Fisiología Vegetal Parte II: ENERGÍA Y METABOLISMO VEGETAL La fotosíntesis y la fijación del CO 2 son procesos fundamentales para la vida en la tierra, pues son un conjunto de reacciones que permiten la reducción el CO2 atmosférico con ayuda de la energía incidente de la luz solar, formando carbohidratos o materia orgánica. Se trata del proceso inverso a la respiración. Los pigmentos fotosintéticos son moléculas proteicas de enorme importancia, pues muestran capacidad para captar la energía electromagnética solar, jugando el papel de intermediarios energéticos. Destacan entre ellos la clorofila, los carotenoides y las biliproteínas. Sólo el 40% de la radiación solar corresponde con la luz visible, y es aprovechable por la vegetación. Cuando el pigmento intercepta la radiación, queda excitado, y se inicia una cadena de transporte de electrones similar a la de la respiración mitocondrial. El pigmento que capta inicialmente el electrón va a quedar reducido, y va a actuar por lo tanto como reductor de otro intermediario de la cadena de transporte, de menor poder reductor que el primero. Ante dos pares red-ox, el de menor potencial (E0) tomará el papel de reductor, y el de mayor E0 tomará el papel de oxidante. La transferencia de electrones desde los pigmentos reductores excitados a los pigmentos inactivos en la cadena de transporte de electrones presenta pérdidas de energía en cada paso, pero puede permitir a las células vegetales la producción neta de ATP y NADPH 2, que son los verdaderos productos de la fotosíntesis. Estas moléculas de elevado contenido energético podrán ser utilizados para la síntesis de otros compuestos metabólicos a partir de la fijación de CO2. La vía reductiva de las pentosas fosfato es la ruta metabólica clásica por la que se transformará el CO 2 en carbohidratos, y dentro de la misma es fundamental el papel del enzima rubisco. La fijación de CO2 se produce inicialmente en moléculas de tres átomos de carbono, en el denominado metabolismo C3. Esto fue descubierto por Calvin y colaboradores, que trabajaron con carbono marcado radioactivamente ( 14C). Posteriormente, trabajando con el mismo isótopo, se encontró un grupo de plantas que inicialmente fijan el carbono a metabolitos de cuatro átomos de carbono; se trata del metabolismo C4, una adaptación a las temperaturas cálidas. Finalmente las crasuláceas y plantas crasas adaptadas a la aridez desarrollan un metabolismo CAM. I/ Fotosíntesis: A/ Organización del Aparato Fotosintético: 1.- Estructura del Aparato Fotosintético: La hoja es un órgano vegetal adaptado especialmente para cubrir las funciones fotosintéticas, y se conforma de distintos tejidos. El mesófilo esponjoso cumple en particular las funciones de fotosíntesis y fijación de dióxido de carbono. Contiene espacios aéreos, comunicados con el exterior a través de estomas, que facilitan los intecambios gaseosos entre las células y el 53 Fisiología Vegetal medio. Los estómas están formados por dos células de la guarda o células oclusivas capaces de reducir su potencial hídrico hasta deshincharse y permitir la apertura de un poro; el ostiolo. Epidermis inferior Estoma Mesófilo esponjoso Espacios Aéreos Haz vascular Mesófilo en empalizada Epidermis inferior En el interior de las células se encuentran los cloroplastos, orgánulos exclusivos de células de los organismos fotosintéticos, que llevan a cabo los procesos de fotosíntesis e incorporación del carbono inorgánico. El estroma es el plasma interno del cloroplasto donde se encuentran los tilacoides y otros gránulos. Existe una doble membrana que recubre al cloroplasto, así como sucede en las mitocondrias. La membrana externa es altamente permeable a la difusión de metabolitos hasta el espacio intermembranoso, no así la membrana interna que delimita el estroma. Los tilacoides o lamelas son subsistemas de membrana que delimitan un espacio interno o lumen del tilacoide del resto del estroma. Presentan una elevada superficie total de membrana. Se diferencian los tilacoides del estroma, lisos e individuales, y los tilacoides de los grana, que son grupos de tilacoides que se apilan formando discos (grana). Todo el sistema de tilacoides 54 Fisiología Vegetal suele presentar continuidad de las membranas, y presentan membranas muy fluídas gracias a los sulfolípidos y los galactolípidos. Los pigmentos fotosintéticos se encuentran formando grandes complejos en las membranas de los tilacoides; se trata de los fotosistemas. Estos fotosistemas son responsables de la formación del ATP. En el estroma se encuentran libres los enzimas que reducen NADP, y los enzimas solubles del ciclo reductivo de las pentosas fosfato (rubisco) y de la ruta oxidativa de las pentosas fosfato. También se produce el metabolismo de lípidos y otros compuestos. Puede encontrarse ADN cloroplástico, dependiente del ADN nuclear, donde se sintetizan los enzimas componentes de los fotosistemas. También se encuentran ribosomas 70S que demuestran la semiautonomía genética del cloroplasto, y apoyan junto con el ADN propio la teoría según la cual mitocondrias y cloroplastos son el resultado de la simbiosis de procariontes en las células eucariontes. También se encuentran plastoglóbulos, reservorios de lípidos, y amiloplastos donde se acumulan los productos de la fotosíntesis. 2.- Radiación Solar y su Captación por el Cloroplasto: Los complejos clorofila-proteína presentan capacidad para absorber la energía de las radiaciones electromagnéticas de entre 400nm y 740nm, es decir, en el espectro de la luz visible. Se trata en realidad del 28% del espectro solar, pero el 40% de la radiación que alcanza la superficie de la tierra. Esto es debido a la absorción por gases de la atmósfera de las radiaciones ultravioletas (ozono O3, estratosfera) e infrarrojas o caloríficas (CO2, CH4, vapor de agua). Esto modifica la radiación desde que alcanza la superficie de la atmósfera hasta la superficie del sustrato. 55 Fisiología Vegetal La radiación electromagnética se caracteriza por un vector eléctrico y un vector magnético, ambos perpendiculares. Los fotones se desplazan en el tiempo y el espacio con movimientos ondulatorios en ambos planos. La radiación electromagnética se caracteriza por su ondulación y su energía. Cada radiación aporta una cantidad de energía exacta o cuanto (quantum). Se trata de un paquete de energía que puede ser transmitido entero, o no ser transmitido. La longitud de onda es la distancia entre dos puntos de la onda que se encuentran en la misma fase, y suele medirse en nanómetros (nm). La velocidad de la onda en el vacío es constante y corresponde a la velocidad de la luz o celeridad (c = 3.108 m.s-1), pero puede calcularse en función de la longitud de la onda y de su frecuencia () cómo (en el vacío): 𝑐 = 𝜆. 𝜈 Un fotón que se desplaza lleva una cuanto de energía (E q), que es proporcional de su longitud de onda. Cuanto mayor sea su longitud de onda menor es el cuanto de energía que transporta (infrarrojos), y sucede lo contrario cuanto menor es la longitud de onda (ultravioleta). La energía del cuanto Eq se calcula en función de la frecuencia de la onda y la constante de Plank (h=6,6262.10-34 J.s-1). Cuanto mayor sea la frecuencia (menor longitud de onda) mayor será la energía del cuanto; = c/. Para realizar las estimaciones energéticas de la fotosíntesis en fisiología vegetal, no se utiliza la relación de una molécula de pigmento con un fotón. En su lugar se contempla la relación de un mol de moléculas de pigmento con un mol-cuanto de fotones de luz visible. Se trata un número de cuantos equivalente al número de avogadro (N=6,023.1023). Así se puede calcular la energía einstein en lugar de la energía del cuanto como: 𝐸𝐸𝐼𝑁𝑆𝑇𝐸𝐼𝑁 = 𝑁. . 𝜈 56 Fisiología Vegetal Así podemos clasificar los diferentes pigmentos por las longitudes de onda máximas y mínimas cuyos cuantos pueden absorber. Por ejemplo la clorofila a absorbe los cuantos de la radiación que se encuentra entre 430nm (azul) y 660nm (rojo). La energía electron-voltio (eV) es la energía desarrollada por un electrón al atravesar una diferencia de potencial de un voltio. La energía puede medirse en unidades eV utilizando la constante de faraday (f=9,65 C.mol-1): 𝐸 𝑒𝑉 = 𝐸𝐸𝐼𝑁𝑆𝑇𝐸𝐼𝑁 (𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙𝑐𝑢𝑎𝑛𝑡𝑜 −1 ) 𝑓 (𝐶. 𝑚𝑜𝑙 −1 ) 3.- Los Pigmentos Fotosintéticos: Los principales pigmentos fotosintéticos son clorofilas (verdes), carotenoides (anaranjados o amarillos), y ficobiliproteínas (amarillo verdoso). Estas últimas son moléculas muy similares a la bilirrubina y la biliverdina hepáticas de muchos animales. Los pigmentos cuentan con una cabeza polar hidrofóbica porfirílica con un tetrapirrol ciclado semejante al del fitocromo (anillos A, B C y D), y parecido también al grupo hemo de la hemoglobina animal con un ión magnesio en lugar de hierro. Existe ciclación de un quinto anillo pentagonal en el caso particular de las clorofilas. Los anillos presentan dobles enlaces próximos y distintos radicales libres como grupos metilo. Los distintos tipos de pigmentos (por ejemplo los distintos tipos de clorofilas) se diferencian por presentar distintos radicales libres. 57 Fisiología Vegetal Las plantas superiores presentan clorofilas a y b, de estructura casi idéntica y con una cadena de fitol. Se diferencian por el radical R 2 que hace más polar a la clorofila b, y más soluble en agua a clorofila a. Presentan un sistema de dobles enlaces conjugados específico que permite la absorción de la luz visible propio de clorofila a y bacterioclorofila. La cola de los pigmentos es un alcohol de 20 átomos de carbono (fitol) hidrofóbico que aporta a la molécula de clorofila el carácter anfipático. Los orbitales de los átomos del pigmento aceptan un determinado número máximo de electrones (fotones), además cada uno con un cuanto de energía característico y restringido. Si reciben radiaciones con otro cuanto son totalmente incapaces de absorberlas. La energía del cuanto es capaz de hacer que los elecrones que orbitan alrededor de los átomos se aproximen a los mismos, en una situación energéticamente más elevada. Debido a su capacidad para absorber cuantos de determinada cantidad de energía, cada pigmento tiene su propio espectro de absorción de luz. Varía con los pigmentos, pero cambia también ligeramente para un mismo pigmento dependiendo del medio o disolvente en que se encuentra. Por ejemplo las clorofilas a y b tienen espectros muy similares y absorben luz de los dos extremos de luz visible (azul y rojo) pero no de la región central (verde). Sus máximos de absorción son ligeramente diferentes; para clorofila a se encuentran a 430nm y 670nm, y para la clorofila b a 450nm y 640nm. La clorofila c se encuentra en algas pardas y dinoflagelados. La bacterioclorofila es propia de procariontes. Los carotenoides son un grupo variado de pigmentos que están presentes en todos los organismos fotosintéticos, como carotenos o xantófilas. Las ficobiliproteínas sólo se encuentran en algas rojas y cianobacterias. Los carotenoides son hidrocarburos poco solubles en agua, similares al fitol, y derivados de los isoprenoides (ácidos grasos). Ocho grupos de isopreno activo (5 carbonos) pueden unirse formando el carotenoide de 40 átomos de carbono, También pueden dar lugara a ABA y GA. Inicialmente dos isoprenos se unen 58 Fisiología Vegetal formando terpenos (10C), posteriormente diterpenos (20C), y finalmente los tetraterpenos (40C) con 8 dobles enlaces (formados entre isoprenos). El primer tetraterpeno que se forma es el licopeno, que es el pigmento que da su coloración roja al tomate. Este es el precursor de los otros carotenoides derivados por hidroxilación, hidrogenación, deshidrogenación, ciclación en los extremos. En función de la ciclación en el extremo 1 los carotenoides pueden ser acíclicos (no hay ciclación), monocíclicos o dicíclicos. Además se diferencian carotenos, que son hidrocarburos puros (C, H) y xantofilas que son sus derivados oxigenados (C, H, O). Los carotenos son más polares e hidrofóbicos que las xantofilas. Su región central suele ser conservada como en el licopeno, pudiendo variar los extremos. Se trata por ejemplo de la zeaxantina (protector del aparato fotosintético), la neoxantina, la violaxantina, la luteína o el -caroteno. La longitud de onda máxima de los carotenoides es similar a la de la clorofila b; 450nm (azul). Su papel principal dentro del aparato fotosintético es también similar al de la clorofila b, pues ambos son pigmentos auxiliares de la clorofila a; captan cuantos de luz diferentes a los de la clorofila a y luego transmiten su energía a la misma, pigmento central. Además los carotenoides protegen a la planta y en particular al aparato fotosintético de los posibles daños causados por las radiaciones de determinadas longitudes de onda. 59 Fisiología Vegetal Las ficobiliproteínas son proteínas capaces de absorber la radiación gracias a un tetrapirrol lineal similar al del fitocromo (la clorofila tiene uno en su cabeza, pero es cíclico). Absorben radiación entre 500nm y 600nm, donde ningún otro pigmento tiene capacidad de absorber, gracias a un sistema de dobles enlaces; por ello algas rojas y bacterias son los únicos seres con capacidad para aprovechar estas longitudes de onda. Destacan las ficocianinas (con cromoforo ficocianobilina) y las ficoeritrinas (con ficoeritrobilina) muy semejantes. Se trata de holoproteínas unidas a un cromóforo por un enlace tioeter en Cys, que forman así una cromoproteínas (apoproteína). La parte proteica 60 Fisiología Vegetal contiene dos cadenas ( y ). Están organizadas en ficobilisomas que son estructuras de mayor tamaño, cilíndricas, adyacentes a las membranas fotosintéticas alrededor del fotsistema II. Recolectan luz pero sólo para este fotosistema. Los complejos proteína-clorofila se agrupan en las membranas fotosintéticas formando complejos de unión en los que todos los pigmentos se unen a proteínas de membrana; se trata de los fotosistemas I y II. En los fotosistemas existen pigmentos centrales (clorofila a) y pigmentos auxiliares o accesorios, adyacentes. Todos los pigmentos absorben radiación solar, y los pigmentos accesorios transmiten la energía a los centrales. El fotosistema I se encuentra en las lamelas del estroma, y el fotosistema II en las lamelas de los grana. Otros fotosistemas contienen exclusivamente pigmentos auxiliares, como los LHCP, o carecen de pigmentos (cictocromo b6/f o la ATPsintasa). La realización eficiente de estos procesos de transmisión de la energía de excitación requiere que los pigmentos y transportadores están colocados de una forma determinada, con una orientación correcta y una distancia de separación específica, además de estar ordenados en una secuencia específica. B/ Etapas Radiofísica y Fotoquímica de la Fotosíntesis: 1.- Excitación y Desexicitación de la Clorofila a: La energía física de la radiación electromagnética solar deberá ser transformada por la fotosíntesis en la energía química de los enlaces de los hidratos de carbono. Cuando la energía es absorbida por las clorofilas u otros pigmentos no se producen reacciones químicas, pues inicialmente la energía captada permanece en estado físico permitiendo las transiciones electrónicas redox y la transmisión de la energía entre las moléculas. Cuando la energía de excitación es transmitida a través de los pigmentos auxiliares hasta el centro de reacción, comienza la cadena de transporte de electrones, en la que el efector es el primer reductor. El espectro de absorción de la fotosíntesis depende de la absorción de los distintos pigmentos y de su absorción en distintas longitudes de onda. Para realizar una valoración de la fotosíntesis se utilizan la fijación de CO 2, la producción de O2 y se calcula el espectro de acción de la fotosíntesis. Lógicamente se espera que la acción de la fotosíntesis a distintas longitudes de onda se corresponda a las longitudes de onda de los pigmentos presentes que pueden absorber. Los espectros obtenidos con soluciones de pigmentos purificados contribuyen conjuntamente en el espectro total de la fotosíntesis, de manera que por norma general deberíamos esperar: 𝐴𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠 í𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 = 𝐴𝑏𝑠𝑝𝑖𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 Existen sin embargo ciertas discrepancias entre ambos espectros, puesto que una parte de la radiación absorbida por los carotenoides está destinada a proteger el aparato fotosintético y no a realizar la fotosíntesis, y 61 Fisiología Vegetal esto explica que su espectro de absorción sea mayor a su espectro de acción. Por otra parte además se produce la caída en el rojo, que se refiere a la incapacidad de aprovechar la radiación absorbida por las clorofilas en la región del rojo; es decir que existe absorción pero no acción. Durante el proceso fotosintético los electrones que se encuentran en los orbitales moleculares, que pueden estar implicados en los enlaces moleculares, pueden moverse. Además pueden contener uno o dos electrones y encontrarse en situaciones de estabilidad (poco reactivo) o inestabilidad. Cada electrón de un orbital (con 2 electrones) tiene un spin opuesto. El spin es el momento angular de la rotación del electrón en el orbital, y puede ser de +1/2 o -1/2. +1/2 -1/2 Cuando una molécula contiene es su orbital un electrón con spin +1/2 y otro con -1/2 se dice que la molécula es estable, pues existe un equilibrio de spin (spin=+1/2-1/2=0). 62 Fisiología Vegetal Los orbitales de valencia de los átomos son varios. Los más energéticos son los utilizados para formar los enlaces covalentes de las moléculas. Existen sin embargo otros orbitales vacíos o libres donde pueden ser aceptados nuevos electrones. Los electrones de valencia, ante aportes energéticos, pueden desplazarse hacia orbitales vacíos más energéticos. De hecho estos orbitales suelen estar vacíos porque la molécula no tiene una carga energética suficiente para desplazar hasta ahí a sus electrones. Las transiciones de electrones entre distintos orbitales energéticos depende en el caso de los pigmentos fotosintéticos de los cuantos de energía aportados por las radiaciones. Las transiciones de energía más sencillas son las que requieren cuantos menores. Pueden producirse cuatro tipos de transiciones energéticas entre los orbitales. El singlete fundamental (S0) corresponde al contenido de energía típico de una molécula no excitada, con sus dos electrones en el orbital de valencia. Para calcular si hay singlete en una molécula se utiliza el spin neto multiplicado por dos (2 electrones) y se suma 1: 𝑆 = 2. 𝑠𝑝𝑖𝑛 + 1 En un singlete fundamental hay dos electrones con spin opuesto, y se obtiene un valor S0=1 singlete. Si existiese un electrón de spin positivo S=2 singletes, y si es negativo S=-2 singletes. En estos casos se habla de dobletes (2 singletes). Cada electrón contiene el nivel de energía característico del orbital molecular en que se encuentre. Cuando un electrón recibe un cuanto de energía que le permite exactamente la transferencia desde su orbital fundamental (S0) hasta un orbital vacío energéticamente superior (S1), entonces cambia de orbital y se habla de un singlete excitado. Si durante el cambio de orbital no se invierte el sentido de giro del spin, el spin neto sigue siendo 0 (singlete), como suele suceder en los pigmentos. Sin embargo esto puede cambiar durante la transición energética 63 Fisiología Vegetal en cuyo caso el spin neto pasa a ser 1 y S = 3 singletes = 1 triplete. El triplete contiene mayor cantidad de energía, y esta energía extra deberá ser perdida. 𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑢𝑚 = Δ𝐸 = 𝐸𝑆1 − 𝐸𝑆0 SINGLETE FUNDAMENTAL SINGLETE EXCITADO S1 E TRIPLETE S0 +1/2 -1/2 Existen en realidad dos orbitales vacíos más energéticos que el orbital de valencia en el estado fundamental (antienlazantes), con niveles energéticos crecientes. El orbital S2 (orbital molecular *) es energéticamente superior, y corresponde a cuantos de energía que corresponden aproximadamente a 430nm (278 kJ.mol-1). El orbital S1 (orbital molecular *) es energéticamente superior su nivel energético corresponde a cuantos de radiaciones de alrededor de 660nm (181 kJ.mol-1). 64 Fisiología Vegetal Dentro de cada orbital molecular existen de hecho subniveles vibracionales de energía, próximos entre sí. De no ser así los pigmentos sólo podrían absorber un cuanto muy preciso, y sólo podrían absorber luz monocromática de dos longitudes de onda concretas (se obtendrían bandas de absorción). Los pigmentos absorben una longitud de onda máxima, pero absorben progresivamente menores cantidades de las longitudes de onda próximas. En preparaciones con concentraciones muy elevadas de clorofila puede observarse una emisión fluorescente de un color rojizo después de excitación por luz solar. Esto demuestra que parte de la energía captada de la radiación es emitida en forma de fluorescencia, aunque otra gran parte pasará a formar parte de la cadena de transporte de electrones. De hecho las moléculas en su estado más energético son altamente inestables y tienden a liberar toda su energía en un periodo de tiempo muy breve (tS2=10-12 s, tS1= 10-9 s). Cuando un pigmento excitado encuentra a tiempo (entre 10-12 y 10-9 segundos) un oxidante capaz de absorber su energía de excitación, se la cederá. De no ser así la energía será liberada en forma de calor o fluorescencia o fosforescencia. La energía de excitación de un orbital cae a saltos ente los subniveles vibracionales de energía, hasta el subnivel más bajo posible. En cada salto, existen pérdidas de energía que suelen ser liberadas en forma de radiación infrarroja (calor). Se pueden producir conversiones internas cuando el electrón pasa de un orbital molecular al que se encuentra justo por debajo sin pérdidas, o cruces intersistémicos cuando los electrones excitados han formado un triplete, y deben revertir el sentido de giro del spin para formar un singlete, para lo que también liberan energía. Por ejemplo, si una molécula recibe un cuanto de energía suficiente para desplazar un electrón hasta el nivel S 1, el electrón tardará alrededor de 10-9 65 Fisiología Vegetal segundos en alcanzar el subnivel vibracional más bajo. Según descienda entre los subniveles liberará energía calorífica. Si en algún subnivel contacta con una molécula capaz de absorber la energía se producirá una transferencia del electrón. Si esto no sucede y el electrón alcanza el subnivel más bajo, pasará al orbital de valencia emitiendo fluorescencia (o fosforescencia). Debido al paso a subniveles vibracionales inferiores, la longitud de onda de la fluorescencia se encuentra desplazada respecto de la luz absorbida por el pigmento. 2.- Transferencia de Energía entre Pigmentos Accesorios: La cadena de transporte de electrones se inicia cuando una clorofila a excitada cede un electrón y pasa a estar oxidada reduciendo a otro compuesto del fotosistema. En este caso la energía ha sido aprovechada para la fotosíntesis. Para ello primero debe producirse la transferencia de energía de excitación entre los pigmentos accesorios, hasta los efectores p680 y p700 formados por clorofila a. En el centro de reacción las reacciones químicas almacenan parte de la energía transportando electrones desde la clorofila a efectora hasta una molécula aceptora. Entonces una molécula donadora reduce de nuevo a la clorofila. Se calcula que por una molécula de clorofila a se encuentran entre 200 y 300 pigmentos accesorios de tres tipos. Muchos pigmentos juntos actúan como antenas que transportan la energía de la luz captada y se la transfieren al centro de reacción. La antenas de pigmentos accesorios pueden ser intrínseca o proximal de los fotosistemas o centros de reacción, (complejos clorofila aproteína) o extrínsecas o distales si se encuentran en la periferia (clorofilas a y b y carotenoides). Las moléculas de pigmento funcionan como bipolos oscilantes (cargas negativas oscilantes) que puede desexcitarse sin pérdida de energía si encuentran otro pigmento suficientemente próximo y adecuadamente orientado para asimilar el bipolo. Además el pigmento acceptor debe ser 66 Fisiología Vegetal menos energético, menos reductor y captar radiación de mayor longitud de onda. La transferencia puede producirse por resonancia o por excitón. Si pasa demasiado tiempo (superior a 10 -9 segundos) sin encontrar un pigmento aceptor se producen pérdidas por fluorescencia. Si el tiempo que tarda se encuentra entre 10-9 y 10-12 segundos se produce una transferencia por resonancia desde el subnivel vibracional más bajo del pigmento más energético, al menos energético en un subnivel intermedio que contiene la misma cantidad de energía que el anterior. Así la energía va dirigida vectorialmente desde pigmentos más energéticos (tipo 1), a los menos energéticos (tipo 3) que interaccionan con los efectores de los fotosistemas. 67 Fisiología Vegetal Cuando los electrones son transferidos por resonancia no pueden retroceder debido a la pérdida energética; este fenómeno es llamado trampa. Cuando dos pigmentos similares con solapamiento de orbitales interaccionan antes de que se produzca la cascada vibracional, en menos de 10-12 segundos, se produce una transferencia de electrones por excitón deslocalizado. Este tipo de transferencia no implica pérdidas caloríficas, y además es reversible. Al aumentar el número de dobles enlaces conjugados próximos entre sí aparecen nuevos subniveles vibracionales, y disminuye la distancia que separa los niveles enlazante y * antienlazante, de forma que la transición entre estos orbitales se hace menos energética. Por ello cuantos más dobles enlaces tiene un pigmento, mayor es el número de energía que puede acumular. Cuando los electrones alcanzan al efector se produce la separación de cargas, y un electrón es extraído del agua, separándolo de los protones (H+). Los complejos fotosistema con sus proteínas estructurales y los pigmentos accesorios ligados (aceptores, protectores y efectores) se conocen muy bien actualmente. La cadena de transporte de electrones entre los elementos de los fotosistemas se producen por reacciones de reducción y oxidación en las que las moléculas de mayor E0 (potencial reductor) tienden a reducir a las de menor E0. Se diferencian dos fotosistemas (I y II) con distintas propiedades. El efector (P) permite la separación de cargas, y va a reducir a una molécula aceptora (A), primer eslabón de la cadena de transporte de electrones. El aceptor es un reductor fuerte, pero no tanto como el efector excitado P*, potente donador de electrones. Después de ceder su electrón, P* queda oxidado en la forma P+. Entonces debe recuperar el electrón desde un eslabón inferior de la cadena (un donador asociado al fotosistema) retornando a su estado de reductor pobre P, y posteriormente absorber un nuevo cuanto de luz para excitarse formando P*, fuerte reductor. 68 Fisiología Vegetal C/ Transporte de Electrones: 1.- Los Fotosistemas: Los fotosistemas son agrupaciones de pigmentos y proteínas que llevan a cabo los procesos de la cadena de transporte de electrones. Algunas moléculas son incapaces de captar luz, pero actúan como intermediarios entre los pigmentos permitiendo la transferencia efectiva de electrones. El complejo de citocromo b6/f es un ejemplo de una importante molécula transportadora de eletrones entre los dos fotosistemas. El fotosistema II está formado por la pareja redox p680/p680 + (oxidante fuerte – reductor débil) (máximo absorbido a 680nm) y es capaz de oxidar al agua, donador final. En la fotosíntesis oxigénica esto da lugar a la producción de O2 y H+. Se trata de dos moléculas de clorofila a unidas. El fotosistema I está formado por la pareja p700/p700 + (oxidante débil – reductor fuerte) (máximo absorbido a 700nm) y es capaz de captar electrones de p680+ a través del citocromo b6/f y reducir un NADP+, aceptor final. Ambos fotosistemas tienen distintos potenciales E 0, pero funcionan de manera análoga. El funcionamiento lineal de ambos fotosistemas da lugar de forma espontánea al funcionamiento según un diagrama en Z, que requiere por supuesto de la energía de la radiación solar incidente sobre el sustrato. Según este diagrama, el electrón tiende hacia las zonas de mayor E0 (notar que el eje E0 está invertido). Los pigmentos de los fotosistemas están ordenados de manera que aquellos que absorben longitudes de onda más cercanas a las del efector se encuentran situados más cerca de los efectores. Los efectores son los 69 Fisiología Vegetal pigmentos de clorofila del fotosistema que absorben la longitud de onda máxima (p700, p680), y están unidos a proteínas. Así se produce la separación de carga, la reacción más rápida. A partir de aquí las reacciones son cada vez más lentas. El material fotosintético en solución adaptado a la oscuridad presenta un determinado espectro de absorción (con máximos en 430nm y 660nm). El 100% de los pigmentos tienen singletes de electrones en los niveles S 0 (P). Cuando comienza la incidencia de luz algunos pigmentos comienzan a mostrar singletes y tripletes excitados en determinado porcentaje (P*), y otros han perdido sus electrones excitados (P+). Por ello la absorción del material fotosintético en solución cambia ante la luz. El espectro diferencial corresponde al espectro de absorción en luz menos el espectro de absorción en oscuridad. Este tipo de espectros ponen de manifiesto la pérdida de absorción en el máximo de absorbancia (700nm), debido a la oxidación de los pigmentos fotosintéticos con la energía de dichas longitudes de onda. p700 p680 Las longitudes de onda inferiores o iguales a 680nm excitan más efectivamente a p680, pero también pueden excitar a p700. La velocidad de transferencia del cit b6/f marca la velocidad máxima de reacción para este tipo de luz, por saturación. Las longitudes de onda superiores a 680nm sólo pueden excitar a p700 y al fotosistema I. En este caso el citocromo b6/f se encuentra completamente oxidado. El citocromo, durante la noche, queda totalmente reducido pues capta electrones pero no puede cedérselos a p700 en ausencia de luz. La distribución asimétrica de los fotosistemas en los tilacoides tiene un valor funcional. El fotosistema II se encuentra mayoritariamente apilado en los 70 Fisiología Vegetal grana, mientras que el fotosistema I no se encuentra apilado, y está en las lamelas del estroma. 2.- La Cadena de Transporte Lineal: La transferencia de electrones y protones en los tilacoides se produce vectorialmente, mediante la actividad de 4 complejos proteicos. Se produce liberación de protones en el lumen durante la oxidación del agua por el fotosistema II, y durante la reoxidación del plastoquinol (PQ) por el complejo del citocromo b6/f. Estos protones difunden a través de la ATPsintasa durante la síntesis de ATP. Los acceptores (NADP+) se encuentran hacia el lado del estroma, mientras que los compuestos oxidados (H 2O) se encuentran en el lado del lumen. Así se produce una separación de carga vectorial a través de la mambrana, y se acumulan protones en el lumen del tilacoide, cargado positivamente respecto al estroma. Los electrones son tomados inicialmente a partir del agua, por lo que durante la fotofosforilación oxigénica se produce oxígeno. El O2 puede ser así utilizado para valorar la fotosíntesis. Este gas disuelto puede difundir a través de la membrana. Los hidrogeniones formados no pueden difundir debido a su carga. El transporte lineal desde el fotosistema II hasta el fotosistema I depende de la excitación del citocromo intermediario por el fotosistema II, y por lo tanto de la calidad de la luz (inferior a 680nm). Si la luz es infrarroja el citocromo queda oxidado, y el fotosistema I extrae electrones de la luz. Los cuatro complejos del transporte lineal de electrones presentan una separación física. La plastoquinona (PQ) es una molécula hidrosoluble de pequeño tamaño que difunde en el interior de la membrana, y transporta electrones desde el fotosistema II y el complejo citocromo b6/f. La plastocianina 71 Fisiología Vegetal (PC) es una molécula pequeña hidrosoluble que se encuentra en el lumen de los tilacoides y transporta electrones entre el citocromo y el fotosistema I. No está ligada a la membrana. 3.- El Fotosistema II: En los fotosistemas la clorofila a interacciona con muchos otros compuestos y proteínas que modifican ligeramente sus características espectrales. Esto explica que p680 y p700 absorban a distintas longitudes de onda máximas. El donador inicial de electrones es el agua del lado del lúmen de los tilacoides en vegetales y cianobacterias, pero pueden ser compuestos orgánicos como sucede en bacterias verdes y purpúreas. El proceso por el que dos moléculas de agua forman una molécula de dioxígeno, cuatro protones y cuatro electrones recibe el nombre de fotólisis del agua, y tiene lugar en el fotosistema II para reducir a p680+, el oxidante más fuerte del fotosistema. El agua es un oxidante muy fuerte, por lo que p680 + debe serlo aún más. p700+ no es suficientemente fuerte como para oxidar agua. La aparición de p680 en la historia natural es fundamental para el estado actual de la vida en la tierra. Cuando el efector capta los electrones forma p680 reducido, y entonces puede absorber un cuanto de luz formando p680*, de poder reductor muy superior a p680. El fotosistema II sólo es capaz de aceptar un electrón, y sin embargo durante la fotólisis de dos moléculas de agua deben formarse 4 electrones simultáneamente. Por ello existen intermediarios que captan los electrones del agua y los ceden a p680+. El primer intermediario contiene 4 átomos de manganeso (Mn) pudiendo retener un electrón cada uno de ellos hasta que sea requerido por el fotosistema. Se encuentra en la región del lúmen del tilacoide. Se trata del complejo OEC (oxigen envolving center). Este complejo absorbe dos moléculas de agua y las fija. Por cada electrón cedido al segundo intermediario Yz (resto Tyr), libera un protón al lumen, y finalmente, después de 72 Fisiología Vegetal ceder los cuatro electrones (estado S4), libera O2 y vuelve a tomar dos moléculas de agua (estado S0). Se han realizado experimentos de medición del desprendimiento de O 2 por número de cuantos de luz recibidos, utilizando flashes de luz muy cortos e intensos para sincronizar la excitación de todos los p680 de la preparación (1 cuanto por fotosistema por flash), que demuestran que existe una periodidad de 4 cuantos de luz por cada molécula de dioxígeno liberada. El primer pico de liberación de O2 se produce al tercer cuanto, pero el siguiente a los 7, y después a los 11, con una periodicidad de cuatro cuantos. El hecho de que el primer pico se produzca al tercer cuanto se explica porque determinado porcentaje de intermediarios puede haber perdido electrones y encontrarse en estado S1, aunque en oscuridad la mayoría suele encontrarse en estado S 0. El primer aceptor de los electrones del p680* del fotosistema II es la feocitina (Pheo), molécula similar a la clorofila a pero carente de magnesio. 73 Fisiología Vegetal Existen dos moléculas de feocitina en el fotosistema, pero sólo una de ellas es funcional. Los siguientes acceptores son las plastoquinonas Q A y QB. El pool de plastoquinonas corresponde al conjunto de plastoquinonas libres y solubles en la membrana lipídica; PQ. Las plastoquinonas unidas al fotosistema II son QA y QB, pero son moléculas idénticas a las del pool de plastoquinonas libres. Como intermediarios, pueden donar o ceder electrones. De hecho el distinto funcionamiento de las tres depende exclusivamente de su disposición en el sistema. El balance final del fotosistema II es la oxidación del agua y la reducción del pool de PQ. Una PQ necesita tomar dos electrones del fotosistema II y dos protones del estroma para reducirse formando plastoquinol PQH 2. Los dos electrones son cedidos al fotosistema I a nivel del lumen, y los dos protones son de hecho liberados al lumen del tilacoide. En realidad, sin embargo, el p680 sólo puede ceder un único electrón en el fotosistema II. Por ello las plastoquinonas ligadas al complejo deben actuar de formas distintas. De hecho Q B toma un primer electrón, y después un segundo electrón que desestabiliza su unión al complejo, formando una PQH2 libre en el interior de la membrana. Cuando cede los electrones al fotosistema I se transforma en PQ y vuelve a ligarse al fotosistema en forma de QB. 4.- El Fotosistema I: El citocromo b6/f es un intermediario fundamental puesto que permite el transpaso de los electrones de PQH2 tomados del fotosistema II hasta la plastocianina (PC-) soluble en el lumen, que al ser reducida formará PCH 2. La plastocianina difunde sobre la superficie de la membrana hasta que puede transferir los electrones al fotosistema I. El funcionamiento del complejo citocromo b6/f es muy interesante pues da lugar a una cadena de transporte de electrones cíclica y al efecto de aumento de Emerson. El centro de reacción del fotosistema I es similar al del fotosistema II. Está formado por dos proteínas centrales psaA y psaB que ligan a los cofactores de la transferencia de electrones. Los electrones alcanzan el fotosistema I gracias a la plastocianina PCH 2 del lúmen. Esta molécula cede los electrones al p700 + que al absorber un cuanto de luz forma p700*, de un poder reductor tan elevado que va a poder reducir a NADP+. La molécula de p700* cede sus electrones a una clorofila a (A0) que a su vez los transfiere a una filoquinona (A 1) más próxima a estroma. Después el electrón es transferido a los centros sulfoférricos Fe-SX, Fe-SA y FeSB, para finalmente ser donado a la ferredoxina libre del estroma. 74 Fisiología Vegetal Los centros sulfoférricos Fe-S se conforman por una apoproteína que puede encontrarse unida a uno, dos o cuatro átomos de hierro no hémicos, asociados a átomos de azufre unidos a cys. Catalizan la transferencia de un eletrón. La ferredoxina, por ser más accesible al encontrarse soluble en el estroma, fue uno de los primeros componentes de la cadena de transporte de electrones en ser descubierto. La dos moléculas de feredoxina oxidada (FdOX) toman dos electrones del fotosistema I formando 2 Fd-. Gracias a la enzima del estroma Ferredoxin-NADP+ reductasa se produce la oxidación de las dos ferredoxinas formándose una molécula de NADPH 2, de elevado poder reductor para el metabolismo vegetal (no más reductora que los acceptores del fotosistema I). 5.- El Complejo Citocromo b6/f y el Ciclo Q: Este complejo, intermediario entre los fotosistemas II y I, es un complejo de proteínas transmembrana sin pigmentos, que cuenta con tres tipos de transportadores de electrones. La proteína rieske Fe-S toma un electrón de la PQH2 y lo cede al citocromo f (tipo c), que los cede a su vez a la plastocianina (PC). Por otro lado se encuentran dos citocromos b6 (tipo b) de bajo potencial y de alto potencial que toman y transfieren el otro electrón de la PQH2. El máximo de absorción de los citocromos presenta tres picos, dos de los cuales se 75 Fisiología Vegetal encuentran entre los 500nm y los 600nm. El tercer pico coincide con la zona de máxima absorción de la clorofila, por lo que existe ruido. Por ello para detectar cambios en el mecanismo de acción de los citocromos se utilizan longitudes de onda de 500-600nm. Muestran espectros distintos cuando están oxidados (Fe 3+) o reducidos (Fe2+). Citocromo c =550nm Existen dos componentes del complejo que no transportan linealmente los electrones; se trata de los citocromos b6. Estos citocromos van a dar lugar al ciclo Q de transporte de elecrones. PQH2 transfiere dos electrones al complejo; uno de ellos es transportado linealmente hasta la PC - por rieske Fe-S y citocromo f, pero el otro entrará en el ciclo Q por acción de los citocromos b6l (bajo potencial) y b6h (alto potencial). Van a retornar a las PQ. 76 Fisiología Vegetal De hecho existen dos sitios de unión para plastoquinonas en la región interna de membrana. El sitio QP es el más cercano al lumen del tilacoide, y une PQH2 para captar sus dos electrones. Más cercano al estroma se encuentra el sitio QN que toma PQ- y le cede un primer electrón de una molécula de PQH 2, y después un segundo. La molécula de PQ reducida finalmente es liberada, y va a tomar dos protones del estroma, que después transferirá al lumen en el sitio QP. Sin ciclo Q, se aportan 4 protones al lumen por cada dos electrones transportados linealmente. Con el ciclo Q, sin embargo, se transportan 6 protones al lumen por cada 2 eletrones (de hecho debe sumarse para uno de los dos electrones que entrará en el ciclo Q 1H ++1/2H++1/4H++1/8H+…). Una gran parte de la energía de la luz es almacenada inicialmente en un gradiente de concentración de protones a través de la membrana del tilacoide. Durante la fotofosforilación se producirá la transducción biológica de la energía, formándose ATP. 6.- Efecto del Aumento de Emerson: El efecto de aumento de emerson también es conocido como la caída en el rojo, y demuestra que existen dos fotosistemas que funcionan independientemente. La caída en el rojo se produce cuando se aplica una luz monocromática de longitud de onda superior a 680nm a una preparación fotosintética, y cae su eficacia fotosintética. Lo descubrió aplicar en una preparación de Chlorella una luz de estas características, y observar que se producía un descenso importante de de la fotosíntesis; el fotosistema II (p680) no puede excitarse. Después aplicó dos longitudes de onda; la anterior y una igual a 680nm, observando un aumento de la fotosíntesis. Así Emerson demostró que existen dos fotosistemas y que ambos deben funcionar juntos. El fotosistema II debe actuar antes que el fotosistema I, y sólo puede ser excitado por luz de 680nm o inferior. A partir de 680nm se produce la caída en el rojo y cae notablemente el rendimiento de acción de la fotosíntesis frente al espectro de absorción. Aunque p700 absorbe luz, no puede 77 Fisiología Vegetal producirse oxígeno. Sucede lo mismo en la zona azul donde los carotenoides absorben luz con función protectora, no fotosintética. Al aplicar dos longitudes de onda (1=680nm y 2 variable) se observa un aumento de del rendimiento de fotosíntesis cuando 2 > 680nm que cuando es inferior, ya que se activa así con mayor eficacia p700, ya siendo activado a su máxima eficacia p680 por 1. Los dos fotosistemas funcionan en serie formando una cadena lineal de transporte de electrones desde un donador final de electrones, el agua, y un aceptor final, el NADP+. La eficiencia con la que trabaja un fotosistema es fundamental para el rendimiento total de todo el proceso. Si el fotosistema I no puede funcionar no se podría liberar oxígeno en el fotosistema II. Efecto del aumento de Emerson D/ Fotofosforilación: 1.- Actividad de Hidrogeniones: Los hidrogeniones o protones han se acumulan en el lumen del tilacoide y eliminados del estroma durante la cadena de transporte de electrones. Por cada molécula de agua fotolizada se añaden 6 protones al lumen, cuatro de los cuales son extraídos del estroma (los otros dos corresponden a la propia molécula de agua). 78 Fisiología Vegetal En fase de oscuridad la concentración de protones está equilibrada en ambos compartimentos, y pHL=pHE. Al comenzar a incidir la radiación de luz comienza la cadena de tranporte de electrones y los protones son activamente transportados hacia el lumen. Los protones acumulados representan una importante fuente de energía para la planta, pues su salida se produce a favor de un gradiente electroquímico muy fuerte. Es facilitada por el complejo ATPsintasa de la membrana del tilacoide, que permite la salida de los protones aprovechando la energía del gradiente electroquímico para sintetizar ATP con ADP+Pi. La reacción de síntesis de ATP se produce a expensas de un importante aporte de energía, debido al enlace fuertemente energético que la molécula forma con su tercer fostato. La actividad de los hidrogeniones (aH) depende de su gradiente de concentración (c), corregido por el coeficiente de actividad de estos iones (). En una solución muy diluída no hay interacción entre las moléculas, y el coeficiente de actividad es 1 (no modifica a c). En soluciones concentradas aumenta el número de interacciones y disminuye . La energía ligada a los protones es superior en el lumen que en el estroma. Al pasar a través de la ATPsintasa los iones pierden su energía de actividad de forma proporcional a su gradiente de concentración, y la ceden al enlace fosfato de ATP. 𝑎𝐻 = 𝛾𝐻 . 𝑐𝐻 Pero el gradiente de concentración de H+ también tiene un factor eléctrico, y no sólo afecta a los protones sino también a otras moléculas cargadas. De hecho el gradiente de protones genera un potencial eléctrico a través de la membrana, de forma que el lumen está cargado positivamente respecto al estroma. Los iones de carga positiva tienden a pasar al estroma. La fuerza química y el potencial eléctrico pueden formalizarse conjuntamente como dos fuerzas que se suman gracias al gradiente de potencial electroquímico de un ión (i) en julios por mol. Representa la energía libre en julio que se encuentra disponible en un mol de una sustancia. Para los protones tenemos H(lumen) >>> H(estroma). Cualquier proceso, aunque ocurra en ausencia de luz, que de lugar a este gradiente de potencial electroquímico, se ve acompañado por la fosforilación de ATP. De hecho se puede calcular la energía aportada por un mol de hidrogeniones para la fotofosforilación como E. Δ𝐸 = 𝜇𝐻 𝐿 − 𝜇𝐻 𝐸 Jagendorf y Uribe (1966) demostraron experimentalmente por primera vez que el establecimiento de un potencial de gradiente electroquímico de protones a través de la membrana de tilacoides puede dar lugar a la fosforilación de ATP. Realizaron un experimento de transición ácido-base en oscuridad. Equilibraron tilacoides aislados en un medio a pH=4, y luego, en presencia de ATP + Pi ajustaron el pH a 8, y observaron síntesis neta de ATP en oscuridad. 79 Fisiología Vegetal También pueden realizarse experimentos de transición luz orscuridad con una solución de tilacoides. Para ello deben exponerse los tilacoides en luz en ausencia de ADP, y después rápidamente colocarlos en oscuridad con ADP + Pi. En este caso, de nuevo, hay síntesis de ATP en oscuridad. 2.- La Fosforilación por ATPsintasa: El complejo multiproteico transmembrana del tilacoide ATPsintasa tiene el papel fundamental de sintetizar ATP a partir de la energía de actividad de los hidrogeniones. Esta molécula queda inactivada si el gradiente electroquímico es pequeño, y su velocidad de acción depende de hecho de este gradiente. Se forma por muchas subunidades proteicas asociadas en un complejo de membrana. a La región F0 atraviesa la membrana. CF0 se forma por 14 copias de subunidades c. Se trata de un anillo concéntrico a modo de canal para protones, donde se inserta el vástago que conecta CF0 y CF1. El giro del vástago es facilitado por los movimientos circulares de las subunidades c por protonación y repulsión. La subunidad a es un canal hidrofóbico que permite la salida de los protones desde el lúmen hasta la mitad de la membrana, y 80 Fisiología Vegetal porteriormente desde la mitad de la membrana hasta el estroma. En la mitad de la membrana los hidrogeniones van a protonar a las subunidades c en restos Asp. En este paso se producen interacciones electrostáticas de repulsión entre las subunidades a y c. Cuando la subunidad c se une a H+ forma Asp-H sin carga, e interacciona con la membrana lipídica cambiando su afinidad. Al liberar el protón, Asp- es lipofóbico y gana afinidad por la subunidad a. Esto permite que gire CF0. El canal de protones no colineal de la subunidad a fuerza a los protones a atravesar la membrana protonando una subunidad del anillo CF0. La región F1 es externa a la membrana y se encuentra del lado del estroma. La región CF1 o cabeza es un heterohexámero formado por 3 subunidades y 3 . Las subunidades y son subunidades reguladoras. Por último la subunidad interacciona con CF1 y CF0; se trata de un vástago cuyo giro forzado por la salida de los protones en CF0 permite la fosforilación del ATP. La fosforilación del ATP sucede de forma similar a como lo hace una ATPasa, pero inversamente. Funcionalmente existen tres sitios de unión para ATP, cada uno de ellos formado por un dímero -. El giro del vástago modifica la conformación de cada sitio funcional de O (open) a L (light) y luego a T (tight). La conformación O proporciona el sitio inicial para la unión de un ADP y un Pi liberándose un ATP. La conformación L aproxima a ambos sutratos. En posición T se facilita la síntesis de un ATP. 81 Fisiología Vegetal Según la hipótesis quimiosmótica (Mitchell) la energía de la luz se transduce a energía de un gradiente de potencial electroquímico de hidrogeniones, que sirve para la transducción biológica de la energía y la fosforilación de ADP. Según la hipótesis conformacional (Boyer) la fotofosforilación implica cambios conformacionales en las subunidades del heterohexámero de la ATPsintasa. De hecho ambas hipótesis son ciertas pues, como hemos visto, el giro del vástago forzado por la salida de los hidrogeniones es lo que fuerza los cambios conformacionales en la ATPsintasa (las subunidades del heterohexámero no giran). 3.- Potencial Electroquímico y Velocidad de Fotofosforilación: El potencial electroquímico para un ión i dado (i) a través de una membrana impermeable (en J.mol-1) corresponde a la energía disponible por mol de i para realizar un trabajo. La energía estándar disponible en un mol del mismo ión (i*) debe ser tenida en cuenta, para estimar la energía disponible en el estado de referencia. Depende de la actividad del ión en función de su concentración a cada lado de la membrana (que estima la energía libre del mol de ión), y las diferencias de potencial eléctrico entre ambos departamentos, que depende de la diferencia de cargas generadas por la diferencia de concentración del ión. El término químico debido a la concentración del ión en una única solución es: 𝜇𝑖 ∗ +𝑅. 𝑇. ln 𝑎𝑖 𝑅 = 8,3143 𝑃𝑎. 𝑚3 . 𝑚𝑜𝑙 .1 . 𝐾 −1 : constante de los gases perfectos. 𝑎𝑖 : actividad del ión i. 𝜇𝑖 ∗: energía estándar. 𝑇: temperatura en grados kelvin. El término eléctrico debido a la carga del ión en una única solución es: 𝑧𝑖 . 𝐸. 𝐹 𝐸: voltios. 𝐹: constante de faraday en C.mol-1. 𝑧𝑖 : Carga del ión i ( 𝑧𝐻 = 1). Finalmente podemos obtener el potencial electroquímico del ión en una única solución, que equivale a la suma del término químico dependiente de concentración y el término eléctrico dependiente de la carga: 𝜇𝑖 = 𝜇𝑖 ∗ +𝑅. 𝑇. ln 𝑎𝑖 + 𝑧𝑖 . 𝐸. 𝐹 El incremento de potencial electroquímico para el hidrógeno entre el lumen y el estroma a través de la membrana tilacoidal (Δ𝜇𝐻 𝐿−𝐸 = 𝜇𝐻 𝐿 − 𝜇𝐻 𝐸 ) corresponde realmente a la energía liberada durante la salida de estos iones a través de la ATPsintasa. Depende del potencial electroquímico del mismo ión a 82 Fisiología Vegetal ambos lados de la membrana, y por lo tanto los términos eléctrico y químico deben ser restados. Se restarán las del estroma (menor potencial) a las del lumen, obteniéndose normalmente valores positivos. Δ𝜇𝐻 𝐿−𝐸 = 𝜇𝐻 𝐿 ∗ −𝜇𝐻 𝐸 ∗ + 𝑅. 𝑇. ln 𝑎𝐻 𝐿 − 𝑅. 𝑇. ln 𝑎𝐻 𝐸 + 𝑍𝐻 𝐿 . 𝐸𝐿 . 𝐹 − 𝑍𝐻 𝐸 . 𝐸𝐸 . 𝐹 Teniendo en cuenta que por un lado 𝜇𝐻 𝐿 ∗ −𝜇𝐻 𝐸 ∗= 0 , por otro lado tenemos 𝑍𝐻 = 1 tanto en el lumen como en el estroma, y finalmente reemplazando ln 𝑎𝐻 𝐿 = 2,303. log 𝑎𝐻 𝐿 = −2,303. 𝑝𝐻 (siendo negativo obtenemos Δ𝑝𝐻 𝐸−𝐿 en lugar de Δ𝑝𝐻 𝐿−𝐸 ), obtenemos la formula completa de la diferencia de potencial electroquímico que se establece a través de la membrana es: Δ𝜇𝐻 𝐿−𝐸 = 𝑅. 𝑇. 2,303. Δ𝑝𝐻𝐸−𝐿 + 𝐹. Δ𝐸 𝐿−𝐸 La velocidad de fosforilación de la ATPsintasa depende de las concentraciones disponibles de sustratos y productos (ATP, ADP, Pi) y la energía aportada por Δ𝜇𝐻 𝐿−𝐸 . En la fotólisis de dos moles de agua se generan 40kJ de energía, por lo que la estequiometria de la relación entre protones movilizados y energía liberada es de 10 kJ.mol de H +. La fotofosforilación por la ATPsintasa sólo se produce activamente para 𝐿−𝐸 Δ𝜇𝐻 > 10𝐽. 𝑚𝑜𝑙 −1 , pero no para valores inferiores. Por otro lado si la luz es demasiado contínua e intensa pueden llegarse a generar diferencias de potencial electroquímico demasiado elevadas que pueden resultar perjudiciales para el aparato fotosintético. El movimiento de iones de cloro hacia el lumen del tilacoide puede neutralizar la diferencia de carga eléctrica si esta es excesiva, al igual que la salida de magnesio hacia el exterior. Así, en condiciones normales, Δ𝐸𝐿−𝐸 = 20𝑚𝑉 y el término eléctrico es poco significativo a través de la membrana del tilacoide. La mayor parte de la diferencia de potencial se debe por lo tanto a Δ𝑝𝐻 𝐸−𝐿 . El complejo ATPsintasa también puede presentan actividad ATPasa. Esta actividad debe ser inactivada de forma específica en condiciones de oscuridad, pues en caso contrario podría haber pérdidas de ATP que no aportarían nada al organismo vegetal. De hecho la activación del complejo viene contolada por la protonación y reducción del residuo Cys de la proteína del vástago por el lado del estroma. Se produce activación por reducción en luz gracias a la proteína tirodoxina y el enzima tirodoxina reductasa. Por otro lado a activación del vástago sólo puede producirse cuando este se desplaza hacia el estroma, y esto requiere que se haya generado un Δ𝑝𝐻 𝐸−𝐿 positivo y suficientemente energético. La diferencia de la concentración de protones (o de pH) presenta una doble función, pues es necesaria tanto para permitir la activación del vástago, sólo en condiciones de luz, como para forzar el giro del vástago permitiendo la fotofosforilación del ADP. 4.- El Acoplamiento, Desacopladores e Inhibidores: El acoplamiento se produce durante la fotofosforilación; se trata de la transducción energética electromagnética a energía de enlaces bioquímicos. 83 Fisiología Vegetal Se ha demostrado que existe acoplamiento mediante experimentos de transición acido-base, y transición luz-oscuridad. Se dice que la síntesis de ATP está acoplada a la cadena de tranporte de electrones. También existe un acoplamiento inverso, por el cual el transporte de electrones continuado requiere la actividad de la ATPsintasa. Si el complejo ATPsintasa no funcionase se produciría una acidificación excesiva del lumen de los tilacoides, y esto inhibe la casión de hidrogeniones por PQH2, y por lo tanto también la cesión de los electrones asociados. El bloqueo de esta reacción concreta es responsable de que se inhiba por completo la cadena de transporte de electrones y el ciclo Q. De esta manera, si el número de cuantos incidentes por unidad de tiempo supera la capacidad de funcionamiento del sistema, se inhibe la cadena de transporte de electrones. Además, aunque no haya exceso de luz, se requiere que los protones sean continuamente expulsados al estroma por ATPsintasa. Si se aíslan tilacoides con una sustancia A + que cumpla las funciones de aceptor del NADP+, y con ADP y Pi puede tener lugar la fotosíntesis de forma normal, pero ante carencia de alguno de los sustratos de la reacción los protones no pueden salir y se produce acidificación del lumen, además de bloquearse el transporte de electrones. Los desacopladores son compuestos implicados en el desacoplamiento de la fosforilación y la cadena de transporte de electrones. De hecho los desacopladores son sustancias que permiten el transporte de eletrones de forma independiente de la fosforilación de ATPsintasa, permitiendo la salida de protones del lumen por diferentes mecanismos. Así puede reducirse el NADP + en ausencia de los sustratos ADP y Pi, es decir, de forma desacoplada. Rupturas en la membrana del tilacoide o malfunción del complejo ATPsintasa pueden ser considerados como agentes desacopladores. Por ejemplo si se despega del complejo ATPsintasa la unidad funcional CF 1, la salida de protones a través de CF0 no produce fosforilación. Los agentes quelantes son capaces de extraer cationes del lumen. Existen otros productos y proteínas que facilitan y median la salida de protones por difusión facilitada al estroma. Por ejemplo los protonóforos son canales que permiten la salida de hidrogeniones. Los ionóforos son antiportadores de protones y otro catión (por enemplo K+), como FCCP, CCCP, valina o micina. La aminas también son desacopladores que pueden atravesar la membrana en su forma no protonada (R-NH2). Se trata por ejemplo de la 9aminoacridina. La forma no protonada puede difundir pasivamente y se reparte equitativamente a ambos lados de la membrana. Cuando aumenta la diferencia de pH, los R-NH2 entran al lumen y se protonan, y los R-NH3+ salen al estroma donde ceden sus protones. La cadena de transporte de electrones queda así desacoplada. Las sales de amonio (R-NH3 y R-NH4+) funcionan de la misma manera y pueden actuar como desacopladores. Los desacopladores permiten la disipación del gradiente de potencial electroquímico de los hidrogeniones en caso de que se sature el complejo ATPsintasa, pudiendo inhibir la fotofosforilación y disminuir la velocidad de actividad de la ATPsintasa. De hecho la cadena de transporte de electrones tiene capacidad para funcionar más rápido de lo que permitiría la ATPsintasa. 84 Fisiología Vegetal La medición del acoplamiento de la cadena de transporte de electrones puede realizarse en una solución de tilacoides aislados, donde se añade al medio un aceptor A, ADP, y Pi. Con estos sustratos no se inhibe la fotofosforilación acoplada, aunque en teoría puede haber transporte de electrones desacoplados sin ADP o Pi. De hecho al iluminar una preparación de tilacoides aislados en ausencia de Pi y con desacopladores añadidos en concentraciones crecientes se puede medir el transporte de electrones (E.T.) basal (sin Pi) y el que se produce de forma desacoplada y acoplada (con Pi). Cuando la concentración de desacoplador es muy elevada, el transporte basal iguala al desacoplado. El transporte basal indica que pueden escapar protones del lumen aún en ausencia de desacoplador añadido. Los inhibidores del transporte de electrones son sustancias que inhiben la cadena de transporte de electrones bloqueando un paso concreto de la cadena de transferencias. DCMU impide el paso de electrones de Q A a QB. El metil viológeno (MV o paraquat) bloquea al aceptor natural NADP+, y es un aceptor no fisiológico que sustituye a la ferredoxina. DBMIB es un análogo de las quinonas que compite con PQ inhibiendo la transferencia de electrones al complejo citocromo b6/f. A elevadas concentraciones de inhibidor el desacoplador no tiene efecto. 85 Fisiología Vegetal También existen inhibidores de la transferencia de energía que inhiben la actividad de ATPsintasa. Los inhibidores de CF1 no permiten la fotofosforilación ni el transporte acoplado, pero sí el transporte basal. Los inhibidores de CF0 inhiben también el transporte basal. Si hay desacopladores estos inhibidores no afectan al transporte desacoplado. Numéricamente el acoplamiento representa la cantidad de ATP (P ó producto) sintetizado por cada 2 electrones. Teniendo en cuenta el ciclo Q se tranportan 6 protones por cada 2 electrones. El complejo ATPsintasa requiere transportar 4 protones para sintetizar un ATP. Por lo tanto el valor del acoplamiento es teóricamente de P/2e - = 1,5, es decir, se forman 1,5 ATP por cada dos electrones transportados. Experimentalmente se obtiene valores de P/2e- = 1,3 cuando se utilizan aceptores no fisiológicos como el metil viológeno (MV). Sin embargo, al utilizar al aceptor fisiológico ferredoxina se obtienen valores de P/2e- = 1,6 superiores a los teóricos. 𝑃 𝑣𝑠𝑖𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑑𝑒 𝑢𝑛 𝐴𝑇𝑃 = − 2. 𝑒 𝑣𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑝𝑜𝑟𝑡𝑒 𝑑𝑒 2 𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑛𝑒𝑠 Las diferencias entre los valores teóricos (1,5 ATP/2e-) y los obtenidos en la práctica con aceptores no fisiológicos como MV (1,3 ATP/2e-) pueden encontrar distintas explicaciones. Al trabajar con aceptores no fisiológicos como el MV pueden escapar protones del lumen, lo que se pone de manifiesto con el transporte basal, y además el ciclo Q no se produce obligatoriamente. El resultado es que el numero de protones netos transportados por la cadena al lumen sea inferior a 6 por cada dos electrones. Los valores con ferredoxina (1,6 ATP/2e -), el aceptor fisiológico, son sin embargo superiores a los teóricos. En este caso no se producen escapes de hidrogeniones, y el ciclo Q tiene lugar de forma obligatoria. Además la 86 Fisiología Vegetal ferredoxina permite que se produzca un transporte de electrones cíclico que tiene lugar alrededor del fotosistema I. 5.- Ferredoxina y Fotofosforilación Cíclica: La ferredoxina está implicada en un transporte de electrones cíclico alrededor del fotosistema I, que no implica al fotosistema II. En este proceso no existehidrólisis de agua ni desprendimiento de oxígeno. Debe además implicar a un intemediario actualmente no bien conocido que sea capaz de tomar electrones de la ferredoxina reducida y cedérselo a la plastoquinona en lugar de al NADP+. Este intermediario es la Ferredoxina-PQ óxido-reductasa, un complejo enzimático transmembrana. El complejo NADPH deshidrogenasa también es capaz de ceder electrones oxidando NADPH a la PQ. Este complejo transmembrana ha sido encontrado en mitocondrias. Sus genes han sido encontrados en cloroplastos, pero este complejo no es abundante. Este transporte cíclico de electrones implica además un nuevo ciclo Q, y el transporte de 4 protones más al lumen del tilacoide por cada 2 electrones bombeados. Este tipo de transporte de electrones da lugar a una fotofosforilación cíclica, puesto que los mismos electrones permiten acumular protones en el lumen sin desprendimiento de oxígeno, y sin formación de NADPH2 ni reducción de ningún otro aceptor final. Por la vía lineal, seguida por el 100% de electrones ante un aceptor que no sea ferrodoxina, P/2e- = 1,3<1,5. Como esta vía puede no satisfacer las necesidades de la planta ante déficit de ATP o exceso de NADPH2, se recurre a la vía cíclica donde P/2e- = 1,6>1,5. La vía reductiva de las pentosas fosfato requiere ATP:NADPH 2 en proporciones 3:2, es decir, 1,5 ATP por cada NADPH 2. Teniendo en cuenta que 87 Fisiología Vegetal 2 electrones son necesarios para reducir un NADPH 2 en cualquier caso, la velocidad P/2e- = 1,3 es insuficiente para una fijación eficaz del CO 2. 6.- El Ciclo Agua-Agua: El ciclo agua-agua corresponde a la fotofosforilación pseudocíclica. Los electrones captados del agua del lumen terminan formando agua en el estroma. Esto aporta hidrogeniones al lumen pero no forma NADPH 2. En el cloroplasto, dependiendo de la disponibilidad de NADP +, el O2 del estroma puede actuar como aceptor final de electrones. En este caso se forma anión superóxido tóxico. El enzima transmembrana superóxido dismutasa (SOD) debe actuar rápido para evitar daños, y forma H 2O2 tomando 2 protones del estroma, gracias a un átomo de cobre. Este enzima toma un electrón de un anión superóxido transformándolo en O2 de nuevo, y se lo cede a otro anión superóxido que formará el peróxido de hidrógeno. H2O2 también es tóxico, y puede dar lugar a un grupo hidroxilo y un radical hidroxilo. Ascorbato peroxidasa es un enzima que se encuentra libre en el estroma y en la membrana. Cede dos protones y dos electrones al H 2O2 fomando dos moléculas de agua. El ascorbato cede los electrones y queda oxidado en monoaldehido ascorbato (MDA). Debe ser reducido por MDA reductasa, captando dos electrones y dos protones que son transferidos desde la ferrodoxina. El ciclo agua-agua permite la recaptación del oxígeno formado por la fotólisis del agua en el lumen para formar agua de nuevo, y es muy importante en condiciones de aridez o estrés hídrico, pues evita las pérdidas de agua. Para formar dos moléculas de agua a partir de un O 2 se requiere el transporte de 4 electrones. Es muy difícil de medir pues no se libera O 2 y es difícil medir la reducción del aceptor final. E.T. y FOTOFOSFORILACIÓN Lineal (P/2e- = 1,3) Cíclica (P/2e- = 1,6) Pseudocíclica O2 NETO EFECTOR ACEPTOR MAX Si No No p680 y p700 p680 P680 y p700 Si No Agua <680nm <680nm >680nm 88 Fisiología Vegetal La reoxidación del NADP+ tiene lugar en el ciclo reductivo de las pentosas fosfato, ruta metabólica por la cual las plantas son capaces de fijar el dióxido de carbono atmosférico. Esto permite que haya disponibilidad de NADP+ para la fotosíntesis. Sucede del mismo modo para el ATP y el ADP + Pi. En el cloroplasto deben actuar en acoplamiento la cadena de transporte de electrones, la fotofosforilación, y el ciclo reductivo de las pentosas fosfato. En el ciclo reductivo de pentosas-P (RPP) se consume una proporción de 3 ATP por cada 2 NADPH2. La proporción de ATP y NADPH2 producido en los tilacoides es como hemos visto variable. Oscila entre 1,25 y 1,5 ATP por cada NADP+ que es reducido. Existe por lo tanto una tendencia al exceso de producción de NADPH2, siendo la producción de ATP saturante para el ciclo RPP. Cuando no hay NADP+ disponible, el dioxígeno del estroma acepta los electrones del fotosistema I. Esto permite generar más ATP sin necesidad de reducir NADP+ lo que permite generar más NADP+ en el ciclo RPP. 7.- Adaptaciones del Aparato Fotosintético: El efector p700, al igual que los efectores de bacterias fotosintéticas, se forma por un dímero de clorofila a. No presenta fotooxidación ni fotodestrucción. El efector p680 funciona de forma diferente. Se trata en este caso un tetrámero de clorofila a que es sensible al exceso de iluminación, que puede causar fotooxidación, por lo que cesa su actividad. Si p680 es destruido se perderían gran parte de los pigmentos accesorios de la antena. Esto podría suceder a determinadas longitudes de onda elevadas como 700nm, provocando un descenso importante en el flujo de electrones. Esto se soluciona en la naturaleza mediante adaptaciones del aparato fotsintético. Por ello alrededor del fotosistema II se encuentran proteínas y moléculas que protejen al complejo, y en particular a su efector (y también algunas en el fotosistema I). 89 Fisiología Vegetal Las LHCP (light harvesting clorofile proteins) protegen a los complejos fotosintéticos de las radiaciones solares dañinas. Se encuentran distintos tipos, como las LHCa (1, 2, 3…), las LHCb (1, 2...). Las LHCP son capaces de captar luz de longitud de onda inferior a 680nm y transferirla a p680. Ante un exceso de luz y falta de CO 2 (por ejemplo con los estomas cerrados) p680 se fotooxida y el ciclo RPP se detiene por falta de carbono inorgánico. En este caso las LHCP son móviles y pueden despegarse del fotosistema II inactivo, por acción de una kinasa ATPasa del tilacoide, y asociarse a la antena del fotsistema I. La activación del enzima kinasa a expensas de APT se produce durante la transición de estado. Una fosfatasa del tilacoide facilita la desfosforilación y el retorno al fotosistema II. El complejo citocromo b6/f es el mediador entre los dos fotosistemas, y controla la situación general de transferencia de electrones entre ambos. Es lógico que sea este complejo el que perciba las diferencias de transferencia de electrones o de potencial reductor de los dos fotosistemas. Por lo tanto tiene capacidad para regular la fosforilación de las LHCP (o LHC II). El complejo citocromo b6/f se encuentra en la membrana formando dímeros, y la proteína sulfoférrica rieke interviene en la estabilización del dímero. El desprendimiento de LHCP del fotosistema II ha sido atribuído a una repulsión electrostática. La unión de PQH2 en su sitio de unión del complejo citocromo provoca un cambio conformacional en el mismo, pasando la proteína rieske de posición proximal a distal. Esto favorece la interacción entre LHCP y kinasa. La kinasa fosforila tanto al complejo citocromo como a la LHCP. En la transición de estado no sólo hay movimiento de las LHCP, sino que el complejo citocromo b6/f también se desplaza desde los grana a las lamelas del estroma. En el estado II se favorece así el transporte cíclico de electrones. 90 Fisiología Vegetal Además de la transición de estado, existen otros dos mecanismos que los vegetales emplean para evitar daños en p680. Entre ellos destaca la actuación del O2 en el ciclo de agua-agua, ante carencia de NADP+ o de agua, y el efecto protector de los carotenoides. El efecto protector de los carotenoides son notables. Se puede observar que el máximo de absorción de los carotenoides corresponden con la caída del rojo, en las longitudes de onda que p680 no es capaz de absorber. Absorbiendo energía de excitación sencillamente protegen al aparato fotosintético de la fotooxidación. Cuando las clorofilas se excitan y forman un triplete, el triplete debe ser eliminado. Puede eliminarlo el oxígeno formando un oxígeno singlete. Los carotenoides desactivan el estado de triplete de las clorofilas (1) evitando la formación de oxígeno singlete (90% de los casos). Además desactivan el estado de singlete del oxígeno (2) formado por causa de clorofilas excitadas (99,99% de los casos). En algunos casos muy raros se produce la oxidación de carotenoides por oxígeno siglete (3) formado por clorofila excitada. La zeaxantina es una xantofila que actúa en condiciones de exceso de iluminación y riesgo de fotooxidación del aparato fotosintético. La violaxantina puede interconvertirse en zeaxantina pasando por un único intermediario, la 91 Fisiología Vegetal antheraxantina. Esta transformación es catalizada por enzimas que se activan y forman la zeaxantina cuando la radiación es muy intensa, es decir, a mediodía. La reconversión a violaxantina requiere NADPH. 8.- Quenching: La clorofila en estado de singlete excitado puede liberar su energía de tres formas; por radiación fluorescente, por radiación calorífica, o por quenching fotoquímico. Por ejemplo cuando PQ se acumula, los LHCP se desplazan y pueden emitir fluorescencia. La clorofila emite fluorescencia cuando se encuentra diluída en éter. En solución diluída emite un 32% de los cuantos en forma de fluorescencia, y el 68% restante formará tripletes. En soluciones concentradas se producen agregados de clorofila en los que hay transferencias de energía de excitación por excitón o por resonancia. En vivo hay un 6% de emisión de fluorescencia en condiciones normales, debida mayoritariamente al fotosistema II. También hay formación de agregados de clorofila. Los tripletes tienden a ser desactivados por el oxígeno y los carotenoides. 92 Fisiología Vegetal En ausencia de aceptor, exceso de luz, o presencia de DCMU, el PQH2 no puede reaccionar y p680 no es capaz de transferir su energía. Los pigmentos accesorios están organizados en trampa cerrada y no transmiten energía a p680, y este no puede transferir los electrones de la fotólisis del agua. Entonces aumenta la emisión de fluorescencia por el fotosistema II. El quenching, descenso o atrapamiento de la fluorescencia tiene lugar cuando los pigmentos accesorios se disponen en trampa abierta, en ausencia de inhibidores del transporte de electrones como DCMU, con iluminación limitante y en presencia de aceptor. El estudio de los cambios en la cadena de transporte de electrones, en ocasiones difíciles de medir por otros métodos, puede ser valorada por la cinética de la evolución de fluorescencia. El rendimiento de la fluorescencia puede ser medido en tejidos completos y no es necesario romper el aparato fotosintético para extraer los tilacoides. En material adaptado a la oscuridad las antenas se diponen en trampa abierta. Al comenzar la iluminación se puede detectar una fluorescencia basal (F0) de 6%. Si aumenta la intensidad de la luz se saturan las reacciones 93 Fisiología Vegetal fotoquímicas, y las antenas se disponen en trampa cerrada. Entonces se observa una fluorescencia máxima (Fm) emitida por todos los pigmentos de alrededor de 35%. El material se encuentra adaptado así a la luz. Si posteriormente disminuye la intensidad de luz, disminuye el rendimiento de fluorescencia del material adaptado a luz debido a que se produce quenching. Ante nuevos pulsos de luz saturantes el rendimiento de fluorescencia es inferior al primero (Fm’<Fm). El quenching o atrapamiento de la fluorescencia puede medirse como la diferencia entre Fm y Fm’. Existen distintos mecanismos de atrapamiento de fluorescencia, y se diferencian un quenching fotoquímico (qP) que se produce cuando la captación de fluorescencia es reutilizada para hacer funciona a la cadena de transporte de electrones, y un quenching no fotoquímico (qE + qT + qI). El quenching por acidificación del lumen (qE) se produce cuando hay daño y fotooxidación de los pigmentos en condiciones naturales. Los pigmentos degradados no funcionan, por lo que no pueden captar luz ni emitir fluorescencia. Se pierde rápidamente después de la adaptación a la luz. El quenching por transición de estado (qT) corresponde a la desactivación de clorofilas por carotenoides, y en particular por la zeaxantina que se forma a partir de violaxantina si el lumen se acidifica. El quenching fotoinhibitorio (qI) es debido a la fotoinhibición o destrucción de los propios pigmentos del aparato fotosintético Cuando el material queda adaptado a la luz, después de un primer pulso de luz saturante, el qI es el que más tarda en recuperarse. La fotodestrucción del fotosistema II provoca importantes disfunciones del aparato fotosintético, y puede ser muy dañino para los tejidos vegetales. Puede producirse ante iluminación excesiva, o en condiciones naturales por estrés hídrico. Existen tres mecanismos preparados para evitar estos daños en el fotosistema: El ciclo agua-agua (se recupera agua), la inhibición del fotosistema II por transición de estado ante acúmulo de PQH2 por movimiento de LHCP hacia los fotosistemas I, y por último la inhibición de la 94 Fisiología Vegetal fotofosforilación. Ante excesos de luz el p680, y en particular el heterodímero D1, son los primeros pigmentos dañados. El cloroplasto tiene capacidad para sintetizar D1, y también muchas otras proteínas implicadas en los procesos fotosintéticos, gracias a su auntonomía genética. Las nuevas D1 sintetizadas deben ser reincorporadas junto a los demás componentes del fotosistema II. 95