. MATERIALES Y METODOS
4.1
Peces
Especie
Piscicultura origen
Lote - grupo
Peso
Vacunaciones
Enfermedades
Tratamientos con
fármacos
4.2
S.salar
X=20-40 grs.
No deben estar vacunados previamente
Sin ningún cuadro clínico anterior
Ningún tratamiento previo al inicio del estudio
Parámetros ambientales durante el estudio
4.2.1 Parámetros ambientales – agua dulce
Capacidad
700 litros
estanque
Salinidad
0
Temperatura
9-11ºC
Oxígeno
8-10 mg/l
Tasa recambio
1 recambio total por hora
Densidad
15-20 kg/m3
4.2.2 Parámetros ambientales – agua Mar
Capacidad
estanque
Salinidad
Temperatura
Oxígeno
Tasa recambio
Densidad
700 litros
30-35 ppm
10-12ºC
8-10 mg/l
1 recambio total por hora
15-20 kg/m3
200
5. Diseño del estudio
Esta experiencia considera la utilización de 270 peces salmo salar provenientes
de piscicultura o lago con un peso promedio de 20-40 g.
Para la selección de los peces se buscará un grupo que no presente
antecedentes de enfermedades bacterianas o virales, así como tampoco ningún
tratamiento reciente con algún fármaco. Posteriormente, 20 días antes del traslado
de los peces a la estación experimental se tomaran 30 peces del grupo
seleccionado para realizar el chequeo sanitario. El chequeo considera análisis de
necropsia, IFAT BKD, cultivo Flavobacterias, y cultivo celular para IPNv.
Los peces serán recepcionados en 1 estanque de 1000 lt con suministro
constante de agua dulce (10 L/minuto)
en la estación experimental de SGS
Aquatic Health.
Al segundo día post ingreso los peces se distribuirán en 3 estanques de 700
litros con 90 peces cada uno donde permanecerán por todo el periodo de
aclimatación, Inmunización y posteriormente serán desafiados.
5.1 Alimentación
Durante los días de aclimatación los peces serán alimentados con una dieta
comercial al 2% de P.C / día.
En este periodo los peces serán observados diariamente donde cualquier
comportamiento anormal será registrado. También se llevara un registro diario del
nivel de apetencia de los peces (bueno, malo o regular). Previo al término del
periodo de aclimatación los peces deberán estar comiendo el total del alimento
calculado (90-100% de la población), de no ser así, se deberá dar al menos una
semana más de aclimatación.
La alimentación se realizara en forma manual y a saciedad entregando la mayor
parte de la ración durante la mañana.
5.2 Vacunación:
La administración se realizara por inyección intraperitoneal en la línea media
ventral a razón de 0.1 ml de vacuna por pez. Adicionalmente se incluirá la
201
aplicación de PBS al grupo control a razón de 0.1 ml/pez. Los peces deberán estar
en ayuno de 48 horas antes de la vacunación y anestesiados previo a la inyección
con Benzocaina 20 % de ASL en una dosis de 50 ppm .En el proceso de
inoculación, la temperatura corresponderá a la temperatura ambiente de la
piscicultura entre 10-11 °C.
Luego de ser administrada la vacuna a cada uno de los grupos de prueba, los
peces se dejaran en los estanques sin ser sometidos a ningún manejo estresante.
Los grupos deberán completar 500 UTA (aprox 50 días) como periodo de
inmunización . Durante este tiempo las temperaturas serán monitoreadas en forma
diaria y la mortalidad será extraída y analizada para descartar la acción de algún
otro patógeno.
Estanque 1 : 30 peces vacunados Vacuna 1 SRS inyectable 0.1 ml/pez
30 peces vacunados Vacuna 2 SRS inyectable 0.1 ml/pez
30 peces vacunados con PBS estéril inyectable 0.1 ml/pez.
Control
Estanque 2 : 30 peces vacunados Vacuna 1 SRS inyectable 0.1 ml/pez
30 peces vacunados Vacuna 2 SRS inyectable 0.1 ml/pez
30 peces vacunados con PBS estéril inyectable 0.1 ml/pez.
Control
Desafío con
P. salmonis
Estanque 3 : 30 peces vacunados Vacuna 1 SRS inyectable 0.1 ml/pez
30 peces vacunados Vacuna 2 SRS inyectable 0.1 ml/pez
30 peces vacunados con PBS estéril inyectable 0.1 ml/pez.
Control
5.3 Desafío con P. salmonis
El día 65 post inmunización se procederá al desafío con P. salmonis. Este
consistirá en aplicar a cada uno de los estanques la dilución calculada en el
punto 5.4.
La inoculación se realizara en la línea media ventral en razón de 0.2 ml/pez de
inoculo, los peces serán anestesiados previo a la inyección con Benzocaina 20 %
de ASL en una dosis de 50 ppm. Previo a la inyección los peces tendrán un ayuno
de 48 hrs.
Posteriormente los peces se dejaran en los estanques por un periodo de 30 días
en los cuales se registrara la temperatura promedio diaria y la mortalidad.
202
De la mortalidad generada post desafío se tomaran muestras de todos los grupos
y enviadas al laboratorio para realizar análisis que confirmen la presencia del
patógeno.
6. EVALUACIÓN DE LA VACUNA :
6.1 Evaluación de eficacia
Todos los estudios dirigidos a evaluar la calidad de la vacuna para peces, en
cuanto a inmunogenicidad, están basados en experiencias prácticas, es decir, en
Bioensayos, Holt y col (1987), ya que no existe una correlación directa entre la
inmunogenicidad de una vacuna y la respuesta inmune medida por título de
anticuerpos.
Criterios específicos para obtener un satisfactorio test de Eficacia :
1.- El test se debe hacer en duplicado, con un mínimo de 25 peces por experiencia
por cada vacuna a evaluar. Estos deben estar en los estanques las UTA
recomendadas por el fabricante antes del desafío.
2.- El desafío se debe realizar usando el método de inyección intraperitoneal o por
cohabitación.
3.- El % de mortalidad por el desafío en el control, debe ser igual al 50 % en los 30
días post desafío de no ser así se rechaza el ensayo y se debe repetir.
4.- RPS superior o igual al 60 %, se considera como satisfactorio, calculado
cuando la mortalidad del grupo control alcanza el 50% de mortalidad.
5.- Si el RPS es de 50-60% el ensayo debe repetirse una vez mas.Si nuevamente
se repite el resultado se considera la serie de vacuna como NO eficaz y debe ser
descartada.
6.-Si el RPS es menor al 50% se considera la serie de vacuna como NO eficaz y
debe ser descartada.
Los resultados pueden ser expresados relacionando la respuesta del control no
vacunado comparado con los vacunados. El código federal americano sobre
regulaciones, en el título 9, expresa potencia relativa (RP) como la relación
proporcional de los controles comparado con los vacunados, es decir;
203
Para la evaluación de la eficacia de los productos, se utilizará el método del
porcentaje relativo de supervivencia (RPS : Relative Percent Survival ) (Ellis, 1988
) a través de la siguiente fórmula :
RPS = 1 (Porcentaje mortalidad vacunados / Porcentaje mortalidad no
vacunados) X 100
Adicionalmente se considera la aplicación de la prueba de Z ESTADISTICO para
proporciones y tasas (Medical Statistics: a commonsense approach. Campbell,M.,
and Machin D., 2nd ed. 1995, John Wiley and sons) , considerando un nivel de
significancia de un 5 %.
P < 0.05 = ( Las diferencias de mortalidad son estadísticamente significativas )
P > 0.05 = ( Las diferencias de mortalidad no son estadísticamente significativas )
7.
Condiciones Generales
7.1 Mortalidad:
La mortalidad deberá ser retirada y registrada en cada estanque durante todo el
periodo del ensayo.
7.2 Tratamientos:
Los peces no deberán ser medicados durante el ensayo salvo lo estipulado en el
protocolo y en caso de ser necesario deberá ser autorizado por el monitor del
estudio.
7.3 Diagnostico:
Durante el estudio la mortalidad generada en cada estanque desafiado con P.
salmonis será enviada al laboratorio para realizar análisis de necropsia e IFAT
SRS para confirmar la presencia del patógeno.
a) Necropsia de la mortalidad generada post desafío: La necropsia sera realizada
a 5 peces muertos por grupo por estanque post desafío con P. salmonis y el
informe de laboratorio sera adjuntado al informe final.
b) IFAT SRS: El análisis de inmunofluorescencia directa será realizada a 5 peces
muertos por grupo por estanque post desafío con P. salmonis y el informe de
laboratorio será adjuntado al informe final.
204
d) Chequeo sanitario: Análisis previo a la compra 30 Necropsia, 30 IFAT BKD, 6
cultivo flavobacterias y 6 cultivo celulares IPNv.
7.4 Registros
Durante todo el periodo de seguimiento se registrará la siguiente información para
cada estanque:
a) Mortalidad: desde el inicio y diariamente. Considera el conteo de la
mortalidad por cada estanque.
b) Alimento suministrado. Considera el registro de la cantidad de alimento
suministrado diariamente a cada estanque.
c) Temperatura. Considera el registro de la temperatura diaria del agua ( 3
veces al día ).
d) Considerar el registro de manejos y siniestros
8. ANALISIS DE RESULTADOS
8.1 Resultados de mortalidad post desafío
a) Se compararán las curvas de mortalidad diaria y acumulada de los grupos
vacunados y el grupo control
b) RPS
c) Adicionalmente se considera la aplicación de la prueba de Z ESTADISTICO
para proporciones y tasas (Medical Statistics: a commonsense approach.
Campbell,M., and Machin D., 2nd ed. 1995, John Wiley and sons) , considerando
un nivel de significancia de un 5 %.
P < 0.05 = (Las diferencias de mortalidad son estadísticamente significativas)
P > 0.05 = (Las diferencias de mortalidad no son estadísticamente significativas)
9.
RESULTADOS
9.1
Registros e informe
El informe del ensayo incluirá al titular, resumen, material y métodos, resultados
estadísticos incluyendo las discusiones. Todos los registros de temperatura,
oxígeno, mortalidad, serán resumidos en tablas y/o figuras.
205
Los anexos Incluirán; datos individuales mortalidad, diagnóstico, temperatura
durante todo el periodo del estudio. Informe laboratorio incluyendo los análisis
realizados previos al estudio.
El informe final será enviado a Pontificia Universidad Católica de Valparaíso en un
plazo de 20 días post término del estudio. El investigador del estudio firmará el
informe.
El análisis estadístico de los resultados será realizado por SGS Aquatic Health. La
prueba será utilizada para revelar cualquier diferencia estadística de mortalidad
entre los grupos (Z ESTADISTICO para proporciones y tasas (Medical Statistics: a
commonsense approach. Campbell,M., and Machin D., 2nd ed. 1995, John Wiley
and sons y análisis de varianza según diseño en bloque con una significancia de
un 5% , ) .
9.2
Cambios en el protocolo
Si los cambios en el protocolo son necesarios o se presentan durante el curso del
estudio, el monitor del estudio será informado inmediatamente. Cualquier cambio
se debe firmar y fechar por el director del estudio y someter con el informe.
9.3
Archivos de datos
Los registros con datos originales del estudio serán archivados por un período de
2 años después de que el informe del estudio sea aprobado.
206
ANEXO 1
Hito I+D 1: Expresión y recuperación desde el espacio periplásmico de E. coli Bl21
star, del extremo COOH de ChaPs de cada una de las variantes (LF-89, NOR-92 y
CI-95).
Hito I+D 2: Obtención de quimeras del extremo COOH de Chaps, mediante
técnicas de DNA suffling.
Hito I+D 3: Selección de tres quimeras por variabilidad nucleotídica derivada de
su secuenciación.
Hito I+D 4: Clonamiento de las tres quimeras seleccionadas.
Hito I+D 5: Subclonamiento y expresión de las tres quimeras elegidas en E. coli
BL21 star.
Hito I+D 6: Inmunización de peces juveniles con cada una de las tres variantes
del extremo COOH-Chaps y de las tres quimeras seleccionadas.
Hito I+D 7: Caracterización, en el tiempo, de los sueros de los peces inyectados.
Hito I+D 8: Determinación del efecto inactivador de los sueros sobre la capacidad
infectiva de P. salmonis en células de peces en cultivo.
Hito I+D 9: Desafío de los peces inmunizados con P. salmonis (cepa LF-89).
Hito I+D 10: Viaje a Noruega para la evaluación, con la empresa, de los resultados
parciales (V.Henríquez).
Hito I+D 11: Selección de la molécula con mayor capacidad protectora de
sobrevida al desafio.
Hito I+D 12: Producción a gran escala de la molécula seleccionada.
Hito I+D 13: Adición de la mejor molécula protectora a la vacuna de IPNV preexistente (Alpharma-Noruega).
Hito I+D 14: Evaluación de la vacuna P.s-IPNV en un desafío a mediana escala
(5000 peces), Chile.
Hito I+D 15: Evaluación en Noruega de la vacuna P.s- IPNV.
207
Hito I+D 16: Viaje a Noruega, evaluación de la vacuna divalente. (V. Henríquez).
Hito I+D 17: Formalización negociada entre PUCV y el licenciatario para
comercializar la vacuna.
208
II) ANEXOS.
Índice de Anexos.
No hay anexos
209
EVALUACION DEL INFORME CyT
(Esta sección será completada sólo por el Comité de Area de FONDEF o por
Evaluadores Designados para tal efecto, por favor no incluya nada aquí)
Nombre Evaluador(a):
Fecha de Revisión
:
1-. Comentarios al Informe y Recomendaciones:
2.- Sugerencias de cambio de estado del proyecto (Marque con una X donde
Corresponda):
Normal
Alerta
Firma del (de la) Evaluador(a):
210
CERTIFICADOS DE APORTES PHARMAQ AS 211